ROTEIRO DAS PRATICAS

DE BROMATOLOGIA

Profa Dra Roseane Fett 2006

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Composição Centesimal O valor energético de um alimento pode ser determinado pela energia química obtida de seus constituintes orgânicos, lipídios, proteínas e carboidratos, juntamente com a energia fornecida pelos constituintes em menor quantidade como os ácidos orgânicos. A determinação experimental da energia envolve um ou dois procedimentos, o uso de bomba calorimétrica ou do cálculo de energia que fornece resultados aproximados. A bomba calorimétrica envolve a ignição do alimento em containeres de metal, sob alta pressão de oxigênio (usualmente cerca de 25 atmosferas). O resultado é a oxidação dos constituintes orgânicos resultando em água e dióxido de carbono juntamente com óxidos, nitrogênio, sulfurosos e fosforosos e conseqüente liberação da energia e do calor. Este calor é absorvido pela água contida na bomba e resulta em um aumento na temperatura da água o qual permite estimar o valor da energia do alimento. Embora a bomba calorimétrica seja uma técnica segura, simples e precisa, a matéria-prima original da qual foi feita a medida de energia no alimento pode não corresponder a mesma no organismo humano. Muitos constituintes da fibra dietética, por exemplo, não digeridos no sistema digestivo humano, alimentos com alto teor em fibras, a bomba calorimétrica pode superestimar o verdadeiro valor energético do alimento. Enquanto que constituintes não fibrosos, normalmente considerados digeríveis, podem não ser totalmente digeridos e absorvidos pelo organismo humano. O verdadeiro valor energético de um alimento pode ser medido pelo valor calórico (energia total) de um alimento, menos as ocorrências como: digestão incompleta; absorção incompleta; valor energético da fibra no alimento; efeito da fibra apressando o transporte e excreção de gorduras e proteínas, reduzindo a quantidade de energia derivada deste. Em conseqüência disto, em muitos países, a bomba calorimétrica não é o método de escolha para determinar o conteúdo de energia do alimento. Em lugar deste, o valor energético do alimento é determinado pelo cálculo aproximado das análises individuais de cada constituinte presente. O valor energético (valor calórico) de um alimento é dado por: Valor calórico (kj/100g) = [(% carboidratos x17) + (% proteína x17) + (% de gordura x 37)] ou kcal/100g = [( % carboidratos x 4) + ( % de proteína x 4) + (% de gordura x 9)]. O termo valor calórico é derivado do uso de calorias como a unidade original de energia. Sendo assim, 1 caloria eqüivale a 4,1833 joules, e o valor calórico em calorias por kg pode ser obtido pela aplicação deste fator de conversão. É usado também no estudo dos alimentos como uma unidade alternativa do valor calórico. Isto é equivalente a 1000 calorias. A composição centesimal de um alimento exprime de forma básica o valor nutritivo ou valor calórico, bem como a proporção de componentes em que aparecem, em 100g de produto considerado, os grupos homogêneos de substâncias do alimento. Composição química ou composição centesimal de

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um alimento são conhecidas através de análises químicas de determinação: Umidade e voláteis a 105°C; Cinza ou resíduo mineral fixo; Lipídios (extrato etéreo); Protídeos (N x fator de correção); Fibra alimentar; Glicídios ou “Nifext”, quando determinado por diferença. Então o valor calórico (Kcal em 100 g) é a soma de: Onde P = conteúdo de proteínas (%); L= conteúdo de lipídios (%); C= conteúdo de carboidratos (%) . Tabela 1. Relação dos fatores de conversão dos principais componentes de um alimento.

Componentes Fator de

conversão (kcal/g)

Fator de convenção (kj/g)

Lipídios 9,0 37,65 Proteínas 4,0 16,73

Carboidratos (exceto polióis) 4,0 16,73 Ácidos orgânicos 3,0 12,55

Polidextrose 1,0 4,18 Polióis 2,4 10,04

Álcool (etanol) 7,0 29,28 *1 caloria equivale a 4,1833 joules.

VALOR CALORICO

O valor energético (valor calórico) de um alimento é dado por

Valor calórico (kj/100g) = [(% carboidratos x17) + (% proteína x17) + (% de

gordura x 37)]

O termo valor calórico é derivado do uso de calorias como a unidade original de energia. Sendo assim, 1 caloria eqüivale a 4,2 joules, e o valor calórico em calorias por kg pode ser obtido pela aplicação deste fator de conversão. É usado também no estudo dos alimentos como uma unidade alternativa do valor calórico. Isto é equivalente a 1000 calorias.

Então o valor calórico (Kcal em 100 g) é a soma de: P x 4,0 + L x 9,0 + C x 4,0

Onde P = Conteúdo de proteínas (%); L= Conteúdo de lipídios (%); C= Conteúdo de carboidratos (%).

