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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUIacuteMICA
Vitoacuteria Muumlller Rathke
Desenvolvimento e validaccedilatildeo de um meacutetodo por HPLC-DAD para a determinaccedilatildeo
de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo
Porto Alegre novembro de 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUIacuteMICA
Desenvolvimento e validaccedilatildeo de um meacutetodo por HPLC-DAD para a determinaccedilatildeo
de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo
Monografia apresentada junto agrave atividade de
ensino ldquoProjeto Tecnoloacutegicordquo do Curso de
Quiacutemica Industrial realizado na UFRGS sob
a supervisatildeo do Prof Eliseu Rodrigues
Prof Dr Eliseu Rodrigues
Orientador
Porto Alegre 2016
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AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo ao meu orientador Eliseu Rodrigues por toda ajuda e
empenho nesse trabalho por me ensinar a por em praacutetica os
conhecimentos sobre cromatografia por depositar confianccedila
em mim e por toda paciecircncia Ao meu chefe Jonathan Vaz
Martins Silva por todo auxiacutelio ajuda e por acreditar que esse
trabalho seria possiacutevel Aos meus colegas de trabalho e a
minha famiacutelia por acreditarem que eu era capaz de chegar ateacute
aqui As minhas grandes amigas e amigos da faculdade
principalmente agrave Letiacutecia Deacutebora Mariana e Pedro por toda
parceria apoio e amizade ao longo desses 5 anos
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RESUMO
A importacircncia dos folatos para a sauacutede humana associada a sua perda
significativa durante o processamento dos alimentos levou o Brasil a estabelecer a
obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas de trigo e milho com no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico por 100 g de produto O monitoramento dos niacuteveis dessa vitamina nos
produtos fortificados depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Neste contexto o objetivo desse trabalho foi desenvolver um meacutetodo
analiacutetico por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
(HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho Aleacutem
disso o meacutetodo foi aplicado em cinco amostras comerciais de farinha de trigo Nesse
meacutetodo o aacutecido foacutelico foi separado em uma coluna C18 utilizando um gradiente de aacutegua
e acetonitrila ambas acidificadas com 01 de aacutecido foacutermico O meacutetodo foi
desenvolvido e validado com sucesso apresentando um custo baixo por amostra
facilidade na sua execuccedilatildeo linearidade na faixa de concentraccedilatildeo de 013 a 300 microgmL-
1 baixos valores de limites de detecccedilatildeo (004 gmL-1) e quantificaccedilatildeo (011 gmL-1)
recuperaccedilatildeo na faixa de 96-113 e repetibilidade inferior a 10 A aplicaccedilatildeo do
meacutetodo revelou que 40 das amostras comerciais de farinha de trigo analisadas natildeo
estatildeo de acordo com a legislaccedilatildeo brasileira Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de
fiscalizaccedilatildeo devem atuar de maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido
foacutelico adicionados na farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um
controle de qualidade maior na fortificaccedilatildeo destes produtos
Palavras-chave vitaminas aacutecido foacutelico validaccedilatildeo fortificaccedilatildeo
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ABSTRACT
The importance of folates to human health associated with their significant
loss during food processing led Brazil to establish the obligatory fortification of wheat
and corn flours with at least 150 g of folic acid per 100 g of product Monitoring
vitamin levels in fortified products depends on reliable and economically feasible
analytical methods In this context the objective of this work was to develop an
analytical method by high performance liquid chromatography with diode arrangement
detector (HPLC-DAD) for the determination of folic acid in wheat and corn flours In
addition the method was applied to five commercial samples of wheat flour In this
method folic acid was separated on a C18 column using a gradient of water and
acetonitrile both acidified with 01 formic acid The method was developed and
validated successfully presenting a low cost per sample ease of execution linearity in
the concentration range of 013 to 300 μgmL-1 low detection limit values (004
gmL-1) and quantification (011 gmL-1) recovery in the range of 96-113 and
repeatability less than 10 The application of the method revealed that 40 of the
commercial samples of wheat flour analyzed are not in accordance with the Brazilian
legislation Our results suggest that surveillance agencies should act more effectively in
monitoring the folic acid levels added in wheat flour as well as industries should adopt
a higher quality control in the fortification of these products
Key words vitamins folic acid validation fortification
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6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
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LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
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LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
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2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
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Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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2004
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUIacuteMICA
Desenvolvimento e validaccedilatildeo de um meacutetodo por HPLC-DAD para a determinaccedilatildeo
de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo
Monografia apresentada junto agrave atividade de
ensino ldquoProjeto Tecnoloacutegicordquo do Curso de
Quiacutemica Industrial realizado na UFRGS sob
a supervisatildeo do Prof Eliseu Rodrigues
Prof Dr Eliseu Rodrigues
Orientador
Porto Alegre 2016
3
3
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo ao meu orientador Eliseu Rodrigues por toda ajuda e
empenho nesse trabalho por me ensinar a por em praacutetica os
conhecimentos sobre cromatografia por depositar confianccedila
em mim e por toda paciecircncia Ao meu chefe Jonathan Vaz
Martins Silva por todo auxiacutelio ajuda e por acreditar que esse
trabalho seria possiacutevel Aos meus colegas de trabalho e a
minha famiacutelia por acreditarem que eu era capaz de chegar ateacute
aqui As minhas grandes amigas e amigos da faculdade
principalmente agrave Letiacutecia Deacutebora Mariana e Pedro por toda
parceria apoio e amizade ao longo desses 5 anos
4
4
RESUMO
A importacircncia dos folatos para a sauacutede humana associada a sua perda
significativa durante o processamento dos alimentos levou o Brasil a estabelecer a
obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas de trigo e milho com no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico por 100 g de produto O monitoramento dos niacuteveis dessa vitamina nos
produtos fortificados depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Neste contexto o objetivo desse trabalho foi desenvolver um meacutetodo
analiacutetico por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
(HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho Aleacutem
disso o meacutetodo foi aplicado em cinco amostras comerciais de farinha de trigo Nesse
meacutetodo o aacutecido foacutelico foi separado em uma coluna C18 utilizando um gradiente de aacutegua
e acetonitrila ambas acidificadas com 01 de aacutecido foacutermico O meacutetodo foi
desenvolvido e validado com sucesso apresentando um custo baixo por amostra
facilidade na sua execuccedilatildeo linearidade na faixa de concentraccedilatildeo de 013 a 300 microgmL-
1 baixos valores de limites de detecccedilatildeo (004 gmL-1) e quantificaccedilatildeo (011 gmL-1)
recuperaccedilatildeo na faixa de 96-113 e repetibilidade inferior a 10 A aplicaccedilatildeo do
meacutetodo revelou que 40 das amostras comerciais de farinha de trigo analisadas natildeo
estatildeo de acordo com a legislaccedilatildeo brasileira Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de
fiscalizaccedilatildeo devem atuar de maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido
foacutelico adicionados na farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um
controle de qualidade maior na fortificaccedilatildeo destes produtos
Palavras-chave vitaminas aacutecido foacutelico validaccedilatildeo fortificaccedilatildeo
5
5
ABSTRACT
The importance of folates to human health associated with their significant
loss during food processing led Brazil to establish the obligatory fortification of wheat
and corn flours with at least 150 g of folic acid per 100 g of product Monitoring
vitamin levels in fortified products depends on reliable and economically feasible
analytical methods In this context the objective of this work was to develop an
analytical method by high performance liquid chromatography with diode arrangement
detector (HPLC-DAD) for the determination of folic acid in wheat and corn flours In
addition the method was applied to five commercial samples of wheat flour In this
method folic acid was separated on a C18 column using a gradient of water and
acetonitrile both acidified with 01 formic acid The method was developed and
validated successfully presenting a low cost per sample ease of execution linearity in
the concentration range of 013 to 300 μgmL-1 low detection limit values (004
