À Alexandre - Université du Québec à ChicoutimiIll RÉSUMÉ L'industrie forestière du Québec...
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UNIVERSITE DU QUEBEC A CHICOUTIMI MÉMOIRE PRÉSENTÉ À L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À CHICOUTIMI COMME EXIGENCE PARTIELLE DE LA MAÎTRISE EN RESSOURCES RENOUVELABLES PAR CHARLES SIROIS B. Se. (CHIMIE) VALORISATION DES EXTRAITS DE PIN GMS (Pinus banksiana) PAR L'ÉTUDE DE LEUR COMPOSITION CHIMIQUE ET DE LEURS ACTIVITÉS BIOLOGIQUES Avril 2008
Transcript of À Alexandre - Université du Québec à ChicoutimiIll RÉSUMÉ L'industrie forestière du Québec...
UNIVERSITE DU QUEBEC A CHICOUTIMI
MÉMOIRE PRÉSENTÉ À
L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À CHICOUTIMI
COMME EXIGENCE PARTIELLE
DE LA MAÎTRISE EN RESSOURCES RENOUVELABLES
PAR
CHARLES SIROIS
B. Se. (CHIMIE)
VALORISATION DES EXTRAITS DE PIN GMS (Pinus banksiana)
PAR L'ÉTUDE DE LEUR COMPOSITION CHIMIQUE
ET DE LEURS ACTIVITÉS BIOLOGIQUES
Avril 2008
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À Alexandre
Ill
RÉSUMÉ
L'industrie forestière du Québec abandonne annuellement environ 10 millions de mètres
cube de résidus forestiers sur les parterres de coupe. Les travaux de recherche ont été
effectués à l'UQAC. Les travaux présentés dans ce mémoire tentent d'identifier par le
truchement de l'analyse phytochimique de nouvelles substances bioactives à valoriser à
même ces rejets de coupe.
Au total, 11 espèces d'essences ligneuses de la forêt boréale, réparties sur deux récoltes, ont
été testées pour l'activité anticancéreuse, antibiotique, antioxydante et antifongique de leurs
bois. Les résultats d'analyse nous ont amené à concentrer l'effort sur le Pinus banksiana
qui démontrait une très bonne réponse aux tests anticancéreux.
Au cours des travaux, dix molécules comprenant entre autre des flavonoïdes (la
pinobanksine ainsi que sont dérivé acétate, la pinocembrine), et des acides résiniques
faydroxylé ont été isolées par diverses techniques chromatographiques, identifiées par
résonance magnétique nucléaire et testées sur des cultures de cellules pour déterminer la ou
les molécules responsables de l'activité anticancéreuse observée sur les extraits bruts.
IV
Au terme de plusieurs mois de recherche, je remercie du fond du c�ur les personnes qui
m'ont soutenu dans cette recherche, en particulier :
Vakhtang Mshvildadze, pharmacognosiste profondément géorgien;
Serge Lavoie, l'homme orchestre, pour son support indéfectible;
François Simard, mon modèle au quotidien et colocataire à Marseille;
Carole Grenon, pour l'aide apportée en HPLC;
Professeur Riad Elias, qui a généreusement partagé son savoir et son temps lors de mon
stage à Marseille.
Je ne peux non plus oublier la contribution d'André Barrette, Hélène Gagnon. Maxime
Lebrun, Catherine Dussault, Josette Ross, Tommy Perron. Marie-Eve Bradette-Hébert et
Dominic Dufour.
Enfin, je remercie André Pichette et Jean Legault, mes directeurs de recherche, pour la
liberté dont j 'ai bénéficié tout au long de ce projet et pour leur soutien financier.
V
TABLE DES MATIÈRES
TABLE DES MATIÈRES v
LISTE DES FIGURES ...ix
LISTE DES TABLEAUX , ........x
INTRODUCTION ..13
CHAPITRE 1 REVUE DE LITTÉRATURE ........20
1.1 Description morphologique ............21
1.2 Habitat et distribution 21
1.3 Utilisation par l'industrie forestière 22
1.4 Compositions chimiques connues des parties de Pinus banksiana... 23
1.4.1 La résine 24
1.4.2 L'écorce 24
1.4.3 Les aiguilles 24
1.4.4 Le bois...... ...........25
CHAPITRE 2 MÉTHODOLOGIE 29
2.1 La récolte et la préparation 30
2.1.1 La récolte du matériel végétal ............30
2.1.2 La préparation du bois ........30
2.1.3 Le broyage. , 31
2.2 Les extractions des produits naturels 31
2.2.1 Extractions au Soxhlet à petite échelle (50 g) 31
2.2.2 Extractions au Soxhlet à grande échelle (400 g) 33
2.2.3 Extractions effectuées à la sonde ultrason 35
2.3 Le criblage biologique et biochimique 35
2.3.1 Évaluation de l'activité anticancéreuse..................................................36
2.3.2 Évaluation de l'activité antibiotique ............37
2.3.3 Évaluation de l'activité antifongique ..........37
2.3.4 Évaluation de l'activité antioxydante 38
2.4 La chromatograpMe... 35
2.4.1 La nomenclature des échantillons...................... 38
2.4.2 La chromatographie sur couche mince............................................ ..39
2.4.3 La chromatographie sur colonne.... ....................................40
2.4.4 La chromatographie en phase gazeuse.................................. 41
2.4.5 La chromatographie liquide haute performance 42
2.5 La spectroscopie .................44
2.5.1 La spectroscopie de résonnance magnétique nucléaire 45
CHAPITRE 3 RÉSULTATS ET DISCUSSION 46
3.1 Extractions ..47
3.1.1 Résultats des extractions de la première cueillette 47
3.1.2 Résultats des extractions de la seconde cueillette 47
3.1.3 Rendements des extractions avec la sonde à ultrason....... 48
3.1.4 Rendements des extractions à grande échelle (Soxhlet 400 g) 49
vu
3.2 Criblage biologique et biochimique 49
3.2.1 Résultats du criblage biologique de la première cueillette 49
3.2.2 Résultats du criblage biologique de la seconde cueillette 51
3.3 ' Choix de l'espèce......................................................... 56
3.4 Résultats de chromatographie... 56
3.4.1 Isolation des composés de l'extrait dichlorométhane 56
3.4.2 Purification de l'extrait à l'hexane .................61
3.5 Résultats de spectroscopie : identification des molécules 64
3.5.1 CS1CA et CS1EB : le matairésinol.............. 64
3.5.2 CS1BB : lapinosyîvinemonométhyleéther.. 65
3.5.3 CS1CB : lapinocembrine... 65
3.5.4 CS1CC : l'acétate de pinobanksine 66
3.5.5 CS1EA : le pinorésinol ................................66
3.5.6 CS1EC : la pinobanksine .67
3.5.7 CS6CC : l'acide 15-h.ydroxydéhydroabiétique ...................68
3.5.8 CS6CD : l'acides 13-keto-8(14)-podocarpenoïque 68
3.5.9 CS6CF : l'acide 12-hydroxyabiétique 69
3.5.10 CS6CH : l'acide imbricatolique 70
3.6 Bioactivité des molécules isolées ..70
vm
CONCLUSION 72
BIBLIOGRAPHIE ..................75
ANNEXE 1 Liste des abréviations.... ...................84
ANNEXE 2 Identification RMN des molécules 86
CS1CA et CSÏEB : MatairésinoL... 87
CS1CB : Pinocembrine 88
CS1CC : Acétate depinobanksine.... .....................................................89
CSÏEB : Pinorésinol.... 90
CSlEC:Pinobanksine .91
CS6CC: Acide 15-hydroxydehydroabiÉtique.. 92
CS6CD : Acide 13-keto-8(14)-podocarpenoïque .....93
CS6CE: Acide 12-hydroxyabiÉtique ......94
CS6CH : Acide imbricatolique 95
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1 : PINUSBANKSIANA LAMBERT 21
FIGURE 2 : DISTRIBUTION DU PINUS BANKSIANA LAMB. [THOMPSON, 1999] 22
FIGURE 3 : STRUCTURE MOLÉCULAIRE DE LA PINOBANKSINE 23
FIGURE 4 : STRUCTURE MOLÉCULAIRE DE L'ACIDE 13~KETO-8(14)PODQCARPEN-18-QÏQUE .25
FIGURES : STRUCTURE MOLÉCULAIRE DE LA PINOSYLVINE...................................................25
FIGURE 5 : STRUCTURE MOLÉCULAIRE DE LA CONIFÉRINE-E.... ........................26
FIGURE? : SCHÉMA DE L'EXTRACTION AU SOXHLET 32
FIGURES : MONTAGE DU SOXHLET DE 400 G 34
FIGURE 9 : SCHÉMA DE PURIFICATION DE L'EXTRAIT AUDICHLOROMÉTHANE... 57
FIGURE 10 : CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCES SUR GEL DE SILICE DES FRACTIONS 1A
À H ( C H C L 3 : M E O H 4 0 : 1;VANILLINE) 58
FIGURE 11 : CHROMATOGRAMME GC/MS DE LA FRACTION IB................ .......................59
FIGURE 12 : CHROMATOGRAMME HPLC PRÉPARAIT* DE LA FRACTION 1C. 60
FIGURE 13 : CHROMATOGRAMME HPLC DE LA FRACTION IE 61
FIGURE 14 : SCHÉMA DE PURIFICATION DE L'EXTRAIT À V HEXANE 62
FIGURE 15 : CHROMATOGRAMME HPLC DE LA FRACTION CS6C. 64
X
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU 1 : MOLÉCULES IDENTIFIÉES À PARTIR DE PINUSBANKSIANA, SELON LA FAMILLE,
1930-2007 27
TABLEAU 2 : CHRQMATOGRAPHIE DE L'EXTRAIT DICHLOROMÉTHANE BRUT. 40
TABLEAU 3 : CHROMATOGRAPHIE DE L'EXTRAIT HEXANE DU BOIS DE PIN GRIS ..............41
TABLEAU 4 : PARAMÈTRE D'UTILISATION DU GC/MS..... ..........42
TABLEAU 5 : CONDITION EN HPLC ANALYTIQUE UTILISÉ POUR L'ANALYSE DE
L'ÉCHANTILLON 1C 43
TABLEAU 6 ; CONDITION EN HPLC ANALYTIQUE UTILISÉ POUR L'ANALYSE DE
L'ÉCHANTILLON CS6C 43
TABLEAU 7 : CONDITIONS HPLC UTILISÉES POUR L'ISOLATION DES COMPOSÉS DE LA
FRACTION 1 C . 4 4
TABLEAU 8 : RENDEMENTS OBTENUS AVEC L'APPROCHE SÉQUENTIELLE D'EXTRACTION POUR
LES DIFFÉRENTS BOIS DE LA PREMIÈRE CUEILLETTE . . . . . . . . .47
TABLEAU 9 : RENDEMENTS DES EXTRACTIONS DE LA SECONDE CUEILLETTE 48
TABLEAU 10 : RÉSULTATS IC50 DES TESTS D'ACTIVITÉ ANTICANCÉREUSE DE LA PREMIÈRE
CUEILLETTE...... 5 1
TABLEAU 11 : RÉSULTATS IC5Q DES TESTS D'ACTIVITÉ ANTICANCÉREUSE DE LA DEUXIÈME
CUEILLETTE................. 5 2
TABLEAU 12 : RÉSULTATS DES INDICES ORAC ET ACTIVITÉ ANTIOXYDANTE SUR CELLULE
POUR LES EXTRAITS DE LA SECONDE CUEILLETTE ...54
TABLEAU 13 : ÉVALUATION DE L'AVTICITÉ ANTIBIOTIQUE DE PLUSIEURS ESPÈCES DE LA
FORÊT BORÉALE RÉSULTATS DES TESTS ANTIBACTÉRIENS D'EXTRAITS DE LA
SECONDE CUEILLETTE..... . 5 5
TABLEAU 14 : MASSE ET VALEUR D'IC5O DE L'EXTRAIT À L'HEXANE ET DES DIFFÉRENTES
FRACTIONS OBTENUES LORS DELA PURIFICATION PRIMAIRE..... 63
TABLEAU 15 ; ACTIVITÉ ANTICANCÉREUSE DES MOLÉCULES ISOLÉES..... 71
INTRODUCTION
INTRODUCTION
Deux ordres de préoccupation se rencontrent dans ce mémoire et lui donnent sa substance.
Le premier a trait à la maladie et à la recherche incessante de l'homme qui, observant la
nature et les effets de ses propres expériences, a depuis longtemps découvert que le monde
végétal est porteur d'une multitude de solutions aux problèmes de santé qui affligent les
humains.
Le deuxième se rapporte au fait que l'industrie forestière exploite massivement l'univers
végétal de la forêt boréale, y laissant comme résidu une proportion majeure de biomasse
coupée sans qu'on se soit assuré que ces résidus - que l'on perçoit d'emblée comme un
problème - fassent plutôt partie de l'ordre des solutions.