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UMIDADE Considera-se geralmente como umidade, a água presente em um

alimento. Esta água apresenta-se de duas maneiras. a) Umidade de superfície: é a água presente na superfície externa, como por exemplo, no grão de trigo. Esta umidade é facilmente evaporada. b) Umidade absorvida: é a água encontrada no interior de certos alimentos ou produtos alimentícios, sem, no entanto combinar-se quimicamente com os mesmos. Esta umidade muitas vezes está concluída, tornando sua evaporação mais difícil. Neste caso, o material a ser submetido a eliminação de água por evaporação, deve ser reduzido a partículas pequenas para possibilitar a sua liberação. Na manteiga, margarina e produtos similares, a água separar-se à temperatura de 130° C sob forma de pequenas partículas, as quais tão logo sejam liberadas, evaporam violentamente espalhando a gordura em todos os sentidos. Para prevenir essas perdas durante a determinação, costuma-se usar um recipiente padrão (béquer para manteiga) cuja principal característica é apresentar as paredes bastante altas. Não falaremos da água de cristalização de determinadas substâncias químicas, pois ela se encontra comumente nos alimentos. TÉCNICA GRAVIMÉTRICA COM O EMPREGO DE CALOR Este método está baseado na determinação de perda de peso do produto submetido ao aquecimento. a) Método gravimétrico a 105°C Este método está baseado na determinação da perda de peso, do produto submetido ao aquecimento. É o método mais usado. A maioria dos métodos mais usados habitualmente implicam a desidratação da amostra, até peso constante, sob determinada temperatura e pressão.

Material : estufa de secagem a 105 ± 3°C, cápsula de alumínio ou borosilicato. Procedimento: pesar de 5-10 gramas do produto ou amostra média em cápsula previamente submetida a temperatura de 105ºC e pesada, levar à estufa por 5 horas, ou manter o material até que a diferença entre pesagens não seja superior a 0,01g. Cálculo: Relacione a perda de peso por 100 gramas da amostra.

umidade % m/m = P - p x 100 P

onde: P = massa em g da amostra. p = massa em g da amostra seca.

.

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TÉCNICA GRAVIMÉTRICA SEM O EMPREGO DO CALOR Este método é utilizado quando se deseja preservar princípios termolábeis, e em casos especiais, como o dos alimentos muito açucarados, que tendem a se caramelizar.

b)Método gravimétrico a frio. Indicado para alimentos que não podem ser submetidos ao aquecimento térmico (105°C), como no caso de alimentos muito açucarados, pois, caramelizam-se. Material: dessecador + ácido sulfúrico, cápsula de alumínio ou porcelana, bomba de vácuo, balança analítica. Procedimento: pesar exatamente cerca de 2-5 gramas da amostra a ser analisada, colocar no interior de um dessecador no qual foi previamente adicionado ácido sulfúrico. Promover o vácuo. Realizar movimentos no dessecador nas primeiras 12 horas. Após 24 horas, abra o material. Repetir a operação até que a diferença entre pesagens não seja superior a 0,01g. Cálculo idêntico, a técnica anterior.

RESÍDUO SECO Nos produtos líquidos ou de alto teor de umidade, é mais usado considerar o resíduo seco (sólido totais) obtido, para a avaliação dos sólidos existentes no produto. Material Pipeta de 10 ml, cápsula de platina de 50 ml, estufa a 105° C, dessecador com ácido sulfúrico. Procedimento a) Transfira com auxílio de uma pipeta 10 ml de amostra, se a mesma for líquida, ou pese 10 g se amostra for sólida, para uma cápsula de platina de 50 ml, previamente aquecida a 105° C por 2 horas, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Esfrie em dessecador com ácido sulfúrico até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento (30 minutos) e resfriamento, até peso constante Cálculo

100 x N = resíduo seco por cento p/v (ou p/p no caso de amostra sólida).

A N = n.º de g de resíduo seco A = n.º de ml da amostra (ou n.º de gramas de amostra ou mL) b) Subtraia de 100 g de amostra o número de g de “umidade por cento”. Considere a diferença como o n.º de g do “resíduo seco por cento”

Cálculo

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100 – A = resíduo seco por cento p/p A = n.º de g de umidade por cento RESÍDUO MINERAL FIXO (CINZAS)

A fração “cinzas” compreende o resíduo mineral fixo que não é destruído pela queima do produto. Sua composição depende, até certo ponto, da temperatura e do tempo em que se pode processar a ignição. As cinzas podem ser calculadas em relação ao produto e em relação ao produto dessecado. Evidentemente, os valores numéricos obtidos serão diferentes em cada caso, havendo, portanto necessidade de se exprimir, no resultado, as condições em que se processou a determinação. Consideram-se cinzas totais o resultado da incineração do produto à temperatura de 500-550°C em mufla, ou à do “vermelho sombrio”. A ignição deve ser prolongada até que a cinza mostre cor uniforme; normalmente essa cor é branca ou cinzenta, ocorrendo casos em que apresenta vermelha ou avermelhada, verde ou esverdeada, por causa do excesso de certos elementos presentes; de qualquer modo, as cinzas não devem apresentar pontos de carvão.

