COMPARAÇÃO IN VITRO DA REATIVIDADE DE DIFERENTES BIOCERÂMICAS NA FORMA DE PÓS E GRÂNULOS

Silva, S. N.1 e Pereira, M. M.2

1 Departamento de Engenharia Materiais, Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

2 Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

e-mail: sidneynicodemos@yahoo.com.br

Resumo. A reatividade superficial é uma característica importantíssima das cerâmicas bioativas. Durante a implantação, ocorrem fenômenos complexos na superfície dos biomateriais que acarretam alterações nas características da interface em formação material-tecido, e/ou portanto no tipo de tecidos neoformado. Uma abordagem físico-química para entender os mecanismos básicos desta interação enfoca os vários fenômenos observados in vitro em fluidos contendo células e partículas de biomateriais. A literatura vem relatando uma sequência de diferentes fenômenos in vivo concatenados ao tipo de reatividade superfícial esperada para as classes de biomaterial, tais como: adsorção proteica, dissolução, precipitação e troca de íon dos componentes inorgânicos, normalmente seguida por adsorção e incorporação de outras biomacromoléculas na reparação da matriz extracelular. Neste estudo células da linhagem continua de macrófagos humanos (THP-1) foram postas em contato com grânulos e pós de diversas biocerâmicas e polimero: hidroxiapatita, fosfato de cálcio bifásico (BCP), biovidro, titânia e PMMA, in vitro, com o objetivo de avaliar a interação ou locomoção (quimiotaxia) das células. No estudo da quimiotaxia e reações  das células, um modelo de movimentação célula/grânulos baseado nas observações desses vários materiais pôde ser averiguado. Fundamentado nos resultados experimentais (quadriplicatas) pode-se extrair explicações que discriminam os mecanismos fundamentais envolvidos no movimento e reatividade das células/biocerâmicas baseados em postulados teoricos envolvendo campos elétricos, meios viscoelásticos e funções Lagrangeanas para um sistema de partículas. A premissa (condições de contorno) é que as células em cultura após atingirem o repouso, no meio de cultivo, possuem um carregamento eletrostático positivo na parte externa da sua membrana citoplasmática e que, as partículas de alguns destes biomateriais no pH = 7.35 (do meio de cultura) têm um potencial de superfície negativo (potencial zeta das partículas neste pH). Assim a partir de medições cuidadosas experimentais e dados de ângulo de contato foi possível a dedução de equações matemáticas relacionada a interação célula-partícula em função das cargas superficiais e forças de atração eletrostática de curta distância resultante; Conclui-se que estas forças são inversamente proporcionais à distância, e estão perfeitamente em consonância  com a resposta biológica ou classificações distintas dos biomateriais aqui estudados. 

Palavras-chave: Biocerâmicas, resposta celular, caracterização biológica

1. INTRODUÇÃO

A reatividade superficial é uma característica comum das cerâmicas bioativas. Durante a implantação, ocorrem reações na interface material-tecido que acarretam algumas alterações nas características da superfície do material do implante ou mesmo nos tecidos na interface (Hench, 1998; Ducheyne & Qiu, 1999). Os materiais cerâmicos foram utilizados pela primeira vez como biomateriais a cerca de 40 anos. Inicialmente a atenção era voltada para o desenvolvimento de materiais cerâmicos que provocassem uma mínima ou nenhuma reação do tecido, características típicas destes materiais em meios agressivos. Mas com o decorrer do tempo e o aumento do conhecimento na área dos materiais cerâmicos gerou proposta conceitualmente oposta: as biocerâmicas deveriam provocar reações de formação de tecido e, se possível, com a formação de uma ligação íntima entre a cerâmica e os tecidos. Essas mudanças superficiais contribuem para a habilidade de ligação das cerâmicas bioativas e o seu efeito pode ser observado, sobretudo, na melhoria da formação do tecido ósseo de ligação. A busca de materiais que aumentem a proliferação e a atividade osteogênica tem importante aplicação terapêutica na regeneração óssea e/ou na reconstrução e restauração do esqueleto e articulações. Este fato tem gerado reflexos no desenvolvimento de um grande número de biomateriais para o tratamento de defeitos ósseos, incluindo cerâmicas de fosfato de cálcio (Oreffo et al., 1998; Daculsi, 1998; Ishikawa et al., 2002; Higashi et al., 1998; Yamada et al., 1997). Para entender os mecanismos que levam à ligação material/osso, precisa-se antes avaliar os fenômenos atômico e molecular que acontecem na superfície do material e posteriormente os efeitos pertinentes destes sobre as reações das células e dos tecidos. Um progresso considerável foi realizado no entendimento dos mecanismos básicos da formação das interfaces que unem os materiais bioativos/ossos e também dos efeitos destes materiais sobre a neoformação óssea (Kokubo et al., 1990; El-Ghannam et al., 1997; El-Ghannam et al., 1999; Ricci et al., 1992; Gauthier et al., 1999; Hyakuna et al., 1989; Binderman & Fin, 1990; Anderson, 1998; Benahmed et al., 1996). Este progresso foi o resultado principalmente de duas abordagens. Uma abordagem enfocando o estudo da interface osso-biomaterial e seu desenvolvimento in vivo e a outra abordagem usando imersões in vitro em fluidos fisiológicos simulados ou em meio contendo células. Estas análises revelaram que uma seqüência de reações acontece nas superfícies do material implante, tais como: dissolução, precipitação e troca de íon dos componentes inorgânicos, normalmente seguida por adsorção e incorporação de proteínas e moléculas biológicas (Ducheyne & Qiu, 1999; El-Ghannam et al., 1999). Vem sendo reportado na literatura que a presença de biocerâmicas em contato com tecidos in vivo talvez pudesse conduzir à formação de uma camada interfacial que contém macrófagos e células gigantes da reação ao corpo-estranho (Hyakuna et al., 1989; Binderman & Fin, 1990; Anderson, 1998; Benahmed et al., 1996). Em tais casos, foi mostrado que os macrófagos representam de 60-80% da população de células locais. Em função disso, os macrófagos são apontados como uma das células chaves responsáveis pelos eventos associados a reabsorção por osteólise, conforme esquema abaixo, Figura 1.

