1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma...
-
Upload
lucas-camarinho-castanho -
Category
Documents
-
view
221 -
download
2
Transcript of 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma...
![Page 1: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/1.jpg)
11
Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano naParede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e
análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos nas Reações de Reciclagem de Grupos Metil durante a
Doença Vassoura-de-Bruxa
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira
Co-orientadora: Dra. Maria Carolina Sacatolin do Rio
Aluno: Gleidson Silva Teixeira
![Page 2: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/2.jpg)
22
Tópicos da Apresentação
• Introdução– A Vassoura-de-bruxa– Parede celular primária– Homogalacturonano (HGA)– Reciclagem de metil via SAM (S-adenosil-L-metionina)
• Objetivos• Metodologia• Resultados preliminares• Próximos passos
![Page 3: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/3.jpg)
33
Introdução
• A Vassoura-de-Bruxa• Agente etiológico: Moniliophthora perniciosa• Evolução e sintomas da doença
![Page 4: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/4.jpg)
44
• Implicações no desenvolvimento vegetal• Defesa contra a invasão por microrganismos
IntroduçãoParede celular primária
Zeiger, T. Plant Physiology 3ed 2005.
![Page 5: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/5.jpg)
55
Domínios pécticos
Willats, WGT et al. Plant Molecular Biology 2001a.
(1→2)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-D-galacturonic acid
(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução
![Page 6: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/6.jpg)
66
Homogalacturonano (HGA)
Ridley, BL et al. Phytochemistry 2001.
1
4
6
6
3
2
(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução
![Page 7: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/7.jpg)
77
Homogalacturonano (HGA)Introdução
Willats, WGT et al. Planta 2001b.
• Ocorrência de GalA não metilado na superfície de células epidermais e radícula
• Regiões de-metiladas restritas a junções celulares
![Page 8: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/8.jpg)
88
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
Índice de metil SAM:SAH
![Page 9: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/9.jpg)
99
IntroduçãoAlterações na atividade de HGA-MT
Mouille, G et al., The Plant Journal 2007.
PAM1Qua2
Krupková, E et al., The Plant Journal 2007.
TSD2
![Page 10: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/10.jpg)
1010
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
(-)
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
![Page 11: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/11.jpg)
1111
Alterações na atividade de SAHH Introdução
![Page 12: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/12.jpg)
1212
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
(-)(-)
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
![Page 13: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/13.jpg)
1313
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
IntroduçãoAlterações na atividade de ADK
![Page 14: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/14.jpg)
1414
Introdução
Pereira, LAR et al., Planta 2006b.
Alterações na atividade de ADK
(10% ADK activity)
LM7
![Page 15: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/15.jpg)
1515
IntroduçãoAlterações na atividade de SAMS
• Aumento da atividade de SAMS• Acúmulo de SAM e SAH
SAMS
![Page 16: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/16.jpg)
1616
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
?
![Page 17: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/17.jpg)
1717
SAM com precursor de etileno Introdução
Scarpari, LM et al. J Exp Bot 2005.
![Page 18: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/18.jpg)
1818
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
![Page 19: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/19.jpg)
1919
Lionett, V et al., Plant Physiology 2007.
Alterações na atividade de PMEs Introdução
![Page 20: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/20.jpg)
2020
• Caracterização do domínio péctico HGA;
• Análise da expressão de genes envolvidos nas reações de reciclagem de metil via SAM
Objetivos do projeto
![Page 21: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/21.jpg)
2121
MetodologiaExperimento em
casa de vegetação
Hibridização in situ Imunolocalização
Fixação em Karnovsky Escolha dos epítopos
Desidratação e inclusão
Microtomia emontagem
Escolha das lâminas
Definição dosanticorpos primários
Síntese de anticorpossecundários
FotografiaFotografia
Interpretação dosresultados
Desidratação e Inclusão
Microtomia emontagem
Escolha das lâminas
Síntese de cDNA eamplificação
Clonagem eseqüenciamento
Linearização e transcrição in vitro
Escolha dos genes esíntese de primers Fixação em FAA
Extração de RNA
![Page 22: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/22.jpg)
2222
ACC
SAM Synthase
demethylesterificationPME
QUA1 e QUA2
ACC Oxidase
JIM5 – JIM7
PAM1
Resultados preliminares
![Page 23: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/23.jpg)
2323
28S rRNA
18S rRNA
T. c
acao
T. c
acao
M. m
uscu
lus
• Extração de RNA
Resultados preliminares
![Page 24: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/24.jpg)
2424
Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 50bp
200bp
Resultados preliminares
• Síntese de cDNA e amplificação por PCR
![Page 25: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/25.jpg)
2525
• Clonagem
Resultados preliminares
200bp
50bp PME 50bp ADK ADK
200bp
50bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox
200bp
200bp
![Page 26: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/26.jpg)
2626
• Seqüenciamento
100bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox
400bp
Resultados preliminares
M13 F 2949
M13 R 197
![Page 27: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/27.jpg)
2727
ER-Sp6 T7 (F) ER-T7 Sp6 (R) F B1 +R B4 -F C2 +R C4 -F D2 -R D4 +F E3 -R E4 +F F1 +R F4 -F G2 -R G4 +F A2 -R A5 +F x +R H4 -
SAMS
CaffMT
Accox
Qua1
Qua2
PME
SAHH
6
7
8
1
2
3
4
Linearização/TranscriçãoAmostra Frame (BLASTx)
Linearização/Transcrição
Nco I
Nco I
ASSal I
S AS
S AS
AS S
AS S
Nco I
Apa I
GENE
Sal I
Sal I
Sal I
Sal I
5 ADK
Sal I
Nco I
S
S
Nco I
Sal I AS Nco I
Sal I
AS
AS S
Nco I
S
Resultados preliminares
![Page 28: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/28.jpg)
2828
λ hi
nd II
I
4361bp
2322bp
Não
dig
.
S (A
paI)
AS
(Sal
I)
~ 3233bp
Resultados preliminares
• Linearização do plasmídeo
λ hi
nd II
IS
AH
H N
ão d
ig.
SA
HH
AS
(Apa
I)
AD
K S
(Sal
I)
AD
K N
ão d
ig.
4361bp
2322bp
~ 3237bp ~ 3233bp
![Page 29: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/29.jpg)
2929
Próximas etapas
• Transcrição in vitro (síntese da sonda)• Confecção das lâminas para a hibridização• Hibridização in situ• Real-Time PCR ou PCR semi-quantitativo• Confecção das lâminas para a imunolocalização• Imunolocalização
![Page 30: 1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau ( Theobroma cacao L. ) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes.](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062316/5706386d1a28abb823905ea6/html5/thumbnails/30.jpg)
3030
Próximas etapas
Digoxigenin
BCIP/NBT