As cinzas deverão ficar brancas ou levemente acinzentadas. (Em caso contrário, esfriar, adicionar 0,5 ml de água, secar e incinerar novamente). Algumas gotas de azeite comestível, adicionadas inicialmente à amostra, facilitam a carbonização. Algumas amostras contendo sais de metais alcalinos, que retêm proporções variáveis de dióxido de carbono nas condições da incineração, são tratadas, inicialmente, com solução de carbonato de amônio ou ácido sulfúrico diluído e, após secagem do excesso do reagente, aquecidas e pesadas.

O resíduo é, então, denominadas “Cinzas carbonatadas” ou “Cinzas sulfatizadas”, respectivamente. Muitas vezes é vantajoso combinar a determinação direta de umidade e a determinação de cinzas, incinerando o resíduo obtido na determinação de umidade.

A determinação de cinzas insolúveis em ácido, geralmente ácido clorídrico a 10 %, p/p, dá uma avaliação da sílica, (areia) existente na amostra. Alcalinidade nas cinzas é outra determinação auxiliar, no conhecimento da composição. Dificuldades práticas que envolvem a obtenção das cinzas: a) Materiais muito ricos em fósforo; b) Produtos muito gordurosos; c) Produtos com elevado teor de material alcalino. No primeiro caso, uma massa vítrea envolve o carvão inicialmente formado, tornando-o dificilmente atingível subseqüentemente. Nessas condições, com paciência, procura-se desintegrar o bloco formado, colocando,

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cuidadosamente, sobre o material, que então, deverá estar frio, uma gota de água destilada ou ácido nítrico. No segundo caso, há quase sempre formação de espuma, que acarreta a perda da amostra. A ignição deve ser lenta e paciente. No terceiro caso, a dificuldade reside em se obter, em dois ou mais ensaios, resultados concordantes. De fato, pequenas variações no tempo ou na temperatura de ignição ocasionam variações devidas a maior ou menor decomposição dos carbonatos e volatilização dos cloretos; há ainda o perigo de hidratação das cinzas quando fora do dessecador, ou mesmo de perdas mecânicas, por serem leves e fofas. O material rico em água deve ser previamente dessecado, cuidado que previne o sobressalto e a conseqüente perda durante a determinação. A ignição deve ser gradual, com assistência do analista. Só depois de formado o bloco de carvão, poderá o analista deixar que a operação prossiga sem supervisão direta. É aconselhável quando a operação for executada em bico de gás, colocar o cadinho ligeiramente inclinado sobre a chama. Os cadinhos empregados podem ser de porcelana, quartzo, vitreosil, aço inoxidável, níquel ou platina. O uso de cada tipo depende do caso considerado, porém, para os trabalhos rotineiros de determinação de composição centesimal, são perfeitamente aceitáveis os cadinhos de porcelana, quartzo ou vitreosil. O tempo necessário para uma perfeita incineração depende tanto da temperatura empregada, quanto do tipo de material examinado, assim como a sua quantidade. Pode variar de alguns minutos a algumas horas. O teor de cinzas em alimentos pode variar dentro do limite de 0,1 à 15%, dependendo do alimento e das condições em que este se apresenta. A título ilustrativo temos a seguir alguns exemplos: Método por Incineração FUNDAMENTO

O método está baseado na determinação da perda de peso do material submetido ao aquecimento a 550° C. É, portanto, um método gravimétrico. A perda de peso nos fornece o teor de matéria orgânica do alimento. A diferença entre o peso original da amostra e essa perda, fornece a quantidade de cinzas presente no produto. Material: forno mufla, cadinho de porcelana. Procedimento: em cadinho calcinado e tarado, pesar cerca de 2 gramas da amostra. Começar, a incineração aos poucos, em bico de gás ou chapa elétrica, procurando aquecer igualmente todas as faces do cadinho. Quando o produto estiver transformado em massa de carvão e cessar o desprendimento de fumaça, transferir o cadinho para mufla a 550°C, deixando-o por espaço de tempo suficiente para total destruição da matéria orgânica. Esperar a temperatura baixar de 80°C, retirar e colocar em dessecador. Pesar até peso constante. Cálculo:

A diferença entre o peso líquido do cadinho e o peso bruto após a incineração nos dá a quantidade de “cinzas” na tomada de ensaio. Calcular para 100g de “produto dessecado” e para 100g de “produto integral”.

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Cálculo:

100 x N = cinzas % m/m P

N = massa em gramas de cinza. P = massa em gramas da amostra.

