Quim. Nova, Vol. 34, No. 5, 780-786, 2011

Artigo

*e-mail: eprimelfurg@gmail.com

OTIMIZAO E VALIDAO DE MTODO EMPREGANDO QuEChERS MODIFICADO E LC-ESI-MS/MS PARA DETERMINAO DE AGROTXICOS EM CEBOLA

Sherol Acosta Rodrigues, Sergiane Souza Caldas, Eliana Badiale Furlong e Ednei Gilberto Primel*Escola de Qumica e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, 96201-900 Rio Grande RS, BrasilRenato ZanellaDepartamento de Qumica, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria RS, Brasil

Recebido em 18/5/10; aceito em 3/12/10; publicado na web em 25/2/11

OPTIMIZATION AND VALIDATION OF A METHOD USING MODIFIED QuEChERS AND LC-ESI-MS/MS FOR THE DETERMINATION OF PESTICIDES IN ONION. An evaluation of the pesticides extraction from onion using a modern sample preparation method (QuEChERS) and determination by liquid chromatography tandem mass spectrometry was carried out. All the calibration curves showed r>0.99. The recoveries ranged between 61.8 and 120.0% with relative standard deviation lower than 20% for all compounds. Due to the occurrence of matrix effect, the quantification was performed using matrix-matched calibration. The limits of quantification of the method were between 0.0005 and 0.05 mg kg-1. The method shows the advantages of not require the clean-up step and consume low volume of organic solvents, decreasing time, costs and residues.

Keywords: pesticides; QuEChERS; LC-ESI-MS/MS.

INTRODUO

A cebola (Allium cepa L) est entre os alimentos mais consumidos no mundo. Devido s propriedades antioxidantes e anticancergenas, considerada um alimento funcional, por consequncia da presena de compostos bioativos, como as antocianinas e a quercetina em sua composio.1-3

O maior produtor de cebola do mundo a China, responsvel por cerca de 30% da produo mundial. Nessa mesma escala, o Brasil est em 9 lugar, como o maior produtor da Amrica do Sul.4

No Brasil, a cebola ocupa a terceira posio em importncia econmica, com plantio que se estende desde a regio Sul at a regio Nordeste. No estado do Rio Grande do Sul, o municpio do Rio Grande destaca-se com relao produo.5

A cultura da cebola, contudo, passvel de ser atacada por vrias doenas de origem fngica, bacteriana, viral e nematolgica, as quais podem ocorrer no campo, na ps-colheita, no transporte, no armazenamento e na comercializao. Como consequncia dessa vulnerabilidade, a produtividade da cebola decresce drasticamente, podendo atingir at 100% de perda na produo de bulbos comer-cializveis.6,7

Embora o uso de agrotxicos seja necessrio para garantir bons resultados de produtividade, o aumento da aplicao dos mesmos na cultura de cebola8 fez com que, em 2008, fosse includa no Progra-ma de Anlise de Resduos de Agrotxicos em Alimentos (PARA), iniciado em 2001, pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), com vistas a avaliar continuamente os nveis de resdu-os de agrotxicos presentes nos alimentos in natura que chegam mesa do consumidor. Das 103 amostras de cebola analisadas, 2,91% (3 amostras) foram consideradas insatisfatrias, em decorrncia, exclusivamente, do uso de acefato, agrotxico no autorizado para a cultura em estudo.9

Entre as dificuldades que envolvem as anlises de agrotxicos

em amostras de alimentos como a cebola, destaca-se a complexidade dos procedimentos necessrios para extrao e purificao dessas amostras. A otimizao das etapas envolvidas no preparo da mesma essencial para reduzir o tempo e as fontes de erro relacionadas ao procedimento.10

Dentre as tcnicas mais utilizadas para a extrao de agrotxicos em alimentos, podem ser citadas a extrao acelerada por solvente,11 extrao lquido-lquido,12 extrao por ultrassom,13 extrao com fluido supercrtico14,15 e a extrao por disperso da matriz em fase slida.16-23

Nos ltimos anos, tcnicas e mtodos de preparo de amostra ba-seados na minimizao do uso de solventes orgnicos para a extrao de agrotxicos foram desenvolvidos como, por exemplo, o mtodo QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe), o qual tem sido largamente empregado para determinao de agrotxicos em matrizes complexas. Foi assim denominado pelas caractersticas que possui: rapidez, facilidade, economia, efetividade, robustez e segurana. baseado em uma extrao com acetonitrila, seguida de partio lquido-lquido (adio de MgSO4 e NaCl) e posterior etapa de purificao com extrao em fase slida dispersiva.24-26 um mtodo robusto,27 adotado nos EUA, como o oficial da Association of Official Analytical Chemists para a determinao de resduos de pesticidas em alimentos.28 tambm considerado mtodo oficial pelo European Committee for Standardization.26,29,30

