000843784.pdf

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA

ALINE GUADALUPE COELHO

ESTUDO DA DEGRADAO TRMICA DE ANTOCIANINAS DE EXTRATOS DE UVA (Vitis vinifera L. Brasil) E JABUTICABA

(Myrciaria cauliflora).

ORIENTADOR: Prof. Dr. ADRIANA VITORINO ROSSI

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE VERSO FINAL DA DISSERTAO DEFENDIDA POR ALINE GUADALUPE COELHO, E ORIENTADA PELA Prof. Dr. ADRIANA VITORINO ROSSI.

_______________________ Assinatura do Orientador

CAMPINAS, 2011

DISSERTAO DE MESTRADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUMICA DA UNICAMP

PARA OBTENO DO TTULO DE MESTRE EM

QUMICA NA REA DE QUMICA ANALTICA.

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado ii

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado iv

Onde voc quer chegar? Ir alto? Sonhe alto.

Queira o melhor do melhor,

Se pensamos pequeno, coisas pequenas teremos,

Mas se desejarmos fortemente o melhor.

E, principalmente, lutarmos pelo melhor...

O melhor vai se instalar em nossa vida.

Porque sou do tamanho daquilo que vejo, e no do tamanho da minha altura.

(Carlos Drummond de Andrade)

Dedico esta dissertao aos meus pais:

Jos Guadalupe Coelho e Emdia Joaquina Coelho aos meus irmos

Igor Guadalupe Coelho e Yane Guadalupe Coelho

por todo apoio, incentivo, cumplicidade e amor.

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado v

Agradecimentos

Agradeo a Profa. Dra Adriana Vitorino Rossi pela orientao desse

trabalho.

Aos amigos do GPQUAE: Accia, Eva, Lilia, Patrcia Castro e Patrcia

Tonon, Willian, Nathssia, Juliana, Adriano, Sabir, Suryyia, Martha, pela amizade,

companheirismo, brincadeiras, ajuda nas disciplinas, nas discusses e por tudo ao

longo desse trabalho, tudo ficou mais fcil graas presena e amizade de cada

um de vocs.

Agradeo a todos os funcionrios do IQ-UNICAMP que contriburam para a

realizao deste trabalho. Em especial a Isabel (Bel) e ao Miguel, da CPG, Rita,

ao Ricardo e Fabi, das salas de aparelhos por toda ajuda.

Agradeo tambm aos queridos amigos do GEM, que contriburam com

muita pacincia, incentivo e amizade, para que os momentos mais difceis fossem

superados com alegria: Aline, Richard, Heloisa, Juclio, Renata, Alexandre,

Grazielle, Jaqueline, Dbora, Walter, Dosil, Fracassi e Volpe obrigada por todo

apoio!

Agradeo aos amigos: Lvia, Dani, Juliana, Laiane, Benedito, Francine,

Manu, Marcelo, Brbara, Samuel, Magale, Euzbio, Pedro, Vinicius e Guilherme,

pela amizade, carinho e apoio sempre.

Dra Tnia e Marly por todo profissionalismo e seriedade que foram

essenciais para vencer os desafios pelo caminho.

Agradeo a minha famlia querida: Minha V Marlene, meus pais meus

irmos, meus tios, tias, primos e amigos de Minas, que entenderam que minha

ausncia era necessria para que esse sonho fosse realizado.

Cada pgina dessa dissertao meu agradecimento a Deus e a todas as

pessoas que de alguma forma me ajudaram a alcanar esse objetivo.

Muito obrigada!

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado vi

Curriculum vitae

Graduao-Licenciatura em Qumica

Universidade vale do Rio Doce- UNIVALE- Governador Valadares-MG Concluso:

12/2007

ATUAO PROFISSIONAL

Tcnica em Qumica, no Instituto de Qumica, IQ-UNICAMP, Campinas

Desde: outubro de 2010

TRABALHO DESENVOLVIDO EM INICIAO CIENTIFICA

Bolsa de Iniciao Cientfica - BIC FAPEMIG, vinculada ao projeto de pesquisa

Implantao e validao de um sistema de injeo em fluxo aplicado

determinao de nitrato em solos." Perodo: Maro de 2006 a fevereiro de 2007

Orientado pela Profa. Dr. Raquel Andrade Donagemma.

PARTICIPAO EM EVENTOS CIENTFICOS

Quantificao de antocianinas em extratos de frutas com medidas colorimtricas

em dispositivo porttil. No 16o Encontro Nacional de Qumica Analtica, Campos do

Jordo, 2011.

Ferramentas analticas no estudo da degradao trmica de antocianinas. Na 34

Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Florianpolis, 2011.

Formao continuada e atividades de extenso em foco: Comida, vida e

Qumica. Para integrar professores, estudantes e pesquisadores. Na 34 Reunio

Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Florianpolis, 2011.

II Escola de inverno de Separaes Mini curso 2: Eletroforese capilar.

IQ-UNICAMP, 2011.

Comisso organizadora do IV Frum de Ps Graduao em Qumica.

IQ-UNICAMP, 2010.

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado vii

Efeito da temperatura de extrao e de armazenamento na degradao de

extratos de antocianinas de Uva Brasil (Vitis vinifera L. cv. Brasil). Na 33a

Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, guas de Lindia, 2010.

Achilla millefolium L.: marcha fotoqumica e anlise espectromtrica no: IV

Simpsio de Pesquisa e Iniciao Cientfica, Goverdador Valadares, 2006.

Implantao e validao de um sistema de injeo em fluxo aplicado a

determinao de nitrato em solos no IV Simpsio de Pesquisa e Iniciao

Cientfica, Governador Valadares, 2006,

Perfil espectromtrico no IV Simpsio de Pesquisa e Iniciao Cientifica,

Governador Valadares, 2006.

Implantao e validao de um sistema de injeo em fluxo aplicado

determinao de nitrato em solos no: XLVI Congresso Brasileiro de Qumica,

Salvador, 2006.

ATIVIDADES EXTRA-CURRICULARES

Monitora do Programa de Iniciao Cientifica Junior junto ao projeto:

Quantificao de antocianinas em extratos de frutas com medidas fotomtricas

em dispositivo porttil. Orientado pela Profa. Dra. Adriana Vitorino Rossi. Perodo:

maio de 2010 a abril de 2011.

Monitora no Simpsio de profissionais de Ensino de Qumica (SIMPEQ),

IQ-UNICAMP, 2011.

Monitora no IX Simpsio de profissionais de Ensino de Qumica (SIMPEQ),

IQ-UNICAMP, 2010.

Para maiores detalhes consultar Currculo Lattes

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado viii

Resumo

Estudo da degradao trmica de antocianinas de extratos de uva (Vitis vinifera

L. Brasil) e jabuticaba (Myrciaria cauliflora).

Autora: Aline Guadalupe Coelho

Orientadora: Adriana Vitorino Rossi

Antocianinas (ACYS) so corantes naturais que conferem cor a folhas,

flores e frutas, so derivados glicosilados do ction flavlio, da classe dos

flavonides e apresentam potencial para uso como corante, alm de atividade

antioxidante e teraputica. Essas caractersticas estimulam buscar formas de

viabilizar a utilizao desses corantes na indstria de diversos segmentos, alm

de fomentar pesquisas acerca de sua estabilidade. Nesse trabalho, realizou-se o

estudo da degradao trmica de extratos de ACYS, obtidos de uva (Vitis vinifera

L. Brasil) e jabuticaba (Myrciaria Cauliflora). Os padres das ACYS majoritrias

para cada fruta malvidina-3-glicosdeo e cianidina-3-glicosdeo foram utilizados

como referncia. Foram realizados ensaios de estabilidade, para extratos obtidos

a 25, 55 e 85 C, com pH ajustado para 3,0 e mantido natural, armazenados sob-

refrigerao ou a temperatura ambiente. Alm disso, foram realizados ensaios de

degradao acelerada a 55 e 85 C com monitoramento espectrofotomtrico e

anlises dos extratos e padres iniciais e degradados por UHPLC-MS. Os ensaios

de estabilidade dos extratos foram monitorados por at 170 dias. Foi verificado o

efeito da baixa temperatura de armazenamento, para a estabilidade dos extratos

de uva, enquanto para os extratos de jabuticaba foram verificados tambm o efeito

da diminuio do pH, e do aumento da concentrao. Os estudos da degradao

trmica indicaram o aumento da velocidade da degradao das ACYS, com o

aumento da temperatura. As anlises de UHPLC-MS dos extratos degradados

indicaram que a temperatura de degradao no altera a rota de degradao das

ACYS nas amostras. As reaes de degradao dos padres seguem ajustes de

segunda ordem com energias de ativao de 95,20,1 e 89,340,05 kJ mol-1, e

tempos de meia vida de 78 2 e 4,2 0,1 e 58,7 e 3,80,4 horas para degradao

a 55 e 85 C da cianidina-3-glicosdeo e malvidina-3-glicosdeo, respectivamente.

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado ix

Abstract

Study of thermal degradation of anthocyanins of grape (Vitis vinifera L. BRASIL)

and jabuticaba (Myrciaria cauliflora).

Author: Aline Guadalupe Coelho

Advisor: Adriana Vitorino Rossi

Anthocyanins (ACYS) are natural dyes that give color to leaves, flowers and

fruits, they are glycosylated derivatives of flavylium cation, the class of flavonoids

and have potential for use as a dye, as well as antioxidant activity and therapy.