FRAÇÃO EXTRATO ETÉREO

Os métodos rotineiros para determinação quantitativa de lipídios baseiam-se na extração intermitente da fração lipídica por meio de um solvente orgânico adequado. Após extração e remoção do solvente, determina-se gravimetricamente, a quantidade de lipídios presentes. O resíduo obtido não é, na verdade, constituído unicamente por triglicerídeos, mas por todos os compostos que, nas condições da determinação, possam ser extraídos pelo solvente. Geralmente, são fosfatídeos, esteróis, vitaminas A e D, carotenóides, óleos essenciais, etc., mas em quantidades relativamente pequenas, que não chegam a representar uma diferença significativa na determinação.

Os solventes mais comumente usados são: o éter etílico anidro (éter sulfúrico) e o éter de petróleo fração 30-60°C. A mistura desses dois também é recomendada. O éter etílico, apesar de ser um excelente extrator para lipídeos, tem algumas desvantagens: a) deve estar completamente livre de água (anidro), necessitando, portanto, de uma série de manuseios e cuidados; b) contendo água, dissolverá também alguns mono e dissacarídeos provocando desvios na determinação; c) a amostra a ser usada deve, portanto, estar completamente seca; d) não extrai completamente derivados como a lecitina; e) é altamente inflamável e, quando oxidado, é explosivo, e f) sua recuperação deve ser acompanhada com grande cuidado. O éter de petróleo, por sua vez, apesar de não ser o solvente por excelência, traz uma série de vantagens: a) não extrai outras frações que não seja a lipídica; b) não é afetado por pequenas quantidades de água e c) a sua recuperação por destilação é muito mais conveniente, porém seu custo é muito maior. A extração pode ser levada a efeito em um extrator intermitente sendo o mais comum o aparelho de Soxhlet. Neste aparelho o produto a ser extraído fica completamente protegido da indesejável elevação da temperatura. O material colocado no cartucho deve ser previamente dessecado, pois assim, o éter penetra rapidamente em sua massa, além de ser prevenida a possível extração conjunta de substâncias indesejáveis, solúveis em água, bem como arrastamento da própria água, o que provocaria um erro. O material deve ser finamente dividido, para permitir melhor atuação do solvente. O tempo de extração é variável dependendo da natureza do produto. Tem-se indicação do ponto final do processo quando uma gota do solvente recém destilado não acusar a presença de gordura (teste da mancha na folha de papel). Recupera-se por destilação a maior parte possível do solvente. Neste caso os teores de substâncias etéreo-solúveis podem ser desde traços como no caso do amido, ou até de 15 %, como no caso do abacate. As carnes e pescados também apresentam um teor bastante variável de lipídios, esta variação está em função da manipulação do alimento e condições do animal.

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Em se tratando de material líquido, esse deve ser colocado sobre fibra de amianto recentemente calcinada e resfriada, a seguir será dessecado e só então levado para o cartucho Soxhlet. Materiais que se aglomeram facilmente formando pastas consistentes, devem ser manipulados com areia lavada e seca, antes de serem levados ao cartucho. Uma extração completa dos lipídios se torna difícil em produtos contendo alta proporção de proteínas, e a presença de carboidratos também interfere. Em muitos casos, ocorre o encapsulamento dos lipídios, ou seja, os triglicerídeos ficam envoltos por moléculas de proteínas. Este fenômeno ocorre, normalmente, quando um alimento líquido foi transformado em sólido, como é o caso do leite em pó. Para estes casos, utiliza-se o método modificado de extração, onde são feito tratamento prévio da amostra com álcali ou ácido. No tratamento com ácido emprega-se HCl em concentração próxima a 6N e aquecimento. A proteína é hidrolisada pelo ácido, e os lipídeos ficam livres para extração com solvente. No tratamento com álcali, o produto é tratado com hidróxido de amônio e álcool. O álcool precipita a proteína, que se dissolve no hidróxido, restando os lipídios para serem extraídos com solvente. Uma vez evaporado ou destilado o solvente, determina-se gravimetricamente o resíduo obtido. Em certos casos, determinam-se volumetricamente os lipídios obtidos, tratando a amostra com reagentes (solvente mais ácido ou álcali) em butirômetro, fazendo-se em seguida uma centrifugação. O solvente contendo os lipídios extraídos pode ser medido através de uma leitura direta na escala do butirômetro. Método de Soxhlet Material: Extrator de Soxhlet; Éter etílico (anidro) ou Éter de petróleo; Cartucho de Soxhlet. Procedimento: Pesar cerca de 2-5 g da amostra em vidro de relógio e dessecar em estufa ou usar amostra obtida no final da determinação da umidade. Transferir a substância seca para um cartucho previamente desengordurado, cobrir a amostra com um pedaço de algodão desengordurado. Extrair no aparelho Soxhlet (balão previamente aquecido por l hora em estufa a 105°C, resfriado em dessecador até temperatura ambiente e pesado), com éter etílico por 6 horas.