Ao longo de seu desenvolvimento, o mtodo QuEChERS tem sofrido variadas modificaes, na direo de ser empregado como um mtodo multirresduo para extrao de agrotxicos em alimen-tos, usando tcnicas cromatogrficas acopladas espectrometria de massas.20,31,32 Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi propor modificaes no mtodo QuEChERS, utilizado, no caso, para a extrao de resduos de agrotxicos em cebola, empregando determinao por cromatografia lquida com fonte de ionizao por eletronebulizao acoplada espectrometria de massas sequencial (liquid chromatogtaphy tandem mass spectrometry with electrospray ionization, LC-ESI-MS/MS).

Otimizao e validao de mtodo empregando QuEChERS modificado 781Vol. 34, No. 5

PARTE EXPERIMENTAL

Escolha dos agrotxicos

Os agrotxicos foram selecionados a partir de entrevistas com produtores de cebola dos municpios de So Jos do Norte e Rio Grande, no estado do Rio Grande do Sul. Foram feitas perguntas a respeito dos agrotxicos mais empregados na cultura de cebola, poca de aplicao e a existncia de orientao para aplicao dos mesmos.

A partir dos dados obtidos, foi realizada uma pesquisa nas pginas eletrnicas da ANVISA e do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA)33,34 a fim de identificar quais das substncias mais empregadas so permitidas para a cultura de cebola e quais poderiam ser determinadas no laboratrio. Os agrotxicos selecio-nados para o trabalho foram dimetoato, metalaxil-M, tebuconazol, azoxistrobina e difenoconazol. A Figura 1S, material suplementar, apresenta as estruturas qumicas dos agrotxicos estudados. A classe, o grupo qumico, os limites mximos de resduos (LMR) e o intervalo de segurana para agrotxicos aplicados no cultivo da cebola, na regio de Rio Grande, assim como as propriedades fsico-qumicas de cada substncia so apresentados nas Tabelas 1S e 2S, material suplementar. O agrotxico dimetoato, apesar de no ter LMR esta-belecido para a cultura de cebola pela ANVISA, foi escolhido por ter o uso constantemente relatado nas entrevistas com os agricultores e, tambm, por sua elevada toxicidade.

Instrumentao

Foi utilizado um cromatgrafo a lquido Alliance Separations modelo 2695 Waters (Milford, MA, USA) equipado com amostrador automtico, bomba quaternria, sistema de desgaseificao e coluna analtica Waters XTerra MS C18 144 (50 3 mm, 3,5 m - Milford, MA, USA), acoplado ao espectrmetro de massas Micromass Quatro Micro API Waters, com fonte API, utilizando o modo de ionizao por eletronebulizao e sistema de aquisio de dados via software Masslynx 4.0 Waters.

Para o preparo das amostras de cebola, foi empregado um pro-cessador de alimentos, modelo Mega Master Plus RI 3170; Vrtex modelo Certomat MV-B Braun (Bioteck Internacional, Alemmar - Comercial e Industrial S.A.) e centrfuga de tubos microprocessada modelo Quimis Q222T (Quimis Aparelhos Cientficos).

Reagentes

Os padres analticos dos agrotxicos dimetoato (pureza 99,4%), metalaxil-M (pureza 99,0%), tebuconazol (pureza 99,6%), azoxistrobina (pureza 97%), difenoconazol (pureza 99%) foram obtidos da Sigma-Aldrich (So Paulo, Brasil). O cido frmico grau analtico (pureza 98%) foi adquirido da Merck (Dar-mstadt, Alemanha).

Acetonitrila, grau cromatogrfico, foi fornecida pela J.T. Baker (Mallinckrodt, Phillisburg, NJ, USA) e a gua foi purificada em sis-tema Direct-Q UV3 (resistividade 18,2 M cm, Millipore, USA). Sulfato de magnsio anidro e cloreto de sdio foram adquiridos da J.T. Baker; bondesil-PSA (40 m) foi obtido da Varian (Palo Alto, CA, USA).

Preparo das solues analticas

As solues analticas estoque, contendo 1000 mg L-1 de cada agrotxico foram preparadas pela dissoluo do padro slido em metanol, considerando-se o grau de pureza. As solues foram ar-mazenadas em frasco mbar e estocadas a -18 C.