These features facilitate finding ways to encourage the use of these dyes in

various industry segments, and foster research about its stability. In this work, we

carried out the study of thermal degradation of ACYS extracts obtained from grape

(Vitis vinifera L. 'Brazil') and jabuticaba (Myrciaria cauliflora). Standards of the

ACYS (malvidin-3-glucoside and cyanidin-3-glucoside) present in major quantity in

each fruit were used as a reference. Stability tests over time, for extracts obtained

at 25, 55 and 85 C, with pH adjusted to 3.0 and maintained course, and stored

under refrigeration, were performed at room temperature. Further tests were

carried out in order to determine accelerated degradation at 55 and 85 C and

were analyzed through spectrophotometry. Initial and degraded standards were

analyzed by UHPLC-MS. Monitoring of the extracts was performed for up to 170

days, and the effect of storage temperature for stabilization of grape extracts was

verified. In case of jabuticaba extracts, the effect of lower pH, the concentration of

the extracts was also verified in addition to storage temperature. The thermal

degradation studies indicated that the increased speed of degradation of ACYS

with increasing temperature. The UHPLC-MS analysis of degraded extracts to

indicate, that the degradation temperature does not change the route of

degradation of samples. The standards degradation reaction followed fit second

order adjustment with activation energies of 95.20.1 and 89.340.05 kJ mol-1,

half-life of 782, 4.20.1 and 58.70.4 and 3.8 hours to decay to 55 and 85 C of

cyanidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside, respectively.

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado x

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................ XIII

LISTA DE TABELAS. ......................................................................................... XIV

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ XV

PREFCIO ......................................................................................................... XXII

CAPTULO 1: INTRODUO ................................................................................. 1

1. INTRODUO .................................................................................................... 2

1.1. ANTOCIANINAS .............................................................................................. 2

1.2. APLICAO INDUSTRIAL ............................................................................. 4

1.3.1 DEGRADAO TRMICA DE ANTOCIANINAS .......................................... 7

1.4 COPIGMENTAO .......................................................................................... 9

1.5 TCNICAS ANALTICAS UTILIZADAS NO ESTUDO DE ANTOCIANINAS . 11

1.6 FRUTAS UTILIZADAS COMO FONTES DE ANTOCIANINAS ...................... 15

1.6.1 UVA BRASIL ............................................................................................... 15

1.6.2 JABUTICABA .............................................................................................. 16

1.7 SISTEMA DE AUTORIZAO E INFORMAO EM BIODIVERSIDADE (SISBIO) ................................................................................................................ 17

CAPTULO 2: OBJETIVOS .................................................................................. 19

2.1 GERAIS: ......................................................................................................... 20

2.2 ESPECFICOS: ............................................................................................... 20

CAPTULO 3: PARTE EXPERIMENTAL .............................................................. 21

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xi

3.1 CONSIDERAES GERAIS .......................................................................... 22

3.2 EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES. .......................................... 22

3.2.1 EQUIPAMENTOS ........................................................................................ 22

3.2.2 MATERIAIS .................................................................................................. 23

3.2.3 PADRES DE ACYS ................................................................................... 23

3.2.4 REAGENTES ............................................................................................... 23

3.3. PROCEDIMENTOS PRELIMINARES ............................................................ 24

3.3.1. OBTENO DE EXTRATOS ..................................................................... 24

3.3.1.1. OBTENO DOS EXTRATOS BRUTOS UTILIZADOS NA FASE 1 ...... 24

3.3.1.2. OBTENO DOS EXTRATOS BRUTOS UTILIZADOS NA FASE 2 ...... 24

3.3.1.3. OBTENO DOS EXTRATOS SECOS .................................................. 24

3.3.1.4 QUANTIFICAO DAS ACYS TOTAIS ................................................... 24

3.3.1.5. PURIFICAO DOS EXTRATOS POR EXTRAO EM FASE SLIDA .............................................................................................................................. 25

3.3.2. IDENTIFICAO DE ACYS ....................................................................... 25

3.3.2.1. MTODO DE GOIFFON ET AL ............................................................... 25

3.3.2.2 IDENTIFICAO DE ACYS POR UHPLC ............................................... 26

3.3.3 ANLISE TERMOGRAVIMTRICA ............................................................ 26

3.4 FASE 1- MONITORAMENTO DA DEGRADAO ........................................ 26

3.4.1 MONITORAMENTO DE DEGRADAO .................................................... 26

3.5 FASE 2 MONITORAMENTO DA DEGRADAO ACELERADA .................. 27

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xii

3.5.1 DEGRADAO DOS EXTRATOS E PADRES ........................................ 27

3.5.2 ANLISES POR UHPLC-MS ....................................................................... 27

CAPTULO 4: RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................... 29

4. RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................ 30

4.1 ESTUDOS PRELIMINARES ........................................................................... 30

4.1.1 QUANTIFICAO DAS ACYS .................................................................... 30

4.1.2 COMPARAO DE DOIS MTODOS DE IDENTIFICAO DE ACYS: MTODO GOIFFON E UHPLC-MS ...................................................................... 32

4.1.3 ANLISE TERMOGRAVIMTRICA ............................................................ 34

4.2 EXPERIMENTOS DA FASE 1. ....................................................................... 36

4.2.1 MONITORAMENTO DA DEGRADAO EXTRATOS DE JABUTICABA . 37

4.2.2 MONITORAMENTO DA DEGRADAO EXTRATOS DE UVA ................. 38

4.3 EXPERIMENTOS DA FASE 2. ....................................................................... 39

4.3.1 RESULTADOS FASE 2: SOLUES DE PADRES DE ACYS ............... 40

4.3.2 RESULTADOS FASE 2: EXTRATOS BRUTOS DE ACYS. ........................ 46

4.3.3 RESULTADOS FASE 2: EXTRATOS PURIFICADOS DE ACYS. .............. 55

4.3.4 CINTICA DA DEGRADAO DE EXTRATOS E PADRES ................... 60

CAPTULO 5: CONCLUSO ................................................................................ 66

CAPTULO 6: REFERNCIAS ............................................................................. 69

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ACYS - Antocianinas

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

AOAC - Association of Analytical Communities

CE - Eletroforese capilar

Ea - Energia de ativao

ESI Ionizao por eletrospray

HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia

IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renovveis

k- Constante de reao

MS Espectrometria de massas

PPO - Polifenoloxidase

SISBIO Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade

t1/2 Tempo de meia vida

UHPLC Cromatrografia Lquida de Ultra Alta Aficincia

UV-Vs Ultravioleta- Vsivel

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xiv

LISTA DE TABELAS.

Tabela 1: Concentrao mdia de ACYS extrada com gua em diferentes

temperaturas. ........................................................................................................ 31

Tabela 2: ACYS identificadas nos extratos de uva e jabuticaba por UHPLC-MS e

pelo mtodo de Goiffon et al. ................................................................................ 34

Tabela 3: Dados padro de malvidina-3-glicosdeo. ............................................. 40

Tabela 4: Dados padro de cianidina-3-glicosdeo. .............................................. 42

Tabela 5: Dados de espcies presentes em extrato bruto de uva. ....................... 46

Tabela 6: Dados de espcies presentes em extrato bruto de jabuticaba. ............ 46

Tabela 7: Constantes de reao, tempo de meia- vida e parmetros de Arrhenius

para a degradao da Malvidina-3-glicosdeo. ...................................................... 62


para a degradao de cianidina-3-glicosdeo ........................................................ 63


para a degradao de extrato bruto de uva .......................................................... 64

Tabela 10: Constantes de reao, tempo de meia-vida para a degradao de

extrato purificado de jabuticaba. ............................................................................ 64

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura ction flavilio, sendo que antocianinas tm R = unidade

glicosdica. Se R= H, tm-se antocianidinas. ......................................................... 3

Figura 2: Mudanas estruturais das ACYS em funo do pH (TERCI e ROSSI,

2002). ...................................................................................................................... 5

Figura 3: Variao da cor de solues aquosas de ACYS obtidas de uva em

funo do pH. ACYS de uva com solues de pH conhecido variando de 1 a 14 da

esquerda para direita. ............................................................................................. 6

Figura 4: Possvel mecanismo de degradao trmica de ACYS (Original em

Patras et al, 2010). .................................................................................................. 7

Figura 5: Modelo hipottico da copigmentao intramolecular de antocianinas

adaptado de Falco et al, 2003) ............................................................................ 10

Figura 6: Modelos de interaes intermoleculares entre delfinidina-3-glicosdeo e

rutina (adaptado de Rein, 2005). ........................................................................... 11

Figura 7: Espectro eletrnico de ACYS em solues de pH 1,0 e 4,5 e estrutura

do ction flavlio (A) e hemiacetal(B). R= H ou substituinte glicosilado (adaptado de

Wrolstad et al, 2005) ............................................................................................. 12

Figura 8: Frutos de Vitis vinifera L. A) cv. Itlia, B) cv. Rubi, C) cv.Benitaka, D)

Brasil (Oliveira-Collet et al 2005) ........................................................................... 15

Figura 9: Origem das variedades Rubi e Benitaka a partir da Itlia (1972 em Santa

Mariana e 1988 em Flora, respectivamente) e da variedade Brasil a partir da

Benitaka (1991 na regio de Flora). Original em Oliveira-Collet et al 2005. ......... 16