Figura 1. Linhagem células ósseas.

Neste trabalho, foi investigado o efeito do BCP sintetizado principalmente sobre as funções de macrófagos humanos. Células da linhagem continua de macrófagos denominadas THP-1 foram postas em contato com grânulos de BCP in vitro, com o objetivo de avaliar a interação e secreção de fatores solúveis, sendo também a avaliada locomoção (ou quimiotaxia) das células.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais. Foram utilizados vários tipos diferentes de células, buscando avaliar a interação dos biomateriais com as células e também observar as linhagens que melhor se adaptavam as condições do estudo. Foram utilizadas duas linhagens de células mononucleares primárias (uma de camundongo e uma humana) e mais outras duas linhagens imortalizadas. Entre as linhagens foram usadas uma linhagem contínua e aderente de monócitos com morfologia semelhante aos macrófagos de camundongo J774 (RJCB -Banco de células, Rio de Janeiro) de Janeiro) e outra cultura em suspensão de macrófagos humanos THP-1 (Rockville, Maryland, E.U.A.). Elas foram adquiridas objetivando o estudo do caráter quimiotáxico, toxicológico, metabólico e interativo do BCP. Num primeiro grupo de experimento, foram feitas comparações entre o comportamento das células em um meio de cultura com grânulos do BCP, tendo como referência vários fosfatos de cálcio na forma de partículas e grânulos: uma hidroxiapatita pura (Calcitek/USA), o óxido de titânio ou titânia (Merck), um outro BCP comercial HAP-91 com 70% HA e 30% -TCP (JHS/Brasil), o fosfato de cálcio amorfo produzido durante a síntese (grânulos sem tratamento térmico – ACP como sintetizado) e ainda outros materiais tidos como biotoleráveis ou bioinertes como: a alumina (Merck) e polimetilmetacrilato (METCO). O objetivo deste trabalho foi estudar prováveis indícios toxicológicos e fenômenos diversos da interação local das células com cada um desses materiais cerâmicos e polimérico, sobretudo a fagocitose no nível microscópico. 2.2 Caracterização dos Grânulos. Os grânulos dos materiais foram identificados quanto à composição de fase através de análise de difração de raio-x (XRD). Amostras foram analisadas por um difratômetro de Philips com tubo de Cu operado a 40 kW e 20 mA e a uma velocidade varredura de 0.060/sec. Para os materiais polifásicos - teores de 2º fase superior a 5 % (BCP, HAP-91 e ACP)- foram calculadas as porcentagens das fases cristalinas baseadas nas somas das áreas abaixo das curvas para cada fase. A morfologia dos grânulos BCP foi estudada com um microscópio eletrônico de varredura (MEV) JEOL 6300, operado a 15 kV. As imagens do MEV revelaram que os grânulos de BCP, TiO2, ACP, BG60S (vidro bioativo com 60% de sílica) e HAP-91 (BCP comercial) eram aglomerados de partículas muito finas mais os cristais maiores. No entanto, a faixa dos tamanhos dos grânulos para as experiências in vitro foi fixada através do peneiramento do material e sendo sempre utilizada a fração inferior a 100 m. A distribuição de tamanho dos grânulos foi medida usando o método de difração de laser (analisador de tamanho de partícula CILAS 1064). Em todos os experimentos biológicos os grânulos de BCP e também dos outros materiais utilizados foram previamente esterilizados com óxido de etileno.2.3 Cultura de Macrófagos. Neste experimento foram realizados estudos com linhagens primárias e imortalizadas (ou contínuas) de macrófagos num número de aproximadamente 50:1 células para cada partícula (a contagem tanto das células quanto dos pós foram realizadas com o uso de uma câmara de Neubauer). Estas células foram cultivadas em garrafas pequenas de 5 mL de RPMI 1640 contendo em geral 5 ou 10% (v/v) de soro e suplementadas com antibióticos. As células foram mantidas em estufas a 37 0C com uma atmosfera úmida de 95% de ar e 5% CO2. Os experimentos com as células THP-1 foram realizados entre segunda e sexta passagens do replique. A manutenção das células THP-l foi feita com 5% de FBS (soro fetal bovino). As imagens foram adquiridas através de microscopia de luz com contraste de fase, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura (MEV), em tempos de observação que variaram até 45 dias de cultura. Foram plaqueadas uma densidade 1x104 a 1x105 células 1x105

células em placas de 24 wells costarâ de cultura, sendo incubadas com 0,5 ml de RPMI 1640 contendo de 5% (v/v) soro, e completando a solução com antibióticos. A cultura de células mantida em meio de cultura contendo os vários materiais foi observada através de microscopia de campo claro e/ou usando o modo de contraste de fase. O tipo de imagem adquirida está indicado nas legendas das figuras. As células de macrófagos THP1 foram utilizadas porque estas células em suspensão e permitiram investigação mais fácil de movimento e de reações de células.