A partir das solues estoque de 1000 mg L-1 foram preparadas solues estoque de concentraes de 100 mg L-1 de cada agrotxico em metanol. A soluo trabalho contendo a mistura dos analitos foi preparada na concentrao de 10 mg L-1; foram realizadas diluies para a otimizao dos parmetros de fragmentao, preparo das curvas analticas e nos ensaios da exatido. A soluo trabalho foi preparada mensalmente, enquanto as diluies utilizadas, diariamente.

Avaliao da vazo da fase mvel

A fase mvel empregada foi composta por gua ultrapura e acetonitrila, acidificadas com 0,1% de cido frmico, na proporo (52:48, v/v). As vazes da fase mvel testadas foram de 0,2; 0,3 e 0,4 mL min-1. Os solventes empregados na fase mvel foram filtrados a vcuo, atravs de membranas de nylon 0,45 m, e desgaseificados em banho de ultrassom durante 30 min, temperatura ambiente.

Otimizao dos parmetros de fragmentao

A otimizao dos parmetros de fragmentao foi realizada com vistas a selecionar as melhores condies de fragmentao dos ons na anlise por MS. Para tanto, foram realizadas infuses diretas no espectrmetro de massas com soluo analtica na concentrao de 1,0 mg L-1 de cada agrotxico estudado. Os parmetros variados foram: voltagem do cone, energia de coliso, temperatura da fonte, temperatura e vazo do gs de dessolvatao, voltagem do capilar e do cone extrator. A etapa de otimizao das condies de fragmentao foi determinante para selecionar os ons a serem monitorados para qualificao e quantificao dos agrotxicos estudados.

Otimizao do procedimento de extrao

Em 2008, um mtodo empregando QuEChERS modificado para determinao de agrotxicos em frutas e vegetais foi desenvolvido.32 Neste trabalho, foram realizadas modificaes no mtodo proposto, sendo realizados testes para avaliar a influncia da etapa de purificao e da adio de cloreto de sdio na exatido do mtodo.

Avaliao da influncia da etapa de purificao na exatido do mtodo

O procedimento foi realizado com a pesagem de 10,0 g de amos-tra processada em um tubo de polipropileno (capacidade 50,0 mL), seguida por etapa de fortificao no nvel de 1,0 mg kg-1, realizada atravs da adio de volume conhecido de soluo padro (100,0 L) amostra slida. Em seguida, 10,0 mL de acetonitrila foram adicio-nados, seguido por agitao manual (15 s) e agitao em vrtex (1 min). Aps, foram adicionados 4,0 g de sulfato de magnsio anidro e repetida a etapa de agitao; finalmente, o tubo foi centrifugado a 5000 rpm durante 3 min. Para o procedimento sem a etapa de puri-ficao, uma alquota do extrato foi retirada e 10,0 L injetados no sistema cromatogrfico.

Para o procedimento com etapa de purificao, 6,0 mL do extrato foram transferidos para um tubo de polipropileno (capacidade 15,0 mL), contendo 150,0 mg de amina primria-secundria (primary secondary amine, PSA) e 950,0 mg de MgSO4, seguido pelas etapas de agitao e centrifugao. Uma alquota do extrato final foi retirada e 10,0 L foram injetados no sistema cromatogrfico.

Avaliao da influncia de NaCl na extraoMtodos empregados em trabalhos prvios utilizam sais como

MgSO4 e NaCl. Assim, foram realizados testes comparando-se os resultados de recuperao, ao se empregar os dois sais ou apenas MgSO4.24,32 A adio de sais promove o efeito salting out, incremen-

Rodrigues et al.782 Quim. Nova

tando o nvel de recuperao para analitos mais polares e diminui a solubilidade dessas substncias na fase aquosa, bem como a quanti-dade de gua na fase orgnica.26

Para a realizao dos testes foram pesados 10,0 g de amostra em 6 tubos de polipropileno (capacidade 50,0 mL). Por sua vez, as amostras foram fortificadas no nvel de 1,0 mg kg-1 e foram adicionados 10,0 mL de acetonitrila em cada tubo; em 3 tubos foram adicionados 4,0 g de MgSO4 e 1,0 g de NaCl e, nas trs amostras restantes, foram adicionados apenas 4,0 g MgSO4. O restante do procedimento foi realizado sem a etapa de purificao.