Figura 10: Uva Brasil utilizada no trabalho. .......................................................... 16

Figura 11: Frutos de jabuticaba ............................................................................ 17

Figura 12: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de jabuticaba e uva,

respectivamente, extrado a 55 C, tendo gua destilada como branco................ 30

Figura 13: Estrutura genrica das ACYS (Harbone,1994). .................................. 32

Figura 14: Cromatograma do extrato de jabuticaba. Condies cromatogrficas:

eluio isocrtica em fase reversa, fase mvel: gua deionizada: acetonitrila: cido

frmico 89:9:10 (v/v/v), volume de injeo 20 L, deteco em 525 nm. .............. 33

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xvi

Figura 15: Cromatograma do extrato de uva. Condies cromatogrficas: eluio

isocrtica em fase reversa, fase mvel: gua deionizada: acetonitrila: cido

frmico 89:9:10 (v/v/v), volume de injeo 20 L, deteco em 525 nm. .............. 33

Figura 16: Termograma de extrato seco de uva. .................................................. 35

Figura 17: Termograma de extrato seco de jabuticaba. ....................................... 36

Figura 18: Representao dos valores de D (calculados pela equao 3), para

extratos de Jabuticaba com pH natural e armazenado a 8 C (JN8), com pH

ajustado para 3,0 e armazenado a 8 C (J38), com pH ajustado para 3,0 e

armazenado a temperatura ambiente (J3A) e com pH natural e armazenado a

temperatura ambiente (JNA). ................................................................................ 37

Figura 19: Grfico de barras correspondentes aos valores de D (calculados pela

equao 3), para extratos de uva com pH natural, armazenado a 8 C (UN8), com

pH ajustado para 3,0, armazenado a 8 C (U38), com pH ajustado em 3,0 e

armazenado a temperatura ambiente (U3A) e com pH natural e armazenado a

temperatura ambiente (UNA). ............................................................................... 39

Figura 20: Cromatogramas do padro de A: malvidina-3-glicosdeo, B: malvidina-

3-glicosdeo degradado a 55 C e C: malvidina-3-glicosdeo degradado a 85 C,

injetados no UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por gradiente A

(gua:cido frmico 0,1%) e B (acetonitrila: cido frmico 0,1%), tempo de eluio

de 12 minutos, vazo da fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e

1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70% de A e 30%

de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L .............. 41

Figura 21: Espectro de massas dos padro de malvidina-3-gliosdeo, injetado no

UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes

0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. 41

Figura 22: Cromatogramas do padro de A: cianidina-3-glicosdeo, B: cianidina-3-

glicosdeo degradado a 55 C e C: cianidina-3-glicosdeo degradado a 85 C

injetados no UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por gradiente A

(gua:cido frmico 0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1%), tempo de eluio

de 12 minutos, vazo da fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xvii

1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70% de A e 30%

de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L . ............ 42

Figura 23: Espectro de massas dos padro de cianidina-3-glicosdeo, injetado no

UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes

0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. 43

Figura 24: Espectro de massas sequencial do padro de cianidina-3-glicosdeo,

injetado no UHPLC-MS/MS, Condies MS: Capilar 3,0 kV, Cone 30 V, Extrator

3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura de

dessolvatao = 350 C. ....................................................................................... 43

Figura 25: Monitoramento dos padres de malvidina-3-glicosideo (preto) e

B:cianidina-3-glicosideo (vermelho)ostras degradadas a A: 55 C e B: 85 C

utilizando gua destilada como branco, monitorado por 55 e 11 horas

respectivamente, com medidas em 525 nm. ......................................................... 44

Figura 26: Espectros eletrnicos do padro de A: malvidina-3-glicosdeo e B:

cianidina-3-glicosdeo, amostras degradadas a 55 C utilizando gua destilada

como branco, monitorados por 18,5 horas. ........................................................... 45

Figura 27: Espectros eletrnicos do padro de A: malvidina-3-glicosdeo e B:

cianidina-3-glicosdeo amostras degradadas a 85 C utilizando gua destilada

como branco, monitorados por 11 horas. .............................................................. 45

Figura 28: Cromatogramas do A: extrato bruto de uva, B: extrato bruto de uva

degradado a 55 C e C: extrato bruto de uva degradado a 85 C injetados no

UHPLC-MS. Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B

(acetonitrila:cido frmico 0,1 %), tempo de eluio 12 minutos, vazo da fase

mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80 %

de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 %

de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L ............................................................ 46

Figura 29: Cromatrogramas do extrato bruto de uva e os picos das ACYS

identificadas injetados no UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por

gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %),

tempo de eluio de 12 minutos, vazo da fase mvel:0,35 mL/min, gradiente

inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80 % de A e 20 % de B, 8 a 10

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xviii

minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B. Volume

de injeo 10 L . .................................................................................................. 47

Figura 30: Espectro de massas da delfinidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de uva no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V,

Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura de

dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 48

Figura 31: Espectro de massas da cianidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de uva no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 KV, Cone 30 V,


dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 48

Figura 32: Espectro de massas da peonidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de uva no UHPLC-MS, Condies: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V,


dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 49

Figura 33: Espectro de massas da malvidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de uva no UHPLC-MS, Condies: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V,


dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 49

Figura 34: Espectro de massas da petunidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de uva no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 KV, Cone 30 V,


dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 49

Figura 35:Espectro de massas de produtos de degradao dos extratos de uva

bruto por UHPLC-MS, Condies: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF

lentes 0,5 V, temperaturas da fonte: 120 C e dessolvatao: 400 C ................. 50

Figura 36:Cromatogramas UHPLC-MS de A: extrato bruto de jabuticaba, B:

extrato bruto de jabuticaba degradado a 55 C e C: extrato bruto de jabuticaba

degradado a 85 C . Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%)

e B (acetonitrila:cido frmico 0,1%), tempo de eluio: 12 min, vazo da fase

mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80 %

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xix

de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 %

de A e 5 % de B. Volume de injeo 10 L. .......................................................... 51

Figura 37: Cromatrogramas UHPLC-MS do extrato bruto de uva e picos das

ACYS identificadas. Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%)

e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %), eluio: 12 min, vazo da fase

mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 min: 80 % de A

e 20 % de B, 8 a 10 min: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 min: 95 % de A e 5% de

B. Volume de injeo 10 L . ................................................................................ 51

Figura 38: Espectro de massas da protogucinaldeido, obtida da injeo do extrato

bruto de jabuticaba no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V,


dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 52

Figura 39: Espectro de massas da cianidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do

extrato bruto de jabuticaba no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone

30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura

de dessolvatao = 400 C. .................................................................................. 52

Figura 40: Monitoramento de extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras

degradadas a 55 C, monitorados por 70 horas com medidas em 525 nm., tendo

gua destilada como branco. ................................................................................ 53

Figura 41: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva

amostras degradadas a 55 C utilizando gua destilada como branco, monitorados

por 70 horas com medidas em 525 nm. ................................................................ 53

Figura 42: Monitoramento de extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras

degradadas a 85 C utilizando gua destilada como branco, monitorados por 12

horas com medidas em 525 nm. ........................................................................... 54

Figura 43: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva


por 9 horas com medidas em 525 nm. .................................................................. 54

Figura 44:Espectro de massas de produtos de degradao dos extratos de

jabuticaba , obtida da injeo do extrato bruto de jabuticaba no UHPLC-MS,

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xx

Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V,

temperatura da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. .......... 55

Figura 45: Cromatogramas do A: extrato purificado de uva, B: extrato purificado

de uva degradado a 55 C e C: extrato purificado de uva degradado a 85 C.

Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B

(acetonitrila:cido frmico 0,1 %), tempo de eluio de 12 min, vazo da fase

mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 min: 80 % de A

e 20 % de B, 8 a 10 min: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5

% de B. Volume de injeo 10 L ......................................................................... 56

Figura 46: Cromatogramas do A: extrato purificado de jabuticaba, B: extrato

purificado de jabuticaba degradado a 55 C e C: extrato purificado de jabuticaba

degradado a 85 C, injetados no UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio

por gradiente A (gua:cido frmico 0,1 %) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %),


inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80 % de A e 20 % de B, 8 a 10

minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5 % de B. Volume

de injeo 10 L. ................................................................................................... 57

Figura 47: Monitoramento dos extratos purificados de A: jabuticaba e B: uva


por 120 horas com medidas em 525 nm. .............................................................. 58

Figura 48: Monitoramento dos extratos purificados de A: jabuticaba e B: uva


por 18 horas com medidas em 525 nm. ................................................................ 58

Figura 49: Espectros eletrnicos dos extratos purificados de A: jabuticaba e B:uva


por 120 horas com medidas em 525 nm ............................................................... 58

Figura 50: Espectros eletrnicos dos extratos purificados de A: jabutucaba e B:

uva amostra degradada a 85 C utilizando gua destilada como branco,

monitorado por 18,5 horas com medidas em 525 nm. .......................................... 59

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xxi

Figura 51: Espectro de massas do protogucinaldeido, injetado no UHPLC-MS,

Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V,

temperatura da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. .......... 60

Figura 52: Ajuste de segunda ordem para degradao a 55 C dos padres de

malvidina-3-glicosdeo (preto) e cianidina-3-glicosdeo (vermelho) monitorados por

55 horas ................................................................................................................ 61

Figura 53: Ajuste de segunda ordem para degradao a 85 C dos padres de

malvidina-3-glicosdeo (preto) e cianidina-3-glicosdeo (vermelho), monitorados por

11horas. ................................................................................................................ 62

Figura 54: Ajustes tpicos de segunda ordem para degradao a 55 e 85 C de

extratos de uva bruto, em monitoramento espectrofotomtrico por 72 e 18 horas,

respectivamente. ................................................................................................... 63

Figura 55: Ajuste de segunda ordem para degradao a 85 C de extratos de

jabuticaba purificados tpicos, monitorados em espectrofotmetro por 18 Horas. 64

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xxii

Prefcio

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xxiii

O interesse dos consumidores e a motivao para a aquisio de vrios

produtos, como alimentos e cosmticos, esto diretamente relacionados com

algumas propriedades como aspecto visual e aroma, dentre outras caractersticas.