Reliant les deux ordres de préoccupation énoncés, le sujet de ce mémoire rejoint donc
l'interrogation globale suivante :
« Les matières ligneuses qui jonchent si abondamment les parterres de coupe
recèlent-elles, en qualité et en quantité, des molécules utiles à notre lutte contre la
maladie? »
Le monde végétal comme réponse à la maladie
La quête de remèdes au sein du règne végétal date de plusieurs millénaires. Venant en cela
appuyer la transmission orale des savoirs, l'écriture a grandement contribué au transfert
intergénérationnel des connaissances empiriques sur les plantes médicinales. Le papyrus
médical d'Ebers, rédigé environ 1500 ans avant J. C , compte parmi les premiers écrits
consacrés à l'usage thérapeutique des plantes [Wichtl, 1999]. Depuis lors, de nombreux
ouvrages ont servi au fil des siècles à soigner les maux qui affligent l'espèce humaine. Ces
savoirs empiriques, transmis oralement ou par écrit, trouvent aujourd'hui une nouvelle vie
dans le contexte du développement des techniques de la chimie analytique moderne.
En effet, depuis le 19e siècle, les scientifiques s'appliquent à isoler les molécules
responsables de l'activité médicamenteuse des plantes. En 1804, un scientifique allemand
nommé Rose isole l'inuline [Tungland, 2000]. Quelques années plus tard, en 1817, c'est au
tour de la morphine par Seriûmer, puis de la codéine par Robiquet en 1832. Juste après,
Paria identifie l'acide salicylique en 1838. Plusieurs de ces molécules extraites des végétaux
ont grandement contribué à la pharmacothérapie. La morphine, issue du pavot, devient le
premier analgésique central; la cocaïne s'avère un anesthésique local; l'éphédrine, principe
actif de l'éphédra, a mené aux dérivés amphétaminiques. La rauwolfîa a conduit à la
réserpine utilisée comme antihypertenseur et antidépresseur. La famille des solanacées a
mené à l'extraction de l'atropine, un antispasmodique puissant [Chalandre, 1999].
Les produits naturels d'origine végétale sont largement utilisés à des fins thérapeutiques.
On estime que plus de 60% de la population mondiale contemporaine a eu recours à de la
médication issue du règne végétal. Les produits naturels d'origine végétale occupent
également une part importante du marché pharmaceutique. En 1999, neuf des vingt
médicaments les plus vendus provenaient d'extraction végétale. Ces médicaments
16
représentent annuellement des ventes de 16 milliards de dollars US [Harvey, 2000]. La
recherche de nouveaux médicaments à l'intérieur de ce règne est loin d'être arrivé à terme3,
À ce jour, moins de 15% des 250 000 espèces connues du règne végétal auraient fait l'objet
d'analyse visant à y déterminer la présence de molécules bioactives [Balandrin et al,, 1993],
La valorisation des résidus, forestiers
Le contexte économique et les préoccupations environnementales partagées par un nombre
grandissant de citoyens et d'autres acteurs incitent l'industrie forestière à évoluer. Ainsi, de
nombreux changements s'introduisent dans ses méthodes de travail qui deviennent plus
conciliables avec la perspective d'une exploitation durable de la ressource.
L'industrie forestière québécoise s'intéresse presqu'uniquernent au bois de certaines
espèces (épinette noire, épinette blanche, pin gris, bouleau blanc, bouleau jaune, sapin
baumier, etc.). L'industrie exploite une quantité importante de matière ligneuse. Elle coupe
annuellement 30,9 millions de mètres cube de résineux pour l'industrie papetière et de
construction ainsi que 7,9 millions de mètres cube de feuillus [Coulombe, 2005]. Sur
l'ensemble de la biomasse ainsi récoltée, 27% est inutilisée et laissée sur le parterre de
coupe. À terme, 55% seulement du volume prélevé sur la biomasse forestière se retrouve
sur le marché sous forme de fibre ou de planche. Il devient donc urgent de vérifier si
certaines essences végétales, dont on abandonne des milliers de tonnes sur place chaque
a En 2005, le marché mondial des médicaments à base de taxanes était estimé à 4 milliards $ US(BioxelPharma inc, 2006),
année à titre de résidu, ne pourraient pas devenir une source pour le développement de
produits à haute valeur ajoutée.
Les, produits forestiers non-ligneux au Canada
Le prélèvement de matière végétale non ligneuse occupe une place marginale comparée à
celle de matière ligneuse. L'acériculture produit tout de même 25 millions de litres de sirop
d'érable par an. La récolte de bleuets et la production de sapin de Noël s'avèrent aussi des
activités économiques non négligeables. À cela, il faut ajouter la récolte de ginseng, d'if du
Canada, de la gomme de sapin, des huiles essentielles, et d'autres produits par les industries
nutraceutique et pharmaceutique [Coulombe, 2005]. Cette industrie génère des retombées
estimées à 241 millions de dollars par armée au Québec. Seulement en Colombie
Britannique, 200 produits forestiers non ligneux font l'objet d'une exploitation. À l'échelle
canadienne, ce chiffre atteindrait 500 produits [Deschesne, 2003]. De façon générale, les
produits forestiers non ligneux ont une grande valeur par rapport au volume récolté.
La province de Québec est un endroit de prédilection pour la recherche de molécules
bioactives d'origine végétale. Le territoire québécois comporte environ 1875 espèces de
plantes vasculaires indigènes [Gagnon, 2004].
Utilisation en. médecine traditionnelle du pin gris (Pinus banksiand)
Le pin gris est une espèce très abondante dans la forêt boréale. Diverses tribus
amérindiennes ont, traditionnellement, fait usage des différentes parties du pin gris. Les
18
Crée du Woodland utilisaient des compresses faites avec des morceaux d'écorce interne
pour soigner les coupures profondes. Les amérindiens de Potawatomi utilisaient la résine
des cônes bouillis en onguent pour toutes sortes de maux. La fumée dégagée par les
aiguilles était un remède utilisé contre la congestion des poumons. Cette même fumée
permettait d'éveiller des malades comateux. [Moerman, 1998]. Kunkel confirme que la
plante et ses graines sont comestibles. Ses jeunes aiguilles sont utilisées pour faire un thé
très riche en vitamines [Kunkel, 1984]. Plusieurs maux étaient également traités à l'aide
d'autres essences de pins comme diurétique, pour traiter la vessie, les reins et les
rhumatismes [Grieves, 1967],
Problématique et objectifs
Depuis près de dix ans, le Laboratoire d'analyse et de séparation des essences végétales
(LASEVE) de l'UQAC poursuit des travaux de recherche et développement ayant
notamment pour objet de valoriser la biomasse résiduelle engendrée par les activités de
coupe de l'industrie en forêt boréale. Les travaux et les résultats présentés dans ce mémoire
s'inscrivent à l'intérieur de ce vaste programme de développement et de mise en valeur des
connaissances sur les essences forestières des écosystèmes boréaux.
Dans le cadre de ce projet, le potentiel anticancéreux du bois de quatre espèces de résineux,
en l'occurrence le Pinus banksiana, le Pinus strobus, le Pinus resinosa et le Thuja
ocddentalis a été évalué sur des cellules en culture. Le second volet de ce projet consistait
à isoler et à identifier les molécules responsables de l'activité anticancéreuse des extraits
démontrant le meilleur potentiel anticancéreux.
Pour contribuer au développement de la base de connaissances du laboratoire LASEVE,
un criblage plus étendu au plan des essences échantillonnées et des types de bioactivité
vérifiés a aussi été effectué. Les huit espèces échantillonnées correspondent à des essences
exploitées par l'industrie forestière : Thuja occidenîalis, Pinus banksiana, Abies baïsamea,
Populus tremuloïdes, Betula atteghaniensis, Betula papyrifera, Picea mariana, Picea
glauca. Les échantillons sont ensuite traités selon des techniques similaires à celles
appliquées dans la première partie du projet. Les extraits soumis aux tests d'activité
anticancéreuse, antifongique, antibactérienne et antioxydante doivent permettre
l'acquisition de résultats utiles aux travaux ultérieurs de valorisation menés par le groupe de
recherche.
CHAPITEE 1
REVUE DE LITTÉRATURE
21
REVUE DE LITTERATURE
1.1 DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE
Figure 1 : Pinus banksiana Lambert
Le pin gris est un conifére de la famille des pinacées. Sa forme et sa hauteur dépendent de
son habitat, en particulier de la composition du sol. Dans un sol sablonneux et riche, sa
hauteur peut atteindre 20 mètres et le diamètre de son tronc presque 60 centimètres.
Cependant, les individus mesurent de 12 à 18 mètres et ont un diamètre variant entre 20 et
30 centimètres [Hosie, 1979]. Le pin gris est une espèce adaptée au feu. En effet ses cônes
éclatent à la grande chaleur d'un incendie et dispersent leurs graines capables de germer en
moins de 10 jours [Marie-Victorin, 1995].
1.2 HABITAT ET DISTRIBUTION
À l'échelle du Canada, le pin gris présente une vaste distribution. De l'île du Cap Breton en
Nouvelle-Ecosse jusqu'à la rivière Mackenzie dans les Territoire du Nord-Ouest, les
22
peuplements mixtes ou purs de pin gris s'étendent sur de vastes étendues du territoire
canadien [Rudolph, 1990].
Le pin gris est un arbre essentiellement boréal qui pénètre très loin au nord, presqu'à la
limite des arbres dans la péninsule labradorienne. Le sol du Saguenay-Lac-Saint-Jean est un
endroit propice à la prolifération des peuplements de pin gris. Les sols composés
d'alluvions et de sable lui conviennent. Il est absent dans les régions calcaires et argileuses.
Le pin gris manifeste une préférence pour les terrains siliceux brûlés. On le retrouve en
grande quantité dans la région de l'Abitibi et dans les zones siliceuses de Kamouraska
[Marie-Victorin; 1995].
. / � � Y
A
Figure 2 : Distribution du Pinus banksiana Lamb. [Thompson, 1999]
1.3 UTILISATION PAR L'INDUSTRIE FORESTIÈRE
Le pin gris représente 10 % du volume des résineux coupés par l'industrie forestière. Il sert
de bois de charpente, de traverses de chemin de fer, de poteaux et est utilisé plus
23
marginalement par la fabrication du papier. Depuis quelques années, l'industrie forestière
québécoise replante jusqu'à 31,6 millions de plants de pin gris par année, ce qui représente
environ 20 % de son effort de reboisement. Depuis 25 ans, 450 millions de plants ont été
mis en terre. L'un des freins à l'utilisation plus importante du pin gris par l'industrie des
pâtes et papier tient à la présence de pinobanksine (Figure 3) un composé dans le bois qui
entraîne une coloration jaunâtre du papier [Chapman, 1974; Law, 1994].
Figure 3 : Structure moléculaire de la pinobanksine
1.4 COMPOSITIONS CHIMIQUES CONNUES DES PARTIES DE PINUS BANKSIANA
Les premières publications touchant la composition chimique du pin gris ont paru dans les
années 1930. On trouvera au tableau 1 une synthèse des principales molécules isolées dans
les différentes parties de Pinus banksiana de 1930 à nos jours.
24
1.4.1 La résine
Les premières molécules isolées de la résine du pin gris furent des acides résmiques, des
acides gras et des stérols (tableau 1). La résine contient aussi une certaine quantité de
monoterpènes volatils [Hippert, 1931].
1.4.2 L'écorce
Les travaux sur l'écorce ont conduit à l'identification d'un bon nombre de terpènes. Cette
partie de l'arbre semble très riche en diterpenes, surtout en acides résiniques (tableau 1).
1.4.3 Les aiguilles
Depuis une trentaine d'années, des chercheurs canadiens tentent de comprendre pourquoi
Neodiprion rufifrons et Neodiprion swainei se nourrissent presque exclusivement
d'aiguilles matures plutôt que des aiguilles issues de l'année. Ces chercheurs ont postulé
que les compositions chimiques des « vieilles » aiguilles et des aiguilles d'un an étaient
différentes. C'est ainsi qu'ils ont constaté des variations dans la composition en acides
résiniques des aiguilles. Par différents tests biologiques, ils ont identifié l'acide 13-keto-
8(14)podocarpen-18-oique(figure 4) comme étant la molécule responsable de ce choix par
les insectes [Hceda, 1977]. Des acides phénoliques ainsi que des acides résiniques ont aussi
été isolé à partir des aiguilles (voir tableau 1).
25
COOH
Figure 4 : Structure moléculaire de l'acide 13-keto-8(14)podocarpen-18-oïque
1.4.4 Le bois
Figure 5 : Structure moléculaire de la pinosylvine
Les premiers polyphénols ont été isolés en 1943 par Erdtman. En 1951, l'équipe de
Lindstedt confirma la présence de trois polyphénols et isola à son tour un stilbène bien
connu, la pinosylvine (Figure 5). En 1963, des progrès majeurs furent réalisés par Rudloff
et Sato. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse de l'huile essentielle de bois de
c�ur mit en évidence 17 composés volatils. Onze de ces pics étaient identifiés comme des
monoterpènes (voir tableau 1). L'extrait acétonique du bois de pin gris a une composition
assez complexe. Trois types de molécules furent isolés : les phénoliques, les acides ainsi
que les glycérides. La présence de coniférine-E (Figure 6) et de sucre apparait aussi au
26
tableau 1. Des travaux parus en 2004 montrent la relation entre l'activité antibactérienne de
l'extrait acétonique du bois et la présence de stilbenes [Lindberg, 2004].