Avaliao do efeito de matriz (EM)Para avaliar o EM, foram injetadas no sistema cromatogrfico

uma soluo padro com a mistura dos agrotxicos, na concentrao de 1,0 mg L-1, diluda no extrato branco da matriz (extrado pelo mtodo proposto) e uma outra soluo padro com a mistura dos agrotxicos diluda com metanol. O clculo do EM (%) foi baseado na bibliografia.35

Validao do mtodo

O mtodo foi validado, avaliando-se os seguintes itens: curva analtica, linearidade, limite de deteco (limit of detection, LOD), limite de quantificao (limit of quantification, LOQ), exatido (recuperao) e preciso (repetibilidade e preciso intermediria), parmetros sugeridos pelo Instituto Nacional de Metrologia, Nor-malizao e Qualidade Industrial (INMETRO) e pela ANVISA.36,37

Curva analtica e linearidadeA linearidade do instrumento e do mtodo foi avaliada pelas

curvas analticas atravs de padronizao externa no solvente e por superposio da matriz com solues analticas nas concentraes de 0,0005; 0,005; 0,05; 0,5 e 1,0 mg L-1.

Para padronizao externa por superposio da matriz, foram preparadas solues analticas atravs de diluies da soluo pa-dro de trabalho com o extrato da matriz. Os procedimentos foram realizados com a matriz isenta de agrotxicos e a padronizao externa no solvente foi estabelecida por diluies da soluo padro de trabalho com metanol.

Cada soluo foi injetada trs vezes e os dados de regresso linear foram obtidos com auxlio do software do equipamento.

Limites de deteco e quantificaoOs limites de deteco (LODm) e quantificao (LOQm) do m-

todo foram obtidos pela injeo de solues analticas de diferentes concentraes, preparadas atravs de diluies da soluo padro de trabalho no extrato da matriz. O LODm e o LOQm para cada agrot-xico foram estimados a partir da relao sinal/rudo, calculada pelo software do equipamento, considerando, no mnimo, 3 e 10 vezes a razo do sinal pela linha de base (rudo), respectivamente.

ExatidoA exatido do mtodo foi avaliada em funo dos ensaios de

recuperao, de acordo com as determinaes da ANVISA e do International Conference Harmonisation.38 Amostras de cebola (isentas de agrotxicos) foram fortificadas nos nveis de 0,0005; 0,005; 0,05 e 1,0 mg kg-1, a partir da adio de um volume conhe-cido de soluo padro de trabalho com a mistura dos agrotxicos a 10,0 g de amostra.

PrecisoA preciso instrumental foi avaliada a partir de injees sucessivas

de soluo analtica padro, com a mistura dos agrotxicos (n=7),

e estimada atravs do coeficiente de variao (CV) com relao mdia das reas de todas as injees.

A preciso do mtodo foi avaliada em funo da repetibilidade e da preciso intermediria. Para o estudo da repetibilidade, foi reali-zada a extrao da amostra fortificada com soluo analtica padro e com a mistura dos agrotxicos em diferentes nveis de fortificao, em triplicata; cada nvel foi injetado trs vezes. A partir das 9 de-terminaes, foi calculado o CV(%).38 A preciso intermediria foi avaliada, assim como a repetibilidade, porm em diferentes dias e com diferentes analistas.

RESULTADOS E DISCUSSO

Avaliao da vazo da fase mvel

A melhor composio de fase mvel foi a mistura de acetonitrila e gua ultrapura, acidificadas com 0,1% de cido frmico, na propor-o de (52:48, v/v) e vazo de 0,4 mL min-1. Um cromatograma para a separao apresentado na Figura 1. A acidificao permite que haja prtons suficientes na soluo para que principalmente a espcie protonada esteja na soluo, dissolvida na fase mvel, consequncia (do controle) da distribuio de espcies. O pH menor proporciona maior interao entre as substncias e a fase estacionria, mais apolar, aumenta a reteno da substncia. Alm disso, a acidificao da fase mvel tambm auxilia na ionizao dos analitos.39,40

Ao se empregar a espectrometria de massas em srie, atravs do modo de aquisio de monitoramento de reaes mltiplas (MRM), possvel quantificar compostos que coeluem atravs do monitora-mento das transies on precursor on produto de cada substncia. Assim, LC-MS/MS assegura a identificao com maior exatido do que quando ela feita apenas com base nas caractersticas de reten-o das substncias analisadas, como ocorre nas outras tcnicas de deteco cromatogrficas.41 Entretanto, a separao cromatogrfica importante para assegurar a eficincia da ionizao dos analitos, diminuindo possveis efeitos de matriz.35

Parmetros de fragmentao otimizados

Foi utilizada a interface ESI, a mais indicada para substncias neutras ou polares, que podem ser protononadas ou deprotonadas em condies apropriadas de pH.42

As melhores condies para a fragmentao dos ons monito-rados, obtidas com infuses diretas no espectrmetro de massas na vazo de 10,0 L min-1, foram: temperatura de 100 C na fonte; temperatura do gs N2 (gs de dessolvatao) de 350 C, mantida a uma vazo para a dessolvatao da amostra de 350 L h-1 e para o cone de seleo dos ons 50 L h-1; a energia do capilar foi 4 kV e no segundo cone, o extrator foi 3 V.

