Post on 04-Aug-2015
description
JÚLIA GAZZONI JARDIM
UTILIZAÇÃO DE PRÓPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE
BOVINA
MARECHAL CÂNDIDO RONDON - PR
2009
JÚLIA GAZZONI JARDIM
UTILIZAÇÃO DE PRÓPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE
BOVINA
Trabalho de Graduação apresentado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como parte das exigências do Curso de Zootecnia, para obtenção do título de “Zootecnista”.
MARECHAL CÂNDIDO RONDON - PR
2009
JÚLIA GAZZONI JARDIM
UTILIZAÇÃO DE PRÓPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE
BOVINA
Trabalho de Graduação apresentado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como parte das exigências do Curso de Zootecnia, para obtenção do título de “Zootecnista”.
APROVADO: 26 de novembro de 2009.
______________________________ __________________________
Profª PhD. Erika C. T.de Mello Peixoto D.Sc. Bruno Borges Deminicis
____________________________
Profª D.Sc. Regina Conceição Garcia
(Orientadora)
“Se o que você estiver fazendo não estiver lhe divertindo,
você não está fazendo coisa alguma.”
Carvalho e Nakagawa
”A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos
outros dez.”
George Bernard Shaw
”O que somos é consequência do que pensamos.”
Buda
“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida e
viver com paixão, perder com classe e viver com ousadia,
pois o triunfo pertence a quem se atreve, e a vida é muito
bela para ser insignificante.”
Charles Chaplin
ii
AGRADECIMENTOS
A UNIOESTE pela oportunidade de realização do curso.
Aos meus professores pelos ensinamentos transmitidos para minha formação
profissional.
Em especial às professoras DSc. Regina Conceição Garcia e DSc. Erika
Cosendey Toledo de Mello Peixoto, por fazerem do aprendizado não um trabalho, mas
um contentamento, obrigada pela paciência, atenção, amizade, apoio e
importantíssima colaboração e orientação no desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu grande amigo Eduardo Luiz Heinzen por sua dedicação, incentivo,
companheirismo, sempre me apoiando em todo o trabalho, fazendo com que este se
concretizasse.
Ao Clauber Polese pela realização dos laudos laboratoriais das amostras de
própolis.
Ao Sr. Romeu Hepp por ceder seus animais e sua propriedade para a
realização desse trabalho.
A UNESP-Botucatu por ceder o Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública e pela realização das amostras
laboratoriais de CCS do leite.
Agradeço a Deus pelas pessoas que colocou em meu caminho por todo apoio
e carinho, por toda ajuda e incentivo.
Aos meus pais Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina Gazzoni Jardim por
acreditarem em mim, por tantas vezes que abdicaram de seus sonhos, para realizar os
meus.
Ao meu irmão Bruno Gazzoni Jardim por seu amor, alegria, carinho e apoio
incondicional nas horas difíceis de minha vida.
iii
Ao meu namorado Bruno Borges Deminicis pelo amor, carinho, paciência,
disposição a mim dedicados. Obrigada por estar sempre ao meu lado me divertindo,
me promovendo como pessoa, mulher e ser humano.
A Suzane Conceição Pantolfi Tostes pela amizade e pelos anos de
convivência na mesma moradia.
As minhas amigas por todas as experiências compartilhadas: Ângela Hinkel
(Anjinha), Andressa de Andrade (Xucra), Camila Hunoff (Camilão), Carine Ferreira de
Souza (Cacah), Carolina Mecabo, Elisângela Neuhaus, Fabiane Murakami e Taimara
Bernardi.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho.
MUITO OBRIGADA
iv
BIOGRAFIA
JÚLIA GAZZONI JARDIM, filha de Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina
Gazzoni Jardim, nasceu em 04 de novembro de 1986, na cidade do Rio de Janeiro,
Estado do Rio de Janeiro.
Cursou o 1º Grau no “Colégio Sagrada Família”, concluindo-o em dezembro
de 2000 e o 2º Grau na “Sociedade Educacional Professor Altair Mongruel – SEPAM”
em Ponta Grossa – Paraná, concluindo-o em dezembro de 2003.