Figure 6 : Structure moléculaire de la coniférine-E
27
Tableau 1 : Molécules identifiées à partir de Pinus banksiana, selon la famille, 1930-2007
FamilleAcide gras
Flavanoïde
Phénylpropane
Stilbène
Sucre
Autres metabolites
Nomacide oléique
acide linoléique
acide linoléniqueacide lignocériqueacide linoléniqueacide palmiqueacide stéariquepinocembrinepinobanksinequercetin6-methylquercetine6-methylmyricetindihydroquercetinedihydromyricetincatecholvanillinconiferine-Eacide ferruliquemonométhyle éther de pinosylvine
pinosylvinecis-monométhylétherde pinosylvinetrans-monométhylétherde pinosylvinearabinosexylosemannosegalactoseglucoseacide maliqueacide quiniqueacide shikimiqueacide syringiqueacide benzoïqueglycérolvanillin
PartieRésineBoisRésineBoisRésineRésineBoisBois3oisBois3oisÉcorceEcorce=corceEcorceEcorceÉcorceEcorceBoisÉcorceBoisEcorceBoisEcorceEcorceBoisBoisBoisBoisBoisAiguilleAiguilleAiguilleAiguilleBoisBoisÉcorce
RéférenceHibbertand Phillips 1931]Rudloff, 1963]Hibbertand Phillips 1931]Rudloff, 1963]Hibbertand Phillips 1931]Buchannan étal, 1959],[Rudloff, 1963]Rudloff, 1963][Rudloff, 1963]Erdtman, 1943].Erdtman, 1943].[Rowe, 1971][Rowe, 1971]Rowe, 1971][Rowe, 1971][Rowe, 1971]Rowe, 1971]Rowe, 1971];Savidge, 1989][Bower, 1969][Erdtman, 1943].[Bower, 1966][Lindstedt, 1951][Rowe, 1969][Rowe, 1969][Hattonm, 1993][Hattonm, 1993][Hattonm, 1993][Hattonm, 1993][Hattonm, 1993][Sarkar, 1979][Sarkar, 1979][Sarkar, 1979][Sarkar, 1979][Rudloff, 1963][Rudloff, 1963][Rowe, 1971]
28
FamilleMonoterpène
Diterpène
Acide résinique
Stérol
Triterpène
Noma-pinène
L-p-pinène
camphènemyrcèneimonènep-phellandrèney-terpinènecis-p-Menthan-8-ola-terpinolagathadiolorulosol13-épitrorulosoloxyde de manoyle
+)-13-epimanoyl oxide(-)-13-epimanoyl oxidedehydroabietol18-norabieta-8,11,13-trien-4-ol19-norabieta-8,11,13-trien-4-olnimaradiènesopimaradiène5-cadinenedehydrojuvabionemanoolZ-abienolisoabienolnéoabienolDimaral7-ketodehydroabietolacide abiétique
acide pimarique
acide sandaracopimarique
acide isopimarique
acide déhydroabiétique
acide 7-ketodehydroabietiqueacide néoabiétique
acide 13-keto-8(14)podocarpen-18-oiacide levopimariqueacide palus triquephytostérol
cam pesteraidihydrocampesterolp-sitosterol
A4-stigmastèn-3-oneA4-campesten-3-oneserra tenèdiolepiserratènedioldiepiserratènediolepiserratènediol-21 monométhyl éthe
PartieRésineBoisRésineBoisBoisBoisSoisBoisBoisSoisBoisÉcorceÉcorceEcorceÉcorceSoisÉcorceEcorceÉcorceÉcorceÉcorceÉcorceEcorceÉcorceSoisBoisSoisBoisBoisBoisÉcorceRésineBoisAiguilleRésineBoisBoisAiguilleBoisAiguilleBoisÉcorceAiguilleEcorceBoisAiguilleAiguilleAiguilleAiguilleRésineEcorceÉcorceEcorceBoisÉcorceÉcorceÉcorceEcorceEcorceEcorce
RéférenceHibbertand Phillips 1931]Rudloff, 1963]Haagen-Smitetal, 1950]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Bower, 1966]Bower, 1966]Bower, 1966]Bower, 1966]Pichette, 1998]Bower, 1966]Bower, 1966]Bower, 1969]Rowe, 1971]Rowe, 1971]Rowe, 1971]Rowe, 1971]Rowe, 1971]Pichette, 1998]Pichette, 1998]Pichette, 1998]Pichette, 1998]Pichette, 1998]Pichette, 1998]Bower, 1969]
[Hibbertand Phillips 1931][Rudloff, 1963]Beth, 1984][Hibbertand Phillips 1931][Rudloff, 1963]Rudloff, 1963]Ikeda, 1977]Rudloff, 1963][Beth, 1984][Rudloff, 1963]Bower, 1969][Ikeda, 1977][Bower, 1969][Rudloff, 1963][Ikeda, 1977][Ikeda, 1977][Ikeda, 1977][Ikeda, 1977][Hibbertand Phillips 1931][Bower, 1966][Bower, 1966][Bower, 1966][Rudloff, 1963]
[Bower, 1966][Bower, 1966][Bower, 1966][Bower, 1966][Bower, 1966][Bower, 1966]
CHAPITRE 2
MÉTHODOLOGIE
30
METHODOLOGIE
2.1 LA RÉCOLTE ET LA PRÉPARATION
2.1.1 La récolte du matériel végétal
La première partie du matériel végétal a été récoltée le 18 mai 2004 soit Pinus banksiana,
P. strobus, P. resinosa et Thuja occidentalis. Ces espèces ont été prélevées à la station de
recherche de Simoncouche, 48°14'38.43"N, 71°15'15.51"O, ainsi qu'au lac des Îlets,
48°12'13.40"N, 71°14'57.99"O. Quatre individus par espèce ont été récoltés afin d'avoir un
échantillonnage représentatif et ainsi minimiser l'impact des différences individuelles. Les
arbres furent ebranchés, coupés en billots de 1 m et entreposés dans un réfrigérateur à 4°C.
La seconde récolte a eu lieu le 5 mai 2005 pour un criblage biologique plus étendu, en vue
de travaux futurs. Huit espèces ont été prélevées : Thuja occidentalis, Pinus banksiana,
Abies balsamea, Populus tremuloïdes, Betula alleghaniensis, Betula papyrifera, Picea
mariana, et Picea glauca. Ces échantillons ont été récoltés sur le même site que la première
cueillette et transportés à l'UQAC.
2.1.2 La préparation du bois
L'écorçage des billots à l'aide d'une plane a permis d'obtenir le bois. Les billots ont été
découpés en tranches minces au moyen d'une scie à ruban. Les tranches de bois furent
ensuite placées une journée dans une étuve Theko Model 18, à une température variant
entre 40°C et 50°C. Un ciseau à bois a ensuite été utilisé pour réduire les tranches de bois
en morceaux afin d'être en mesure d'introduire le bois dans le broyeur.
31
2.1.3 Le broyage
Le broyage des morceaux de bois en fine poudre fut réalisé à l'aide d'un broyeur de marque
Fritsch, modèle D-55743. Le tamis utilisé laissait passer des particules d'une grosseur
maximale de 2 mm. La poudre végétale ainsi récupérée a été placée dans des sacs de papier.
Sur ces sacs sont identifiés le nom de l'espèce, le numéro d'individu (1 à 4) et la date de la
récolte. La poudre végétale fut ensuite conservée dans un congélateur à -20°C.
2.2 LES EXTRACTIONS DES PRODUITS NATURELS
Au fil du projet, différents types d'extraction ont été effectués. L'extraction utilisait une
quantité égale de poudre végétale pour chaque individu afin de réduire la variation
interindividuelle. Les extractions servant au criblage biologique ont été effectuées au
Soxhlet avec une cartouche contenant approximativement 50 g de matériel végétal, tel que
décrit à la section 2.2.1 ci-dessous. Pour obtenir une quantité suffisante d'extrait,
l'extraction du Pinus banksinana, espèce choisie pour l'analyse phytochimique, fut
accomplie à l'aide d'un Soxhlet de 400 g (section 2.2.2 ci-dessous). Quelques
expérimentations ont été effectuées avec une sonde ultrasonique dans le but d'optimiser les
rendements d'extraction. Les détails de ces expériences sont décrits à la section 2.2.3 ci-
dessous.
2.2.1 Extractions au Soxhlet à petite échelle (50 g)
L'extraction au Soxhlet a été retenue comme technique d'extraction car elle favorise
l'extraction relativement complète des metabolites présents dans la matrice végétale. Les
32
extractions au Soxhlet ont été effectuées de façon séquentielle, en utilisant des solvants de
polarité croissante (figure 7). Les solvants utilisés étaient l'hexane, le dichlorométhane, le
méthanol et l'eau. Cette approche d'extraction permet de fractionner grossièrement les
divers produits naturels de la matrice végétale.
Bois interneséché naturellement et broyé
Soxhlet Hexane
Extrait Hexane
Extrait DCM
Extrait MeOH
Extrait H2O
Figure 7 : Schéma de l'extraction au Soxhlet
Les joints de verre frittes du montage étaient recouverts de ruban de téflon pour empêcher
les fuites et diminuer les pertes de solvant. Le montage a été réalisé à l'aide d'un ballon de
250 ml, d'un Soxhlet de 60 mm de diamètre, d'un réfrigérant ainsi que d'une cartouche de
cellulose (Whatmann, 60 x 180 mm) contenant la matière végétale broyée.
33
L'expérience nécessitait 700 ml de solvant. Une petite quantité de pierre ponce servait à
régulariser 1'ebullition. La mante chauffante était utilisée à une puissance correspondant à
70 % de sa capacité. Après le passage de chaque solvant, la cartouche séchait 24 heures à
l'étuve à 40°C. Les extraits étaient ensuite évaporés à l'aide d'un évaporateur rotatif.
L'extrait aqueux était, pour sa part, lyophilisé grâce à un appareil de marque Labconco,
modèle 6 1.
2.2.2 Extractions au Soxhlet à grande échelle (400 g~)
Même si le principe reste identique, l'extraction au Soxhlet de 400 g présente plusieurs
différences. Premièrement, un système de fixation permanent était nécessaire pour
immobiliser le montage. La verrerie requise comprenait un ballon de 4 1, le Soxhlet de 400
g et un réfrigérant de 40 cm. Les joints de verre frittes étaient recouverts de ruban de téflon.
Les cartouches utilisées étaient des Whatmann 90mm x 200mm. Trois litres de solvant et
des pierres à ebullition étaient nécessaires pour assurer le bon fonctionnement du système
de retour du solvant. Le fort volume de solvant et la grosseur du système augmentait
considérablement le temps requis pour faire le premier cycle. Des bandelettes isolantes
servaient à recouvrir la partie inférieure du Soxhlet. Ces bandelettes assuraient une certaine
isolation et contribuaient à diminuer l'emballement de 1'ebullition difficile à contrôler avec
ce système. La régulation thermique de la mante exigeait beaucoup de précision et
d'attention pour maintenir le point d'ébullition, tout en empêchant qu'elle ne s'emballe et
provoque des projections.
L'extraction sur de grandes quantités de bois impliquait deux solvants, hexane et
dichlorométhane. Pour l'extraction séquentielle cependant, tout le matériel a d'abord été
extrait à l'hexane et ensuite au dichlorométhane. Cette procédure a permis de diminuer la
quantité de solvant utilisée puisque le changement de solvant s'effectuait tous les trois
jours, plutôt que sur une base quotidienne. Le matériel végétal était remplacé tous les jours.
Un litre de solvant était ajouté quotidiennement pour compenser les pertes imputables aux
fuites du système. Pour extraire les 10 kg de matrice végétale, 22 jours d'extraction à
l'hexane et 22 jours d'extraction au dichlorométhane ont été requis. Le solvant était éliminé
des extraits par évaporateur rotatif suivi d'un séjour sur la pompe à vide.
i
11
Figure 8 : Montage du Soxhlet de 400 g
35
2.2.3 Extractions effectuées à la sonde ultrason
L'extraction des produits naturels en utilisant les ultrasons a été envisagée afin d'améliorer
le rendement et/ou la vitesse de cette étape. Les pulsations émises par la sonde à ultrasons
permettent souvent d'obtenir de meilleurs rendements car elles favorisent le bris des parois
cellulaires cellulosiques. Dans un erlenmayer de 500 ml, 50 g de bois était mis en contact
avec 500 ml d'hexane. La sonde à ultrasons de marque Sonifer, modèle Cell Disruptor 350
W, a été réglée en mode continu et la puissance ajustée à 70 W. La sonde était plongée dans
la solution pendant 30 minutes. La solution était ensuite filtrée pour séparer le filtrat de la
matière végétale. Celle-ci était séchée et ré-extraite avec dichlorométhane selon le même
protocole. Une tentative non séquentielle, avec dichlorométhane seulement, a aussi été
testée. Les solvants ont été évaporés à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide et les
masses des extraits déterminées afin d'évaluer les rendements d'extraction.
2.3 L E CRIBLAGE BIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE
Les solutions mères des extraits et des fractions ont été préparés à une concentration de 80
mg/ml tandis que les molécules pures étaient préparées à 80 mM. Les solvants utilisés pour
dissoudre ces échantillons étaient le méthanol et le DMSO. Des séries de dilutions
successives avec du milieu de culture ont été préparées pour chaque échantillon (400 à
3.125 ug/ml ou uM) et 100 uL de chacune des concentrations ont été ajoutés aux cellules à
tester.