Terminada esta etapa, dois procedimentos são possíveis. a) Dessecar o material extratado até peso constante. A diferença

de peso entre a tomada de ensaio e o produto final corresponde à quantidade de extrato etéreo da amostra. Calcular para 100g. b) Separar o éter por destilação (até cerca de 9/10 do volume), eliminar o éter residual em banho-maria secar o balão em estufa até que duas pesagens consecutivas não apresentem variações de peso. Essa pesagem corresponde, diretamente, á quantidade de extrato etéreo da tomada de ensaio. Calcular para 100g do produto. Para este caso o balão do extrator de Soxhlet deverá ser previamente tarado. Cálculo: Relacionar a quantidade de substância lipídica obtida na tomada de ensaio para 100 gramas de "produto seco" e/ou em 100 g de produto integral.

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100 x N = lipídios % m/m P

onde N = massa em g de lipídios P = massa em g da amostra.

Métodos volumétricos

Nestes métodos, os lipídios contidos na amostra são dissolvidos em ácido sulfúrico concentrado em tubos calibrados (ex. butirômetro de Terchert), a mistura é centrifugada para separar a fase aquosa da fase oleosa e, após atingir a temperatura específica, a quantidade de lipídios presentes é dada através da leitura direta na escala calibrada, em que está contido o lipídio. Os métodos mais utilizados são: método de Gerber e método de Babcock.

Método de Gerber Este método foi desenvolvido por volta do ano de 1892 como sendo o mais rápido para determinação prática de lipídios. Entretanto com o surgimento de métodos instrumentais, o método de Gerber perdeu sua importância. Contudo, devido sua execução simples e aplicação, apresenta exatidão e reprodutibilidade nos resultados. Os específicos tubos de Gerber ou butirômetro de Terchert foram desenvolvidos para os diferentes tipos de produtos lácteos, com escalas apropriadas e específicas. O procedimento envolve medidas específicas da quantidade de amostra a ser adicionada, seguida de medidas específicas de ácido sulfúrico e álcool amílico para auxiliar na separação da fase aquosa e oleosa. A adição de ácido sulfúrico causa aumento na temperatura, que aumenta ‘a medida em que os lipídios são dissolvidos. A mistura é centrifugada em uma centrífuga especial de Gerber a 1100 rpm por um tempo determinado, após os tubos calibrados são colocados em banho-maria a 65ºC para padronizar a temperatura das amostras e a leitura é dada direto na escala do butirômetro. FRAÇÃO NITROGENADA (PROTÉICA)

O conteúdo em proteína bruta do alimento é determinado através do seu conteúdo em nitrogênio, embora o nitrogênio possa ser proveniente de outros componentes, não somente das proteínas, componentes como ácidos nucléicos, protídeos, aminoácidos, sais de amônio, nitratos, bases púricas, etc.

A determinação do nitrogênio total nos fornece a informação muito reduzida do valor de proteínas de um alimento. Conhecendo-se a proporção de uma proteína em particular, multiplicando-se o valor do nitrogênio pelo fator desta e assim estima-se o conteúdo em proteína.

A maior parte das proteínas tem 16 por cento de nitrogênio, portanto o fator para converter o nitrogênio em proteína é 100/16 ou 6,25 (proteína padrão da carne). Por convenção se designa proteína bruta (N x 6,25). Nem todas as proteínas dos alimentos contêm 16 por cento de nitrogênio e em conseqüência é necessário aplicar outros fatores multiplicadores.

O método de KJELDAHL (AOAC, 1984) foi descrito há quase um século, em 1883. Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl publicou um trabalho de título “Um novo método para determinações de nitrogênio em compostos orgânicos” em uma revista dinamarquesa, sendo que o sucesso do método foi imediato e desde então é o mais amplamente usado indicado para amostras de

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origem biológica. Neste método, por meio de uma digestão ácida, o nitrogênio da amostra é transformado em amônio (NH4

+), o qual é posteriormente separado por destilação e finalmente pela titulação. O método é basicamente dividido em três etapas:

Digestão - o nitrogênio orgânico é transformado em amônio e os componentes orgânicos são convertidos em CO2, H2O, etc... Destilação – fase em que o gás amônia é liberado e recolhido em uma solução receptora. Titulação - determinação quantitativa da amônia recolhida contida na solução receptora. Dependendo da técnica, a separação da amônia é omitida, fazendo-se a sua determinação diretamente no material, após digestão. Em face das diferentes temperaturas exigidas para a decomposição das substâncias orgânicas, pois algumas substâncias não se decompõem à temperatura normal de ebulição do ácido sulfúrico, torna-se necessário aumentar a severidade de reação, pela adição de determinados sais, sendo os mais comuns: o sulfato de potássio ou de sódio (que elevam o ponto de ebulição do ácido sulfúrico de 180°C para, aproximadamente 400°C, pela formação de S2O7, tornam a digestão mais rápida). Mesmo assim, a oxidação da matéria orgânica ainda é relativamente lenta, podendo ser acelerada pela adição de catalisadores ou agentes oxidantes. Os sais de cobre (CuSO4 5H2O) e selênio metálico (Se) são os mais comumente usados. Transformam o oxigênio e o ativam (oxigênio ativo), tornando-o de maior poder de oxidação. A ação ativadora do selênio pode ser explicada por meio das seguintes reações:

Se + 2H2SO4 2SO2 + H2SeO3 + H2O

H2SeO3 Se + H2O + 2 [O]

Da mesma forma, o sulfato cúprico funciona como catalisador, produzindo oxigênio ativado, a fim de apressar a digestão:

2H2SO4 2SO2 + 2H 2O + O

O2 + 2 Cu++ 2CuO

2CuO 2 Cu++ + 2 [O] O uso de uma combinação de catalisadores é benéfico, porque promove melhor efeito associativo do que cada um dos catalisadores separadamente. O uso da mistura cobre e selênio não acarreta perda de nitrogênio, desde que a concentração do sulfato seja alta; porém, quando a concentração do sulfato for baixa, o uso da mistura poderá mesmo assim, acarretar perda de nitrogênio. As reações que se passam durante o processo da determinação dos compostos nitrogenados podem ser assim resumidas. Digestão - durante a fase de digestão, coloca-se no balão Kjeldahl a amostra embrulhada, de preferência, em papel impermeável, juntamente com a mistura digestora e o H2SO 4 concentrado. Faz-se o aquecimento em blocos de aquecedores, e provavelmente as seguintes reações são observadas.

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H2SO4 Matéria orgânica SO2 + CO2 + H2O + R - NH2 ∆ + catalisador H2SO4

R-NH2 + H2O R - OH + NH3 ∆

[H] RCONH2 + H2O RCOOH + NH3

∆ 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

sulfato de amônio

O carbono contido na matéria orgânica é oxidado e o CO2 se desprende, e no final da digestão o material fica completamente claro, depois de passar por uma fase bastante escura, no início da digestão. Além dos agrupamentos protéicos, existe nitrogênio sob forma de amina, amida e nitrila, que são transformados em gás amônia (NH3). Este gás formado reage com o ácido sulfúrico (H2SO4), formando (NH4)2SO4, conforme indicaram as reações. O sulfato de amônio formado, que fica no balão, ao se esfriar, forma cristais. Destilação - Pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste a vapor, sendo preferível este último. O sulfato de amônio é tratado com hidróxido de sódio (NaOH 1+1), em excesso, e ocorre a liberação do gás amônia (NH3), conforme reação a seguir:

(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4

sulfato de amônio ∆ sulfato de sódio

NH4OH NH3 + H2O ∆ amônia

Ao se adicionar o NaOH (1+1), devem-se usar algumas gotas de fenolftaleína, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. O gás NH3 desprendido é então recebido em um Erlenmeyer contendo ácido bórico (H3BO3) com indicador, previamente adaptado ao conjunto. NH3 + H3BO3 NH4H2BO3 borato de amônia O H3BO3 + indicador que, no início, era de cor rosa (laranja), adquire a cor verde à medida que se vai formando o NH4H2BO3 Titulação - É a ultima fase o NH4H2BO3 é titulado com uma solução padrão de HCl 0,01N ou 0,1N com fator conhecido até a viragem do indicador. NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl

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MÉTODO DE KJELDAHL – Fração Protéica Material - ácido sulfúrico isento de nitrogênio; catalisador misto (sulfato de potássio 100 g, sulfato de cobre 10 g, selênio 2 g); ácido clorídrico 0,1N ou 0,01N fatorado; solução indicador misto (0,50% verde de bromocresol + 0,75% de vermelho de metila em álcool etílico); hidróxido de sódio a 50% e ácido bórico 4%. Procedimento: Pesar cerca de 1 g da amostra e transferir para um balão de Kjeldahl, juntar cerca de 2 g do catalisador misto, e 20 mL de ácido sulfúrico concentrado. Aquecer até ebulição em capela química por cerca de 4-6 horas. Nesta fase da digestão, será observado um escurecimento do líquido e, depois, ao passo que o aquecimento vai se prolongando, passa a pardo, ficando finalmente incolor. A função do catalisador é reduzir o tempo de digestão. O clareamento do líquido não indica o fim da digestão. Para se ter certeza de que a operação está terminada, adicionar à mistura um cristal de permanganato de potássio, se este não descorar, não tem matéria orgânica no digerido. Obs: Quando se usa aparelho tipo micro-Kjeldahl, em ebulição lenta, 30 minutos serão suficientes para assegurar uma digestão adequada. Adicionar ao tubo de destilação, cerca de 50 mL de água destilada. Conectar o tubo ao sistema de destilação e ligar o aparelho, após adicionar cuidadosamente com agitação a solução de hidróxido de sódio a 40%, o líquido passar de azul a pardo, o que indica que meio alcalino. 4) Destilar recebendo o destilado em 50 mL de solução ácido bórico a 4% + gotas de vermelho de metila ou alaranjado de metila. Destilar até receber cerca de 200 mL de volume. Titular o destilado com solução de HCl 0,1 N se for utilizado H3BO3

como solução receptora. Cálculo: Peso da amostra (mg) …………P Titulação da amostra (mL) …….V Sabendo-se que 1(um) mL de HCl 0,1N reage com 0,0014 g de nitrogênio:

Nº de meq. de HCl = Nº meq.de N na amostra

O total de ácido bórico consumido pela destilação menos o número de mL de HCl 0,lN gasto na titulação, multiplicado por 0,0014 nos dará a quantidade de nitrogênio presente na amostra % de N. Fator 6,25 é normalmente usado para se transformar a % de nitrogênio em proteína, levando-se em conta que as proteínas contêm, em média, 16% de nitrogênio. 100 g proteína 16 de N x 1 de N X = 6,25 Resultado multiplicado por 6,25, nos dará a quantidade de proteína da amostra. = % de proteína bruta. Relacionar o resultado obtido para 100 g de produto integral ou 100 g do produto seco

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V x f x 0.0014 x 6,25 x 100 = proteína % m/m P

onde: V = n° mL HCl 0,1N gasto na titulação ; f = fator de correção do ácido; P = n° gramas da amostra. FRAÇÃO NITROGENADA - PROTÉICA E NÃO PROTÉICA É uma técnica alternativa que permite reconhecer a porção de nitrogênio de origem protéica e não protéica do alimento analisado, podendo ser aplicada a todos os tipos de produtos alimentícios.

Material e reagentes : frascos de Kjeldahl de 800 mL, funil de Büchner de 12 cm de diâmetro, frascos do tipo Kitasato, papel filtro Whatman n.541, solução a 3% de acetato de cobre monohidratado m/m; solução a 10% de sulfato de alumínio e potássio ( dihidratado ) m/m, antiespumante (silicona). ácido sulfúrico isento de nitrogênio, catalisador misto (sulfato de sódio anidro 100 g, sulfato de cobre 10 g), ácido clorídrico 0,1N ou 0,01N padronizado , solução indicador misto (0,50% m/v verde de bromocresol + 0,75% m/v de vermelho de metila em álcool etílico), hidróxido de sódio a 50% e ácido bórico 4% m/v. (No caso da não possuir ácido sulfúrico isento de nitrogênio, realizar uma determinação em branco do mesmo, para posterior eliminação da interferência no cálculo).

Procedimento: pesar cerca de 2 gramas da amostra com mais de 25 %

m/m de proteína crua, cerca de 1 grama para faixas de 25-50 % m/m de proteína crua e cerca de 0,5 grama para amostras com mais de 50 % m/m de proteína crua. Transferir para um balão de Kjeldahl e adicionar aproximadamente 50 mL de água deionizada, pérolas de vidro e 1-2 gotas de antiespumante. Aquecer em ebulição durante 30 minutos (refluxo). Enquanto a amostra estiver aquecida, adicionar 2 mL da solução de sulfato de alumínio e potássio, homogeneizar, em seguida, adicione 2 mL da solução de acetato de cobre 3% m/m, homogeneizar com vigor, deixar esfriar. Filtrar usando vácuo. Lavar o balão e o precipitado com 50 mL de água destilada fria. Para determinar o nitrogênio protéico, analisar o precipitado por meio da técnica do nitrogênio total de Kjeldahl. O nitrogênio não protéico é analisado por meio da mesma técnica, a partir do líquido filtrado. Os resultados respectivos dos sólidos (precipitado) e líquidos por meio do Kjeldahl oferecem diretamente os dados do nitrogênio protéico (NP) e não protéico (NNP) respectivamente. PS: Pode-se também, analisar por diferença , sendo que de posse do conteúdo de nitrogênio total e do nitrogênio protéico , podemos calcular o nitrogênio não protéico.

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Ebulição homogeneíze 30 min esfrie lave com água deionizada Fluxograma da determinação do nitrogênio protéico e não protéico e alimentos. FRAÇÃO FIBRA

Denominam-se, de fibras dietéticas os carboidratos indisponíveis de origem vegetal que são difíceis ou impossíveis de serem digeridos pelas enzimas endógenas do sistema digestivo do organismo humano.

A Fibra Alimentar (FA) é uma fração complexa, composta de

polissacarídeos e lignina, que se origina, principalmente, da parede celular e do cimento intercelular de tecidos vegetais. Os polissacarídeos (celulose, hemicelulose, substâncias pécticas, β-glucanas e gomas) que a compõem, apesar de constituírem a maior parte da FA, estão associados a outras substâncias como cutina, suberina, taninos, fitatos, lignina podendo, ainda, conter compostos, formados durante o processamento, como produtos de Maillard e amido retrogradado.