gmL-1) and quantification (011 gmL-1) recovery in the range of 96-113 and
repeatability less than 10 The application of the method revealed that 40 of the
commercial samples of wheat flour analyzed are not in accordance with the Brazilian
legislation Our results suggest that surveillance agencies should act more effectively in
monitoring the folic acid levels added in wheat flour as well as industries should adopt
a higher quality control in the fortification of these products
Key words vitamins folic acid validation fortification
6
6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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2004
3
3
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo ao meu orientador Eliseu Rodrigues por toda ajuda e
empenho nesse trabalho por me ensinar a por em praacutetica os
conhecimentos sobre cromatografia por depositar confianccedila
em mim e por toda paciecircncia Ao meu chefe Jonathan Vaz
Martins Silva por todo auxiacutelio ajuda e por acreditar que esse
trabalho seria possiacutevel Aos meus colegas de trabalho e a
minha famiacutelia por acreditarem que eu era capaz de chegar ateacute
aqui As minhas grandes amigas e amigos da faculdade
principalmente agrave Letiacutecia Deacutebora Mariana e Pedro por toda
parceria apoio e amizade ao longo desses 5 anos
4
4
RESUMO
A importacircncia dos folatos para a sauacutede humana associada a sua perda
significativa durante o processamento dos alimentos levou o Brasil a estabelecer a
obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas de trigo e milho com no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico por 100 g de produto O monitoramento dos niacuteveis dessa vitamina nos
produtos fortificados depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Neste contexto o objetivo desse trabalho foi desenvolver um meacutetodo
analiacutetico por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
(HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho Aleacutem
disso o meacutetodo foi aplicado em cinco amostras comerciais de farinha de trigo Nesse
meacutetodo o aacutecido foacutelico foi separado em uma coluna C18 utilizando um gradiente de aacutegua
e acetonitrila ambas acidificadas com 01 de aacutecido foacutermico O meacutetodo foi
desenvolvido e validado com sucesso apresentando um custo baixo por amostra
facilidade na sua execuccedilatildeo linearidade na faixa de concentraccedilatildeo de 013 a 300 microgmL-
1 baixos valores de limites de detecccedilatildeo (004 gmL-1) e quantificaccedilatildeo (011 gmL-1)
recuperaccedilatildeo na faixa de 96-113 e repetibilidade inferior a 10 A aplicaccedilatildeo do
meacutetodo revelou que 40 das amostras comerciais de farinha de trigo analisadas natildeo
estatildeo de acordo com a legislaccedilatildeo brasileira Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de
fiscalizaccedilatildeo devem atuar de maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido
foacutelico adicionados na farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um
controle de qualidade maior na fortificaccedilatildeo destes produtos
Palavras-chave vitaminas aacutecido foacutelico validaccedilatildeo fortificaccedilatildeo
5
5
ABSTRACT
The importance of folates to human health associated with their significant
loss during food processing led Brazil to establish the obligatory fortification of wheat
and corn flours with at least 150 g of folic acid per 100 g of product Monitoring
vitamin levels in fortified products depends on reliable and economically feasible
analytical methods In this context the objective of this work was to develop an
analytical method by high performance liquid chromatography with diode arrangement
detector (HPLC-DAD) for the determination of folic acid in wheat and corn flours In
addition the method was applied to five commercial samples of wheat flour In this
method folic acid was separated on a C18 column using a gradient of water and
acetonitrile both acidified with 01 formic acid The method was developed and
validated successfully presenting a low cost per sample ease of execution linearity in
the concentration range of 013 to 300 μgmL-1 low detection limit values (004
gmL-1) and quantification (011 gmL-1) recovery in the range of 96-113 and
repeatability less than 10 The application of the method revealed that 40 of the
commercial samples of wheat flour analyzed are not in accordance with the Brazilian
legislation Our results suggest that surveillance agencies should act more effectively in
monitoring the folic acid levels added in wheat flour as well as industries should adopt
a higher quality control in the fortification of these products
Key words vitamins folic acid validation fortification
6
6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
4
4
RESUMO
A importacircncia dos folatos para a sauacutede humana associada a sua perda
significativa durante o processamento dos alimentos levou o Brasil a estabelecer a
obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas de trigo e milho com no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico por 100 g de produto O monitoramento dos niacuteveis dessa vitamina nos
produtos fortificados depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Neste contexto o objetivo desse trabalho foi desenvolver um meacutetodo
analiacutetico por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
(HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho Aleacutem
disso o meacutetodo foi aplicado em cinco amostras comerciais de farinha de trigo Nesse
meacutetodo o aacutecido foacutelico foi separado em uma coluna C18 utilizando um gradiente de aacutegua
e acetonitrila ambas acidificadas com 01 de aacutecido foacutermico O meacutetodo foi
desenvolvido e validado com sucesso apresentando um custo baixo por amostra
facilidade na sua execuccedilatildeo linearidade na faixa de concentraccedilatildeo de 013 a 300 microgmL-
1 baixos valores de limites de detecccedilatildeo (004 gmL-1) e quantificaccedilatildeo (011 gmL-1)
recuperaccedilatildeo na faixa de 96-113 e repetibilidade inferior a 10 A aplicaccedilatildeo do
meacutetodo revelou que 40 das amostras comerciais de farinha de trigo analisadas natildeo
estatildeo de acordo com a legislaccedilatildeo brasileira Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de
fiscalizaccedilatildeo devem atuar de maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido
foacutelico adicionados na farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um
controle de qualidade maior na fortificaccedilatildeo destes produtos
Palavras-chave vitaminas aacutecido foacutelico validaccedilatildeo fortificaccedilatildeo
5
5
ABSTRACT
The importance of folates to human health associated with their significant
loss during food processing led Brazil to establish the obligatory fortification of wheat
and corn flours with at least 150 g of folic acid per 100 g of product Monitoring
vitamin levels in fortified products depends on reliable and economically feasible
analytical methods In this context the objective of this work was to develop an
analytical method by high performance liquid chromatography with diode arrangement
detector (HPLC-DAD) for the determination of folic acid in wheat and corn flours In
addition the method was applied to five commercial samples of wheat flour In this
method folic acid was separated on a C18 column using a gradient of water and
acetonitrile both acidified with 01 formic acid The method was developed and
validated successfully presenting a low cost per sample ease of execution linearity in
the concentration range of 013 to 300 μgmL-1 low detection limit values (004
gmL-1) and quantification (011 gmL-1) recovery in the range of 96-113 and
repeatability less than 10 The application of the method revealed that 40 of the
commercial samples of wheat flour analyzed are not in accordance with the Brazilian
legislation Our results suggest that surveillance agencies should act more effectively in
monitoring the folic acid levels added in wheat flour as well as industries should adopt
a higher quality control in the fortification of these products
Key words vitamins folic acid validation fortification
6
6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
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Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
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Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
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36
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Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
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SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
5
5
ABSTRACT
The importance of folates to human health associated with their significant
loss during food processing led Brazil to establish the obligatory fortification of wheat
and corn flours with at least 150 g of folic acid per 100 g of product Monitoring
vitamin levels in fortified products depends on reliable and economically feasible
analytical methods In this context the objective of this work was to develop an
analytical method by high performance liquid chromatography with diode arrangement
detector (HPLC-DAD) for the determination of folic acid in wheat and corn flours In
addition the method was applied to five commercial samples of wheat flour In this
method folic acid was separated on a C18 column using a gradient of water and
acetonitrile both acidified with 01 formic acid The method was developed and
validated successfully presenting a low cost per sample ease of execution linearity in