Adicionou-se o meio RPMI e SFB a 10% nos wells até completar a capacidade do poço. A seguir distribuiu-se as células nas placas 24 wells, calculando-se a quantidade de células nas proporções 104, 105 e 106 por ml para serem cultivadas nos wells. Finalmente, adicionaram-se os biomateriais na proporção aproximada de 50 células por grânulos (ou partícula) de biomaterial, em seguida as placas foram identificadas, datadas e levadas para a estufa de C02. Nestes estudos com as células foram avaliadas a proliferação e morfologia das células, buscando investigar a interação células/biomateriais. O objetivo deste experimento foi fazer comparações entre o comportamento das células em um meio de cultura com grânulos do BCP e com vários pós biocerâmicos na forma de partículas e grânulos – estudando a interação quanto mais próximo possível (o experimento permite) das condições de contorno que o biomaterial teria no meio fisiológico. 2.4 Análise de Energia Dispersiva de Raios-X (EDXA). As culturas de células e biomateriais que tinham sido incubadas por 48 horas foram colocadas em uma placa de titânio, em seguida desidratadas em etanol (70-100%) e lentamente aquecidas a 600C. As amostras foram analisadas então por microscopia eletrônica de varredura. Foram observadas partículas dentro das células aderidas aos grânulos de alguns materiais, e também partículas secretadas pelas células. Estas partículas secretadas foram analisadas por EDXA, usando-se análises pontuais e uma voltagem operacional do MEV de baixa de 15 kV. 2.5 Medida do Cálcio (Ca2+) Citosólico. Para determinação do cálcio intracelular as culturas de células foram cultivadas em contato com os grânulos por aproximadamente 12 horas, e logo após adição de 1 M de Fluo-3/AM (indicador de Ca2+) as células foram novamente incubadas por mais 20 min em uma incubadora de CO2 a 370C. As imagens de microscopia de transmissão e fluorescência foram adquiridas em um microscópio de imunofluorescência usando filtros FITC, no final dos experimentos. 2.6 Teste do MTT. Ao término das experiências, a viabilidade das células foi investigada pelo teste de MTT após incubação por cerca de 2 horas e observação com microscópio ótico. A leitura do MTT, ou seja, a reação de redução do sal tetrazólico (3-[4,5-dimetiltiazol]-2,5-difeniltetrazólio brometo) nos fornece uma medida quantitativa da viabilidade das células. Os reagentes foram adquiridos da Sigma Chemical Company. O levantamento da viabilidade se dá através da leitura de densidade ótica (DO) o índice absorbância no aparelho de ELISA (Universal Microplate Reader, BioTek Instruments Inc.) com comprimento de onda de 595nm. As experiências foram executadas com células entre a 3ª e 5ª passagens e todas as experiências foram repetidas 5 vezes em triplicata.

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.3.1 ESTUDO IN VITRO DE GRÂNULOS EM CULTURA DE CÉLULASO estudo in vitro com vários tipos de biomateriais demonstraram que ocorre uma série de fenômenos interativos entre as diferentes culturas de células e as partículas destes materiais. A reatividade entre as células e os biomateriais é uma característica distinta para cada tipo de material e pode ser classificada como: intensa, moderada e não reativo.. Neste estudo in vitro com grânulos de biomateriais apesar terem sido utilizadas quatro culturas diferentes de células, são apresentados resultados apenas das culturas imortalizadas de macrófagos devido ao seu cultivo mais fácil e reprodutivo. Contudo, observou-se que os experimentos com as diferentes culturas apresentavam similaridade nos resultados. A baixa migração de células para a superfície da alumina e do polimetilmetacrilato (PMMA) confirma que nestes materiais a reação é menos intensa do que os compostos de fosfatos de cálcio e também do que a titânia. Contudo, como observado nas fotos a titânia, o vidro bioativo e os compostos de fosfatos de cálcio bifásicos (BCP e a HAP-91) são sem dúvida os materiais que maior interação (ou reatividade) apresentaram deste grupo de materiais investigados. Foram observadas aglutinações de células

ao redor dos materiais mais nenhuma modificação importante foi observado nas culturas comparando com as culturas controles.

Como esperado no caso do PMMA e da alumina utilizados como material controle negativo, não foram observados mecanismos significativos de reatividade celular, ou seja, formação de grumo, secreção etc. Pelo contrário, foi observado para a alumina um distanciamento das células em relação às partículas desses materiais. Esta observação reforça a idéia de que o mecanismo de movimentação tenha sua origem na energia potencial eletrostática do sistema de cargas das superfícies, cuja discussão foi iniciada no capítulo anterior. Em comparação ao controle, durante o período avaliado, não foram observadas alterações atípicas nas culturas (apoptose, viabilidade, metabolismo etc), a não ser uma pequena modificação no tamanho das células (ou histomorfologia). Também os níveis de movimentação e secreções variaram significativamente para os vários materiais estudados e serão discutidos a seguir. A solubilidade in vitro no caso dos fosfatos de cálcio bifásico depende da proporção entre -TCP/HA, que eram muito semelhantes para o BCP (com 20 e 80% -TCP/HA, respectivamente) e a HAP-91 (com 30 e 70% -TCP/HA, respectivamente). O -TCP apresenta uma dissolução maior do que a HA facilitando a liberação de íons e/ou de cristais. Já o vidro bioativo (BG60S) apresenta normalmente uma elevadíssima taxa de dissolução em água, devido à sua estrutura aberta (material amorfo). A dissolução dos demais materiais é favorecida pelo ambiente produzido pelos macrófagos humanos, tais como, por exemplo, a elevação do pH local através da fosfatase ácida acelerando a solubilização dos grânulos. A proporção usada de 50 células por grânulo propiciou uma observação dos estágios da interação com os materiais. O primeiro e mais importante estágio foi a constatação que as células e os grânulos se movem concomitantemente um em direção ao outro de forma relativamente linear. Observa-se que o movimento de aproximação das células parece ser mais intenso, embora aparentemente os grânulos também se movem dentro do centro de massa do sistema - células vizinhas e grânulos. Este movimento é relativamente rápido e pôde ser monitorado em tempo real em quase todos os campos ao longo dos experimentos, afastando a suposição de que o movimento observado fosse um evento aleatório ou casuístico.