36
2.3.1 Évaluation de l'activité anticancéreuse
Culture des cellules : les lignées cellulaires humaines suivantes ont été utilisées pour cette
étude: A549 (cancer du poumon), DLD-1 (adénocarcinome colorectal) et WS1 (fibroblastes
de peau normale). Toutes les lignées ont été obtenues auprès de l'American Type Culture
Collection (ATCC, Manassas, États-Unis). Les cellules A549, DLD-1 et WS1 ont été
cultivées dans du « Minimum Essential Medium with Earle's salt ». Le milieu de culture a
été complété avec 10% de sérum foetal de veau, des solutions de L-glutamine (IX), de
vitamines (IX), de pyruvate de sodium (IX), d'acides aminés non-essentiels (IX), de
pénicilline (100 UI) et de streptomycine (100 mg / Ml). Les cellules ont été cultivées dans
une atmosphère humidifiée à 37 °C et 5% de CO2
Test de cytotoxicité : les cellules à croissance exponentielle ont été inoculées avec une
densité de 5 * 103 cellules par puits de microplaques 96 puits et 100 uL de milieu de
culture ont été ajoutés. Les cellules ont été incubées pendant 16 heures. Cent microlitres
d'extrait (ou de composé pur) de concentrations croissantes a été ajoutés (voir ci-haut). La
concentration finale de solvant dans le milieu de culture a été maintenue en deçà de 0,5%
(v/v) afin d'éviter leur toxicité des solvants. Les cellules ont été incubées pendant 48 h, en
l'absence ou en présence de l'extrait. La cytotoxicité a été évaluée en utilisant le test de
Hoechst qui quantifie la quantité d'ADN cellulaire. La fluorescence a été mesurée à une
longueur d'onde d'excitation de 350 nm et à une longueur d'onde d'émission de 461 nm. La
cytotoxicité est exprimée comme la concentration de l'extrait ou composés inhibant la
37
croissance des cellules de 50% (IC50). Les manipulations sont similaires à celle rapportée
dans la littérature par notre groupe [Sylvestre M., 2006]
2.3.2 Évaluation de l'activité antibiotique
L'activité antibactérienne a été évaluée en utilisant la méthode décrite par [Banfi, 2006]
avec quelques modifications. Brièvement, les bactéries à croissance exponentielle ont été
inoculés dans des plaques 96 puits à fond rond. Les cellules ont été placées dans chaque
puits des microplaques à une densité de 5 x 103 pour les E. Coli (gram-négatives, ATCC
25922) et à 25 x 103 pour les S. aureus (gram-positive, ATCC 25923) et 50 ul de bouillon
nutritif (Difco) ont été ajoutés. Cent microlitres des produits à tester (concentrations
croissantes) ont ensuite été ajoutés dans chaque puits en augmentant la concentration des
extraits. Cinquante microlitres de résazurine 4% ont été ajoutés à chaque puits et les
bactéries ont été incubées pendant 6 h à 37 ° C. La fluorescence a été mesurée après 6 h par
un appareil automatisé pour la lecture de plaques 96 puits Fluoroskan Ascent à une de
longueur d'onde d'excitation de 530 nm et d'émission de 590 irai. L'activité antibiotique est
exprimée comme la concentration de produit inhibant la croissance des cellules de 50%
(IC50). Les manipulations sont similaires à celle rapportée dans la littérature par notre
groupe [Pichette A., 2007]
2.3.3 Évaluation de l'activité antifongique
La levure utilisée pour le test d'activité antifongique était Candida albicans. Cette levure a
un cycle de division de 3 heures. Comme pour les tests d'activité anticancéreuse, des
plaques 96 puits ont été ensemencés et incubées jusqu'à confluence. Les produits à tester
38
ont déposés dans chaque puit de la même manière que pour les tests d'activité
anticancéreuse
2.3.4 Évaluation de l'activité antioxvdante
La procédure a été modifiée à partir de la méthode décrite par [Ou, 2001]. Le test ORAC a
été effectué sur un Fluoroskan Ascent. Le trolox a été utilisé comme standard de contrôle.
L'expérience a été menée à 37,5 °C et à un pH de 7,4, avec un échantillon témoin en
parallèle. Le fluorimètre a été programmé pour enregistrer la fluorescence de la
fluorescéine toutes les 30 s après l'addition du 2,2-azobis (2-amidinopropane)
dichlorhydrate (AAPH). Les résultats finaux sont calculés en comparant la différence de
l'aire sous la courbe de l'échantillon et celle du témoin. Les valeurs du test ORAC sont
exprimées en micromoles d'équivalents de Trolox (TE) par milligramme (TE umol / mg).
Les manipulations sont similaires à celle rapportée dans la littérature par notre groupe
[Mamelona M., 2007]
2.4 LA CHROMATOGRAPHIE
Plusieurs types de chromatographie ont été utilisés dans ce projet. La combinaison de
diverses techniques de chromatographie permet d'obtenir des fractions purifiées et,
ultimement, des molécules pures.
2.4.1 La nomenclature des échantillons
Les échantillons de ce projet ont tous un code unique qui permet de bien les identifier et de
faciliter le retraçage. Le nom des échantillons commence toujours par les initiales de
39
l'expérimentateur suivi d'un chiffre (1 pour extrait DCM et 6 pour extrait hexane). Les
lettres qui suivent correspondent au fractionnement dans l'ordre d'élution. Le nombre de
lettres dépend du niveau de complexité de la fraction. Exemple : CS6CD : II s'agit d'une
fraction issue de l'extrait hexane (6) séparé 2 fois. La première lettre (C) indique qu'il
s'agit de la troisième fraction et la seconde lettre indique que la fraction C a été
refractionnée et qu'il s'agit de la quatrième fraction (D).
2.4.2 La chromatographie sur couche mince
Les plaques de chromatographie sur couche mince (CCM) de marque Silicycle sont
recouvertes avec du gel de silice 60 et un indicateur fluorescent à 254 nm. Le milieu
d'élution (chloroforme : méthanol, 50 : 1) (Wagner, 1984) était préparé puis ajouté dans la
chambre et laissé une heure avant d'y faire migrer les plaques. Le milieu d'élution
changeait selon les produits à analyser. Plus les produits étaient polaires, plus l'éluant était
riche en méthanol. À l'aide d'une seringue, des dépôts de 15 fj.1 d'une solution de 10mg/ml
de l'extrait ou la fraction étaient effectués de façon linéaire sur la plaque. Les différents
dépôts étaient espacés de 1 cm afin de prévenir la superposition des taches. Les plaques
éluaient sur 7,5 cm lors des chromatographies sur colonne. Pour l'évaluation de la pureté
des fractions, les plaques éluaient sur 15 cm pour obtenir une plus grande résolution.
Après migration, la plaque était séchée à l'air puis observée à l'aide d'une lampe UV à
deux longueurs d'onde (254 nm et 366 nm). Les taches apparentes ont été notées au crayon
plomb pour chaque longueur d'onde. La plaque était ensuite soumise à une pulvérisation
d'une solution 1% de vanilline dans EtOH et une pulvérisation subséquente d'une solution
40
5% de H2SO4 dans EtOH. Les produits étaient ensuite révélés par chauffage de la plaque à
110°C dans une étuve.
2.4.3 La chromatographie sur colonne
A) Chromatographie de l'extrait dichlorométhane brut du bois de pin gris
Dans une colonne de 5,8 cm x 50 cm était ajouté un morceau de laine de verre qui
empêchait le gel de silice de s'échapper par la valve. 400 g de gel de silice en suspension
dans le chloroforme ont été utilisés pour le montage de la colonne. L'extrait (10 g) a été
dissout dans 20 ml de chloroforme et le tout a été ajouté délicatement au sommet de la
colonne. Le tableau 2 résume les volumes, la composition de Féluant et le numéro de
fraction des solvants utilisés pour effectuer la chromatographie.
Tableau 2 : Chromatographie de l'extrait dichlorométhane brut
Volume(ml)1500
6000
1000
1000
SolvantCHCb-MeOH
100:060: 1
20: 1
0 : 100
Volume Fraction
25 ml
25 ml
1000 ml
1000 ml
Numéro de fraction
1 -60
60 - 300
Flush 20 : 1
Flush MeOH
Cette étape a été effectuée à deux reprises pour purifier les 18 g d'extrait dichlorométhane
disponibles. Les fractions contenant des produits similaires par chromatographie sur couche
mince ont été regroupées.
41
B) Chromatographie de l'extrait hexane du bois de pin gris
L'extrait à l'hexane a été partitionné par extraction liquide-liquide entre l'hexane et le
méthanol aqueux (60 %). Cette partition avait pour but d'éliminer les acides résiniques
présents en grande quantité dans l'extrait brut. La colonne a été montée comme
précédemment avec 400 g de silice. La portion soluble dans le méthanol aqueux (6,5 g) a
été déposée sur la tête d'une colonne de silice tel que décrit précédemment (9 cm x 14 cm).
Le tableau 3 résume les volumes, la composition de l'éluant solvants utilisés pour effectuer
la chromatographie et le numéro des fractions associées.
Tableau 3 : Chromatographie de l'extrait hexane du bois de pin gris
Volume(ml)2000
2000
2000
2000
1000
1000
SolvantDCM-MeOH
100:0
100: 1
80: 1
40: 1
20: 1
0:100
Volume Fraction
230 ml
230 ml
230 ml
230 ml
230 ml
1000 ml
Numéro de fraction
1-9
10-18
19-27
27-36
37-41
Flush MeOH
2.4.4 La chromatographie en phase gazeuse
Le chromatographe en phase gazeuse utilisé dans ces travaux est celui des laboratoires
d'enseignement du Département des Sciences Fondamentales (DSF). Il s'agit d'un appareil
Agilent 6890N, couplé à un spectromètre de masse et d'un injecteur automatique de la série
7683. La méthode de chauffage, le débit des gaz ainsi que les différents paramètres sont
42
résumés au tableau 4. Les échantillons ont été dérivés à l'aide de diazométhane avant
l'injection pour augmenter la volatilité des produits (acides).
Tableau 4 : Paramètre d'utilisation du GC/MS
Appareil:Modèle
ConditionsInjection
Gaz porteur
HP6890
chromatographiques :: 3M!: Hélium, 1 ml/min
Détection:MS quadrupoleIonisation : El, 70 eV
Température :
Colonne:Longeur:
Diamètre:Size :
Injecteur :Détecteur :
Colonne initiale :Colonne gradient :
Colonne finale :
DB-530 m0.25mm0.25um
250 °C280 °C100°C(1 min)3 °C/min280 °C
2.4.5 La chromatographie liquide haute performance
Les travaux d'isolation ont nécessité deux types de chromatographes liquides haute
performance (HPLC). Les sous-sections suivantes traitent plus précisément du HPLC
analytique couplé à un détecteur MS ainsi que du HPLC à capacité semi-préparative.
A) HPLC analytique couplé à un détecteur MS
Le HPLC utilisé est un Agilent de la série 1100 équipé d'une pompe quaternaire, d'un
dégazeur, d'un système d'injecteur automatique, d'un module chauffe-colonne, d'un
détecteur UV-visible à barrette à diodes ainsi que d'un détecteur MS. Cet appareil permet
d'évaluer la complexité d'une fraction, le niveau de pureté d'un produit, et donne
également des informations structurales sur les produits séparés (profil de fragmentation et
ion moléculaire). De plus, l'appareil a été utilisé pour élaborer une méthode de séparation
sur HPLC préparatif.
43
Tableau 5 : Condition en HPLC analytique utilisé pour l'analyse de l'échantillon 1C
Appareil:Modèle: Agilent 1100 series
Échantillon : 1CFichier: \Sirois\1 C000008
Détection:
Conditions chromatographiques :Injection : 5ul
Solvent A : H2OSolvent B : MeOH
DAD: Long, d'onde Bandwith Référence :
250 100
Paramètre MSD : Mode: scanPolarité: (+)
Chambre :Drying gas flow (L/min): 10
Nebulizer pressure (psig): 40
Drying gas temp (°C): 350
UV (DAD)MSD
Colonne: ZORBAX ODSLongeur: 150mm
Diamètre: 4.6mmSize : 5um
# série : USG0014484
Elution: Isocratique 50% BDébit: 1mL/min
Temp.colonn 25°C
Long, d'onde Bandwith
360 100
Mass Range: 100-1000Fragmentor: 70
Capillary voltage (V): 4000Corona current (uA): 4
Vaporizer temp (°C): 400
Tableau 6 : Condition en HPLC analytique utilisé pour l'analyse de l'échantillon CS6C
Appareil:Modèle : Agilent 1100 series
Échantillon : CS6CFichier : \CSirois\66-C0009
Conditions chromatographiques :Injection : 5ul
Solvent A : H2O+0.1%HCOOHSolvent B : ACN+0.1%HCOOH
Détection:UV (DAD)MSD
Colonne: ZORBAX ODSLongeur: 150mm
Diamètre: 4.6mmSize : 5um
#série: USG0014484
Élution : Isocratique 40% BDébit : imL/min
Temp.colonne : 25°C
DAD: Long, d'onde Bandwith Référence : Long, d'onde Bandwith
250 100 360 100
Paramètre MSD : Mode: scan
Polarité: (+)
Chambre :Drying gas flow (L/min): 10
Nebulizer pressure (psig): 30
Drying gas temp (°C): 350
Mass Range: 100-1000
Fragmentor: 70
Capillary voltage (V): 4000Corona current (uA): 4
Vaporizer temp (°C): 400
44
Toutes les fractions furent analysées avec une méthode isocratique. Les tableau 5 et 6
résument les principaux paramètres de la méthode d'analyse.