the concentration range of 013 to 300 μgmL-1 low detection limit values (004
gmL-1) and quantification (011 gmL-1) recovery in the range of 96-113 and
repeatability less than 10 The application of the method revealed that 40 of the
commercial samples of wheat flour analyzed are not in accordance with the Brazilian
legislation Our results suggest that surveillance agencies should act more effectively in
monitoring the folic acid levels added in wheat flour as well as industries should adopt
a higher quality control in the fortification of these products
Key words vitamins folic acid validation fortification
6
6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
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36
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2004
6
6
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico 13
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10) 14
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
23
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
233
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
24
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 255
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1) As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 255
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 277
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto 29
7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
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7
7
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos 14
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo 15
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo fosfato pH
90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica 24
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo 26
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo 27
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico 30
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos 31
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata 32
8
8
LISTA DE ABREVIATURAS
UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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8
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ICTA - Instituto de Ciecircncia dos Alimentos
CIENTEC - Fundaccedilatildeo de Ciecircncia e Tecnologia
ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
RDC - Resoluccedilatildeo da Diretoria Colegiada
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
DAD - Detector de Arranjo de Diodos
THF - Tetrahidrofolato
5-MTHF - 5-Metiltetraidrofolato
5-FTHF - 5-Formiltetraidrofolato
UV-Vis - Espectroscopia Ultravioleta no Visiacutevel
PTFE - Politetrafluoretileno
LD - Limite de Detecccedilatildeo
LQ - Limite de Quantificaccedilatildeo
DPR - Desvio-padratildeo Relativo
SPE - Extraccedilatildeo em Fase Soacutelida
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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2004
9
9
SUMAacuteRIO
AGRADECIMENTOS 3
RESUMO 4
ABSTRACT 5
LISTAS DE FIGURAS 6
LISTAS DE TABELAS 7
LISTA DE ABREVIATURAS 8
SUMAacuteRIO 9
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 OBJETIVO 12
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a sauacutede e
fontes 13
32 Perdas com o processamento 15
33 Legislaccedilatildeo brasileira 16
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos 16
4 METODOLOGIA 19
41 Materiais 19
411 Solventes e reagentes 19
412 Amostras 19
42 Meacutetodos 19
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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2004
10
10
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico 19
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico 20
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo 20
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas 20
425 Quantificaccedilatildeo 21
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo 21
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 22
51 Experimentos iniciais 22
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo 24
521 Linearidade 24
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade 26
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo 26
531 Farinhas de trigo 27
532 Farinhas de milho 28
54 Avaliaccedilatildeo de custos 29
6 CONCLUSAtildeO 34
7 REFEREcircNCIAS 35
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
11
11
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os folatos satildeo importantes como coenzimas no metabolismo de aacutecidos nucleacuteicos
e aminoaacutecidos atuando como mediadores nas transformaccedilotildees de carbonos A
deficiecircncia severa de folatos leva agrave anemia megaloblaacutestica e problemas na formaccedilatildeo do
tubo neural em fetos Considerando isso a suplementaccedilatildeo ou fortificaccedilatildeo tem sido
sugerida natildeo soacute para lactantes e graacutevidas mas tambeacutem para mulheres com intenccedilatildeo de
engravidar A importacircncia dos folatos para a sauacutede associada a sua significativa perda
durante o processamento dos alimentos levou vaacuterios paiacuteses como o Brasil a incluir na
legislaccedilatildeo a obrigatoriedade de fortificaccedilatildeo de farinhas com folatos sendo que a forma
quiacutemica escolhida eacute a de aacutecido foacutelico (ANVISA) A RDC nordm 344 de 13 de dezembro de
2002 estabelece que as farinhas de trigo e milho devem conter no miacutenimo 150 g de
aacutecido foacutelico a cada 100 g de produto
O monitoramento da concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pelas induacutestrias produtoras de
farinhas de trigo e milho depende de meacutetodos analiacuteticos confiaacuteveis e viaacuteveis
economicamente Considerando isso neste trabalho foi conduzida a validaccedilatildeo de um
meacutetodo por cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia acoplada a um detector de arranjo
de diodos (HPLC-DAD) para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e
milho
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
12
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meacutetodo e validaacute-lo por HPLC-
DAD para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinhas de trigo e milho o qual seraacute
incluiacutedo nos serviccedilos de anaacutelise de alimentos prestados por uma empresa
Para a realizaccedilatildeo desse objetivo foram realizadas as seguintes etapas (1deg)
pesquisa na literatura dos meacutetodos por HPLC-DAD publicados para a determinaccedilatildeo de
aacutecido foacutelico em farinhas (2deg) otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de preparo do padratildeo de aacutecido
foacutelico (3deg) validaccedilatildeo do meacutetodo por HPLC-DAD avaliando os seguintes paracircmetros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo repetibilidade e exatidatildeo
(atraveacutes de testes de recuperaccedilatildeo) e finalmente (4deg) aplicaccedilatildeo do meacutetodo validado em
amostras de farinha de trigo
13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
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13
13
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Estrutura propriedades quiacutemicas e fiacutesicas importacircncia dos folatos para a
sauacutede e fontes
O aacutecido foacutelico (C19H19N7O6O) tambeacutem conhecido como vitamina B9
representa a forma sinteacutetica e mais estaacutevel dos folatos11 A sua estrutura eacute composta por
um grupo pteridina um aacutecido p-amino benzoico e um resiacuteduo de glutamato (Figura 1)
O aacutecido foacutelico eacute um composto hidrossoluacutevel amarelo-alaranjado inodoro e cristalino
Ele decompotildee-se a 250 degC possui baixa solubilidade em aacutegua com pH neutro sendo
bastante soluacutevel em soluccedilatildeo aquosa aacutecida ou alcalina e insoluacutevel em solventes
orgacircnicos12
Nos alimentos a vitamina B9 estaacute na forma de folatos Os folatos possuem uma
estrutura de aacutecido pteroilpoliglutacircmico (Figura 2) com o grupo pteridina reduzido e
com um nuacutemero variaacutevel de resiacuteduos de glutamato Na Tabela 1 estatildeo apresentados os
teores de folatos de alguns alimentos A anaacutelise dessa tabela permite destacar alguns
alimentos ricos em folatos tais como o fiacutegado o farelo de trigo e o espinafre12
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
O
NH
OOH
O
OH
NH
N
N
NH
N
O
NH2
Figura 1 Estrutura quiacutemica do aacutecido foacutelico
14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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14
14
Fonte Autora Vitoacuteria Muumlller Rathke
Tabela 1 Concentraccedilatildeo meacutedia de folatos em alguns alimentos
Fonte (RG-nutri 2010)
A absorccedilatildeo intestinal do aacutecido foacutelico da dieta eacute de 23-60 enquanto nos
suplementos ou alimentos enriquecidos eacute de 9823
Os folatos satildeo importantes para processos bioquiacutemicos como a formaccedilatildeo de
proteiacutenas estruturais hemoglobina5 e essenciais pra a formaccedilatildeo dos gloacutebulos vermelhos
para a siacutentese de aacutecidos nucleicos e para o desenvolvimento do sistema nervoso e da
medula oacutessea4 Durante a gravidez eacute fundamental para a sauacutede do feto visto que
participa do processo de multiplicaccedilatildeo celular formaccedilatildeo do tubo neural no aumento
dos eritroacutecitos alargamento do uacutetero e crescimento da placenta245 Os requerimentos
dessa vitamina variam com o sexo a idade o periacuteodo de gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo (Tabela 2)
Concentraccedilatildeo de folatos em g100g-1
Fiacutegado de galinha cru 590
Farelo de trigo 260
Espinafre cozido 140
Broacutecolis cozido 110
Farinha de aveia 60