Pode-se ver que o movimento das células ocorre já nos primeiros minutos depois da incubação, e sua aglomeração ao redor de grânulos só foi observada após 24 horas de incubação. É interessante chamar a atenção para o fato de que as células de BCP fixadas também podem atrair um grânulo de BCP vizinho. Foram vistos estes movimentos seguidos pela formação de aglomerados de célula-grânulos concorrentemente em vários campos, o que nos permite concluir que o fenômeno era não localizado e bem representativo. É amplamente conhecido que o potencial de repouso da membrana celular é carregado positivamente. Por outro lado, é também conhecido que as partículas de fosfato de cálcio têm um potencial negativo no pH fisiológico (Ducheyne et al., 1992). Por hipótese acredita-se que a atração célula-grânulo pode envolver uma interação do tipo eletrostática. A natureza desta interação é neste momento hipotética e será discutido no Capítulo seguinte. Para isto serão conduzidas experiências usando partículas de diferentes cargas superficiais e tamanhos nos permitindo entender a natureza e fatores que afetam esta interação.

Figura 2. Sequência de movimentação. Células THP-1 e BCP foram colocadas em contato na proporção de 50:1 células por grânulo. As fotos foram obtidas em microscópio ótico de luz transmitida. Foram obtidas imagens em

vários instantes após a incubação das células-BCP, e também depois de uma incubação por 24 horas, em uma incubadora de CO2. No painel A, as setas indicam os grânulos de BCP e as cabeças das setas apontam a célula THP-

1. Os painéis são representativos de imagens vistas em vários campos de 5 experiências diferentes executadas em triplicata. O painel B a ilustra duas situações nas quais movimento de célula-grânulo ocorreram, a barra indica a ordem de grandeza do deslocamento, 10 m. No painel B são mostradas imagens em sequência de uma célula

aderindo com grânulos de BCP.

Foi observado que a maioria das células de THP-1 que estavam aderidas aos grânulos de BCP apresentavam uma fluorescência mais elevada, como evidenciado pelas imagens de microscopia de fluorescência usando indicador fluorescente (fluo-3/AM) de cálcio intracelular. Esta concentração mais elevada ([Cai

2+]) livre pode ser comparada com as células adjacentes não aderidas, Figura 3.

_____

10 m

0 min 10 min 5 min (B)

(A)

Figura 3. Concentração de cálcio intracelular Ca2+ em célula aderida. As células THP-1 foram incubadas durante a noite com BCP e carregadas por 20 min com o indicador de Ca2+ - fluo-3/AM. A figura do lado esquerdo mostra

células carregadas com o fluo-3/AM. A seta aponta uma região da célula por onde ocorre a aderência ao grânulo de BCP, enquanto a cabeça de seta indica o grânulo. A célula aderida apresenta uma fluorescência mais acentuada e

indica um nível de cálcio livre intracellular bem elevado. A imagem, à direita, de microscopia ótica de luz transmitida mostra a presença de outras células no campo ainda não aderidas ao grânulo. Os painéis são

representativos de imagens vistas em vários campos de 5 experiências diferentes executados em triplicata.

Os ensaios de viabilidade celular pelo ensaio de MTT mostraram que as células aderidas e com altos níveis de [Cai

2+] apresentavam-se viáveis (dados mostrados no capítulo 3), excluindo a possibilidade de que o aumento de cálcio seja devido a dano da membrana das células. Embora os mecanismos exato do aumento de [Cai

2+] nas células aderidas ainda precise ser melhor investigado, acredita-se que perturbação (ou estímulo) mecânica devido à interação célula-BCP possa ter induzido a abertura de canais Ca2+ em locais próximos ao contato do grânulo com a membrana (esta hipótese será investigada no capítulo seguinte). É bem conhecido que em muitos tipos de células, como hepatócitos, astrocitos, e osteoblastos, quando sofrem excitação mecânica ocorre a abertura de canais de Ca2+ e conseqüentemente uma indução levando ao aumento de [Cai

2+] intracelular (Gronowicz & McCarthy, 1996; Schlosser et al., 1996; Nebe et al.,. 1995; Romanello et al., 2001; Stout et al., 2002). Além disso, o cálcio intracellular [Cai

2+] aumentado tem importância em muitos processos celulares, sobretudo variando os níveis de secreção, metabolismo, apoptose, e dentre outros. Um exemplo citológico de estímulo que aumenta [Cai

2+] acontece quando micropipetas excitam a membrana das células. Esta excitação mecânica gera uma elevação hipo-osmótica nas células estimulando a secreção de ATP após diferentes estímulos (Schlosser et al., 1996; Sabirov et al., 2001; Ferguson et al., 1997). Os experimentos, veja Figura 2.5, mostram que o aumento de [Cai

2+] favoreceu o processo de exocitoses. De fato, o papel do Ca2+ na regulação da exocitoses de macrófagos já foi demonstrado (Di Anke et al., 2001), estudos verificaram que uma elevação de [Cai

2+] aumenta o transporte de vesículas para fora das células. Estes resultados colaboram nossos resultados, pois o cultivo de células THP-1 com o BCP evidenciaram a presença de partículas pequenas no citoplasma (Figura 2.5A). Parece que estas partículas são secretadas pelas células e eventualmente se aglomeram ao redor delas (Figura 2.5B). É interessante observar que as partículas são de tamanho semelhante. Acredita-se