B) HPLC à capacité semi-préparative
Ce type de HPLC permet la récupération du matériel après analyse. Le système semi-
préparatif du laboratoire est un appareil Agilent de la série 1100. Il est pourvu de deux
pompes binaires, d'un détecteur UV-visible et d'un collecteur de fractions. Les conditions
de la fraction 1C apparaissent au tableau 7. La fraction IE a été traitée dans les mêmes
conditions. Cependant, le pourcentage de méthanol y a été ajusté à 40%. La fraction CS6C
est soumise aux mêmes conditions d'élution décrite au tableau 6.
Tableau 7 : Conditions HPLC utilisées pour l'isolation des composés de la fraction 1C
Appareil:Modèle :
Echantillon :Concentration échantillon
|| Détection:Agilent 1100 series1C100 mg/mL
Conditions chromatographiques :Injection
Solvent ASolvent B
DAD: Long, d'onde250
200 ML
H2OMeOH
Bandwith Référence :100
UV (DAD)
Elution :Débit :
Temp.colonne :
Long, d'onde360
Colonne:Longeur:
Diamètre:Size :
# série �
Isocratique16 mL/min25°C
Bandwith100
ZORBAX ODS25 cm21.2 mm7 |jm
USBY002127
50% B
2.5 LA SPECTROSCOPIE
Les techniques spectroscopiques sont généralement des méthodes servant à identifier les
produits analysés.
45
2.5.1 La spectroscopie de résonnance magnétique nucléaire
Un spectromètre de résonnance magnétique nucléaire (RMN) Bruker Avance 400 est
employé à 298°K pour réaliser les spectres. La sonde QNP (5mm), capable de produire des
gradients (Z) de champ magnétique est optimisée pour une fréquence de 400.13 MHz pour
le proton et 100.61 MHz pour le carbone. Toutes les molécules font l'objet de plusieurs
expériences : ID !H, ID 13C, DEPT-135, COSY, HMBC et HSQC. Les échantillons de 5 à
10 mg sont solubilisés dans le méthanol-d4 ou le chloroforme-d, selon leurs affinités. Les
déplacements chimiques (ppm) ont été référencés avec les signaux du solvant résiduel, pour
le chloroforme (proton 7,26 ppm, carbone 77,0 ppm) et pour le méthanol (proton 3,31 ppm
et carbone 49,0 ppm).
CHAPITRE 3
RÉSULTATS ET DISCUSSION
47
RESULTATS ET DISCUSSION
3.1.1 Résultats des extractions de la première cueillette
Les extractions séquentielles des produits naturels du bois de Pinus banksiana, P. strobus,
P. resinosa et Thuja occidentalis ont été effectuées avec un Soxhlet contenant 50 g. Les
rendements de ces extractions figurent au tableau 8.
Tableau 8 : Rendements obtenus avec l'approche séquentielle d'extraction pour les
différents bois de la première cueillette
Espèces :
T. ocddentalisa
P. banksiana a
P. resinosa*
P. strobus "
HEX
Rend. (%)b
1,9%
2,5%
. 5,2%
6,9%
Masse (g)
0,8 .
1,12,13,0
DCM
Rend. (%)b
0,8%
1,1%
0,3%
1,0%
M asse (g)
0,4
0,4
0,10,5
MeOH
Rend. (%)b
3,9%
1,2%
1,1%
2,2%
Masse (g)
1,70,5
0,5
0,9
H2
Rend. (%)b
0,0
0,4%
0,4%
0,4%
O
Masse (g)0,1
0,2
. 0,2
0,21 environ 45 g de bois utilisé
masse estais utilisée \Aï,9g
Les rendements obtenus montrent des variations importantes entre les espèces. Ces résultats
suggèrent que les bois des différents pins étudiés sont riches en composés peu polaires qui
ont des affinités avec l'hexane. Le Thuja occidentalis semble cependant riche en composés
polaires ayant une forte affinité pour le méthanol.
3.1.2 Résultats des extractions de la seconde cueillette
Rappelons que la seconde cueillette a eu lieu approximativement 1 an après la première.
48
Tableau 9 : Rendements des extractions de la seconde cueillette
Espèces :T ocddentalisP banksianaA batsameaP tremuloïdesB. alleghaniensisB papyriferaP. marianaP. glauca
HEX
Rend. (%)1,5% -2,2%0,4%4,0%0,3%2,7%0,6%. -0,5%
Masse (g)
: 1.42,00,41,70,41,1
, °.50,4
DCMRend. (%)
0,5%1,7%0,5%0,6%0,2%1,3%0,2%0,3%
Masse (g)0,51,60,50,30,30,50,20,3
MeOH
Rend. (%)4,3%2,0%2,7%6,6%2,0%8,9%
" 0,7%0,8%
Masse (g)4,0
1,92,52,82,83,8
, 0,60,8
H2ORend. (%)
0,8%0,5%0,9%1,8%0,5%2,1%0,8%1,2%
Masse (g)0,70,4.0,80,80,70,90,B
1,1
Tel que montré dans le tableau 9, les rendements obtenus pour certaines espèces sont
étonnamment élevés. En combinant les quatre extraits, le Populus tremuloïdes et le Betula
papyrifera affichent des rendements en extractibles de l'ordre de 13,0% et 14,9%. Ces
rendements dépassent de beaucoup ceux obtenus avec le Betula alleghaniensis, Picea
mariana et P. glauca qui n'atteignent même pas 3 % en extractibles.
3.1.3 Rendements des extractions avec la sonde à ultrason
L'utilisation des ultrasons visait à augmenter les rendements d'extractions des produits
naturels du bois de pin gris ou à obtenir des résultats comparables dans des temps plus
courts que l'extraction au Soxhlet. Deux extractions ont été réalisées; la première,
séquentielle avec l'hexane et le dichlorométhane et la seconde, avec le dichlorométhane
seulement. L'extraction séquentielle effectuée a permis d'obtenir des rendements de 1.2%
avec l'hexane et de 2.1 % avec le dichlorométhane. Les extractions au Soxhlet ont donné
des rendements supérieurs avec l'hexane mais inférieurs avec le dichlorométhane.
L'extraction au dichlorométhane a permis d'obtenir un rendement de 2.9% ce qui se
49
compare avec l'addition des deux rendements séquentiels hexane et dichlorométhane
(3,3%). L'utilisation des ultrasons, même si les résultats étaient encourageants, n'a pas été
priorisé pour la suite de ce projet en raison de problème prévue de mise à l'échelle.
3.1.4 Rendements des extractions à grande échelle (Soxhlet 400 g)
Les rendements des extractions à grande échelle du bois interne de Pinus banksiana sont
décevants par rapport aux tests préliminaires à petite échelle. À partir de 11 kg de bois, 150
g (1,4 %) d'extrait hexane et seulement 20 g (0,2 %) d'extrait dichlorométhane ont pu être
récupérés. Ces faibles rendements sont, par contre, explicables. D'une part, à quelque
reprise, le système de réfrigération a semblé défaillir au cours de l'expérience, ce qui a
détruit des portions d'extrait. Par ailleurs, la taille des cartouches ne facilite pas le passage
du solvant de façon uniforme dans la cartouche : des portions pourraient ne pas avoir été
extraites durant le processus. Les rendements d'extraction observés à grande échelle sont
nettement inférieurs à ceux observés à plus petite échelle. Ces problèmes amènent à mettre
en doute la pertinence de cette technique pour l'extraction sur de grandes quantités de bois
à un faible rendement. Aussi, dans les travaux futurs sur le bois de Pinus banksiana, il est
suggéré d'utiliser d'autres méthodes comme par exemple, la lixiviation sur une colonne.
3.2 CRIBLAGE BIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE
3.2.1 Résultats du criblage biologique de la première cueillette
Les résultats des extraits de première cueillette aux tests d'activité anticancéreuse
constituent la raison d'être de ce projet. Ces résultats ont d'ailleurs servi à déterminer le
50
choix de l'espèce pour l'analyse phytochimique. L'analyse des résultats du tableau 10
indique clairement que certains extraits ne démontrent pas d'activité cytotoxique sur les
cellules. Aucun des extraits aqueux ne présente d'activité digne de mention. Parmi les
quatre espèces du tableau 10, les extraits au méthanol et certains au dichlorométhane
montrent une certaine cytotoxicité. L'extrait au dichlorométhane du bois de Thuja
occidentalis est fortement cytotoxique avec des IC50 souvent inférieurs à 10 ug/ml. Par
contre, cet extrait et même celui au méthanol semblent davantage cytotoxiques pour les
cellules saines que pour les cellules cancéreuses. Il est intéressant de souligner que les
extraits au méthanol et au dichlorométhane du Pinus banksiana et du Pinus resinosa, bien
que moins cytotoxiques que les extraits de Thuja occidentalis, montrent une toxicité plus
sélective aux cellules cancéreuses. Pour cette raison et parce que le rendement d'extraction
au dichlorométhane est plus concluant, nous avons porté notre attention sur le pin gris.
3.2.1 Résultats du criblage biologique de la seconde cueillette
Le tableau 11 présente tous les IC50 des tests anticancéreux de la deuxième
cueillette. Les résultats avec le Thuja occidentalis et le Pinus banksiana diffèrent de la
première cueillette. Dans le cas du Thuja, l'extrait à 1' hexane de la seconde cueillette (IC50
A-549 = 11 ± 1) semble beaucoup plus actif que celui de la première cueillette (IC50 A-549
= 111 ± 8). L'extrait dichlorométhane apparaît par contre un peu moins actif. Cette
tendance s'observe aussi chez Pinus banksiana où l'extrait à l'hexane se montre légèrement
plus actif et l'extrait au dichlorométhane légèrement moins, dans les extraits de la seconde
cueillette.
51
Tableau 10 : Résultats IC50 des tests d'activité anticancéreuse de la première cueillette
EspèceT occidentalis
T. occidentalisT occidentalisT occidentalis
P. banksianaP. banksianaP. banksiana
P. banksianaP resmosaP. resmosaP. resinosa
P resmosaP. strobusP. strobusP. strobusP. strobus
SolvantHex.DCMMeOHH2OHex.DCMMeOH
H2O
HexDCMMeOHHZOHex.DCMMeOH
H2O
Hoechst (pg/mL)A-54930±26±128±1
nd58±428±220±2>200
193±1650±756±5>20055±421±1>200>200
DLD-123±23±115±1nd
68±529±336±394±10>20051 ±351 ±3
170±1065±419±2>200129±9
WS121±34±116±2nd
121±675±746+4
108±11>200
103±1169+7
151±13138±642±5>200
142±13Note : Témoin positif: Etoposide : A-549 1,0 ± 0.3, DLD-1 : 4±1 et WS1 : nd
Le tableau 11 démontre que les extraits aqueux sont inactifs sur les cellules. Dans
les six nouvelles espèces testées, seul l'extrait hexane de Picea mariana montre une
certaine sélectivité sur les cellules cancéreuses comparable aux extraits hexane et
dichlorométhane du bois de Pinus banksiana. Les résultats de l'évaluation de l'activité
anticancéreuse des matrices végétales de cette récole confirment que le bois de Pinus
banksiana possède une activité intéressante et suggèrent qu'il contient un ou des composés
potentiellement anticancéreux.
52
Tableau 11 : Résultats IC50 des tests d'activité anticancéreuse de la deuxième cueillette
EspèceT. occidentalisT. occidentalisT occidentalisT occidentalis
P. banksianaP. banksianaP. banksianaP banksianaA balsameaA balsameaA. balsameaA. balsamea
P. tremuloidesP. tremuloidesP. tremuloidesP tremuloidesB. alleghaniensisB. alleghaniensisB. alleghaniensisB. alleghaniensis
B. papyriferaB. papyriferaB. papyriferaB. papyriferaP. nuiiuiruH irunanaP manoru)n m injnn
P. glaucaP. glaucaP. glaucaP. glauca
SolvantHex
DCM
MeOHH2O
Hex.DCM
MeOHH2O
Hex
DCM
MeOHH2O
Hex.DCM
MeOHH2O
Hex
DCM
MeOHH2O
Hex.DCM
MeOHH2O
Hev
DCM
MeOHH.O
Hex.DCM
MeOHH2O
Hoechst (pg/mL)A-54911±116±120 ±2>200
30 ±223 ±229 ±2>200
178 ±2445 ±4113±7>200
137 ±776 ±682 ±5>20077 ±463 ±4>200>200
67 ±761 ±4151 ±7>20063 ±357 ±4110±5>200
49 ±467 ±5
151 ±7>200
DLD-16 ± 115±211 ±1
123± 10
53 ±664 ±644 ±4
198 ±20>20046 ±4
112 ± 13>200
126 ±447 ±264 ±4>20073 ±544 ±3
200 ±14>200
59 ±550 ±3137 ±8>20088 ±550 ±367 ±4�200
55 ±560 ±353 ±3>200
WS-18 ± 119±338 ±8
154 ±26
103 ±2119 ± 1560 ±9>200>20059 ±3105 ±8>200
163 ±2163 ±650 ±5>20075 ±852 ±7>200>200
25 ±233 ±4
173±19>200
111 ±753 ±656 ±4>200
30 ±837 ±459 ±4>200
Note : Témoin positif : Etoposide : A-549 1,0 ± 0.3, DLD-1 : 4±1 et WS1 : nd
Les tests ORAC permettent d'évaluer le capacité antioxydant des différents extraits.