Laranja 37
O
NH
NH
NH NH
N
O
NH2
NH
NH
O
OOH
OOH
O
OH
n
Figura 2 Estrutura quiacutemica dos folatos (nlt10)
15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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15
15
Tabela 2 Recomendaccedilatildeo nutricional de folatos para cada idade e sexo
Fonte Dietary Reference Intakes Recommended Intakes for Individuals Vitamins
Food and Nutrition Board Institute of Medicine National Academies 2004
32 Perdas com o processamento
Em alimentos a estabilidade dos folatos eacute afetada pelas caracteriacutesticas da matriz
dos meacutetodos de processamento industriais ou caseiros empregados e de fatores como
luz pH temperatura empregados no processamento13 Processos como a refrigeraccedilatildeo o
congelamento a desidrataccedilatildeo a fermentaccedilatildeo a pasteurizaccedilatildeo e esterilizaccedilatildeo podem
influenciar significativamente na retenccedilatildeo dessa vitamina nos alimentos14
A estabilidade dos folatos eacute maior em meio alcalino do que em meio aacutecido
devido a isso se utiliza tampotildees neutros ou baacutesicos tanto na extraccedilatildeo quanto na
Idade g por dia
Lactantes
0 a 6 meses 65
7 a 12 meses 80
Crianccedilas
1 a 3 anos 150
4 a 8 anos 200
Homens
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Mulheres
9 a 13 anos 300
14 a 70 anos 400
gt 70 anos 400
Gravidez 600
Lactaccedilatildeo 500
16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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16
16
quantificaccedilatildeo do aacutecido foacutelico7 Os folatos apresentam estabilidades diferentes sendo o
aacutecido foacutelico o mais estaacutevel e atraente para os fabricantes jaacute que o seu processo de
fabricaccedilatildeo eacute mais barato A lixiviaccedilatildeo eacute outro mecanismo importante envolvido em
perdas de folatos principalmente quando frutas e vegetais satildeo processados em contato
com a aacutegua18 como no branqueamento
A degradaccedilatildeo dos folatos eacute raacutepida principalmente em temperaturas altas e em
presenccedila de oxigecircnio podendo ser evitadadiminuiacuteda por antioxidantes Em geral o
processamento de alimentos a temperaturas elevadas resulta em perdas consideraacuteveis de
folatos a cocccedilatildeo dos alimentos reduz bastante o seu teor16 Por exemplo a retenccedilatildeo dos
folatos em vegetais apoacutes o cozimento variou de 17 para 87 no caso do
Tetrahidrofolato (THF) 53 a 94 para 5-Metiltetraidrofolato (5-MTHF) e 39 a 108
para 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) dependendo da matriz de alimento o tipo de
isocircmero e os meacutetodos de cozimento utilizados19
33 Legislaccedilatildeo brasileira
Devido aos altos iacutendices de anemia megaloblaacutestica e de doenccedilas causadas pela
deficiecircncia de folatos2 o Ministeacuterio da Sauacutede e a Anvisa tornaram obrigatoacuterio a
fortificaccedilatildeo das farinhas de trigo e milho1 com aacutecido foacutelico
Em dezembro de 2002 foi publicada a Resoluccedilatildeo ndash RDC no 344 que estabelece
que as farinhas de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor e aquelas
utilizadas como mateacuteria-prima pelas induacutestrias na fabricaccedilatildeo de outros produtos devem
ser fortificadas com no miacutenimo 150 g a cada 100 g de farinha1 A escolha desses
produtos baseia-se no grande consumo da populaccedilatildeo em geral de produtos feitos a partir
dessas farinhas
34 Meacutetodos para a determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Na literatura haacute um grande nuacutemero de meacutetodos descritos para a determinaccedilatildeo de
folatos e aacutecido foacutelico os quais podem ser divididos em (1) meacutetodos
espectrofotomeacutetricos (2) meacutetodos microbioloacutegicos e (3) meacutetodos por cromatografia
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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2004
17
17
liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) utilizando detector de fluorescecircncia ou UV-Vis ou
detector de arranjo de diodos
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico diretamente por espectrofotometria foi relada na
literatura Neste meacutetodo o aacutecido foacutelico foi extraiacutedo usando soluccedilatildeo de NaOH (01
molL-1) e depois foi realizada a leitura no comprimento de maacutexima absorccedilatildeo do aacutecido
foacutelico ou seja a 280 nm Os resultados encontrados com esse meacutetodo foram de 96-
100 de recuperaccedilatildeo 034 de repetitibilidade e limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo
de 008 e 024 μgmL-1 respectivamente8
O meacutetodo microbioloacutegico baseia-se na relaccedilatildeo quantitativa entre o conteuacutedo de
folatos e o crescimento dos microrganismos a partir da medida da turbidez da soluccedilatildeo
O crescimento dos microrganismos depende da quantidade de folatos presente na
amostra sendo que este crescimento eacute proporcional agrave turbidez do meio Este meacutetodo
que requer equipamentos de baixo custo determina a quantidade total de folatos e eacute
muito sensiacutevel Poreacutem pode ocorrer interferecircncia de outros compostos presentes na
matriz que podem estimular ou inibir o crescimento dos microrganismos Aleacutem disso
pode ocorrer interferecircncia de outros compostos que absorvem a 280 nm tais como
proteiacutenas e compostos fenoacutelicos Assim natildeo eacute um meacutetodo com grande exatidatildeo16
Outro meacutetodo utilizado eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (HPLC) com
detecccedilatildeo por fluorescecircncia Nesse meacutetodo a moleacutecula sofre derivatizaccedilatildeo preacute-coluna
Pode ser utilizado um oxidante de ceacuterio (IV) tri-hidroxi-hidroperoacutexido de reator
empacotado para a oxidaccedilatildeo O meacutetodo eacute baseado na clivagem oxidativa do aacutecido foacutelico
em produtos altamente fluorescentes como 2-amino-4-hidroxipteridina 6-
carboxaldeiacutedo e o aacutecido 2-amino-4-hidroxipteridina-6-carboxiacutelico20 Essa teacutecnica utiliza
comprimentos de onda de excitaccedilatildeo e emissatildeo de 367 e 463 nm respectivamente O
meacutetodo mostrou recuperaccedilatildeo de 9931 desvio-padratildeo relativo de 17 e limite de
detecccedilatildeo de 007 ngmL-1 20
O meacutetodo mais largamente utilizado para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico e
folatos eacute a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia com detector de arranjo de diodos
tanto para farinhas quanto para outros alimentos Nesse meacutetodo jaacute foi relatada a
separaccedilatildeo dos folatos utilizando tanto colunas C18 quanto colunas C30 poreacutem a mais
amplamente utilizada eacute a C18 As curvas analiacuteticas obtidas apresentam uma boa
linearidade com R2 gt09915 Aleacutem disso foram alcanccedilados baixos limites de detecccedilatildeo e
18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
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18
18
quantificaccedilatildeo 006 e 018 gg-1 respectivamente7 assim como recuperaccedilatildeo de 90-104
15
19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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19
19
4 METODOLOGIA
41 Materiais
411 Solventes e reagentes
A acetonitrila (grau HPLC) e o metanol (grau HPLC) foram adquiridos da JT
Baker O aacutecido foacutermico e o hidroacutexido de soacutedio foram comprados respectivamente da
Merck e da Dinamica O fosfato dissoacutedico foi adquirido da Nuclear Os filtros utilizados
para a filtraccedilatildeo das fases moacuteveis foram o acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m)
para a fase aquosa e o PTFE (Sartorius Stedim 045m) para a fase organica O padratildeo
de aacutecido foacutelico foi adquirido da ecircxodo Cientiacutefica (982 de pureza) O filtro utilizado
para as amostras foi de acetato de celulose (Sartorius Stedim 02 m) Todas as
soluccedilotildees foram preparadas com aacutegua ultrapura produzida por um sistema Milli-Q
412 Amostras
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo do tipo 1 adquiridas em
um supermercado de Satildeo Leopoldo - RS
Uma amostra branco (sem adiccedilatildeo de aacutecido foacutelico) foi doada pela empresa Tondo
SA As amostras foram acondicionadas nas suas embalagens originais ateacute o momento
das anaacutelises
42 Meacutetodos
421 Preparo do padratildeo de aacutecido foacutelico
Uma soluccedilatildeo-estoque de aacutecido foacutelico (500 μgmL-1) foi preparada dissolvendo o
padratildeo em uma soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio (01 molL-1 pH 127)
20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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20
20
422 Preparo da curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
A partir da soluccedilatildeo-estoque (500 microgmL-1) foram preparadas 8 concentraccedilotildees de
aacutecido foacutelico (0125 a 300 microgmL-1) atraveacutes da diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90)
423 Extraccedilatildeo do aacutecido foacutelico da farinha de trigo
A extraccedilatildeo foi realizada adicionando 5 mL da soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio
dibaacutesico (005 molL-1 pH 90) agrave 05g de farinha de trigo em um tubo falcon Essa
mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo em vortex (Phoenix Luferco Modelo AP56) por 5
min O extrato obtido foi centrifugado a 3000 g por 15 min O sobrenadante foi
recolhido submetido a uma nova centrifugaccedilatildeo a 13000 g por 5 min e filtrado em filtro
de acetato de celulose e injetado no HPLC-DAD
424 Condiccedilotildees cromatograacuteficas
A determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico foi realizada por cromatografia liacutequida de alta
eficiecircncia em um HPLC da marca Shimadzu equipado com um desgaseficador (DGU-
20A3R) duas bombas (LC-20AD) um injetor automaacutetico (Shimadzu SIL-20A HT) um
forno de coluna (Shimadzu CTO-20A) um software (Shimadzu LC Solution Version
125 SP4) e um detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-M20A) O aacutecido
foacutelico foi separado em uma coluna C18 X-Bridge Shield RP18 (150mm x 46mm x
5microm) antecedida por uma coluna de guarda Waters XBridge Shield RP18 5 m A
temperatura da coluna foi mantida em 35 ordmC A separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico foi realizada
utilizando um gradiente de eluiccedilatildeo com acetonitrila (Fase moacutevel B) e aacutegua acidificada
com aacutecido foacutermico (01 pH 26) (Fase moacutevel A) O gradiente foi iniciado com 8 de
Fase moacutevel B e durante 10 min foi linearmente aumentado para 26 que foi mantida
isocraticamente por 5 min Apoacutes esse tempo a concentraccedilatildeo de Fase moacutevel B foi
aumentada linearmente durante 6 min para 50 e mantida isocraticamente por 9 min
Posteriormente a proporccedilatildeo de Fase moacutevel B voltou para 8 dentro de 5 min O fluxo
foi mantido em 07 mLmin-1 e o volume de injeccedilatildeo foi de 20microL O aacutecido foacutelico foi
monitorado no comprimento de onda de 280 nm
21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
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21
21
425 Quantificaccedilatildeo
A quantificaccedilatildeo foi realizada utilizando uma curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
nas concentraccedilotildees de 0125 a 300 microgmL-1 Para construir a curva analiacutetca os volumes
adequados de soluccedilatildeo estoque foram diluiacutedos na soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato de soacutedio
bibaacutesico (005 molL-1 pH 90) para proporcionar as concentraccedilotildees da curva Para essa
determinaccedilatildeo quantitativa foi realizada uma anaacutelise de regressatildeo linear sendo os valores
de x as concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico e os valores de y as respectivas aacutereas dos picos
cromatograacuteficos
426 Validaccedilatildeo do Meacutetodo
A validaccedilatildeo do meacutetodo foi realizada avaliando os seguintes parametros
analiacuteticos linearidade limites de detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo recuperaccedilatildeo e repetibilidade
A linearidade foi estimada pelo valor do R2 obtido da anaacutelise de regressatildeo e o
criteacuterio de aceitaccedilatildeo segundo o Inmetro e a Anvisa estaacute descrito abaixo24 Os valos de
limites de detecccedilatildeo (LD) e quantificaccedilatildeo (LQ) foram calculados a partir da curva
analiacutetica de acordo com as equaccedilotildees abaixo
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Inmetro Rsup2 ge 090
Criteacuterio de aceitaccedilatildeo Anvisa Rsup2 ge 099
S
sx33LD Equaccedilatildeo 1
S
sx10LQ Equaccedilatildeo 2
onde
s = erro padratildeo da curva analiacutetica
S = coeficiente angular da curva analiacutetica
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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2004
22
22
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Experimentos iniciais
O desenvolvimento do meacutetodo e sua validaccedilatildeo apresentada nesse trabalho foi
baseada em um meacutetodo existente12 com algumas modificaccedilotildees A primeira modificaccedilatildeo
foi em relaccedilatildeo ao aacutecido utilizado para acidificar as fases moacuteveis onde foi substituiacutedo o
aacutecido aceacutetico pelo aacutecido foacutermico As fases moacuteveis foram inicialmente acidificadas com
1 de aacutecido foacutermico poreacutem o pH da fase moacutevel ficou muito baixo (pH 21) Um pH
nessa faixa pode acarretar a hidroacutelise da fase estacionaacuteria da coluna cromatograacutefica
Assim modificou-se o meacutetodo para uma concentraccedilatildeo de 01 de aacutecido foacutermico no
qual a fase moacutevel apresentou um pH de 26
Na sequecircncia foram iniciados os experimentos para a construccedilatildeo da curva
analiacutetica seguindo exatamente o meacutetodo descrito por Alaburda et al (2008) onde a
curva analiacutetica foi preparada em tampatildeo fosfato pH 70 As curvas analiacuteticas preparadas
com esse tampatildeo fosfato pH 70 apresentaram grande variabilidade entre os dias
Assim surgiu a hipoacutetese de que o aacutecido foacutelico estava sofrendo degradaccedilatildeo ao longo do
experimento nessa condiccedilatildeo de pH
Para avaliar a hipoacutetese conduzimos um experimento para avaliar a estabilidade
do aacutecido foacutelico A estabilidade foi avaliada em trecircs diferentes condiccedilotildees (1) aacutecido foacutelico
dissolvido nas fases moacuteveis (composiccedilatildeo inicial do gradiente) (2) tampatildeo fosfato pH
70 e (3) tampatildeo fosfato de soacutedio bibaacutesico (01 molL-1 pH 90) O experimento foi
conduzido atraveacutes do monitoramento da absorbancia do aacutecido foacutelico a 280 nm durante 4
horas a temperatura ambiente (20plusmn2 degC) No experimento foi avaliada a estabilidade de
trecircs concentraccedilotildees de aacutecido foacutelico (05 - 10 - 30 gmL-1) Os resultados (Figuras 3 4
5 e Tabela 3) indicaram que o aacutecido foacutelico degrada significativamente em tampatildeo
fosfato (pH 70) o que explica a grande variaccedilatildeo entre os dias dos coeficientes
angulares das curvas analiacuteticas obtidas inicialmente Em contrapartida os resultados
indicaram que o aacutecido foacutelico eacute mais estaacutevel em tampatildeo fosfato pH 90 Assim a partir
desse experimento as concentraccedilotildees da curva analiacutetica e as amostras foram preparadas
utilizando tambeacutem tampatildeo fosfato pH 90
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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149-154 2004
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Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
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Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
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wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
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275-282 2013
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Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
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GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
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alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
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SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
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Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
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soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
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38
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SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
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[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
23
23
0
001
002
003
004
005
006
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH70
Tampatildeo de fosfato pH90
Fase moacutevel
Figura 3 Estabilidade do aacutecido foacutelico (05 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
Figura 4 Estabilidade do aacutecido foacutelico (10 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo fosfato pH
70
Tampatildeo fosfato pH
90
Fase moacutevel
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
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Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
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dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
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soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
24
24
01
012
014
016
018
02
0 2 4 6
Ab
sorb
acircn
cia
a 2
80
nm
Tempo (h)
Tampatildeo de fosfato pH 70
Tampatildeo de fosfato pH 90
Fase moacutevel
Tabela 3 Porcentagem de degradaccedilatildeo em tampatildeo fosfato pH 70 tampatildeo
fosfato pH 90 e na fase moacutevel de trecircs concentraccedilotildees da curva analiacutetica
52 Validaccedilatildeo do meacutetodo
521 Linearidade
A determinaccedilatildeo da linearidade foi obtida a partir da construccedilatildeo de trecircs curvas
analiacuteticas independentes Os dados obtidos foram submetidos agrave anaacutelise de regressatildeo da
qual foram obtidas a equaccedilatildeo da reta (y = ax + b) valor do R2 e o valor do erro padratildeo
de degradaccedilatildeo pH 70 pH 90 Fase moacutevel
05gmL-1 58 2 17
10gmL-1 20 5 6
30gmL-1 10 6 4
Figura 5 Estabilidade do aacutecido foacutelico (30 gmL-1) dissolvido em diferentes soluccedilotildees
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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149-154 2004
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Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
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Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
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da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
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342 2007
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GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
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37
37