Na Tabela 1 so apresentadas as transies monitoradas no modo

Figura 1. Cromatogramas de ons totais dos agrotxicos estudados em soluo (1,0 mg L-1)

.

Dimetoato (1,00 min), metalaxil-M (1,49 min), azoxistrobina (2,56 min), tebuconazol (2,85 min) e difenoconazol (5,20 min)

Otimizao e validao de mtodo empregando QuEChERS modificado 783Vol. 34, No. 5

ESI (+), modo de aquisio MRM, energia de coliso, voltagem do cone e tempo de reteno dos agrotxicos estudados.

Para cada analito foram selecionadas duas transies caracters-ticas, o que possibilitado por um analisador de massas sequencial (tandem). A transio mais intensa (mais estvel) foi escolhida para quantificao, enquanto a segunda, para confirmao.

Procedimento de extrao

Avaliao da influncia da etapa de purificao na exatido do mtodo

De acordo com os resultados de recuperao (R%) apresentados na Figura 2, possvel verificar que os valores de recuperao foram similares para a maioria dos agrotxicos estudados com e sem a etapa de purificao. Para o primeiro caso, recuperaes na faixa de 86,7 e 108,9% foram obtidas e, no segundo, as recuperaes ficaram na faixa de 85,4 e 107,1%. Considerando que as possveis interferncias da matriz so compensadas pelo emprego de padronizao externa por superposio da mesma, neste trabalho foi estabelecido o desen-volvimento do processo sem a etapa de purificao, a fim de tornar o procedimento de preparo da amostra ainda mais rpido e diminuir o consumo de reagentes.

Influncia de NaCl na extraoNa Figura 3 so apresentados os resultados de recuperao, os

quais indicam que a adio de cloreto de sdio em combinao ao

sulfato de magnsio, conforme empregado em trabalhos prvios, gera valores de recuperao maiores para a maioria das substncias quando comparados aos da adio de apenas MgSO4.24,32

Entretanto, para dimetoato, o valor de recuperao est acima de 150%, o que no aceitvel para a determinao de compostos traos em matrizes complexas e, alm disso, MgSO4, quando empregado sozinho, suficiente para gerar resultados de recuperao entre 70 e 120% para todos os analitos.

O valor elevado de recuperao para dimetoato pode ser explica-do pelo fato de que o sal, alm de favorecer a extrao dos analitos, tambm aumenta a coextrao de componentes da matriz, o que pode ter favorecido o enriquecimento do sinal. Assim, somente MgSO4 foi adicionado aos extratos, por possuir alta capacidade de remover gua, quando comparado a outros sais.24

Efeito matriz No mtodo proposto foi constatado efeito matriz para o agrotxico

dimetoato. Essa influncia se deve provavelmente quantidade de inter-ferentes presentes na amostra, ocasionando interferncia na ionizao dos analitos. Devido s interferncias dos componentes da matriz no processo de ionizao, a quantificao dos agrotxicos foi realizada atravs de superposio da matriz. Na Figura 4, alm do EM%, so apresentados resultados das recuperaes dos agrotxicos em diferentes formas de quantificao. Quando a recuperao avaliada por compa-rao com as curvas no solvente, os valores variam de 49,0 a 105,0%

Tabela 1. Condies de fragmentao para determinao dos agrotxicos por LC-ESI-MS/MS

Agrotxicos MRM transio (m/z) Energia de coliso (eV) Voltagem do cone (V) tR (min)

Dimetoato 230>125230>199QuantificaoQualificao

2010

1620 1,00

Metalaxil-M 280>220280>192QuantificaoQualificao

1717

1616 1,49

Tebuconazol 308>70308>125QuantificaoQualificao

2022

4028 2,85

Azoxistrobina 404>372404>329QuantificaoQualificao

2030

2015 2,56

Difenoconazol 406>251406>337QuantificaoQualificao

3120

3132 5,20

Dwell Time (tempo de janela): 0,3 s

Figura 2. Comparao entre o mtodo QuEChERS modificado, no nvel de 1,0 mg kg-1, com e sem emprego da etapa de purificao. As barras de erro significam CV(%) (n=9)

Figura 3. Valores de recuperao (%) para os agrotxicos em relao aos sais adicionados no processo de extrao. As barras de erro significam CV(%) (n=9)

Rodrigues et al.784 Quim. Nova

com CV de 0,6 a 3,6% e, quando avaliada por meio da comparao por superposio na matriz, os valores para recuperao variaram de 89,6 a 114,1% com CV de 0,2 a 1,4%. O EM% variou de 28,0 a 100,0% com CV de 0,8 a 2,3%, comprovando, assim, a necessidade de quantificao dos agrotxicos atravs de superposio da matriz.