Une valeur de 1 uM/mg signifie que 1 uM de trolox sont nécessaire pour produire la même
activité antioxydante que 1 mg d'extrait. Les résultats obtenus pour les espèces de seconde
cueillette sont présentés au tableau 12. La majorité des espèces testées montrent une activité
53
antioxydante intéressant. Les extraits à l'hexane, à l'exception de ceux du T. occidentalis,
B. alleghaniensis et P. banksiana, s'avèrent moins actifs que les autres extraits obtenus
avec des solvants plus polaires. Les résultats les plus intéressants sont obtenus avec les
extraits méthanoliques de Thuja occidentalis, Pinus banksiana, Abies balsamea, Populus
tremuloïdes, Betula papyrifera et Picea glauca. L'extrait au dichlorométhane d'Abies
balsamea montre une excellente réponse aux tests ORAC. De plus, des tests sur cellules ont
été effectués avec les extraits afin d'évaluer l'activité antioxydante dans un contexte
cellulaire. Les résultats obtenus sur modèle cellulaire indiquent qu'aucun des extraits à
l'hexane et au dichlorométhane ne possède un pouvoir antioxydant. Les extraits aqueux et
méthanoliques possèdent en revanche des niveaux d'activité élevée pour les espèces
suivantes : Abies balsamea, Betula alleghaniensis, Betula papyrifera, et seulement l'extrait
méthanolique du Populus tremuloïdes, Picea glauca et Picea mariana. Tous les IC50 de ces
extraits sont inférieurs à 4 ug/ml (la concentration minimale testée), ce qui est étonnant.
Les résultats sur l'activité antibactérienne des extraits de la seconde cueillette sont
regroupés au tableau 13. Selon les résultats obtenus, les extraits de Thuja se démarquent par
leur efficacité. Il semble qu'ils soient à la fois actifs sur les bactéries à gram positif et
négatif. L'extrait méthanolique du Pinus banksiana montre encore une activité très
marquée à la fois sur les grams positifs et négatifs.
54
Tableau 12 : Résultats des indices ORAC et activité antioxydante sur cellule pour les
extraits de la seconde cueillette
EspèceT. occidentalis
T. occidentalisT. occidentalis
T. occidentalis
P. banksianaP. banksianaP. banksiana
P. banksianaA holiy.imoa
A halsamea
A balsamea
A hcj/ixjf/iea
P. tremuloides
P. tremuloidesP. tremuloides
P. tremuloidesB j/teg'jj/MC/is/iB nlleghamensis
B nlleiihamensis
B jlleqhaniensii
B. papyrifera
B. papyriferaB. papyrifera
B. papyriferaP. mariana
P. marianaP. mariana
P. mariana
P. glauca
P. glaucaP. glauca
P. glauca
SolvantHex.DCMMeOH
H2OHex.
DCMMeOH
H2OHex.DCMMeOH
H2OHex.
DCM
MeOH
H2OHexDCMMeOH
H.,OHex.DCMMeOH
H2OHex.
DCMMeOH
H2O
Hex.DCM
MeOH
H2O
Indice ORACuMol Trolox / mg
4,7 ±0,84,7 ±0,38,7 ± 0,7
4,5 ±0,31,5 ±0,4
4 ± 1
17±2
3,1 ±0,50,7 ± 0,215±2
9,6 ± 0 7
1,9 ±0,3
0,11 ±0,04
1,2 ±0,36,5 ± 0,6
0,8 ±0,11,6 ±0.33 0 ± 0,70,6 ± 0,7
4 ± 1
0,045 ± 0,006
2,7 ±0,713± 1
4,0 ± 0,40,10 ±0,04
1.71 ±0,045 ± 1
0,5 ±0,20,051 ± 0,005
1,4 ±0,19± 1
0,21 ± 0,03
Antiox Cellules
IC5o (Mg'mL)nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
<0,43 ± 1
8 ± 2
nd
43 ± 133± 1
15±4nd
58 ± 131 0 ± 0 5
0 9 ± 0 1
nd
24 ± 60,94 ± 0,09
0,8 ±0,2194 ±3512±5
1,27 ±0,05
7,6 ± 0,2153 ±42
18 ±31,2 ±0,7
319 ±67
55
Tableau 13 : Évaluation de l'activité antibiotique de plusieurs espèces de la forêt boréale
Résultats des tests antibactériens d'extraits de la seconde cueillette
EspèceT ocudontnlisT ocudfiitulis
T uccidontdlis
T uCLidentalis
P. bankslanaP. banksiana
P. banksiana
P. banksianaA hal&amcaA bal^amua
A halsamea
A hnlsamua
P. tremuloides
P. tremuloides
P. tremuloides
P. tremuloidesB KilkxfhumensisB lillcijhamonsis
B Jlleqhjniom>is
B alloghaniensis
B. papyriferaB. papyrifera
B. papyrifera
B. papyriferaP mommaP rnaridnj
P munjna
P mnihina
P. glauca
P. glaucaP. glauca
P. glauca
SolvantHexDCMMeOH
H,OHex.
DCM
MeOH
H2OHexDCMMeOH
H;OHex.
DCMMeOH
H2OHexDCM
MeOH
H.OHex.
DCM
MeOH
H2OHexDCMMeOH
H OHex.DCM
MeOH
H2O
IC50(Mg/mL)E.coli
6,8 ± 0.796 ±1534 ±3>160>160>160
111 ±9>160
>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160>160
S.aureus40 ±5
126 ±5077 ±6>160
58± 15150 ±2550 ±1>160
134±15134 ±7>160>160
79 ±1985 ±4>160>160103 ±2275 ±10>160>160
124 + 1361 ±2>160>16067 + 4
184 + 20>160>16059 ±2>160>160>160
Note : Témoin positif : Chloramphénicol : S. aureus : 7 ±1 etE. coli : 0.90 ± 0.06
56
3.3 CHOIX DE L'ESPÈCE
Les résultats de la première cueillette ont confirmé le potentiel anticancéreux de deux
espèces, le Pinus banksiana et le Pinus resinosa. Ces extraits montraient une activité
sélective sur les cellules cancéreuses. Le choix final de l'espèce s'est fait en considérant les
rendements d'extraction du Pinus banksiana, qui sont supérieurs à ceux obtenus avec le
Pinus resinosa. Les résultats obtenus lors de la seconde cueillette n'ont pas été pris en
compte puisqu'elle a été effectuée un an après le début du projet. Malgré cela, les résultats
découlant de la seconde cueillette ne remettent pas en question la pertinence du choix de
Pinus banksisana.
3.4 RÉSULTATS DE CHROMATOGRAPHIE
Les travaux de chromatographie ont conduit à l'isolation de neuf molécules. Les six
premières molécules viennent de l'extrait dichlorométhane. Les trois autres sont issues de
l'extrait hexane.
3.4.1 Isolation des composés de l'extrait dichlorométhane
La première chromatographie effectuée avec 10 g d'extrait, telle que décrite à la section
2.4.3 a permis d'obtenir plusieurs fractions dont les fractions IB (1,90 g), 1C (1,74 g) et
IE (0,66 g) particulièrement intéressantes pour un fractionnement subséquent car elles
présentent un rendement élevé et une composition chimique simple (par CCM). La
figure 9 résume le travail de purification effectué sur l'extrait dichlorométhane.
57
Fraction A, B
Extrait DCMbois interne
Pinus Banksiana Lamb,
Fraction C
HPLC:C,8MeOH50%
Chromatographie sur SiOa dans un système<r"éluantCHCl3:MeOH
Fract iou D Fraction E
Matairesiuol
Pinoceiubiiue
Acétate depinobauksiue
Fraction F, G. H, I . J,K
HPLC : Ou MeOH40%
Piuobmiksiue
Mntaùésiuol
Piuorésinol
Figure 9 : Schéma de purification de l'extrait au dichloromethane
Les analyses par CCM de la fraction IB (figure 10), montrent la présence de trois taches
dans la même zone chromatographique. Plusieurs conditions d'élution ont été mises à
l'essai et aucune n'a permis d'obtenir une meilleure séparation. Il est intéressant de
souligner que l'une des taches de cette fraction semble correspondre à la tache majoritaire
de la fraction 1C.
58
1D 1E 1F 1Gstd 11
Figure 10 : Chromatographie sur couche mince sur gel de silice des fractions 1A à II
(CHC13 : MeOH 40 : 1; vanilline)
La figure 11, illustrant le chromatogramme obtenu par chromatographie en phase gazeuse
de la fraction IB, montre clairement la présence de deux produits majoritaires et d'un
produit minoritaire. Par comparaison avec les données de la banque spectrales NIST02 et
de standards du laboratoire, les deux molécules majoritaires ont pu être identifiées comme
étant la pinocembrine (m/z = 256 g/mol, TR= 41,5 min) et le pinosylvine monomethyle
ether (m/z = 226 g/mol, TR= 46,5 min). Il n'a pas été possible d'identifier le produit
responsable du pic visible à 34 minutes (Figure 11). Cette fraction semble contenir les
constituants majoritaires du bois dePimis banksiana car elle représente 30% de la masse de
l'extrait au dichlorométhane.
59
1400000
13OOOOO
1200000
-1 1 OOOOO
8OOOOO
7OOOOO
eooooo
sooooo
400000
3OOO00
2OOOOÛ
-i ooooo
S.OO "I O.OO -I S.OO 2O.OO 2S.OO 3 0 . 0 0 35.OO 4O.OO -45.OO 5O.OO 55.OO OO.OO SS.OO
Figure 11 : Chromatogramme GC/MS de la fraction IB
La CCM de la fraction 1C (figure 10), montre la présence d'un composé majoritaire et
d'un produit minoritaire. L'analyse par HPLC en utilisant des conditions isocratiques (50%
MeOH / H2O) révèle clairement la présence de trois produits dont un majoritaire.
Le spectromètre de masse couplé au HPLC a permis de déduire que le produit majoritaire
(TR = 50 min) possède une masse molaire de 256 g/mol, tandis que les produits élues à 10
min et 56 min ont des masses molaires de 358 g/mol 314 g/mol respectivement. Lorsque
cette méthode a été transposée avec succès sur HPLC préparatif (figure 12), la récolte des
fractions et leurs combinaisons ont conduit à trois produits purs : CS1CA (15,6 mg),
CSICB (54,2 mg) et CSICC (6,2 mg). Ces quantités ont été obtenues de cinq injections, ce
qui correspond à 100 mg de la fraction 1C.
60
400
MWO
Figure 12 : Chromatogramme HPLC préparatif de la fraction 1C
Afin de disposer de plus de matériel, la masse de la fraction IE a été augmentée en la
combinant avec une fraction similaire provenant d'une autre chromatographie. L'analyse
par CCM montre, après révélation à la vanilline, la présence d'un produit majoritaire. Ce
produit majoritaire est cependant accompagné d'une impureté visible par CCM et l'analyse
HPLC en condition isocratiques (40 % MeOH : H2O) révèle la présence de trois produits.
La purification par HPLC semi-préparatif à partir de 180 mg de la fraction IE (figure 13a
conduit à l'isolation de 3,0 mg de CS1EA, 1 mg CS1EB et 38 mg du produit majoritaire
CS1EC.
61
200
SX
s*
à '. ' ' ' 4 ' ' ' '
Figure 13 : Chromatogramme HPLC de la fraction IE
3.4.2 Purification de l'extrait à l'hexane
Les rendements d'extraction obtenus sur le bois de Pinus banksiana avec l'hexane sont
supérieurs à ceux obtenus avec le dichlorométhane. Il a donc été possible de disposer d'une
quantité suffisante de cet extrait pour entreprendre un fractionnement guidé par la
bioactivité. La figure 14 présente le schéma d'isolation des différentes molécules de
l'extrait hexane.
Comme différents groupes l'ont décrit [Rudloff, 1965; Bower, 1969; Rowe, 1971], les
différentes parties du pin gris contiennent des acides diterpéniques nommés acides
résiniques. Ces acides puisqu'ils sont solubles dans l'hexane ont été extraits selon nos
conditions d'extraction. Il est possible de séparer les composés non polaires (acides
résiniques et autres) des plus polaires avec une partition à l'hexane et une solution 60%
MeOH/EbO. Lorsque les deux phases sont soumises aux tests de bioactivité, la fraction
MeOH 60% est plus active que l'extrait brut et la fraction hexane s'avère totalement
inactive. Le fractionnement par chromatographie sur colonne sur gel de silice de la phase
62
méthanolique en utilisant un gradient d'élution CHCI3 : MeOH (100 :0 à 20 :1) a conduit à
la récupération de plusieurs fractions. L'activité cytotoxique de ces fractions a été évaluée
sur les trois lignées cellulaires tel que présenté au tableau 14.