Fluo-3/AM Transmissão

_____

10 m

que as partículas que foram secretadas são oriundas do citosol, embora também foram observadas aglomerações de partículas aleatórias ao redor das células, Figura 2.5B. Foi também observado que as partículas secretadas permitiram a união às células adjacentes, Figura 2.5C. Além disso, análise de EDXA das partículas intracelular e secretadas mostrou que a razão cálcio e fósforo (Ca/P) é, respectivamente 1.53±0.06 e 1.64±0.05, uma estequiometria semelhante a hidroxiapatita. O que sugere que as partículas secretadas sejam constituídas de uma apatita carbonatada (hidroxiapatita deficiente em cerca de 10% em Ca) presente nos tecidos duros do corpo humano. É conhecido que partículas de tamanho maior que as fagocitáveis estimulam os macrófagos promovendo a produção de vários tipos de citocinas. Sabe-se, que várias citocinas pro inflamatórias não estimulam a produção de óxido nítrico (NO) (Oliveira et al., 1998; Damoulis et al., 1994). No entanto, também é descrito que algumas citocinas tais como IFN e TNF estimulam os macrófagos a produção de NO, a falta de alguns desses citocinas (presente no meio fisiológico ou no tecido ósseo), nos sugerem que neste caso essa molécula (NO) faz o importante papel como um mediador paracrino das células do osso (Van't Hof & Ralston, 2001; Mancini et al., 2000). No entanto, concentrações alta de NO pode ter um efeito inibidor na formação de osso (Van't Hof & Ralston, 2001). Foi investigado se o BCP estimula por indução a secreção de NO através das células THP-1, para isto foi retirado o sobrenadante do meio de cultivo (THP-1/BCP por 3 dias) e a seguir a presença de NO foi determinada pelo reagente de Griess. Os resultados indicam que o BCP não induziu secreção de quantias mensuráveis de NO in vitro (dados mostrados no capítulo 3 juntamente com outras biocerâmicas). Recentemente, foi demonstrado que o NO participa nas funções regulatórias de macrófagos (Van't Hof & Ralston, 2001), osteoblasto ou osteoclastos (Mancini et al., 2000). Há evidência de que o NO inibe a proliferação, secreção e induz apoptoses em muitos tipos celulares (Mancini et al., 2000). Então, a baixa concentração de NO observado em nossos experimentos indica que o BCP não promovem uma produção significante de NO, preservando, portanto as funções das células THP-1 nas interações com o BCP. A evolução destes deslocamentos células/grânulos por um período de 12 horas levou à formação de aglomerados com várias células ao redor dos grânulos de HAP-91, HA CALCITEK e BCP. Observa-se a formação de clusters de células ao redor de partículas e aglomerados da ordem de 100 m (BCP, HAP-91 e ACP). Estes aglomerados são o resultado de várias trajetórias e movimentos intercalados que, em geral, conduzem à formação de ajuntamentos em cachos ou grumos de materiais bioativos (BG60S, BCP, HA CALCITEK, HAP-91 e ACP) com células ao seu redor.

Logo após a adesão dos grânulos às superfícies das células ocorre o aparecimento de dois novos fenômenos. Constatou-se com o uso de um indicador de cálcio intracelular (Fluo-3/AM) que uma parcela expressiva das células aderidas ao BCP, HAP-91, HA Calcitek e titânia apresentaram um aumento dos níveis de cálcio de livre ([Cai

2+]) intracelular, quando comparadas com as células vizinhas não-aderidas. Ao que tudo indica, o local de contato entre os grânulos e as células sofre uma estimulação mecânica, o que de fato parece favorece a abertura de canais Cai

2+ propiciando a endocitose de cálcio iônico oriundo da dissolução dos grânulos ou do meio extracelular, e portanto, a elevação do gradiente de Cai

2+ ao longo dos organelos no citosol. Assim, um mecanismo fundamental de interação entre os materiais, ao que parece, é fortemente mediado pela atração entre as superfícies do material e das células, possibilitando entender os fenômenos primordiais que regem a interação local dos biomateriais com as células.

Um fenômeno simultâneo também foi evidenciado em todos os campos de observação ao microscópio: em um grande número de células aderidas ou não aderidas foram identificadas alterações morfológicas significativas (quando se comparou o tamanho destas células com células do experimento controle). Por amostragem foram avaliadas variações de até 250% em relação à média de tamanho das células do grupo controle sem biomateriais. Observou-se que essas células gigantes apresentavam também um aumento dos níveis de cálcio livre ([Cai

2+]) intracelular, quando comparadas com as células vizinhas. Em ambos os casos o fenômeno parece

estar associado á forma ou mecanismo de absorção de Ca2+ e caminho escolhido pelas células para contrabalançar a pressão osmótica de Ca do meio extracelular, em virtude da dissolução dos grânulos de biovidro, BCP, HAP-91, HA e o ACP, e, portanto como conseqüência do aumento do gradiente de cálcio iônico Ca2+ no micro ambiente local. Este aumento do volume das células era esperado e uma parte desse evento pode ser explicado pela abordagem termodinâmica.

O gradiente de concentração de Ca2+ e a difusão dos fluidos no microambiente intracelular induz a formação de vesículas esféricas contendo partículas de um fosfato de cálcio sintetizado biologicamente, que apresenta uma razão Ca/P muito semelhante a hidroxiapatita, Tabela 1. As células que apresentaram uma elevação dos níveis de Ca2+ passam a produzir em seu interior (no local próximo a endocitose) pequenas partículas (com cerca de 1 m de diâmetro), aparentemente confinadas por uma vesícula, que a seguir se descolam no sentido oposto ao gradiente de concentração de Ca2+. Com o formato de anéis alinhados estas partículas são liberadas formando veios que se esparramam para fora das células. Os veios apresentam uma forma peculiar, sempre com uma camada protetora de um material orgânico (ainda não identificado), com as partículas ora emparelhadas, ora em forma de corrente. O veio já no meio extracelular se distende diametralmente da região da sua formação (ou seja, local próximo à adesão da célula com o grânulo) e chega a atingir relativamente grandes extensões.