Procedimento de extrao otimizadoNa Tabela 2 so apresentadas as condies otimizadas para o

mtodo QuEChERS modificado, proposto no presente trabalho com relao a outros mtodos, empregando QuEChERS, propostas em trabalhos anteriores.24,32 De acordo com os dados apresentados, possvel observar a diferena entre os mtodos e afirmar que o pro-posto neste trabalho utiliza menor quantidade de reagentes e apresenta maior rapidez no procedimento de extrao.

Validao do mtodo

Curva analtica e linearidadeAtravs dos dados obtidos para a construo das curvas analti-

cas e anlise das equaes das retas no LC-ESI-MS/MS, possvel concluir que o modelo de regresso linear adequado para as deter-minaes analticas em estudo. De acordo com a Tabela 3, os coefi-cientes de correlao (r) foram maiores que 0,99, estando de acordo com as orientaes da ANVISA e do INMETRO, que recomendam, respectivamente, r 0,99 e r 0,90. 36,37

Limites de deteco e de quantificao Os LODm e LOQm dos mtodos foram de 0,016 e 0,05 mg kg-1

para o dimetoato; de 0,0016 e 0,005 mg kg-1 para o metalaxil-M e de 0,00016 e 0,0005 mg kg-1 para difenoconazol, azoxistrobina e tebuconazol.

Os limites de quantificao do mtodo alcanaram valores menores que os limites mximos de resduos estabelecidos pela ANVISA, para metalaxil-M, tebuconazol, azoxistrobina e difeno-conazol. No que se refere ao agrotxico dimetoato, no h LMR estabelecido para a cultura de cebola, por no ser indicado para aplicao na mesma.

Exatido Os processos mais utilizados para avaliar a exatido de um

mtodo analtico so: materiais de referncia, comparao de m-todos, ensaios de recuperao e adio de padro. Neste trabalho a exatido foi avaliada por ensaios de recuperao.38 Para os ensaios de recuperao, diferentes nveis de concentrao do analito foram empregados, visto que a eficincia do mtodo pode variar em funo da quantidade da substncia adicionada.

A literatura sobre validao de mtodos cromatogrficos indica que os intervalos de recuperao aceitveis para a determinao de re-sduos devem estar entre 70 e 120%, com preciso de at 20%.38,40,43 Os valores de recuperao e de CV(%) so apresentados na Tabela 4. Os valores de recuperao variaram de 65,2 a 120,0%, com CV variando entre 3,3 e 20,0% para a repetibilidade e de 61,8 a 116,7%, com CV variando entre 2,0 e 20,0% para preciso intermediria em todos os nveis de fortificao.

PrecisoA preciso instrumental foi avaliada a partir de injees

sucessivas de soluo analtica padro na concentrao de 0,05 mg L-1 (n=7). Os valores de CV(%) das reas de todas as

Figura 4. Comparao entre as recuperaes dos agrotxicos por QuE-ChERS, nvel de fortificao 1,0 mg kg-1, empregando diferentes formas de quantificao e efeito matriz para todos os agrotxicos. As barras de erro significam CV(%) (n=9)

Tabela 2. Comparao entre o mtodo QuEChERS original, o mtodo de Lesueur e o mtodo proposto

QuEChERS Original24 Modificado32 Este estudoAmostra 10,0 g 10,0 g 10,0 gAcetonitrila 10,0 mL 10,0 mL 10,0 mLAgitao 60 s 60 s 60 sMgSO4 4,0 g 4,0 g 4,0 gNaCl 1,0 g 1,0 g _Citrato de sdio _ 1,0 g _Hidrogenocitrato de sdio _ 0,5 g _Agitao 60 s 60 s 60 sPadro interno tirfenilfosfato Trifenilfosfato _Agitao 30 s _ _