Extrait hexane
r
Phase hexane
Extractîonîiq-lk
Phase MeOH 60%
r
Fraction  Fraction B
Chromaiog^aphiêsurSiDî avecun*luantCHC%: MeOH
r
Fraction C
HPLC : Ci«50%ACN -K),l%HCOOH
l p
Pince embrine
Pinosylvinemonomethyl éther
Fraction DF
Fraction E
HPLC : Ci840%ACN +0,1% HC<X)H
�
Acide 12-hydroxyabietique
Acide 15-hydroxy dehydroabietique
Acide imbricratoiique
Acide 8(14)-podocarpeii-13-on-l8-oiqiie
Figure 14 : Schéma de purification de l'extrait à 1' hexane
63
Tableau 14 : Masse et valeur d'ICso de l'extrait à l'hexane et des différentes fractions
obtenues lors de la purification primaire
FractionExtrait brut
Phase hexanePhase MeOH 60%
Fraction AFraction BFraction CFraction DFraction E
Masse totale50,0 g43,1g6,9 g
2,97 g0,35 g1,43 g0,56 g0,53 g
Hoechst (ng/mL)A-54997 ±6>20034 ±217 ±132 ±260 ±338±354 ±3
DLD-1>200>200
60 ±1135 ±266 ±579 ±1261 ±853 ±4
WS-1131 ±6>20048 ±459 ±894 ±4
172 ± 28132 ±761 ±7
La fraction A, qui présente une plus forte activité anticancéreuse a été purifiée par HPLC et
ces travaux ont mené à l'isolement du pinocembrine et du pinosylvine monométhyle éther
isolés par HPLC.
La fraction C est également intéressante puisqu'elle est abondante et sélective envers les
cellules cancéreuses selon le test de Hoechst. Cette fraction est cependant très difficile à
séparer par CCM dans des éluants constitués de chloroforme et de méthanol. La fraction a
donc été analysée au HPLC analytique afin de déterminer son degré de complexité. Pour
augmenter la résolution des pics, l'acide formique a été utilisé avec l'acétonitrile et l'eau.
Puisque la séparation était satisfaisante (figure 15), la technique a été transposée sur HPLC
préparatif et les fractions ont été récoltées selon la méthode décrite au tableau 6.
64
Figure 15 : Chromatogramme HPLC de la fraction CS6C
En 10 injections d'une masse totalisant 200 mg, il a été possible de récolter les fractions
suivantes : CS6CA (9,3 min, 4 mg), CS6CB (11,7 min, trace), CS6CC (12,5 min, 9 mg),
CS6CD (13,3 min, 8 mg), CS6CE (15,1 et 15,6 min, 17 mg), CS6CF (19,5 min, 12 mg),
CS6CG (27,6 min, 100 mg), CS6CH (29,44 min, 17 mg) et CS6CI ( 30,0 min, 9 mg). La
pureté de chaque fraction a été vérifiée par HPLC analytique : seuls C, D, F et H semblent
purs.
3.5 RÉSULTATS DE SPECTROSCOPIE : IDENTIFICATION DES MOLÉCULES
3.5.1 CS1CA et CS1EB : le matairésinol
Cette molécule a été isolée avec un rendement de 2,7 % par rapport à la masse de l'extrait
au dichlorométhane. Le spectre RMN montre des signaux caractéristiques d'un noyau
aromatique trisubstitué en para et en meta. Les signaux à 4,17 et 3,94 ppm proviennent de
protons attachés au même carbone (HSQC) qui est un CBb (8c = 72,9) très déblindé,
caractéristique d'un carbone oxygéné près d'une lactone. Les deux singulets 3,79 et 3,80
ppm, intégrant chacun pour 3H sont caractéristiques des groupes méthoxy. La structure de
la molécule, son assignation totale et d'autres données sont indiquées en annexe et
65
concordent avec les données spectrales de la littérature [Umezawa, 1991]. Il s'agit, à notre
connaissance, de la première mention du matairésinol dans le bois de pin gris. Les détails
de l'identification sont fournis en annexe. Cette molécule a été isolée dans deux fractions
soit CSICAetCSIEB.
3.5.2 CS1BB : la pinosvlvine monométhvle éther
La molécule CS1BB a été identifiée par CCM en la comparant la fraction IB avec un
standard de pinosylvine monomethyle éther en utilisant un milieu d'élution CHCI3 : MeOH
(40 :1). Puisque la molécule avait déjà été isolée du Pinus banksiana [Erdtman, 1943], la
similitude entre le Rf (0.61) et la couleur de la tache permettent d'affirmer qu'il s'agit
probablement de cette molécule. La confirmation s'est faite par injections sur GC/MS de
l'échantillon et d'un standard de pinosylvine monomethyle éther. Les spectres de masse
ainsi que les temps de rétention étaient identiques.
3.5.3 CS1CB : la pinocembrine
Ce composé a été obtenu avec un rendement d'isolation de 9,32% par rapport à la masse de
l'extrait au dichlorométhane. Il est l'un des produits les plus abondants dans le bois de
Pinus banksiana. Cette quantité aurait pu être fortement augmentée puisque la fraction IB
est, elle aussi, très riche en cette molécule. Le spectre RMN *H indique clairement la
présence de deux noyaux aromatiques, l'un monosubstitué et le second tétrasubstitué,
puisque l'intégration des signaux indique respectivement 5H et 2H. La multiplicité des
signaux du noyau aromatique tétrasubstitué (d, J = 2,2 Hz) indique que les deux protons
sont en position meta, l'un par rapport à l'autre. Un seul CH2 est visible sur le spectre
66
DEPT-135. Les deux protons diastéréotopiques sont visibles sur le spectre proton.
L'analyse attentive des spectres permet d'établir que ce composé est le pinocembrine. Ce
composé phénolique a été déjà identifié par le groupe d'Erdtman [Erdtman, 1943]. Les
détails de l'identification apparaissent en annexe et l'identification est confirmée par
comparaison avec la littérature [Wagner, 1976].
3.5.4 CS1CC : l'acétate de pinobanksine
Cette molécule se retrouve en petite quantité dans l'extrait dichlorométhane du bois de pin
gris (1%). Les spectres RMN de cette molécule montrent quelques similitudes (zone des
aromatiques) avec les spectres de la pinocembrine. La présence en RMN 13C d'un signal
supplémentaire attribuable à une fonction carbonyle (ôc 169,0) (caractéristique d'une
fonction acétate) et la perte en RMN !H d'un proton diastéréotopiques et la présence d'un
doublet à (ÔH 5.85; J =11,7 Hz), permettent de déduire la structure de l'acétate de
pinobanksine. La comparaison de nos résultats spectroscopiques avec les données
spectrales de la littérature [Neacsu, 2007] permet de confirmer cette identification. Une
analyse détaillée est présenté en annexe.
3.5.5 CS1EA : le pinorésinol
Cette molécule a été isolée en très faible quantité dans l'extrait (0,11%). Sur le spectre du
proton, on dénote la présence d'un cycle benzénique avec trois protons. La multiplicité des
signaux indique un profil de substitution en 1,3,4. Un seul CH2 est détecté par le DEPT-
135. L'analyse des spectres porte à croire qu'il s'agit de l'époxyconiferyl alcohol [Kostova,
1995]. Malheureusement, selon le spectre de masse, la masse moléculaire est de 358 g/mol,
67
un peu moins de deux fois celle de l'epoxyconyferyl alcohol (196 g/mol). La consultation
d'un erratum [Kostova, 2000] qui indique qu'il s'agit plutôt du pinorésinol et d'un article
[Nathan, 2000] qui porte sur différents dérivés époxydés du trans-coniferyl alcohol ont
cependant modifié notre vision l'identité de ce produit. Il apparaît hautement probable que
le produit CS1EA possède un centre de symétrie qui cause certaine complication pour
l'élucidation de sa structure. De plus, une analyse attentive du spectre RMN !H ne permet
pas d'observer les constantes de couplage typique (12 à 13 Hz) des protons en position
vicinale des fonctions époxydés [Nathan, 2000]. Les constantes de couplage observé pour
les protons au voisinage des oxygènes ne dépassent pas 9 Hz. L'ensemble de ces
informations permet de penser qu'il s'agit du pinorésinol. Cette molécule n'a jamais été
rapportée auparavant dans le pin gris. Elle devrait aussi se retrouver dans un vaste éventail
de plantes car elle est un précurseur de la lignine [Whetten, 1998]. Les détails de
l'identification sont présentés en annexe.
3.5.6 CS1EC : lapinobanksine
Cette molécule a été obtenue avec un rendement d'isolation de 1,4% par rapport à la masse
de l'extrait au dichlorométhane. Les signaux RMN *H associés aux protons aromatiques
sont pratiquement identiques à ceux du pinocembrine (section 3.5.3). Aucun CH2 n'est
visible sur le DEPT-135, ce qui indique que la position 3 est substituée. La masse molaire
déterminée par HPLC/MS (314 g/mol) ainsi que le déplacement chimique du proton en
position 3 (5H 4,56 ppm) (plus déblindé que les protons diastéréotopiques de la
pinocembrine mais moins déblindé que le proton en position 3 de l'acétate de
68
pinobanksine) permettent de penser qu'il s'agit de la pinobanksine. Cette molécule a déjà
été rapportée dans le bois de pin gris [Erdtman, 1943]. Les détails de l'identification sont
donnés en annexe et concordent avec les données de la littérature [Neacsu, 2007] .
3.5.7 CS6CC : l'acide 15-hvdroxvdéhvdroabiétique
Ce composé a été obtenu avec un rendement de 0,22% par rapport à la masse de l'extrait à
l'hexane. Le spectre de masse couplé au HPLC permet d'observer l'ion moléculaire qui
permet de déduire une masse molaire de 316 g/mol. Le spectre RMN C1 révèle la présence
de 20 carbones, ce qui appuie l'hypothèse que ce produit est un diterpène. Des signaux
entre 7,20 et 7,30 ppm sur le spectre proton confirment la présence d'un cycle aromatique.
Cette dernière information permet de supposer que ce produit est apparenté à l'acide
déhydroabiétique. Puisque l'acide déhydroabiétique non substitué présente une masse de
300 g/mol, cette molécule est fort probablement substituée par un oxygène. Le singulet à 5H
1,60 d'une intégration de 6H indique que la fonction alcool est en position 15. En effet, sur
l'acide déhydroabiétique, ce signal est un doublet puisque le proton, normalement présent
en 15, dédouble le signal des méthyles. Il s'agit, à notre connaissance, de la première
mention de l'acide 15-hydroxydéhydroabiétique dans le Pinus banksiana. Les détails de
son identification sont donnés en annexe.
3.5.8 CS6CD : l'acides 13-keto-8a4Vpodocarpenoïque
Ce composé a été obtenu avec un rendement d'isolation de 0,11 % par rapport à l'extrait à
l'hexane. Le rapport m/z de son ion moléculaire permet de déduire que sa masse molaire est
de 276 g/mol. Le spectre RMN 13C présente de façon évidente 17 signaux dont deux sont
69
attribués à des fonctions carbonyles de type cétone (200,1 ppm) et acide (184,3 ppm). De
plus, les signaux à 126,4 et 165,1 ppm suggèrent la présence d'une double liaison
conjuguée avec une fonction carbonyle. L'analyse détaillée des autres signaux RMN, ainsi
qu'une comparaison des données avec celles de la littérature [Ikeda, 1977], ont permis
d'identifier l'acide 13-keto-8(14)-podocarpenoïque. D'autres auteurs ont déjà isolé cette
molécule dans le Pinus banksiana [Ikeda, 1977; Schuh, 1984] ainsi que dans d'autres
espèces du genre Pinus [Cheung, 1993]. Les détails de l'identification sont donnés en
annexe.
3.5.9 CS6CF : l'acide 12-hvdroxvabiétique
L'acide 12-hydroxyabiétique a été obtenu avec un rendement d'isolation de 0,17% par
rapport à la masse de l'extrait hexane du bois de pin gris. Sur le chromatogramme HPLC de
la fraction CS6C, cette molécule semble être le produit majoritaire; toutefois, après
evaporation, la masse indique qu'il se retrouve dans les mêmes proportions que les autres
acides résiniques isolés. Le spectre du RMN !H présente trois signaux déblindés, soit deux
triplets à 4,25 et 5,51 ppm et un singulet à 5,85 ppm. Grâce au spectre HSQC, les
déplacements chimiques 13C associés à ces protons ont été déterminés, permettant ainsi de
les attribuer à deux fonctions alcéniques (5,51 ppm et 5,85 ppm) et à une fonction alcool
(4,25 ppm). De plus, la présence d'une fonction acide est évidente sur le spectre RMN 13C
(181,0 ppm). On trouvera en annexe les détails de l'identification qui concorde avec les
données spectrales fournies dans la littérature [Herz, 1965]. Cette molécule tend à
70
s'isomériser. En effet, quelques mois après son isolation, le vial ne contient plus que de
1 ' acide 15 -hydroxydéhydroabiétique.