Tendo em vista o interesse por pigmentos versteis, com vantagens como baixo

custo, baixa toxidez e obteno de fontes naturais, as antocianinas (ACYS)

despontam com elevado potencial para utilizao em diversas aplicaes

industriais. O uso de ACYS limitado por sua instabilidade em algumas condies

observadas durante o processamento industrial como temperatura, luz, presena

de oxignio. O estudo da degradao trmica de ACYS relevante nesse

contexto j que o processamento industrial de alimentos, sucos e outros produtos

nos quais ACYS podem ser utilizadas, geralmente envolvem etapas de

aquecimento. Mesmo que no haja etapas de aquecimento, a degradao de

ACYS ao longo do tempo outro aspecto relevante para aplicaes em

cosmticos e nutracuticos, por exemplo. Nesses produtos, ACYS podem ser

utilizadas explorando sua capacidade como corante, bem como por suas

propriedades teraputicas.

Nesse trabalho, estudamos condies comuns para essas aplicaes de

ACYS em estudos de estabilidade de extratos de ACYS obtidas de uva (Vitis

vinifera L.Brasil) e jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) ao longo do

tempo e a degradao trmica acelerada desses extratos. Monitoramento

espectrofotomtrico foi utilizado para estudos de degradao, inclusive acelerada

de extratos de ACYS, sendo que a cromatografia lquida de ultra alta eficincia

com deteco por espectrometria de massas (UHPLC-MS) foi aplicada a algumas

amostras degradadas para obter informaes sobre os produtos formados e a

indicao de uma possvel rota envolvida no processo.

Investigaes preliminares, como identificao e quantificao das ACYS e

anlise termogravimtrica trouxeram alguns parmetros de trabalho como a

temperatura mxima de extrao e de monitoramento nos estudos de degradao.

Os resultados obtidos trazem informaes teis para a utilizao de

extratos de ACYS. Temperatura um fator crtico na degradao de ACYS,

portanto, estudos para melhorar condies de processamento industrial e

Coelho, A. G. Dissertao de Mestrado xxiv

armazenamento desses compostos so relevantes j seu uso vem crescendo em

decorrncia de pesquisas sobre potenciais benefcios de seu uso em produtos de

consumo humano e outras aplicaes.

Esta dissertao est dividida em seis captulos:

O primeiro captulo introduz uma reviso com informaes da literatura

sobre ACYS, seus processos de degradao trmica, aplicaes industriais e

implicaes da degradao. Alm disso, tcnicas analticas aplicadas para ACYS

so apresentadas. Uma breve descrio do SISBIO (Sistema de Autorizao e

Informao em Biodiversidade) explica o cadastro necessrio para a realizao

das pesquisas com as frutas utilizadas nesse trabalho. Finalizamos com

informaes gerais sobre as frutas utilizadas no trabalho.

O segundo captulo apresenta os objetivos gerais e especficos que

orientaram a realizao da dissertao.

O terceiro captulo traz a descrio da parte experimental, que foi dividida

em duas fases, alm de um conjunto de testes preliminares comum a todos os

estudos, envolvendo a descrio da obteno dos extratos, a quantificao e a

identificao das ACYS e a anlise termogravimtrica que direcionou a escolha de

alguns parmetros experimentais. A primeira fase descreve os procedimentos de

monitoramento da estabilidade dos extratos obtidos em diferentes temperaturas de

extrao e armazenados a temperatura ambiente ou sob refrigerao, em pH

natural ou ajustado. A segunda fase trata da degradao acelerada dos extratos e

padres e a anlise por UHPLC-MS dos extratos e padres antes e depois da

degradao.

No quarto captulo os resultados so apresentados e discutidos, seguindo a

diviso da parte experimental.

O quinto captulo apresenta as concluses, salientando os pontos

relevantes e conclusivos do trabalho, alm de perspectivas e desdobramentos.

O sexto captulo traz as referncias utilizadas no trabalho.

Coelho, A.G. Captulo 1 Dissertao de Mestrado 1

Captulo 1: Introduo


1. Introduo

A utilizao de corantes naturais que possam substituir corantes artificiais

relevante tendo em vista que corantes artificiais so potencialmente txicos e

podem causar reaes adversas nos consumidores (Ring et al, 2001). Desde

meados da dcada de 1970, alguns corantes vermelhos, por exemplo, tm sido

banidos devido a seus efeitos toxicolgicos (Mazza & Brouillard, 1987).

Corantes so substancias que conferem, intensificam ou restauram a cor de

um alimento e so classificados como aditivos alimentares. No Brasil so 13 os

corantes orgnicos sintticos artificiais permitidos em alimentos (ANVISA), sendo

alguns, azo compostos, que podem ser metabolizados a aminas aromticas e

causar danos aos tecidos heptico e renal (Amin et al,2010).

Por sua vez, corantes naturais, com cores atrativas e possveis aes

benficas sade, despertam o interesse para estudos sobre sua obteno e

conservao. Alm disso, o manejo consciente para favorecer a preservao de

espcies nativas e exticas que so fontes desses corantes tambm torna esses

estudos interessantes.

1.1. Antocianinas

Antocianinas (ACYS) so compostos com diversas caractersticas

interessantes para aplicaes industriais como corantes e podem ser obtidas a

partir de fontes naturais acessveis.

ACYS (do grego anthos = flor e kianos = azul) so corantes que conferem

cores que variam de vermelho ao azul a flores, frutos, folhas, razes e sementes.

So compostos solveis em gua, pertencentes classe dos flavonides, que so

derivados glicosilados do ction 3,5,7,3-tetrahidroxiflavilio, ilustrado na Figura 1.

ACYS apresentam glicosdeos e grupos OH ligados a sua estrutura geral, sendo

muito hidrossolveis e facilmente extradas de plantas utilizando solventes

polares. Cada molcula de antocianina constituda por uma aglicona

(antocianidina), um ou mais grupos de acares e, usualmente, um grupo de

cidos orgnicos (Harbone, 1994). As diferentes substituies nas antocianidinas

originam as vrias ACYS, como indicado na Figura 1.


O interesse em ACYS est relacionado ao potencial de utilizao de ACYS

como corantes em diferentes segmentos da indstria e a diversas propriedades

benficas a sade relacionada a esses compostos (Zhai & Yang, 2010; Pace et al,

2009). O interesse pelos corantes naturais: carotenides, antocianinas e

betacianinas teve impulso na dcada de 1970, quando patentes relacionadas a

aplicao de corantes naturais em alimentos cresceram 100% enquanto o nmero

de patentes relacionadas a compostos sintticos para o mesmo fim, manteve-se

constante (Mazza & Brouillard, 1987 apud Francis, 1984).

O+

R

OH

R'

OH

OH

OR"

Figura 1: Estrutura ction flavilio, sendo que antocianinas tm R = unidade glicosdica. Se R= H, tm-se antocianidinas.

Propriedade antioxidante (Pace et al, 2009; Patras et al,2010; Sendra et al,

2010, Wrolstad, 2004; Wang, 2008), atividade redutora de doenas coronrias e

cardacas, reduo de riscos de acidente vascular cerebral, atividade

anticarcinognica (Jing et al, 2008; Wrolstad, 2004), efeitos anti-inflamatrios,

melhora da acuidade visual (Wrolstad, 2004), so alguns efeitos associados a

ACYS que vem sendo estudados recentemente com indicativos positivos quanto a

bioatividade dos corantes antocinicos.

A estrutura fenlica das ACYS contribui para sua ao antioxidante. A

inativao de espcies reativas de oxignio foi demonstrada por Wang em cultura

de clulas diversas (Wang, 2008), bem como a capacidade de desativar radicais

livres (Nagai et al, 2005). Resultados dos testes da atividade antioxidante de

corantes antocinicos em temperatura ambiente pelo mtodo de descolorao do

radical ABTS+ 1 (Malacrida, 2006) e da reao com DPPH 2 (Sun et al, 2009)

1 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato

2 1,1-difenil-2- picrilhidrazina

Antocianidina Grupo R Grupo R

Cianidina OH H

Delfinidina OH OH

Malvidina OCH3 OCH3

Pelargonidina H H

Peonidina OCH3 H

Petunidina OCH3 OH


tambm demonstraram a atividade antioxidante desses compostos.

Adicionalmente, algumas ACYS quelam metais, inibindo a peroxidao (Smyk et

al, 2008) em processo tambm relacionado com ao antioxidante.