Esta complexidade torna difícil a análise da fração fibra existindo

diversas metodologias. A chamada fibra bruta, obtida através da extração ácida e alcalina, deve ser abandonada por fornecer valores subestimados de FA. Esse processo destrói da a fração solúvel da fibra e quantidades variáveis da fração insolúvel.

As técnicas baseadas no uso de detergente ácido e ou/ neutros, se não acompanhadas do uso de amilases e da determinação de nitrogênio residual, podem apresentar valores superestimados, como, por exemplo, em leguminosas, por incluírem amido e proteína não solúveis e, além disso, não permitirem a avaliação dos componentes solúveis.

Método de Henneberg Consta, fundamentalmente, de uma digestão em meio ácido (H2SO4 1,25%) seguida de uma digestão em meio alcalino (NaOH 1,25%). O resíduo mineral fixo dessas digestões representa a fibra, simulando o que ocorre em “in vivo”. O teor de fibra em alimentos varia de acordo com sua origem. Alimentos de origem vegetal apresentam de 0.5 a 1.5% de fibra.

2g de amostra + 50 mL de água deionizada

Adicione 2 mL de sulfato de alumínio

Adicione 50 mL de acetato de

Filtre a vácuo Determine o nitrogênio no resíduo e no filtrado pelo método de Kjeldhal Calcule o N protéico no

resíduo e N não protéico no filtrado

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Material - solução de ácido sulfúrico a 1,25%; solução de hidróxido de sódio a 1,25%; álcool absoluto, éter etílico; água destilada (fria e quente) e papel de filtro (pesado). Procedimento: Pesar cerca de 2g da amostra média do produto seco e desengordurado (obs. para desengordurar proceda a uma extração total por meio de éter e evapore totalmente o éter, ou então pode ser usada amostra em que foi determinado o extrato etéreo), evitando assim um excesso de saponificação da gordura durante a hidrólise básica, e conseqüentemente, prevenir a formação de espuma. Transferir então quantitativamente a amostra para um frasco digestor adaptado a um refrigerante de refluxo com placa elétrica pré-aquecida. Digestão ácida: Adicionar a amostra 100 mL do ácido sulfúrico à 1.25%, e adaptar o tubo ao bloco digestor e ferver, durante 20 minutos. Após filtrar em funil de Büchner, ainda quente sobre o papel filtro comum, de boa capacidade filtrante. Lavar com água destilada o frasco, e em seguida o papel filtro. Quando a filtração estiver praticamente terminada, iniciar a digestão alcalina com a solução de NaOH a 1.25%. Digestão alcalina: retornar o resíduo contido no papel-filtro para o frasco usado para a digestão ácida e com auxilio de água quente fazer voltar todo o resíduo para dentro do frasco. Adicionar 100 mL da solução de NaOH 1,25% e levar novamente à ebulição nas mesmas condições anteriores, durante 20 minutos. Ao final desse, filtrar a solução com papel filtro devidamente pesado, retirando por meio de água destilada quente todo o resíduo existente no frasco. Geralmente a filtração alcalina é rápida. Verificar por meio de papel indicador, se a água retirou todo o álcali. Lavar se necessário, até que isso aconteça. Lavar depois, com cerca de 20 mL de álcool etílico o material no filtro e, a seguir com 20 mL de éter etílico, tendo o cuidado de projetar o jato sobre a massa de fibra para que haja penetração do líquido na mesma. Evaporar e transferir o papel filtro com o resíduo para uma estufa a 105ºC até peso constante. Cálculo: O peso da fibra total é dado pela diferença apresentada do peso do papel. Calcule para 100g de material seco e integral. 100 x S = n° de g fibra P %m/m

S = massa em g do resíduo da amostra no papel, menos as cinzas ( papel e amostra) P = massa em g da amostra inicial

Obs. Quando se utiliza um papel filtro específico, com teor de cinzas conhecido, pode-se dobrar o papel filtro contendo a fibra em um cadinho calcinado e pesado, e determinar as cinzas totais do resíduo fibra. O teor de cinzas obtido menos o peso das cinzas do papel filtro específico, representam a parte mineral da fibra na tomada de ensaio. A diferença entre a parte mineral da fibra e fibra total nos dará a fração fibra do alimento.

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FRAÇÃO GLICÍDICA OU NIFEXT

Corresponde ao extrato livre de nitrogênio (nitrogen free extract) estando também excluída a fração lipídica. Engloba diversos compostos, tais como: féculas e amido, açúcares, gomas, resinas, ácidos orgânicos, etc. O teor de glicídios em alimentos varia de praticamente “zero” para as carnes, até teores bastante elevados no caso das farinhas, uma vez que estas apresentam cerca de 75%. Cálculo:

Somar os números correspondentes às percentagens das cinco determinações precedentes (umidade, cinzas, lipídios, proteínas e fibra). Diminuir o número obtido de 100. A diferença será correspondente ao valor da fração “Nifext” para 100g do produto.