Tabela 1. Analise de EDXA das Partículas para cada tipo de Biomaterial.Medidas Ca/P

Partícula ExtracelularCa/P

Partícula IntracelularHAP-91 1,53 ± 0,12 1,57 ± 0,09

BCP 1,64 ± 0,05 1,53 ± 0,06HA 1,61 ± 0,08 1,49 ± 0,04

BG60S 1,92 ± 0,11 1,75 ± 0,12ACP 1,83 ± 0,07 1,61 ± 0,05

Os experimentos realizados até aqui nos mostram que o aumento de [Ca i2+] favoreceu o processo

de exocitoses. O papel do Ca2+ na regulação da exocitoses de macrófagos já foi verificado também em outros estudos (Di Anke et al., 2001), e um aumento na concentração de [Cai

2+] aumenta o transporte de vesículas secretoras para fora das células. Acredita-se que as partículas secretadas sejam oriundas do citosol. Neste aspecto, embora sejam requeridos Ca2+ para exocitoses em macrófagos, o aumento do Ca2+ intracelular não é suficiente para o evento exocitótico pleno. No caso dos macrófagos, a exocitoses é extremamente dependente da proteína G ativada (Di Anke et al., 2001). Então, a ausência de proteína G ativada poderia ser a razão temporal requerida para exocitoses completa das partículas. Cerca de 144 horas depois de incubados os veios com as partículas secretadas se aglutinam formando uma estrutura também em cachos. Observa-se que parte do material orgânico que protegia as partículas é dissolvido e as partículas passam a ter um grau de liberdade que permite se rearranjarem.

O tempo de dissolução dos materiais bioinertes, bioativos ou biodegradáveis estudos não foram levantados com exatidão. Contudo, observou-se que a hidroxipatita Calcitek, a titânia, a alumina e o PMMA não se dissolveram, mesmo após 45 dias em cultura. Já com o BCP, a HAP-91 e o ACP mostraram após cerca de 45 dias de incubação em cultura de macrófagos uma completa dissolução tanto dos grânulos quanto das partículas secretadas pelas células. Durante as trocas do meio de cultura eventualmente alguns grânulos desses materiais podem ter sido aspirados, contudo a maior parte destes grânulos parecem que foram efetivamente fagocitados ou solubilizados.

No estudo da quimiotaxia das células, um modelo de movimentação célula/grânulos baseado nas observações dos vários materiais pode ser averiguado. As causas deste fenômeno podem ser múltiplas e complexas. No entanto, baseado em duas premissas formadas de poucos elementos

muito simples, pode-se tentar extrair explicações de fácil utilização ou compreensão; que não apresenta elevada complexidade ou dificuldade e, portanto, tentar tornar inteligível este fenômeno, sem discriminar todos os mecanismos envolvidos no movimento das células. A primeira premissa é que as células em repouso possuem um carregamento eletrostático positivo na parte externa da sua membrana. A segunda premissa é que, as partículas de fosfato de cálcio e titânia no pH estudado (pH = 7.35 do meio de cultura) têm um potencial de superfície negativo (Barralet et al., 2002; Huang et al., 2003). Assim por dedução pode-se supor que em função das cargas superficiais forças de atração eletrostática de curta distância são geradas e atuam ao longo da linha que une ambos os centros de cargas. Estas forças são também inversamente proporcionais à distância. Esta força acarreta um movimento linear que, depois de desencadeado, provoca uma nova configuração na interação eletrostática (ou momento de dipolo elétrico) entre os domínios de cargas opostas da superfície das células e dos grânulos, veja a Figura 17. Com a aproximação entre as superfícies ocorre um deslocamento relativo ou rearranjo da distribuição das cargas positivas e negativas nas superfícies da célula e do BCP (sobretudo nas moléculas não polares que formarão ambas as superfícies) e novos dipolos induzidos. Por sua vez estes dipolos ocasionam nova contra indução eletrostática e, por conseguinte, a geração de momento quadrupolos ou tensores de ordem mais elevados. Este processo de reacomodação das cargas nas superfícies influencia o movimento levando por fim à formação lenta de aglomerações em cachos — o que em termos de energia potencial do sistema representa o estado real que mais apropriadamente minimiza a energia química superficial. Posteriormente, serão discutidas evidências que levam a este raciocínio hipotético-dedutivo. Como parte do desenvolvimento deste modelo foram feitas algumas tentativas de se medir o potencial zeta do BCP e da titânia. No entanto, os valores encontrados não foram reprodutíveis para o BCP, sendo apenas observado que em torno pH = 8,0 da suspensão (ou seja, próximo ao pH do RPMI com BCP) o potencial foi sempre negativo. O valor encontrado também para a titânia indicava um valor negativo no pH neutro do meio de cultura. Na Figura 4 é mostrada a atração de partículas pequenas de titânia pelas células. Ao redor das células observa-se uma zona de vazio onde não existem partículas.

Figura 4. Cultura de células com titânia na sequência de tempos no intervalo de observação de 24 e 48 horas.