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estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
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Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
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38
38
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
25
25
y = 89612x - 4804
Rsup2 = 0992
Erro padratildeo = 8254
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4
Aacutere
a
Concentraccedilatildeo (gmL-1)
O valor de R2 obtido (Figura 6) confirma que o meacutetodo possui boa linearidade
na faixa de concentraccedilatildeo de 0125 a 300 gmL-1 Os valores dos limites de detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo foram de 004 e 011 gmL-1 respectivamente Na Figura 7 eacute
apresentado um cromatograma caracteriacutestico do padratildeo de aacutecido foacutelico
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade
(mA
u)
Tempo (min)
Figura 6 Curva analiacutetica de aacutecido foacutelico
Figura 7 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do padratildeo de aacutecido foacutelico (30 gmL-
1)As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
AacuteCIDO FOacuteLICO
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
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149-154 2004
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Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
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Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
foacutelico por espectrofotometria-UV Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 24 paacuteg
275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
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the Brazilian Chemical Society Vol 19 nuacutemero 5 2008
[10] CHANDRA-HIOE Maria V BUCKNALL Martin P ARCOT Jayashree Folic
Acid-fortified Flour Optimised and Fast Sample Preparation Coupled with a
Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
Monitoring Program Food Analytical Vol 6 paacuteg 1416-1423 2013
[11] BALUZ KaacuteTOA DO CARMO MARIA DAS GRACcedilAS TAVARES ROSAS
GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
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combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
38
[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
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[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
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[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
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1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
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2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
26
26
522 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade
Com o objetivo de avaliar a exatidatildeo foram realizadas testes de recuperaccedilatildeo na
amostra branco Os resultados de recuperaccedilatildeo foram utilizados para estimar a
repetibilidade do meacutetodo A primeira natildeo foi bem sucedida O limitante nessa etapa foi a
pequena massa de aacutecido foacutelico que tiacutenhamos que medir para adicionar agrave farinha Como
tiacutenhamos 1 kg de amostra branco era necessaacuterio adicionar 15 mg de padratildeo Contudo
essa medida em balanccedila analiacutetica apresentou um grande erro analiacutetico sendo obtidos
valores de recuperaccedilatildeo muito superiores a 100
Portanto optou-se por uma adiccedilatildeo de padratildeo em soluccedilatildeo (soluccedilatildeo de 20 μgmL-
1) diretamente na via de anaacutelise em 3 replicatas de amostra branco A recuperaccedilatildeo foi
realizada para a concentraccedilatildeo de 150 μg100g-1 Os resultados obtidos estatildeo descritos
abaixo na Tabela 4
Tabela 4 Recuperaccedilatildeo e repetibilidade do meacutetodo
Replicata Concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico (microg100g-1) Recuperaccedilatildeo
1 170 113
2 146 97
3 144 96
Meacutedia 153 102
Desvio-padratildeo
relativo (DPR) 9 9
O paracircmetro para uma boa recuperaccedilatildeo de acordo com o INMETRO para
concentraccedilotildees de gmL-1 eacute valores na faixa de 80-120 entatildeo eacute possiacutevel afirmar que
se obteve bons resultados A repetibilidade intra-dia do meacutetodo foi estimada pela
avaliaccedilatildeo dos resultados das trecircs replicatas de amostras branco que foram fortificadas
Os resultados (Tabela 4) indicam que o meacutetodo possui uma boa repetibilidade com um
DPR menor do que 10
53 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
27
27
531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
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[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
performance liquid chromatography Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg
149-154 2004
[4] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
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[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
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[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
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[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
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528 2016
38
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[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
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544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
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1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
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531 Farinhas de trigo
O meacutetodo foi aplicado em 5 amostras de farinha de trigo Na Figura 8 eacute
mostrada a separaccedilatildeo do aacutecido foacutelico e na Tabela 5 os resultados encontrados
Tabela 5 Teor de aacutecido foacutelico em amostras comerciais de farinha de trigo
Marca
Meacutedia plusmn desvio-padratildeo
(μg100g-1)
1 189 plusmn 17
2 269 plusmn 165
3 95 plusmn 17
4 81 plusmn 22
5 160 plusmn 29
Figura 8 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de trigo As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico
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Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
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Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
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36
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37
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38
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[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
28
28
Os resultados dos teores de aacutecido foacutelico nas amostras de farinha de trigo
analisadas mostraram que 40 das farinhas de trigo estatildeo com a concentraccedilatildeo abaixo
do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira (150 g100g-1) Essa menor
concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico pode ter ocorrido devido agrave adiccedilatildeo proposital de menores
quantidades ou pode estar relacionado agrave falta de controle de qualidade na etapa de
fortificaccedilatildeo da farinha de trigo na induacutestria
Em estudo com farinhas de trigo consumidas no Brasil foi encontrada uma
porcentagem similar (51) de amostras de farinha de trigo com teores de aacutecido foacutelico
abaixo do miacutenimo estabelecido pela legislaccedilatildeo brasileira7
Essa menor concentraccedilatildeo de aacutecido foacutelico encontrada em uma porcentagem
significativa de amostras de farinha de trigo tem como principal consequecircncia agrave
disponibilizaccedilatildeo de um produto com um menor valor nutricional em relaccedilatildeo a essa
vitamina comprometendo seriamente o objetivo da fortificaccedilatildeo Um estudo sobre a
importacircncia da correta fortificaccedilatildeo foi realizado nos Estados Unidos onde se verificou
que aproximadamente 20 da populaccedilatildeo americana consome menos do que a metade
da ingestatildeo diaacuteria recomendada12 Jaacute no Brasil 152 da populaccedilatildeo brasileira apresenta
deficiecircncia em aacutecido foacutelico22 Um maior estudo foi realizado sobre o aumento dessa
vitamina no organismo apoacutes um mecircs de ingestatildeo de farinhas de trigo e milho
fortificadas e houve um aumento consideraacutevel tanto para crianccedilas quanto para adultos
de respectivamente 57 e 17422 O enriquecimento dos alimentos inclusive das
farinhas tem sido uma estrateacutegia para aumentar os niacuteveis de folatos tendo a vantagem
de alcanccedilar uma ampla parte da populaccedilatildeo sem a necessidade de mudanccedilas nos haacutebitos
alimentares16 sendo uma forma mais eficaz devido ao baixo custo quando comparado
com mudanccedilas nas dietas ou administraccedilatildeo de suplementos21
Depois do iniacutecio da fortificaccedilatildeo obrigatoacuteria das farinhas os niacuteveis meacutedios de
folato no soro sanguiacuteneo em mulheres natildeo graacutevidas mas em idade reprodutiacutevel mais do
que dobraram A fortificaccedilatildeo tem sido responsaacutevel pela reduccedilatildeo de 16-78 de defeitos
do tubo neural16
532 Farinhas de milho
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
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da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
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RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
foacutelico por espectrofotometria-UV Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 24 paacuteg