Centrifugao 5 min5000 rpm3 min

5000 rpm3 min

5000 rpmAlquota do extrato 1,0 mL 6,0 mL _PSA 25,0 mg 150,0 mg _MgSO4 150,0 mg 950,0 mg _

Centrifugao 1 min6000 rpm3 min

5000 rpm _

Determinao GC/MS HPLC/MSGC/MS LC-MS/MS

Tabela 3. Resultados para as curvas analticas e linearidade

Agrotxicos Curva analtica no solvente r Curva analtica na matriz r

Dimetoato y= 29306,7 x + 12,247 0,998 y= 7951,9 x + 3,59037 0,997

Metalaxil-M y= 106839 x + 49,0445 0,993 y= 43794,5 x - 9,50831 0,998

Tebuconazol y= 174947 x + 68,5335 0,999 y= 159082 x + 409,68 0,996

Azoxistrobina y= 218045 x + 223,502 0,991 y= 124042 x + 19,2466 0,999

Difenoconazol y= 130623 x + 17,9105 0,999 y= 124487 x + 183,681 0,997

Otimizao e validao de mtodo empregando QuEChERS modificado 785Vol. 34, No. 5

injees foram: 10,5% para dimetoato; 6,7% para matelaxil-M; 7,8% para tebuconazol; 6,4% para azoxistrobina e 5,3% para difenoconazol.

A preciso do mtodo foi avaliada em funo da repetibilidade e da preciso intermediria, estimadas de acordo com as reco-mendaes da ANVISA.37 Os valores de CV(%) para os estudos de repetibilidade (CVr) e preciso intermediria (CVpi) ficaram na faixa de 3,3-20,0% e 2,0-20,0%, respectivamente. Os valores mais detalhados de CVr e CVpi so apresentados, juntamente com os resultados de recuperao, na Tabela 4.

Para o dimetoato, os valores de CVr e CVpi foram estimados a partir de dois nveis de concentrao. Isso porque o referido agrotxico apresentou menor sensibilidade no sistema LC-ESI-MS/MS, relacionado s outras substncias. A preciso do mtodo foi avaliada em quatro nveis de fortificao. Os valores de CV para a repetibilidade e preciso intermediria, alm de menores que 20%, ficaram muito prximos, indicando a adequada preciso do mtodo.38

Aplicao do mtodo

O mtodo empregando QuEChERS modificado e LC-ESI-MS/MS, aps ser validado, foi aplicado para determinao de resduos dos agrotxicos dimetoato, metalaxil-M, tebuconazol, azoxistro-bina e difenoconazol. As amostras de cebola foram coletadas em um supermercado e em uma propriedade rural na regio e resduos de agrotxicos no foram encontrados.

CONCLUSES

Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que o mtodo empregando QuEChERS modificado e LC-ESI-MS/MS para a determinao dos agrotxicos dimetoato, metalaxil-M, tebuconazol, azoxistrobina e difenoconazol em cebola eficiente, rpido, preciso e exato.

O mtodo QuEChERS modificado foi robusto e altamente re-produtvel, uma vez que elevadas recuperaes foram alcanadas. Alm disso, o procedimento de extrao extremamente rpido e no necessita emprego da etapa de purificao dos extratos de cebola.

Entretanto, os componentes da matriz afetaram a eficincia da ionizao de alguns analitos por LC-ESI-MS/MS e a influncia do efeito matriz para dimetoato, metalaxil-M e azoxitrobina definiu o modo de quantificao dos analitos por calibrao externa, atravs da superposio da matriz.

As condies cromatogrficas e os parmetros de fragmentao otimizados para determinao por LC-ESI-MS/MS permitiram a identificao e a quantificao dos agrotxicos em estudo, em um tempo de anlise menor que 6 min.

As curvas analticas apresentaram valores de r maiores que 0,99 para as faixas de concentrao necessrias s aplicaes. Os valores mdios de recuperao obtidos em diferentes nveis de fortificao estiveram na faixa de 61,8 a 120,0%, com valores de CV(%) menores que 20%. Os limites de quantificao do mtodo variaram na faixa de 0,0005 a 0,05 mg kg-1.

O limite de quantificao do mtodo para todos os analitos foi menor que os limites mximos de resduos definidos pela legisla-o brasileira, ANVISA, para tais agrotxicos em cebola. O fato de suma importncia, uma vez que o Brasil, em 2008, assumiu a liderana mundial no consumo de agrotxicos, segundo dados do SINDAG; em funo disso, no mesmo ano, o PARA incluiu a cebola em seu programa de monitoramento.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Est disponvel em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre. A Tabela 1S apresenta a classe, o grupo qumico, os LMR e o intervalo de segurana para agro-txicos aplicados no cultivo da cebola, na regio de Rio Grande. A Tabela 2S apresenta constante de acidez (pKa), coeficiente de partio octanol/gua (Kow), solubilidade em gua e presso de vapor de cada substncia para agrotxicos em estudo e a Figura 1S, as estruturas qumicas dos agrotxicos estudados.