O potencial de uma carga pontual é dado pela equação:

ε∫ E d A=qi Equação 1Resolvendo a equação 3.1 para o campo elétrico temos:

Ec=1

4 πεo.qc

r2Equação 2

Tanto as células quanto as partículas da titânia (e também do BCP) geram no meio de cultura um

campo elétrico. A carga. qc é a carga da célula e

q p é a carga das partículas de TiO2 (que

podem ser estimadas pelo potencial zeta). Logo a força eletrostática entre as células e as partículas é dada por:

F p=q p . Ec Equação 3No meio viscoso a força de atrito cinético é:

f a=−κ dxdt

=−κ x Equação 4

onde k é a constante de viscosidade do meio. A força resultante é assim igual a:

FR=F p− f a=m x Equação 5

Agrupando as equações 2 a 5 tem-se a equação do movimento:

m x+κ x−q p qc

4 πε x2 =0Equação 6

A possível resolução numérica desta equação diferencial pode ser feita a partir das condições de contorno – média dos vazios ao redor das células e da massa reduzida célula/partícula, veja Figuras 17 e 18. A posição inicial média é igual a 30 m e a velocidade final das partículas é igual a zero na superfície das células (raio médio da célula - 10 m).

x (0 )=r ∵30 μmx (1)=0∵10 μm

Como a carga líquida é conservada num sistema isolado pode-se prever que a força eletrostática será dada por:

F p=q p .∑j=1

N q j

4 πε r2Equação 7

onde N é o número de células. O trabalho realizado pelo campo eletrostático (força x distância) para que se mova uma célula ou partícula da posição inicial x para a posição final y é diretamente proporcional ao sinal e magnitude da carga superficial livre.

Os resultados das dosagens de óxido nítrico das soluções demonstram que o BCP apresentou características muito semelhantes aos materiais tidos como bioativos. O gráfico da Figura 5 mostra a produção de NO para os materiais após o 3º dia de cultura.

NO após 72 Horas

0

20

40

60

80

100

Controle BG BCP ACP HAP-91 TiO2 PMMA Alumina

Biomateriais

[NO

], m

M Número de Amostra = 3

Figura 5. Concentração de NO no meio de cultura com os biomateriais.

A avaliação da viabilidade e/ou proliferação foi bastante semelhante entre os vários materiais dissolvidos. Na Figura 6, pode ser visto que as cultura expostas às soluções com biomateriais

(HA, BCP, ACP, PMMA, titânia e alumina) - apresentam resultados com pequenas alterações na porcentagem relativa de viabilidade/proliferação em comparação com culturas de macrófagos cultivados em meio de controle sem biomateriais. A linha zero (eixo da abscissa) indica o ponto de igual viabilidade com o controle, ou seja, -5 significa 5% a menos de células viáveis em comparação com o controle. Estas pequenas alterações na percentagem de redução do MTT (atividade enzimática em comparação com aos valores achados para o controle) mostram existir uma tendência de equilíbrio na viabilidade/proliferação nas culturas dos vários materiais nos tempos investigados em comparação com à cultura de controle. No entanto, foi observado, especialmente para o ACP e BG60S, uma recuperação (aumento) dos níveis de atividade celular após 60 horas. Em contraste, materiais como alumina e PMMA não apresentaram mudanças significativas.

-20

-15

-10

-5

0

5

10

10 20 30 40 50 60 70

Tempo (horas)

Perc

entu

al d

e C

élul

as V

iáve

is

HA CalcitekHAP-91BCPTitâniaACPBG60SPMMAAlumina

Figura 6. Viabilidade das culturas com biomateriais em comparação com o controle.

Como os níveis de dissolução ou liberação de íons das superfícies das partículas ou grânulos variam, as culturas expostas a estes biomateriais apresentam presença de tipos diversos de íons (Ca, P, Si, Al, Ti, ácido acrílico etc), o que possivelmente ajudaria entender as causas das pequenas alterações na viabilidade das células. Após 60 horas, graças ao metabolismo das células, foi observado um aumento na proliferação para todos os biomateriais. Estes resultados demonstram a acomodação da cultura na presença das partículas dos biomateriais. Apesar da existência de alguma controvérsia, o método de redução do sal de tetrazólico MTT através de reações enzimáticas celulares é o teste mais amplamente utilizado para medição da viabilidade/proliferação das células, e é sobretudo um indicativo para a determinação da toxicidade dos biomateriais em meios cultura. Como conseqüência deste estudo, um padrão de três diferentes grupos ou variação na capacidade de interação dos materiais / células pôde ser assim definido:

Grupo 1: hidroxiapatita CALCITEK e a titânia (quimiotaxia, adesão e baixo nível de secreção e dissolução);

Grupo 2: BG60S, BCP, HAP-91 e o ACP (quimiotaxia, adesão e alto nível de secreção e dissolução);

Grupo 3: alumina e do PMMA (baixíssima quimiotaxia e quase nenhuma adesão ou dissolução).

Com respeito à dissolução dos biomateriais e à proliferação celular, observou-se existir uma interação de semelhança entre os 3 grupos citados acima. Por exemplo, o PMMA e a alumina apresentaram uma baixa dissolução e uma proliferação menor do que o controle. Já o BG60S e ACP apresentaram uma grande dissolução e inicialmente uma também menor proliferação, mais após algumas horas a proliferação foi muito próxima à cultura controle. Os eventos canônicos relacionados com a bioatividade desencadeados pelos materiais são descritos na literatura na seguinte ordem: dissolução, precipitação de íon na solução, trocas iônicas, interdifusão, solução mediando o efeito sobre a atividade celular, deposição sem integração, deposição com integração, quimiotaxia, adesão celular e diferenciação/proliferação/secreção. No caso deste estudo com culturas celulares, foram observados in vitro alguns destes mecanismos (ou eventos) isoladamente. Como conseqüência da atividade de absorção (ou fagocitose), possivelmente