1.2. Aplicao industrial

Corantes naturais despertam o interesse da indstria de diversos

segmentos como alimentcia (Giusti & Wrolstad, 2003; Costa et al, 2000), de

cosmtico (Longo et al, 2007; Valls et al,2009; Yang & Zhai, 2010), cosmecutica

(Ben Amor & Allaf, 2009), nutracutica (Mauro et al, 2002; Bordignon-Luiz et al,

2007, Ersus & Yurdagel, 2007) e farmacutica (Ben Amor & Allaf, 2009; Ersus &

Yurdagel, 2007). Cor um aspecto importante que determina a aceitao de

produtos alimentcios, pois os consumidores a associam qualidade dos produtos.

Essa relao estimula os fabricantes incorporarem corantes aos alimentos

industrializados, inclusive como indicativo de sua qualidade (Mazza & Brouillard,

1987; Giusti & Wrolstad, 2003). As aplicaes de ACYS consideram seu potencial

como corante bem como propriedades teraputicas inerentes a esses compostos.

ACYS podem se adequar a aplicaes industriais por apresentarem poder

corante e caractersticas como alta solubilidade em gua e baixa toxicidade (Burin

et al, 2011; Ersus & Yurdagel, 2007 ). Entretanto, a despeito desses atrativos, a

aplicao desses corantes reduzida devido a alguns fatores crticos. A baixa

estabilidade qumica, a dificuldade de purificao e, consequentemente, baixa

disponibilidade comercial das ACYS e o custo elevado, bem como a pequena

capacidade corante em relao a compostos sintticos, limitam a ampliao das

aplicaes de ACYS (Mazza & Brouillard, 1987 apud Ribon, 1977). Outros fatores

limitantes so relacionados ao fato da cor de ACYS ser facilmente afetada por

reaes comuns em produtos alimentcios, alm da foto-sensibilidade, e a

susceptibilidade degradao trmica (Wrolstad, 2004). Diante disso, diversos

estudos so realizados buscando condies que mantenham caractersticas

funcionais, cor e garantam extraes de quantidades significativas de ACYS

visando fomentar sua aplicao industrial.


1.3 Degradao de antocianinas

Vrios fatores interferem na estabilidade de ACYS, incluindo pH, ao de

oxignio, enzimas, variao de temperatura e incidncia de luz (Alighourchi &

Barzegar, 2009). Variaes do pH do meio, por exemplo, causam alteraes de

cor, com quebra de suas molculas em meio fortemente alcalino, com a formao

de chalconas como mostra a Figura 2. Em meio cido, ACYS so mais estveis na

forma predominante do ction flavlio. Com o aumento do pH para valores em

torno de 6 predomina a anidrobase de cor violeta, e com aumentos sucessivos do

pH em torno de 14, ocorre a quebra do anel pirlio (Adams, 1973) com a

converso irreversvel de ACYS a uma molcula de chalcona de cor amarela. A

Figura 3 apresenta as alteraes da cor de uma soluo aquosa de uva com a

variao do pH, obtidas nesse trabalho que ilustra tais alteraes.

Figura 2: Mudanas estruturais das ACYS em funo do pH (TERCI e ROSSI, 2002).


Figura 3: Variao da cor de solues aquosas de ACYS obtidas de uva em funo do pH. ACYS de uva com solues de pH conhecido variando de 1 a 14 da esquerda para direita.

A degradao de ACYS pode ocorrer por dois caminhos, formando

chalconas e glicosdeos cumarnicos ou aldedos e derivados do cido benzico

(Seeram et al, 2001). A degradao trmica de ACYS com a formao de aldedos

e derivados do cido benzico, representada na Figura 4, inicialmente ocorre uma

clivagem com perda dos glicosdeos ligados s ACYS. Em seguida as molculas

passam por outros processos de clivagem que originam os derivados do cido

benzico e aldedos. Protoglucinaldedo e cido p-hidroxibenzico so

apresentados como produtos da degradao trmica de ACYS (Adams, 1973;

Seeram et al, 2001; Patras et al, 2010).

Alm do pH e da temperatura, outro fator que pode causar rpida oxidao

das ACYS a presena de enzimas, como a polifenoloxidase (PPO) que catalisa

a oxidao de ACYS a cidos derivados de o-difnois e o-quinonas, de colorao

marrom. A estrutura de algumas ACYS pode dificultar a atividade de PPO, os

glicosdeos podem servir como impedimento para o ataque dessa enzima,

entretanto a atividade da -glisosidase, que remove os acares formando

antocianidinas, favorece a atividade da PPO (Shamir, 2009; Buckow et al, 2010).


O+

OH

OH

OH

O Gli

O+

OHOH

OH

OH

O Gli

O+

OH

OH

OHOH

OH

O+

OH

OH

OH

OH

OHOH

OH

O

OH

OH

OH

H

O

OH

OH

O

Deglicosilao

Deglicosilao

Clivagem

Clivagem

Clivagem

Pelargonidina

Cianidina-3-glicosdeo Cianidina

cido Protocateco

Protoglucinaldedo

cido 4-hidroxibenzoco

Pelargonidina-3-glicosdeo

Figura 4: Possvel mecanismo de degradao trmica de ACYS (Original em Patras et al, 2010).

1.3.1 Degradao trmica de antocianinas

A degradao das ACYS implica na perda da colorao caracterstica

desses compostos e das suas propriedades funcionais, o que compromete sua

aplicao como corante.

Os estudos sobre a degradao desses corantes esto relacionados a

condies comuns de processamento industrial, tais como, aquecimento,

exposio luz, variaes de pH, condies de armazenamento e estocagem.

Essas condies influenciam diretamente o tempo de prateleira de extratos e de

produtos contendo ACYS. A instabilidade trmica e a susceptibilidade desses

compostos e a degradao so fatores que precisam ser investigados para

garantir que suas propriedades e funcionalidades possam ser aproveitadas nas

aplicaes. Processos de degradao de ACYS podem levar a perda de cor e

tambm a formao de compostos marrons insolveis (Xu et al, 2007), o que pode

comprometer a qualidade dos produtos.

Diversos estudos sobre a estabilidade de ACYS em diferentes condies j

foram realizados. Estudos com sucos, extratos e concentrados de ACYS para


avaliar a influncia de fatores como: pH, luz, oxignio, enzimas, acares, cido

ascrbico, dixido de enxofre, sulfitos, metais e copigmentos que so fatores que

reconhecidamente afetam a estabilidade de ACYS e podem limitar suas

aplicaes industriais (Wang & Xu, 2007; Ersus & Yurdagel, 2007; Giusti &

Wrolstad, 1999;). Aquecimento normalmente empregado para extrao de

ACYS, alm disso, tratamentos trmicos so utilizados para esterilizar os extratos

e manter suas cores caractersticas, inativando enzimas em processos de

pasteurizao (Harboune et al, 2008 apud Lund, 1982) e branqueamento

(Sampaio, 2008), por exemplo. Como esses tratamentos chegam a ser

indispensveis, a composio e a concentrao dos extratos de ACYS devem ser

monitoradas para assegurar sua qualidade e dos produtos finais contendo ACYS.

Estudos envolvendo a degradao de ACYS indicam a estabilidade de

sucos de mirtilo (blueberry) a temperaturas de at 60 C e destacam a acelerao

da degradao com o aumento da temperatura. Amostras incubadas a 80, 90,

100, 110, e 115 C apresentaram perda de 50% das ACYS em intervalos de tempo

de 180, 115, 40, 15 e 10 minutos (Buckow et al, 2010). Essa fruta contm

predominantemente malvidina-3-glicosdeo e delfinidina-3-glicosdeo e pequenas

quantidades de peonidina-3-glicosdeo e petunidina-3-glicosdeo. Segundo os

autores a estabilidade trmica de diferentes sucos varia com as diferentes ACYS

encontradas em cada fruta. A estabilidade trmica tende a diminuir com o nmero

de hidroxilas ligadas a antocianina e com a posio dos glicosdeos, indicando a

correlao entre a estrutura qumica e a estabilidade das ACYS.

Yang et al (2008) estudaram a cintica de degradao trmica de ACYS de

milho roxo, variedade originalmente cultivada na Amrica Latina e, atualmente, na

China. Esse milho contm cianidina-3-glicosdeo, pelargonidina-3-glicosdeo e

peonidina-3-glicosdeo. Ajustes indicam que os processos de degradao de

extratos aquosos dessas amostras a 70, 80 e 90 C seguem perfil de primeira

ordem. Os autores destacam a maior estabilidade das amostras de ACYS obtidas

do milho quando comparadas a ACYS obtidas de amoras silvestres (blackberry),

indicando que a susceptibilidade trmica das amostras de ACYS depende da

composio que apresentam.


Um estudo da estabilidade trmica de ACYS em sucos concentrados de

uma variedade de laranja conhecida como blood oranges que contm ACYS, foi

realizado entre 70 e 90 C, sendo que os resultados sugerem cintica de primeira

ordem para a degradao das ACYS. A degradao nas amostras de sucos

concentrados mais rpida provavelmente devido ao favorecimento das

interaes entre molculas de ACYS com o efeito da concentrao. Os autores

sugerem que devido instabilidade das ACYS dessa fruta, os sucos s devem ser

comercializados aps tratamentos de estabilizao (Kirca & Cemeroglu, 2003).