REFERNCIAS

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Tabela 4. Recuperao, CVr e CVpi para os agrotxicos em amostras de cebola fortificadas em diferentes nveis

Agrotxico Nvel de fortificao(mg kg-1)

Recuperao (%)

CVr(%)

Recuperao (%)

CVpi(%)

Dimetoato 0,00050,0050,051,0

-

-

92,385,3

-

-

6,97,3

-

-

116,7111,3

-

-

7,74,2

Metalaxil-M 0,00050,0050,051,0

-

97,681,4107,1

-

19,46,49,7

-

93,896,393,0

-

16,47,34,0

Tebuconazol 0,00050,0050,051,0

107,086,198,7100,1

7,29,03,67,9

96,861,8103,8110,3

8,514,32,72,0

Azoxistrobina 0,00050,0050,051,0

65,2109,887,491,8

20,010,49,011,0

86,783,390,789,6

20,06,33,83,7

Difenoconazol 0,00050,0050,051,0

115,2120,0104,1105,3

12,711,13,39,8

108,275,4108,5114,1

17,611,44,13,7

Rodrigues et al.786 Quim. Nova

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Mat

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l Su

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r

Quim. Nova, Vol. 34, No. 5, S1-S2, 2011

*e-mail: eprimelfurg@gmail.com

OTIMIZAO E VALIDAO DE MTODO EMPREGANDO QUECHERS MODIFICADO E LC-ESI-MS/MS PARA DETERMINAO DE AGROTXICOS EM CEBOLA

Sherol Acosta Rodrigues, Sergiane Souza Caldas, Eliana Badiale Furlong e Ednei Gilberto Primel*Escola de Qumica e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, 96201-900 Rio Grande RS, BrasilRenato ZanellaDepartamento de Qumica, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria RS, Brasil

Tabela 1S. Classe, grupo qumico, limites mximos de resduos (LMR) e intervalo de segurana para agrotxicos aplicados no cultivo da cebola, na regio de Rio Grande

Agrotxico Classe Grupo qumico LMR(mg kg-1) CODEXLMR

(mg kg-1) ANVISAIntervalo de segurana

(dias)azoxistrobina fungicida estrobilurina - 0,05 2

bentazona herbicida benzotiadiazinona - - -

captana fungicida diocarboximida - 10,0 7

deltametrina inseticida/formicida piretroide - 0,03 2

dimetoato inseticida organofosforado - - -

difenoconazol fungicida triazol - 0,1 7

glifosato herbicida glicina substituda - - -

iprodiona fungicida dicarboximida 0,2 1,0 14

linurom herbicida ureia - 0,2 60

mancozebe fungicida/acaricida ditiocarbamato - 0,2 7

metalaxil-M fungicida fenilamida - 0,5 7

pendimetalina herbicida dinitroanilina - 0,1 1

propinebe fungicida ditiocarbamato 0,5 1,0 7

tebuconazol fungicida triazol - 0,1 14

trifluralina herbicida dinitroanilina - 0,05 1

2,4-D herbicida cido fenoxiactico - - -

Rodrigues et al.S2 Quim. Nova

Tabela 2S. Propriedades fsico-qumicas dos agrotxicos selecionados para estudo1,2

Agrotxico pka log Kow Solubilidade em gua (g L-1) Presso de vapor (mPa)dimetoato 2,0 0,7 23,3 0,25 (25 C) metalaxil-m 1,4 1,7 26,0 3,3 (25 C) tebuconazol - 3,7 0,036 1,7 10

-3 (20 C)

azoxistrobina -0,67 2,5 0,06 1,1 10-7 (20 C)

difenoconazol 3,0 1,1 0,015 3,3 10-5 (25 C)

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Figura 1S. Estruturas qumicas dos agrotxicos estudados

ClCH2

H2C C C(CH3)

OH

H2CN

N

N

H3C CH3N

CHCO2CH3CH3OCH2COH3C

Cl

O Cl

O

O

CH3H2CN

NN

O

NN

OCH3O CO2CH3

SP(OCH3)2

CH3NHCOCH2S

CN

DIMETOATO

TEBUCONAZOL METALAXIL-M

AZOXISTROBINA DIFENOCONAZOL