estimulada pela fosfatase ácida secretada pelos macrófagos (células da mesma origem dos osteoclastos), observou-se uma elevada dissolução dos materiais e, eventualmente, ocorrência de trocas iônicas no meio de cultura. No entanto, a atividade dos macrófagos resultou principalmente em outros três eventos também observados neste estudo: a quimiotaxia, a adesão e a secreção celular. A associação destes mecanismos resultam no desencadeamento de uma cascata de interações primordiais que possibilitam a bioatividade do material, ou seja, o fenômeno da interação local dos biomateriais. No meio fisiológico sabe-se que esta interação é bem mais complexa e que possivelmente esteja associada também com uma grande produção de osteocalcina e citosinas (hormônios) que estimulariam os demais eventos não observados aqui (Ducheyne, 1999). O estudo in vitro com cultura de células é caracterizado por uma indução incompleta, cujas conclusões, não obstante parciais, dado a complexidade do meio fisiológico, podem se revelar universais e necessárias, pois se estabelecem por meio de estudos e procedimentos sistemáticos no microambiente da interação, e levam a algumas descobertas de relações coincidentes entre o que é observado no nível celular com o que realmente pode ocorrer no meio fisiológico quando da interação com um biomaterial. Alguns dos mecanismos relacionados com interação local das células com o biomaterial foram, durante o período de testes em cultura, investigados quantitativamente, através dos resultados de microscopias e espectroscopia, buscando-se evidências morfológicas atípicas, tais como: níveis de absorção, alterações morfológicas atípicas, secreções e outros indícios ou fenômenos que possam caracterizar uma citotoxicidade, sobretudo comparando o BCP com os outros materiais. No entanto, nenhuma indicação houve que revele quais anormalidades na resposta celular, ou mesmo que elementos tóxicos são liberados durante a fagocitose ou dissolução do BCP.

4 CONCLUSÕES

O BCP sintetizado e aqui analisado apresentou 80% hidroxiapatita (HA) e 20% fosfato de tricálcico (-TCP). O BCP pode ser considerado uma substância bioativa devido, aos fenômenos de interação com as células apresentadas durante os testes in vitro e também por não apresentar nestes testes nenhum indício de toxidez pode ser classificada como uma substância com baixa toxicidade ou atóxica. Os protocolos de pesquisa e desenvolvimento de biomateriais recomendam nestes casos que sejam conduzidas novas investigações utilizando para isto estudos com animais. O BCP em cultura de células demonstrou a habilidade de induzir a proliferação de células, assim como os outros biomateriais testados.Os biomateriais utilizados nos estudos com grânulos e partículas mostraram, segundo os seguintes agrupamentos: bioinerte, bioativo e biorreabsorvível; fenômenos gerais (ou característicos) que se enquadram nas observações já realizadas por outros grupos de pesquisa. O ACP mostrou-se toxêmico quando utilizado nos implantes esterilizados em autoclave, sendo por isto não recomendado para os estudos posteriores com animais.O passo seguinte na avaliação do BCP é utilizar este material em ambiente de spray a plasma para produção de recobrimentos. E a posterior caracterização da adesão desses implantes junto ao tecidos vivos (modelo animal).As células aderidas ao BCP apresentaram uma alta concentração de Ca2+ livre intracelular, quando comparada com as células vizinhas não aderidas. As partículas de fosfato de cálcio secretadas formaram clusters com as células adjacentes. O estudo desta cascata (ou seqüência) de eventos nos permitiram iniciar a abordagem dos mecanismos celulares (in vitro) na interação células-BCP, contribuindo para a melhoria da performance destes materiais bioativos.A análise de energia dispersiva de raios-X mostrou que as partículas secretadas apresentaram uma relação de Ca/P de 1.64 ± 0.05, semelhante a da HA. Das observações conduzidas neste trabalho é possível cogitar que as partículas secretadas criem uma zona de transição que permite adesão de macrófago adicional, o que poderia no meio

fisiológico eventualmente levar à fixação do biomaterial.

AGRADECIMENTOSAo Centro Tecnológico de Minas Gerais- CETEC/MG e ao Departamento de Bioquímica e Imunologia da UFMG pela infraestrutura cedida. A Fapemig – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais e ao Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais- CEFET/MG pelo apoio na pesquisa.

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COMPARISON OF IN VITRO REACTIVITY OF POWDERS BIOCERAMICS AND GRANULES´

Silva, S. N.1 e Pereira, M. M.2

1 Departamento de Engenharia Materiais, Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

2 Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

e-mail: sidneynicodemos@yahoo.com.br

Summary: The surface reactivity is an important characteristic of bioactive ceramics. During deployment, complex phenomenon occurring on the surface of biomaterials which lead to alterations in the characteristics of the interface material-tissue formation, and / or the type of fabrics thus formation. A physical-chemical approach to understand the basic mechanisms of this interaction focuses on the various phenomena observed in vitro in cells and fluids containing particles of biomaterials. The literature has been reporting a result of various phenomena concatenated in vivo reactivity of the type superficial classes expected biomaterial, such as protein adsorption, dissolution, precipitation and ion exchange of inorganic components, usually followed by adsorption and inclusion of other biomacromoléculas the repair of the extracellular matrix. In this study cell line continues from human macrophages (THP-1) were put in contact with granules and powders of different polymer and bioceramics hydroxyapatite, biphasic calcium phosphate (BCP), bioglass, titania and PMMA in vitro in order evaluating the interaction or movement (chemotaxis) of cells. In the study of reactions and chemotaxis of cells, a type of movement cell / granule based on observations of these various materials might be ascertained. Based on experimental results (quadriplicatas) can extract explanations that discriminate the fundamental mechanisms involved in the movement and reactivity of the cells / bioceramic based on theoretical assumptions involving electric fields, viscoelastic media and functions for a Lagrangian particle system. Premise (boundary conditions) is that cells in culture after reaching the rest, in the culture medium have a positive electrostatic charge on the outside of their cytoplasmic membrane and the particles of some of these biomaterials with pH = 7.35 (the culture medium) have a negative surface potential (zeta potential of particles in this pH). Thus from the experimental data and careful measurements of contact angle was possible the deduction of mathematical equations related to cell-particle as a function of surface charges and electrostatic forces of attraction resulting short distance; conclude that these forces are inversely proportional distance, and are perfectly in line with the biological response or classification of different biomaterials studied here.

Keywords: Bioceramics, cellular, biological characterization