Os diversos estudos na literatura apontam que a degradao de ACYS

segue processos de primeira ordem (Adams, 1973; Alighourchi & Barzegar, 2009;

Wang & Xu, 2007; Kirca & Cemeroglu, 2003). Todos os estudos disponveis

apontam a importncia dos estudos de estabilidade de ACYS para viabilizar sua

aplicao industrial em diversos segmentos. consenso o grande efeito da

temperatura na degradao desses compostos e a relevncia desses estudos

para garantir a qualidade dos extratos e ampliar as aplicaes das ACYS.

Introduzimos neste trabalho, os estudos da degradao trmica de extratos

de uva e jabuticaba, buscando elucidar o efeito da temperatura e a influncia na

degradao desses extratos e as possveis consequncias do processo de

degradao no tempo de prateleiras de extratos e de produtos contendo ACYS.

1.4 Copigmentao

Um fator relevante para estabilizar ACYS conhecido como

copigmentao. Esse fenmeno decorrente de interaes entre ACYS e seus

copigmentos, que podem ser compostos fenlicos como flavonoides e flavonas, ou

alcaloides, cidos orgnicos dentre outros, normalmente sem cor, aos quais

quando em solues de ACYS produzem efeito hipercrmico e deslocamento

batocrmico no espectro de absoro no UV-Vis (Castaeda-Ovanda et al, 2009).

Em geral, os complexos formados por copigmentao tm configurao que

protege o ction flavlio de ataques nucleoflicos, reduzindo a formao de carbinol

e chalconas (Gonzlez-Manzano et al,2009). Na copigmentao podem ocorrer

quatro diferentes tipos de associaes: a auto-associao; a copigmentao


intramolecular e copigmentao intermolecular, associao com metais

(Cavalcanti et al, 2011).

A auto-associao ocorre quando duas ou mais molculas de ACYS se

associam. O mecanismo de auto-associao proposto como um empilhamento

vertical das ACYS. Essa estrutura estabilizada atravs de interaes

hidrofbicas criadas entre os ncleos aromticos (Cavalcanti et al, 2011).

A copigmentao intramolecular (Figura 5) envolve interao do grupo

cromforo da molcula de antocianina e seu copigmento, com ligao covalente a

partir de um mesmo glicosdeo. A interao ocorre pelo alinhamento do grupo

aromtico do glicosdeo com o ction flavlio, o que desfavorece o processo de

hidratao nas posies 2 e 4 do anel pirlio (Brouillard,1983).

Figura 5: Modelo hipottico da copigmentao intramolecular de antocianinas adaptado de Falco et al, 2003)

A copigmentao intermolecular (Figura 6) a interao entre a antocianina

e um copigmento sem cor que no est ligado covalentemente molcula de

antocianina. Foras de Van der Waals, efeito hidrofbico e interaes inicas so

mecanismos sugeridos como as foras que dirigem a copigmentao

intermolecular (Brouillard,1983).


Figura 6: Modelos de interaes intermoleculares entre delfinidina-3-glicosdeo e rutina (adaptado de Rein, 2005).

A associao com metais outro fenmeno de copigmentao que

estabiliza ACYS que contm grupos hidroxila livres no anel B, capazes de quelar

metais. Os complexos mais comuns so formados com ferro, magnsio, clcio,

alumnio, estanho (Cavalcanti et al, 2011)

1.5 Tcnicas analticas utilizadas no estudo de antocianinas

Distintas tcnicas analticas so utilizadas para o estudo de ACYS em

procedimentos de quantificao, monitoramento e identificao em extratos e

amostras contendo ACYS.

Espectrofotometria uma tcnica muito utilizada para obteno de

informaes quantitativas de ACYS devido ao perfil espectral desses compostos, a

simplicidade e o baixo custo da tcnica (Castaeda-Ovando et al, 2009). O

mtodo oficial da AOAC (Association of Analytical Communities) para

quantificao de ACYS monomricas totais sucos (Lee et al, 2005) realizado

com medidas espectrofotomtricas e baseia-se nas alteraes estruturais das

molculas de ACYS em funo do pH do meio. As absorbncias de solues

contendo ACYS em pH 1,0 e 4,5 so medidas no comprimento de onda de

absoro mximo a pH 1,0 e a 700 nm (este ltimo comprimento de onda para

correo de eventual absoro de materiais particulados segundo recomendao

dos autores). A quantidade de ACYS total calculada pela equao 1:


10FDMAACYS

3

mg/Ltotais Equao 1

Onde: A = (A mx- A 700nm) pH 1,0 (A mx A 700nm) pH 4,5, M = massa molar, FD = fator de

diluio, = absortividade molar da cianidina-3-glicosdeo, considerando-se cela com

caminho ptico unitrio.

A figura 7 mostra os espectros eletrnicos tpicos de solues de ACYS em

pH 1,0 e 4,5 e a variao estrutural de acordo com o pH.

Figura 7: Espectro eletrnico de ACYS em solues de pH 1,0 e 4,5 e estrutura do ction flavlio (A) e hemiacetal(B). R= H ou substituinte glicosilado (adaptado de Wrolstad et al, 2005)

Tcnicas cromatogrficas so utilizadas para isolamento, identificao e

quantificao de ACYS. Cromatografias em papel e em camada delgada j foram

utilizadas para separao desses corantes (Terci, 2004). Atualmente,

cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) uma das tcnicas

cromatogrficas mais utilizadas no estudo de ACYS, com a aplicao de mtodos

diretos que utilizam padro de ACYS e mtodos indiretos, que no utilizam esses

padres (Campos, 2006).

Absorb

ncia


Um mtodo de identificao indireta de ACYS foi proposto por Goiffon e

colaboradores, 1999, com HPLC em fase reversa e misturas de gua, acetonitrila

e cido frmico como eluente. A identificao indireta de ACYS por esse mtodo

realizada comparando-se tempos de reteno das ACYS presentes na amostra

em relao ao tempo morto, com o tempo de reteno da cianidina-3-glicosdeo

que comumente encontrada em frutas vermelhas, tambm em relao ao tempo

morto. O resultado comparado com valores previamente definidos e representa

uma opo acessvel para identificao inicial de ACYS (Favaro, 2008).

Outra tcnica cromatogrfica que vem se destacando no estudo de ACYS

a cromatografia lquida de ultra alta eficincia (UHPLC). A utilizao de colunas

com partculas de 1,7 m ao invs de 3,5 m como em HPLC pode trazer a

diminuio da ordem de quatro vezes no tempo de anlises, (Serra et al, 2011)

aliadas a economia significativa de fase mvel e amostras, desde que o preparo

de amostras seja adequado. A economia de amostras importante para estudos

com ACYS tendo em vista o alto custo de padres desses compostos. Outro fator

relevante a aplicao da tcnica para monitoramento de ACYS em amostras de

fludos biolgicos, em estudos clnicos e farmacocinticos, para os quais

pequenas quantidades de amostras podem estar disponveis (Ling et al, 2009).

Espectrometria de massas (MS) se destaca na identificao de ACYS.

Estudos relacionados elucidao estrutural, transformaes durante

envelhecimento de vinhos tintos, polimerizao e reao com outros flavonides

(Castaeda-Ovando et al, 2009; Villiers et al, 2011) so aplicaes desta tcnica

relacionadas com ACYS. MS apresenta sensibilidade e seletividade adequadas a

identificao de amostras, sendo usualmente acoplada a UHPLC, (Gonzalo et al,

2004; Lee et al, 2008; Vidal et al, 2009; Huang et al, 2009). A identificao

satisfatria principalmente com espectrometria de massas sequencial, que permite

selecionar ons de interesse para fragmentaes adicionais que em geral

fornecem mais informaes sobre a estrutura das amostras (Steimer & Sjberg,

2011). Para molculas termicamente instveis, como protenas e ACYS,

adequado aplicar-se ionizao por eletrospray (ESI) que permite que os ons e

fragmentos permaneam intactos para a identificao (Huang et al, 2009;


Castaeda-Ovando et al, 2009). Recentemente, mtodos LC-ESI/MS-MS foram

descritos e vem sendo aplicados para quantificar ACYS em plasma humano e

amostras biolgicas (Ling et al, 2009).

Eletroforese capilar (CE) uma tcnica relativamente nova com

caracteristicas como alta resoluo, baixo consumo de amostra e de resduo

gerado, que pode ser aplicada para separao, quantificao e identificao de

ACYS. Como exemplo, h trabalhos de separao ACYS de blackcurrant por CE

utilizando capilar de slica fundida, tampo fosfato (pH 1,8) e acetronitrila (da

Costa et al, 2000; Senz-Lpez et al 2003; Castaeda-Ovando et al, 2009). Bridle

& Grcia- Viguera, num dos primeiros trabalhos de anlises de ACYS por CE

descreveram o uso de tampes de pH ~ 8 e deteco em 560 nm e obtiveram baixa

resoluo e sensibilidade devido a instabilidade das ACYS nesse pH, s foram

obtidos resultados com amostras muito concentradas. Outro mtodo encontrado

utilizou tampo fosfato em pH 2,1 e CTAB como surfactante cationico, para

revestir a parede do capilar e evitar o contato das ACYS com as paredes do

capilar, alm de promover a inverso do fluxo eletrosmotico afetando os

resultados de separao e quantificao (Castaneda-Ovando, 2009) .A anlise de

ACYS por CE tem dificuldades e tcnicas de inverso de fluxo e recobrimento de

capilares representam possibilidades a serem exploradas.