275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
quantify folic acid in wheat flour samples using liquid chromatography Journal of
the Brazilian Chemical Society Vol 19 nuacutemero 5 2008
[10] CHANDRA-HIOE Maria V BUCKNALL Martin P ARCOT Jayashree Folic
Acid-fortified Flour Optimised and Fast Sample Preparation Coupled with a
Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
Monitoring Program Food Analytical Vol 6 paacuteg 1416-1423 2013
[11] BALUZ KaacuteTOA DO CARMO MARIA DAS GRACcedilAS TAVARES ROSAS
GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
treatment and storage on ascorbic acid stability of cashew apple processed by
combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
38
[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
separation to determine folic acid Journal of Chromatographic Science Vol 51 paacuteg
544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
grain an economic analysis American Journal Public Health Vol 85 paacuteg 667-76
1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
29
29
Natildeo foi possiacutevel aplicar o meacutetodo validado as amostras de de farinha de milho
Apenas uma amostra de farinha de milho foi testada e a anaacutelise do cromatograma
obtido indicou uma co-eluiccedilatildeo (Figura 9)
Uma possiacutevel soluccedilatildeo futura para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
milho seraacute a utilizaccedilatildeo da teacutecnica de extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPE) A teacutecnica SPE
apresenta diversas vantagens com relaccedilatildeo ao meacutetodo claacutessico utilizado nesse trabalho
tais como praticidade melhor separaccedilatildeo maior sensibilidade poreacutem tem algumas
limitaccedilotildees como a etapa de dessorccedilatildeo do analito aprisionado no cartucho de SPE que
requer geralmente o uso de solventes toacutexicos17 Natildeo foi utilizada nesse trabalho devido
agrave falta da mesma no ICTA e a sua compra levaria mais tempo do que o disponiacutevel para a
finalizaccedilatildeo desse projeto tecnoloacutegico
54 Avaliaccedilatildeo de custos
Os custos foram avaliados considerando o desenvolvimento de uma curva
analiacutetica com 8 pontos e a anaacutelise de uma amostra em triplicata As cotaccedilotildees de preccedilos
foram realizadas na distribuidora VWR que dispotildee de vaacuterias marcas como Merck e J T
Figura 9 Cromatograma obtido por HPLC-DAD do aacutecido foacutelico de uma amostra de
farinha de milho As condiccedilotildees cromatograacuteficas estatildeo descritas no texto
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsi
dad
e (m
Au
)
Tempo (min)
aacutecido foacutelico + outros
compostos
30
30
Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
fortification to prevent neural-tube defects Lancet Vol 350 paacuteg 1666-1669 1997
[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
performance liquid chromatography Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg
149-154 2004
[4] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
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275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
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[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
treatment and storage on ascorbic acid stability of cashew apple processed by
combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
38
[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
separation to determine folic acid Journal of Chromatographic Science Vol 51 paacuteg
544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
grain an economic analysis American Journal Public Health Vol 85 paacuteg 667-76
1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
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Baker e tambeacutem na Sigma-Aldrich Os valores utilizados para a construccedilatildeo do preccedilo
final satildeo baseados no menor valor encontrado conforme consta na Tabela 6
Tabela 6 Avaliaccedilatildeo de custos para o desenvolvimento do projeto tecnoloacutegico
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Para calcular o valor final para a execuccedilatildeo dessa anaacutelise deve-se levar em conta
gastos como energia (HPLC-DAD centriacutefuga computador e voacutertex) assim como o
custo relativo de matildeo de obra e o preccedilo das lampadas do detector que satildeo caras e tecircm
limite de uso conforme consta na Tabela 7 Em todos os valores satildeo considerados os
Reagente Tamanho da
embalagem Preccedilo (R$)
Quantidade
utilizada Custo (R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 15L 3058
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 2L 690
aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 3mL 098
Hidroacutexido de Soacutedio
(pellets) 1kg 4302a 2g 0086
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 14g 074
Padratildeo
aacutecido Foacutelico (gt98) 100g 18789a 50mg 094
Materiais
Membrana Acetato de
Celulose 022m
Caixa com 100
unid 1200c 2unid 240
Membrana filtrante Acetato
de Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 12unid 3012
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 2unid 980
Total (R$) 4200
31
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gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
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Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
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CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
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7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
fortification to prevent neural-tube defects Lancet Vol 350 paacuteg 1666-1669 1997
[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
performance liquid chromatography Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg
149-154 2004
[4] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
foacutelico por espectrofotometria-UV Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 24 paacuteg
275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
quantify folic acid in wheat flour samples using liquid chromatography Journal of
the Brazilian Chemical Society Vol 19 nuacutemero 5 2008
[10] CHANDRA-HIOE Maria V BUCKNALL Martin P ARCOT Jayashree Folic
Acid-fortified Flour Optimised and Fast Sample Preparation Coupled with a
Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
Monitoring Program Food Analytical Vol 6 paacuteg 1416-1423 2013
[11] BALUZ KaacuteTOA DO CARMO MARIA DAS GRACcedilAS TAVARES ROSAS
GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
treatment and storage on ascorbic acid stability of cashew apple processed by
combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
38
[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
separation to determine folic acid Journal of Chromatographic Science Vol 51 paacuteg
544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
grain an economic analysis American Journal Public Health Vol 85 paacuteg 667-76
1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
31
31
gastos por kWh dos equipamentos utilizados no Instituto de Ciecircncia e Tecnologia de
Alimentos da UFRGS e considerando o valor em reais por kWh da AES SUL (1kWh =
R$ 100) Os valores de depreciaccedilatildeo do aparelho natildeo foram colocados nesse trabalho
pois dependem de cada aparelho
Tabela 7 Avaliaccedilatildeo de custos fixos
Equipamento Consumo
(kWh)
Preccedilo por hora
(R$)
Tempo
utilizado
Custo
(R$)
HPLC-DAD 155 155 9h 140
Centriacutefuga 2 200 1h 20
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 9h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 9h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 9h 103
Matildeo-de-obra 2619 10h 2619
Total (R$) 2994
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
Entatildeo o valor final para essa anaacutelise considerando a execuccedilatildeo da curva de
calibraccedilatildeo e uma amostra com trecircs replicatas eacute de R$ 71940
Na empresa prestadora de serviccedilo de anaacutelise o provaacutevel caacutelculo de custo para
essa anaacutelise originaraacute um valor final bem inferior ao valor final apresentado Na
empresa eacute feito um caacutelculo de gastos por amostra e mais um adicional pela curva visto
que uma curva tem estabilidade maior do que um dia (testes sobre estabilidade da curva
natildeo foram efetuados por falta de tempo) e podem ser realizadas mais de uma amostra
por dia O valor adicional pela curva depende de cada local conforme seus gastos e
quantidade de serviccedilo mas os outros valores podem ser estimados conforme consta
abaixo na Tabela 8
32
32
Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
fortification to prevent neural-tube defects Lancet Vol 350 paacuteg 1666-1669 1997
[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
performance liquid chromatography Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg
149-154 2004
[4] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
36
[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
foacutelico por espectrofotometria-UV Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 24 paacuteg
275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
quantify folic acid in wheat flour samples using liquid chromatography Journal of
the Brazilian Chemical Society Vol 19 nuacutemero 5 2008
[10] CHANDRA-HIOE Maria V BUCKNALL Martin P ARCOT Jayashree Folic
Acid-fortified Flour Optimised and Fast Sample Preparation Coupled with a
Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
Monitoring Program Food Analytical Vol 6 paacuteg 1416-1423 2013
[11] BALUZ KaacuteTOA DO CARMO MARIA DAS GRACcedilAS TAVARES ROSAS
GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
37
37
[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
treatment and storage on ascorbic acid stability of cashew apple processed by
combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
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[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
separation to determine folic acid Journal of Chromatographic Science Vol 51 paacuteg
544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
grain an economic analysis American Journal Public Health Vol 85 paacuteg 667-76
1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
32
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Tabela 8 Avaliaccedilatildeo de custos para a anaacutelise de uma amostra em triplicata
Reagente Tamanho da
embalagem
Preccedilo
(R$)
Quantidade
utilizada
Custo
(R$)
Acetonitrila (grau HPLC) 4L 8154b 253mL 516
Metanol (grau HPLC) 4L 1380a 40mL 138
Aacutecido Foacutermico (98-100) 1L 3273b 0025mL 001
Hidroacutexido de Soacutedio (pellets) 1kg 4302a 2g 009
Fosfato Dissoacutedico Anidro 1kg 5302a 042g 002
Materiais
Membrana Acetato de Celulose
022m
Caixa com 100
unid 1200c 1unid 12
Membrana filtrante Acetato de
Celulose 020m
Caixa com 100
unid 25100d 3unid 753
Membrana Teflon (PTFE)
022m
Caixa com 100
unid 4900c 1unid 49
Equipamento
HPLC-DAD
Consumo
(kWh)
155
Preccedilo por
hora (R$)
155
Tempo
utilizado
225h
Custo
(R$)
35
Centriacutefuga 2 200 15min 05
Vortex 013 013 15min 003
Computador 025 025 225h 225
Lacircmpada D2 (Deuteacuterio) 203 203 225h 183
Lacircmpada W (Tungstecircnio) 011 011 225h 103
Matildeo-de-obra 2619 3h 786
Total (R$) 1244
a Sigma b Distribuidora VWR c Sartorius d Unifil
Valor considerando a matildeo-de-obra de um funcionaacuterio teacutecnico da Fundaccedilatildeo de Ciecircncia
e Tecnologia (CIENTEC)
33
33
Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
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CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
35
7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
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[3] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Determination of folic acid in enriched wheat and corn flour by means of high
performance liquid chromatography Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg
149-154 2004
[4] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Validaccedilatildeo de metodologia para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em margarina
enriquecida e avaliaccedilatildeo da estabilidade da vitamina durante estocagem Revista
Instituto Adolfo Lutz Vol 63 paacuteg 10-14 2004
[5] LIMA JULIANA A CATHARINO RODRIGO R GODOY HELENA T
Metodologia analiacutetica para determinaccedilatildeo de folatos e aacutecido foacutelico em alimentos
Quiacutemica Nova Vol29 2006
[6] SANTOS LEONOR MARIA PACHECO PEREIRA MICHELLE ZANON Efeito
da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo dos defeitos do tubo neural Cadernos
de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
36
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[7] ALABURDA JANETE DE ALMEIDA ADRIANA P SHUNDO LUZIA
RUVIERI VALTER SABINO MYMA Determination of folic acid in fortified
wheat flours Revista Journal of Food Composition and Analysis Vol 21 paacuteg 336 -
342 2007
[8] SILVA Walisson Martins DOS SANTOS Flaacutevia Regina BATISTUTI Joseacute
Paschoal Validaccedilatildeo de um novo meacutetodo analiacutetico para quantificaccedilatildeo de aacutecido
foacutelico por espectrofotometria-UV Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 24 paacuteg
275-282 2013
[9] MARTINS JUNIOR Helio A WANG Alexandre Y ALABOURDA Janete A
PIRES Maria A F VEGA Oscar B LEBRE Daniel T A validated method to
quantify folic acid in wheat flour samples using liquid chromatography Journal of
the Brazilian Chemical Society Vol 19 nuacutemero 5 2008
[10] CHANDRA-HIOE Maria V BUCKNALL Martin P ARCOT Jayashree Folic
Acid-fortified Flour Optimised and Fast Sample Preparation Coupled with a
Validated High-Speed Mass Spectrometry Analysis Suitable for a Fortification
Monitoring Program Food Analytical Vol 6 paacuteg 1416-1423 2013
[11] BALUZ KaacuteTOA DO CARMO MARIA DAS GRACcedilAS TAVARES ROSAS
GLORIMAR O papel do aacutecido foacutelico na prevenccedilatildeo e na terapecircutica oncoloacutegica
revisatildeo Revista Brasileira de Cancerologia Vol 48 paacuteg 597-607 2002
[12] ALABURDA JANETE SHUNDO LUZI Aacutecido foacutelico e fortificaccedilatildeo de
alimentos Revista Instituto Adolfo Lutz Vol 66 paacuteg 95-102 2007
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[13] CORREIA Laura Fernandes Melo FARAONI Aureacutelia Santos PINHEIRO-
SANTrsquoANA Helena Maria Efeitos do processamento industrial sobre a
estabilidade de vitaminas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 19 paacuteg 83-95
2008
[14] SOUZA FILHO M S M et al Effect of bleaching osmotic process heat
treatment and storage on ascorbic acid stability of cashew apple processed by
combined methods Ciecircncia Tecnolia Alimentos Vol 19 paacuteg 211-213 1999
[15] SUH Joon Hyuk YANG Dong-Hyuf LEE Byung Kyu EOM Han Young KIM
Unyoung KIM Junghyung LEE Hyeyeon HAN Sang Beom Simultaneous
Determination of B Group Vitamins in Supplemented Food Products by High
Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection Bulletin of the
Korean Chemical Society Vol 32 2011
[16] LMP Santos MZ Pereira Efeito da fortificaccedilatildeo com aacutecido foacutelico na reduccedilatildeo
dos defeitos do tubo neural Caderno de Sauacutede Puacuteblica Vol 23 paacuteg 17-24 2007
[17] BARRIONUEVO Wilma Regina LANCcedilAS Fernando Mauro Extraccedilatildeo em fase
soacutelida (SPE) e micro extraccedilatildeo em fase soacutelida (SPME) de piretroacuteides em aacutegua
Quiacutemica Nova Vol24 2001
[18] DELCHIER NicolasHERBIG Anna-Lena RYCHLIK Michael RENARD
Catherine MGC Folates in Fruits and Vegetables Contents Processing and
Stability Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol 15 paacuteg 506-
528 2016
38
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[19] DELCHIER N RINGLING C MAINGONNAT J-F RYCHLIK M RENARD
CMGC Mechanisms of folate losses during processing diffusion vs Heat
degradation Food Chemistry Vol 157 paacuteg 439ndash447 2014
[20] EMARA Samy MASUJIMA Tsutomu ZARAD Walaa KAMAL Maha EI-
BAGARY Ramzia Online pre-column derivatization with chromatographic
separation to determine folic acid Journal of Chromatographic Science Vol 51 paacuteg
544-551 2013
[21] OS Romano NJ Waitzman RM Scheffler RD Pi Folic acid fortification of
grain an economic analysis American Journal Public Health Vol 85 paacuteg 667-76
1995
[22] BRITTOA Jeacutessica Carrilho Brittoa CANCcedilADO Rodolfo GUERRA-
SHINOHARA Elvira Maria Concentrations of blood folate in Brazilian studies
prior to and after fortification of wheat and cornmeal (maize flour) with folic acid
A review Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Vol 36 paacuteg 275-286
2013
[23] UEHARA Sofia Kimi ROSA Glorimar Association between folic acid
deficiency and disease and prevention strategies a critical view Revista Nutriccedilatildeo
Vol 23 2010
[24] RIBANI Marcelo BOTTOLI Carla Beatriz Grespan COLLINS Carol H
JARDIM Isabel Cristina S Fontes MELO Luacutecio Flaacutevio Costa Validaccedilatildeo em
meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
33
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Entatildeo o valor da anaacutelise se torna acessiacutevel e barato admitindo-se que o valor
final para uma amostra seja R$ 1244 mais o percentual em cima da curva analiacutetica
enquanto apenas a curva o valor eacute de R$ 59500 Algumas empresas rotineiramente
calculam 10-20 sobre um custo ldquofixordquo que eacute distribuiacutedo entre diversas amostras
visando ter um menor preccedilo para o cliente e mesmo assim obter um lucro consideraacutevel
Para fins de um resultado mais soacutelido considerando 10 sobre o custo da curva
analiacutetica a anaacutelise tem um valor de mercado de R$ 18500
34
34
CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
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7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
[2] DALY S MILLS JR MOLLOY AM CONLEY M LEE YJ KIRKE PN
WEIR DG SCOTT JM Minimum effective dose of folic acid for food
fortification to prevent neural-tube defects Lancet Vol 350 paacuteg 1666-1669 1997
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meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Vol27 paacuteg 771-780
2004
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CONCLUSAtildeO
Neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um meacutetodo analiacutetico por HPLC-
DAD simples barato e confiaacutevel para a determinaccedilatildeo de aacutecido foacutelico em farinha de
trigo Um total de 5 amostras de farinha de trigo comerciais foram analisadas sendo que
uma porcentagem significativa apresentou teores de aacutecido foacutelica abaixo do estabelecido
pelo legislaccedilatildeo brasileira
Nossos resultados sugerem que os oacutergatildeos de fiscalizaccedilatildeo devem atuar de
maneira mais efetiva no monitoramento dos niacuteveis de aacutecido foacutelico adicionados na
farinha de trigo bem como as induacutestrias devem adotar um controle de qualidade maior
na fortificaccedilatildeo destes produtos
35
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7 REFEREcircNCIAS
[1] BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilancia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo
RDC n 344 Brasiacutelia Distrito Federal Dezembro 2002
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