3.5.10 CS6CH : l'acide imbricatolique
L'acide imbricatolique a été obtenu avec un rendement d'isolation de 0,22% par rapport à
la masse de l'extrait hexane du bois de pin gris. Par HPLC/MS, le rapport m/z de son ion
moléculaire permet de déduire que sa masse est de 322 g/mol. Le spectre RMN du carbone
montre la présence de 20 carbones, ce qui peut laisser croire qu'il s'agit encore ici d'un
acide résinique. La fonction carbonyle à 182,2 ppm confirme la présence de l'acide
carboxylique. Dix CH2 sont visibles sur le DEPT-135, ce qui infirme la possibilité d'un
acide résinique tricyclique qui possède au maximum 9 CH2 lorsqu'il n'y a aucune
insaturation. Trois signaux se démarquent des autres dans l'analyse du spectre proton. Le
signal à ÔH 4,53 et celui à ÔH 4,86 sont liés à un seul carbone, qui est un alcène géminal. Le
signal à 5H 3,71 correspond aux protons C-15 où est attaché un alcool. Les détails de
l'identification se retrouvent en annexe et correspondent à ceux parus dans la littérature
[Su, 1994].
3.6 BlOACTIVITÉ DES MOLÉCULES ISOLÉES
Les molécules isolées n'ont malheureusement pas toutes été testées. En effet, certaines
molécules ont été isolées en trop petite quantité ou se sont dénaturées durant leur
entreposage. Le tableau 15 résume les résultats pour chacune des cinq molécules dont
l'activité a pu être testée.
71
Tableau 15 : Activité anticancéreuse des molécules isolées
MoléculePinocembrine
PinobanksinePinosylvine monométhyle éther
Acide 12-hydroxyabiétique
Acide 15-hydroxydehydroabiétique
Hoechst (\M)A-549
62±19>20027±3>200>200
DLD-1
100±20>20018±2>200>200
WS-1
>200>20024±6>200>200
À la lumière des résultats décrit au tableau 15, une molécule isolée démontre un certain
potentiel. La pinosylvine monométhyle éther montre une toxicité modérée à la fois sur les
cellules cancéreuses et sur les cellules saines. Ces résultats sont intéressants car cette
molécule représente l'un des produits majoritaires du Pinus banksiana. En effet, ces
produits se retrouvent dans les extraits hexane, dichlorométhane et méthanolique de cet
arbre. La pinosylvine monométhyle éther pourrait être en partie responsable de l'activité
anticancéreuse. Cependant on ne peut pas éliminer la possibilité que d'autres composés
pourraient être impliqués dans l'activité de cette fraction observée lors des tests
préliminaires.
CONCLUSION
73
CONCLUSION
Ce mémoire s'inscrit d'emblée dans un programme de recherche portant sur la valorisation
de la biomasse résiduelle engendrée par l'activité de coupe forestière. Les résultats d'une
première cueillette ont permis de mettre en évidence le potentiel anticancéreux de deux
espèces, le Pinus banksiana et le Pinus resinosa. Les extraits testés ont en effet montré une
action sélective sur les cellules cancéreuses. Le Pinus banksiana, sur lequel se sont ensuite
concentrés nos efforts, a été soumis à une analyse phytochimique. Cela a conduit à
l'identification de dix molécules. Parmi celles-ci, la pinosylvine monométhyle éther,
constituant majoritaire de l'extrait hexane et DCM, a démontré une activité anticancéreuse.
Par contre, le faible rendement d'extraction primaire combiné à une activité modeste limite
le potentiel de valorisation du bois de cette espèce.
Sur les dix molécules que ce projet a permis d'isoler dans le bois interne de Pinus
banksiana, cinq n'avaient jamais été identifiées dans cette espèce. Il s'agit du matairésinol,
du pinorésinol, de l'acétate de pinobanksine, de l'acide 15-hydroxydéhydroabiétique et de
l'acide imbricatolique. Ces substances ont, par contre, été isolées dans d'autres espèces du
genre Pinus. La pinosylvine monométhyle éther (Lindstedt, 1951), la pinocembrine
(Erdtman, 1943), la pinobanksine (Erdtman, 1943), acides 13-keto-8(14)-podocarpenoïque
(Ikeda, 1977) ont été aussi isolés mais étaient déjà connus dans la littérature.
La seconde cueillette de huit espèces cette fois, a permis d'obtenir des résultats qui
pourraient contribuer au développement de nouveaux projets au laboratoire LASEVE. Sur
les huit espèces récoltées, deux espèces se sont démarquées lors des tests anticancéreux :
74
l'extrait hexane de Picea mariana agit de façon sélective sur les cellules cancéreuses et les
extraits (DCM et MeOH) du Pinus banksiana y ont confirmé leur potentiel anticancéreux.
Les résultats du criblage antioxydant mettent en évidence les extraits méthanoliques et
aqueux de trois espèces : Abies balsamea, Betula alleghaniensis, Betula papyrifera. Une
forte activité antioxydante est également remarquée avec les extraits méthanoliques Picea
glauca, Piceae mariana et Populus tremuloïdes. Le pouvoir antioxydant de ces extraits est
élevé et pourrait ces matrices végétales pourraient s'avérer une source intéressante
d'antioxydant naturel. De surcroît, les extraits de Thuja occidentalis montrent, pour leur
part, un pouvoir antibactérien sur S. Aureus et E. Coli. Globalement, les résultats de la
seconde cueillette étayent ce que les résultats de la première avaient laissé entrevoir : ces
résidus forestiers possèdent un fort potentiel pour la découverte de produits bioactifs.
À la lumière des quelque résultats découlant de ce projet, les travaux de recherche sur la
valorisation des résidus de l'industrie forestière apparaissent prometteurs. Ce mémoire s'est
concentré plus spécifiquement sur la valorisation du bois interne de pin gris. Des molécules
majoritaires présentant une activité anticancéreuse en ont été extraites. Plusieurs espèces
échantillonnées ont démontré des activités anticancéreuse, antibiotique ou antioxydante et
justifieraient que des projets plus approfondis soient amorcés.
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83
ANNEXE 1
LISTE DES ABRÉVIATIONS
85
Abréviation
CCM
cm
CHCI3
DCM
Se
5h
km
GC
g
Hex
Hz
HPLC
H20
IC50
LÀSÈVË
MeOH
mg
MIC8o
MS
PFNL
ÔRAC
RMN
TR
UQAC
um
Description
Chromatographie sur couche mince
Centimètre
Chloroforme
Dichlorométhane
Déplacement chimique en carbone (ppm)
Déplacement chimique en proton (ppm)
Kilomètre
Gas Chromatography
Gramme
Hexane
Hertz
High Pressure Liquid Chromatography
Eau
Concentration de produit qui inhibe 50 % de la croissance
cellulaire
Laboratoire de séparation des essences végétales
Méthanol
Milligramme
Concentration où on observe une inhibition de 20% de la
prolifération bactérienne de façon significative
Mass Spectroscopy
Produits forestiers non ligneux
Oxygen Radical Absorption Capacity
Résonnance magnétique nucléaire
Temps de rétention (min)
Université du Québec à Chicoutimi
Micromolaire (10~6 mol/L)
ANNEXE 2
IDENTIFICATION RMN DES MOLÉCULES
87
CS1CAET CS1EB : MATAIRESINOL
H3CO, ,OCH3
Matairésinol
^20^2296Masse moléculaire: 358.38
Position1234567891'2'31
41
5'6'T8'91
OCH3OCH3'
Ôc(ppm)130,1111,8147,6144,8114,8120,837,541,171,5129,4112,5147,6145,0114,7121,633,946,3180,354,855,0
SH (ppm)-
6,57 d--
6,70 D6,52 Dd2,55 m2,50 m
4,17; 3,94 T-
6,69 d--
6,72 D6,59 D
2,90; 2,83 Dd2,67 Q
-3,79 S3,80 S
MultiplicitéC
CHCC
CHCHCH2
CHCH2
CCHCC
CHCHCH2
CHC
CH3
CH3
88
CS1CB : PINOCEMBRINE
Pinocembnne
Masse moléculaire: 256,25
Position12345678910
r2'3'4'5'6'
ôc(ppm)-
78,842,9195,5163,796,1166,895,2162,9102,0138,3125,8128,4128,4128,4125,8
5H (ppm)-
5,15 Dd2,52-2,8 D
--
5,69 d-
5,719 d---
7,18 m7,15 m7,09 m7,12 m7,21m
Multiplicité0
CHCH2
CC
CHC
CHCCC
CHCHCHCHCH
89
CS1CC : ACÉTATE DE PINOBANKSINE
OH
Acétate de pinobanksineC17H14°6
Masse moléculaire: 314,29
Position123456789101112
r2'3'4'5'61
ôc (ppm)-
81,172,4191,4162,795,4168,296,5164,1100,6169,418,8135,9127,3128,2129,0128,2127,3
OH (ppm)-
5,43 D5,85 D
5,96 d
5,98 d
1,97 S
7,53 m7,43 m7,43 m7,43 m7,53 m
MultiplicitéOxygène
CHCH
C=OC
CHC
CHCC
C=O (acétate)CH3
CCHCHCHCHCH
CS1EB : PINORESINOL
H
III 7V"UII||
H
Pinorésinol
Masse moléculaire: 358,38
90
Position12345678910
r2'3'4'5'6'7'8'9'10'
8C (ppm)133,3109,7147,4145,9114,6118,771,385,854,455,4133,3109,7147,4145,9114,6118,785,871,354,455,4
8H(ppm)-
7,00 d--
6,78 D6,84 Dd
3,81 Dd, 4,21 Dd4,67 d3,1 q
3,85 S-
7,00 d--
6,78 D6,84 Dd4,67 d
3,81 Dd, 4,21 Dd3,1 q
3,85 S
MultiplicitéC
CHCC
CHCHCH2
CHCH
O-CH3
CCHCC
CHCHCHCH2
CHO-CH3
91
CS1EC : PINOBANKSINE
OH O
PinobanksineC15Hl2O4
Masse moléculaire: 256,25
Position12345678910
r2'31
41
5'61
ôc (ppm)-
85,173,7198,2165,497,5168,896,4164,4101,9138,6128,9129,4129,9129,4128,9
OH (ppm)-
5,08 D4,56 D
5,95 S
5,92 S
7,55 m7,42 m7,38 m7,42 m7,55 m
MultiplicitéOxygène
CHCHCC
CHC
CHCCC
CHCHCHCHCH
92
CS6CC : ACIDE 15-HYDROXYDEHYDROABIÉTIQUE
17
COOH20
Acide 15-hydroxydehydroabietiqueC2oH28°3
Masse moléculaire: 316,43
Position1234567891011121314151617181920
ôc(ppm)37,918,636,747,444,621,830,2134,8147,837,0124,2122,0146,1125,072,431,731,725,116,3184,3
ÔH (ppm)2,36 m ; 1,53m
1,80 m1,85 m ; 1,75 m
2,27 Dd1,90 m ; 1,59 m
2,96 m
7,24 m7,26 m
7,19 m
1,60 S1,60 S1,25 S1,32 S
MultiplicitéCH2
CH2
CH2
CCHCH2
CH2
CCC
CHCHC
CHC
CH3
CH3
CH3
CH3
C
93
CS6CD : ACIDE 13-KETO-8(14)-PODOCARPENOÏQUE
HCOOH
16 17Acides 13-keto-8(14)-podocarpenoïque
Position1234567891011121314151617
C 17H24°3Masse moléculaire: 276,37
ôc (ppm)38,418,037,047,148,024,235,3165,151,838,420,536,8
200,1126,415,716,9184,3
OH (ppm)1,80, 1,22 m
1,60 m1,76 m
2,08 m1,62, 1,47 m
2,52, 2,37 Dd
2,19 m
2,02, 1,75 m2,46, 2,28 m
5,89 br s0,86 S1,24 S
MultiplicitéCH2
CH2
CH2
CCHCH2
CH2
CCHC
CH2
CH2
CCHCH3
CH3
C
94
CS6CE : ACIDE 12-HYDROXYABIETIQUE
OH
Acide 12-hydroxyabietiqueC20H30O3
Masse moléculaire: 318,45
Position1234567891011121314151617181920
8C (ppm)37,217,838,040,845,125,5123,1134,843,533,730,765,4143,4125,332,221,420,613,416,0181,0
5H (ppm)1,81 m ; 1,66 m
1,62 m1,89 m
2,16 m2,12 m ; 1,87 m
5,51 T
2,38 m
1,86 m4,24 T
5,85 S2,41m1,07 D1,11 D0,854 S1,27 S
MultiplicitéCH2
CH2
CH2
CCHCH2
CHC
CHC
CH2
CHC
CHCHCH3
CH3
CH3
CH3
C
CS6CH : ACIDE IMBRICATOLIQUE
95
,0H12 14
18'11
2
3 5̂
^ 4 ^
f10
19 ^ 20 COOH
1 16
8 [
7,
Acide imbricatoliqueC20H34O3
Masse moléculaire: 322,48
Position ôc12345678 191011121314151617181920
(PPm)39,019,837,944,156,326,038,7148,256,540,521,036,330,239,461,119,8106,312,728,9183,5
ôH (ppm)1,89,1,10m1,90,1,54 m2,18,1,07 m
1,35 m2,00,1,92 m2,43,1,92 m
1,56 m
1,55,1,31m1,50,0,97 m
1,55 m1,67, 1,38 m
3,710,93 D
4,86, 4,530,63 S1,27 S
MultiplicitéCH2
CH2
CH2
CCHCH2
CH2C
CHC
CH2
CH2
CHCH2
CH2
CH3
CH2CH3CH3
C