Ressonncia magntica nuclear (RMN) outra tcnica que vem sendo

utilizada para elucidao estrutural de ACYS e pode ser util tambm para

identificar produtos de reao de ACYS como no caso de derivados dos cidos

cinamico, radicais perxido, catechinas e flavonis (Castaneda-Ovando, 2009 ).


1.6 Frutas utilizadas como fontes de antocianinas

1.6.1 Uva Brasil

A uva Brasil (Vitis vinifera L. Brasil`) um tipo ou clone da cultivar Itlia

(Vitis vinifera L.) que surgiu em 1991 na regio de Flora no Paran. A uva Brasil

derivada da cultivar Benitaka. A Figura 8 apresenta imagem dos frutos de Vitis

vinifera L. e de diferentes cultivares.

Figura 8: Frutos de Vitis vinifera L. A) cv. Itlia, B) cv. Rubi, C) cv.Benitaka, D) Brasil (Oliveira-Collet et al 2005)

As cultivares Itlia, e variedades Rubi, Benitaka e Brasil de Vitis vinifera

L. so uvas finas de mesa pela qualidade e aparncia de seus frutos, cultivadas

na regio noroeste do estado do Paran. Sua origem estaria relacionada com

mutaes somticas ocorridas em setores da cultivar Itlia, originando as

variedades Rubi e Benitaka, e em setores de Benitaka, originando a variedade.

Brasil. A cultivar Itlia e suas mutaes apresentam poucas diferenas

morfolgicas, e, em nvel bioqumico e molecular, devido s semelhanas entre

essas frutas, no so classificados como cultivares diferentes, so considerados

tipos ou clones diferentes da cultivar Itlia (Oliveira-Collet et al 2005).

A Figura 9 apresenta um esquema com a origem das variedades Rubi,

Benitaka e Brasil.


Figura 9: Origem das variedades Rubi e Benitaka a partir da Itlia (1972 em Santa Mariana e 1988 em Flora, respectivamente) e da variedade Brasil a partir da Benitaka (1991 na regio de Flora). Original em Oliveira-Collet et al 2005.

A escolha da variedade Brasil para os estudos realizados neste trabalho foi

devido forte colorao da casca desta variedade, que um forte indicativo de

quantidades significativas de ACYS. Alm disso, a ausncia de dados na literatura

sobre essa fruta tambm foi considerada. A Figura 10 apresenta imagens das

frutas utilizadas no trabalho.

Figura 10: Uva Brasil utilizada no trabalho.

1.6.2 Jabuticaba

Jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) uma espcie nativa

brasileira pertencente famlia das Myrtaceae, encontrada do Par ao Rio Grande

do Sul. Os frutos negros (Figura 11) so bagas globosas cujo epicarpo varia de

roxo-escuro a preto. A polpa macia, branca, suculenta e de sabor cido (Citadin

et al, 2005) os frutos crescem fixados ao tronco da rvore. Os frutos podem ser


consumidos in natura ou podem ser utilizados para fabricao de geleias, sucos,

chs e licores. (Barros et al,1996)

Figura 11: Frutos de jabuticaba

O fato de a jabuticaba ser nativa e a escassez de dados da literatura de

estudos relacionados a degradao trmica de ACYS dessa fruta motivaram os

estudos dos extratos obtidos da casca da jabuticaba. A utilizao industrial dos

frutos da jabuticabeira poder contribuir para o manejo consciente e aumento do

cultivo desta espcie.

1.7 Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade

(SISBIO)

O Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade (SISBIO) um

sistema automatizado e simplificado que envolve autorizaes e licenas para

atividades com finalidade cientfica e didtica que envolva recursos naturais ou o

acesso a unidades de conservao federal. O SISBIO foi criado seguindo

diretrizes da Instruo Normativa n. 154/2007 do IBAMA (Instituto Brasileiro do

Meio Ambiente e dos Recursos naturais Renovveis), que regulamenta a coleta e

o transporte de material biolgico para fins cientficos e didticos, alm de unificar

os instrumentos legais referentes s atividades de pesquisa. Vale destacar o

Cadastro Nacional de Colees Biolgicas que foi criado para facilitar o


intercmbio cientfico de espcimes necessrios para realizar investigaes

taxonmicas e sobre a conservao das espcies.

O cadastro no SISBIO foi realizado para obteno da autorizao para

atividades com finalidade cientfica coleta e transporte de material botnico

(SISBIO, 2010). O cadastro da Profa. Dra. Adriana Vitorino Rossi e de Aline

Guadalupe Coelho foram realizados e os registros so 5092212 e 5111503, respectivamente.


Captulo 2: Objetivos


2. Objetivos

2.1 Gerais:

Estudar a degradao trmica de ACYS.

2.2 Especficos:

Estudar o efeito das temperaturas de extrao e armazenamento na

estabilidade de extratos de ACYS, obtidos a partir de uva Brasil (Vitis

vinifera L. cv. Brasil) e jabuticaba (Myrciaria cauliflora);

Estudar a degradao trmica acelerada simulada dos extratos e de

padres de cianidina-3-glicosdeo e malvidina-3-glicosdeo;

Obter informaes cinticas sobre a degradao trmica e os possveis

produtos formados.

Avaliar a estabilidade e a degradao dos extratos utilizando-se

espectrofotometria, cromatografia lquida de alta eficincia e espectrometria

de massas.


Captulo 3: Parte experimental


3. Parte experimental

3.1 Consideraes gerais

Os procedimentos experimentais foram divididos em duas fases alm de

um conjunto de procedimentos preliminares comum a todos os estudos: a

obteno dos extratos, a quantificao e identificao das ACYS e a anlise

termogravimtrica dos extratos. A primeira fase envolveu o estudo da estabilidade

de extratos de ACYS ao longo do tempo em diferentes condies de pH,

temperatura de extrao e temperatura de armazenamento. A segunda fase

relacionou-se com a simulao de degradao acelerada dos extratos e padres

de ACYS, alm de estudos dos produtos de degradao gerados.

3.2 Equipamentos, materiais e reagentes.

3.2.1 Equipamentos

Refrigerador GE TMNF-E;

Banho termosttico RC6 LAUDA;

Bomba de vcuo TE-0581 Tecnal;

Cromatgrafo Shimadzu Prominece, coluna C18 Varian Microsorb MV,

tipo ODS2, com 25,0 cm de comprimento e 4,6 mm de dimetro

interno, com tamanho de partcula = 5 m e tamanho de poro = 100 ,

com eluio isocrtica em fase reversa e detector com arranjo de

diodos SPD-M20A;

Espectrofotmetro Biotech Pharmacia Ultrospech 2000;

Analisador termogravimtrico TGA 2050 TA Instruments.

Espectrmetro de massas LC-MS/MS Waters Ultra Performance LC

Acquity ionizao por eletrospray (ESI) coluna Acquity UHPLC BEH


C18 1,7 m com 2,1 mm x 50 mm;e detector Triplo Quadrupolo (TQD)

Quattro Micro API, eluio por gradiente.

Micro centrfuga Centrifuge 5424 Eppendorf

3.2.2 Materiais

Vidraria de uso comum em laboratrio;

Papel de filtro quantitativo - Qualy filtrao lenta;

Cartucho C18 para SPE - Varian, 1000 mg;

Filtros de membrana Millipore 0,45 m;

Celas de acrlico, caminho ptico de 1 cm - Plastibrand.

3.2.3 Padres de ACYS

Cianidina-3-glicosdeo 99,0% (Sigma-Aldrich),

Malvidina-3-glicosdeo 99,0% (Sigma-Aldrich).

3.2.4 Reagentes

cido clordrico 36,5-38,0% v/v (Synth);

cido frmico 85,0% v/v (Synth);

cido ctrico 99% (Synth);

Acetonitrila grau HPLC (Carlo Erba);

gua destilada (destilador de vidro);

gua deionizada (Millipore);

Cloreto de potssio 99,0% (Synth);

Fosfato cido de sdio 99% (Synth);


Metanol grau HPLC (Synth);

As frutas utilizadas neste trabalho foram Vitis vinifera L. cv. Brasil (Uva

Brasil) e Myrciaria cauliflora (Jabuticaba). As uvas foram adquiridas no comrcio

varejista local em um nico lote e armazenadas em congelador domstico. As

jabuticabas foram colhidas na cidade de Casa Branca-SP e fornecidas congeladas

pela empresa Anidro do Brasil Extraes Ltda tambm em um nico lote. Para

realizao dos experimentos, as pores necessrias de frutas eram removidas do

congelador e mantidas a temperatura ambiente at degelo.

3.3. Procedimentos preliminares

3.3.1. Obteno de extratos

3.3.1.1. Obteno dos extratos brutos utilizados na fase 1

Extratos de uva e de jabuticaba foram preparados separadamente em

triplicata, imergindo-se 30 g de cascas das frutas em 90 mL de gua destilada, sob

termostatizao por 30 minutos a 25, 55 e 85 C, seguindo-se filtrao vcuo em

papel quantitativo. Os extratos brutos obtidos nessa extrao foram identificados e

armazenados em frascos mbar.

3.3.1.2. Obteno dos extratos brutos utilizados na fase 2

O mesmo procedimento do item 3.3.1.1 foi seguido, exclusivamente a 55 C.

3.3.1.3. Obteno dos extratos secos

Extratos de uva e de jabuticaba foram preparados em triplicata de acordo

com o item 3.3.1.2 e transferidos para placas de petri para secagem sob fluxo de

ar em capela laboratorial vazo 0,6 m/s com abertura de 28 cm por 24 horas

(Favaro, 2008).

3.3.1.4 Quantificao das ACYS totais

A quantificao das ACYS foi realizada pelo mtodo oficial (Lee et al, 2005),

que envolve a diluio da amostra em solues de pH 1,0 e 4,5 e medidas de


absorbncia no comprimento de onda de mxima absoro da soluo em pH 1,0

e a 700 nm

Alquotas de 750 L de trs amostras para cada condio dos extratos

aquosos brutos foram diludos com solues de pH 1,0 preparados com HCl

0,2 mol/L em KCl 0,2 mol/L e pH 4,5 preparados com fosfato cido de sdio

0,2 mol/L e cido ctrico 0,1 mol/L. A absorbncia das solues foi medida em

525 nm e 700 nm em espectrofotmetro com celas de 1,0 cm de caminho tico.

3.3.1.5. Purificao dos extratos por extrao em fase slida

Os extratos de uva e jabuticaba trs amostras de cada fruta, obtidos como

descrito no item 3.3.1.2 foram purificados em cartuchos C18 para extrao em

fase slida (SPE). Este procedimento foi otimizado anteriormente no GPQUAE

(Campos, 2006) e foi utilizado para separar as ACYS de outros constituintes dos

extratos. Previamente, o cartucho foi condicionado pela percolao de 10 mL de

metanol e 10 mL de gua deionizada. A concentrao de ACYS dos extratos foi

calculada pelo mtodo oficial (Lee et al, 2005) e utilizou-se volume de extrato que

no ultrapassasse 0,1 % da massa do sorvente seguindo recomendao do

fabricante. Sendo assim, 4,3 mL de extrato bruto de uva e 18 mL de extrato bruto

de jabuticaba foram percolados pelo cartucho e eludos com 3 mL de HCl 0,01%

(v/v) em metanol(Campos, 2006; Sampaio, 2008; Favaro, 2008). O extrato

percolado foi seco sob fluxo de ar para que o metanol evaporasse e o extrato seco

obtido foi dissolvido em 5 mL de gua e acondicionado em frascos mbar a 8 C .

3.3.2. Identificao de ACYS

3.3.2.1. Mtodo de Goiffon et al

A identificao das ACYS nos extratos foi realizada pelo mtodo proposto por

Goiffon e colaboradores (1999). Trs amostras de 50 mg do extrato seco de uva e

e duas amostras de extrato seco de jabuticaba, foram solubilizados em 5 mL de

metanol com 0,1 % de HCl (v/v) condies otimizadas por Sampaio (2008). As

amostras foram analisadas em cromatgrafo com eluio isocrtica em fase


reversa e deteco espectrofotomtrica. Como fase mvel, foi utilizada a mistura

de gua deionizada:acetonitrila:cido frmico na proporo 81:9:10 (v/v/v), com

vazo da fase mvel de 1,0 mL/min, volume de injeo de 20 L e tempo de

eluio de 40 minutos (Sampaio, 2008; Favaro, 2008).

3.3.2.2 Identificao de ACYS por UHPLC

Os extratos aquosos obtidos como descrito nos itens 3.3.1.2 e 3.3.1.5 foram

diludos e filtrados em filtro de seringa de 0,45 m. Antes da injeo, as amostras

foram centrifugadas por 8 min a 12000 rpm. Posteriormente, foram injetadas 10 L

no UHPLC-MS, com eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B

(acetonitrila:cido frmico 0,1%)(Adaptado de Goiffon et al, 1999 e Favaro, 2008) ,


inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A e 20 % de B, 8 a 10

minutos: 70% de A e 30% de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B.

Condies MS: Capilar 0,80 KV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V,

temperatura da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. Os

dados obtidos foram tratados no programa de aquisio Mass Lynx V 4.1 em

modo off-line.

3.3.3 Anlise termogravimtrica

A anlise termogravimtrica foi realizada com trs amostras de 15 mg de

extrato seco de uva e trs amostras de 30 mg de extrato seco de jabuticaba. Os

termogramas foram obtidos no analisador termogravimtrico com rampa de

aquecimento de 20 a 1000 C, a 10 C/min.

3.4 Fase 1- Monitoramento da degradao

3.4.1 Monitoramento de degradao

Para o estudo da degradao dos extratos de uva e jabuticaba, triplicatas dos

extratos de cada fruta foram obtidos a 25, 55 e 85 C. Algumas amostras tiveram o

pH ajustado para 3,0 com soluo de HCl 0,2 mol/L em KCl 0,2 mol/L e nas


demais manteve-se o pH natural (4,5 0,1 para os extratos de uva e 3,5 0,1

para os de jabuticaba).

Para armazenamento e monitoramento da degradao, metade dos extratos

foi mantida temperatura ambiente e os demais foram armazenados sob

refrigerao a 8 C, por at 170 dias, todos em frascos de vidro mbar.

Quinzenalmente, foram obtidos espectros de 400 a 800 nm dos extratos em celas

de acrlico com caminho ptico de 1 cm.

3.5 Fase 2 Monitoramento da degradao acelerada

3.5.1 Degradao dos extratos e padres

Para simulao de degradao dos extratos de ACYS, trs amostras em

duplicata dos extratos brutos e purificados separadamente foram diludos com

gua destilada na proporo 1:3 (v/v) em tubo de ensaio, fechado com papel

alumnio (para evitar perdas por evaporao) e aquecidos a 55 e 85 C em banho

termostatizado. A degradao foi monitorada espectrofotometricamente por 70

horas para os extratos brutos aquecidos a 55 C, por 10 horas para os aquecidos

a 85 C. Para os extratos purificados, o monitoramento foi de 120 horas para os

extratos aquecidos a 55 C e por 18 horas para os aquecidos a 85 C.

Os ensaios de degradao de solues de padres de ACYS foram

realizados em duplicatas, utilizando-se 4 mL de solues 125 mg/L de malvidina-

3-glicosdeo e cianidina-3-glicosdeo. Seguiu-se o mesmo procedimento usado

com os extratos, com monitoramento de 55 horas os padres aquecidos a 55 C e

por 11 horas aqueles mantidos a 85 C.

Extratos e padres submetidos a esse processo foram resfriados, filtrados

em filtro de membrana de 0,45 m e acondicionados em frascos mbar sob

refrigerao a 8 C para posterior anlise por UHPLC-MS.

3.5.2 Anlises por UHPLC-MS

Todos os extratos e padres antes da degradao e os degradados conforme

os itens 3.5.1 foram filtrados em filtro de membrana de 0,45 m diludos


adequadamente em gua deionizada e centrifugadas por 8 min a 12000 rpm.

Posteriormente, foram injetados 10 L de cada amostra no UHPLC-MS, com

eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico

0,1%), tempo de eluio de 12 minutos, vazo da fase mvel:0,35 mL/min,

gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A e 20 % de B, 8 a

10 minutos: 70% de A e 30% de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B.

Condies: Capilar 0,80 KV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura

da fonte = 120 C e temperatura de dessolvatao = 400 C. Optou-se pala

utilizao apenas do primeiro quadrupolo para a maioria das amostras. Entretanto

na busca de dados mais detalhados, utilizou-se tambm o segundo quadrupolo

para algumas amostras. O intervalo de tempos de reteno e a on molecular da

antocianina de interesse, foram selecionados e as corridas realizadas nas

condies apresentadas anteriormente.

Os dados obtidos foram tratados no programa de aquisio Mass Lynx V 4.1

em modo off-line.


Captulo 4: Resultados e discusso


4. Resultados e discusso

4.1 Estudos preliminares

ACYS so compostos fenlicos pertencentes classe dos flavonides.

Esses compostos apresentam absoro caractersticas na regio do visvel, com

mximo de absoro entre 510 e 540 nm, valores relacionados com o padro de

hidroxilao das antocianidinas e a posio de fixao do acar nas molculas

(Goiffon et al,1999). Esse padro pode ser observado na Figura 12 que apresenta

espectros eletrnicos obtidos a partir dos extratos brutos de jabuticaba e uva,

respectivamente. Os espectros eletrnicos so teis como indicativo da presena

de ACYS em uma amostra, entretanto como pode ser observado nos espectros

eletrnicos, no possvel distinguir diferentes ACYS apenas com esses dados.

400 500 600 700

0,0

0,5

1,0

1,5

Ab

so

rb

ncia

(nm)

400 500 600 700

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Ab

so

rb

ncia

(nm)

Figura 12: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de jabuticaba e uva, respectivamente, extrado a 55 C, tendo gua destilada como branco.

4.1.1 Quantificao das ACYS

A concentrao de ACYS nos extratos foi obtida pelo mtodo oficial, com

tcnica espectrofotomtrica, com base nas mudanas estruturais das ACYS em

pH 1,0 e 4,5 (Lee et al, 2005). Os resultados em termos de concentrao de ACYS

totais obtidas a partir de extrao aquosa realizada em triplicatas e diferentes

temperaturas so apresentados na Tabela 1.


Tabela 1: Concentrao mdia de ACYS extrada com gua em diferentes temperaturas.

Fruta Temperatura (C) Concentrao* (mg/L)

Concentr

000843784.pdf

Documents

Transcript of 000843784.pdf