Ingressou em 2006 no curso de graduação em Zootecnia da Universidade
Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE, campus de Marechal Cândido Rondon
onde em dezembro de 2009 obteve o título de Zootecnista.
v
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS...................................................................................... iii
BIOGRAFIA..................................................................................................... v
SUMÁRIO........................................................................................................ vi
RESUMO........................................................................................................ viii
ABSTRACT..................................................................................................... ix
INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 4
2.1. Atividade antimicrobiana da própolis...................................................... 4
2.2. Atividade antiinflamatória da própolis..................................................... 5
2.3. Extrato de própolis................................................................................... 6
3. MATERIAL E METODOS.......................................................................... 9
3.1. Análise do Leite....................................................................................... 9
3.1. Preparo e análise do extrato de Própolis............................................... 12
3.1.2. Extrato Solúvel Seco (%)......................................................................
Erro! Indicador não definido.
3.1.3. Extrato Bruto Seco (mg/mL).................................................................
Erro! Indicador não definido.
3.1.4. Compostos Fenólicos (%).................................................................... 12
3.1.5. Teor de Flavonóides em Quercetina (%)............................................. 12
3.1.6. pH........................................................................................................
Erro! Indicador não definido.
vi
3.1.7. Propriedade Antioxidante....................................................................
Erro! Indicador não definido.
3.1.8. Análises Microbiológicas......................................................................
Erro! Indicador não definido.
3.2.1.6. Análise Estatística.............................................................................. 13
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 14
4.1. California Mastite Teste............................................................................ 15
4.2. Contagem de Células Somáticas.............................................................. 15
4.3. Análise Microbiológica do Leite............................................................... 18
4.4. Análise Físico-química da Própolis........................................................ 20
4.4.1. Peso Seco e Extrato Seco.....................................................................
Erro! Indicador não definido.
4.4.2. Teores de Compostos Fenólicos e Flavonóides................................... 20
4.4.3 pH...........................................................................................................
Erro! Indicador não definido.
4.4.4 Propriedade Antioxidante....................................................................... 21
4.4.5 Análise Microbiológica do Extrato Alcoólico de Própolis (EAP).............
Erro! Indicador não definido.
5. CONCLUSÃO.............................................................................................. 22
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 23
vii
RESUMO
JARDIM, Júlia Gazzoni, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, agosto de 2009, Utilização de própolis no controle da mastite bovina. Orientadora: Regina Conceição Garcia. Conselheiros: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis.
Mastite corresponde à inflamação da glândula mamária e apresenta-se de
forma clínica ou subclínica. O risco de resíduos de antibióticos no leite e a alta relação
custo / benefício, são fatores que devem ser considerados na implantação da terapia
durante a lactação. A tolerância e ausência de toxicidade conferem à própolis seu
valor medicinal quando administrada ao organismo animal. A mastite clínica foi
identificada pelo teste da caneca de fundo preto. A mastite subclínica foi identificada
pelo California Mastite Teste (CMT), contagem de células somáticas (CCS) e exame
microbiológico. Foram realizados quatro tratamentos: Grupo 1: uso de 5mL de extrato
alcoólico de própolis a 30%, por via oral, durante sete dias consecutivos; Grupo 2:
além do procedimento descrito no Grupo 1, foi utilizado 5mL de própolis a 30%
adicionado de glicerina líquida em igual volume na desinfecção por imersão dos tetos;
Grupo 3: uso de extrato alcoólico de própolis a 30% na desinfecção dos tetos e Grupo
4 (controle): os animais foram submetidos aos procedimentos de desinfecção por
imersão dos tetos antes e após a ordenha, rotineiramente empregados pela
propriedade. Os resultados foram analisados pelo teste não paramétrico Qui-quadrado
em nível de 5% de probabilidade, que demonstrou não ter havido diferença entre os
tratamentos.
Este estudo objetivou verificar as atividades terapêuticas e anti-sépticas da
própolis no controle de mastite bovina.
Palavras-chave: Agroecologia, leite, produção orgânica, biodinâmica.
viii
ABSTRACT
JARDIM, Júlia Gazzoni , Universidade Estadual do Oeste do Paraná, agosto de 2009, Propolis use in the control of the bovine mastitis. Adviser: Regina Conceição Garcia. Council member: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis.
Mastitis corresponds to the inflammation of the mammary gland and it comes of clinical
form or subclinical. The risk of residues of antibiotics in the milk and the high
relationship cost / benefit, they are factors that should be considered in the implantation
of the therapy during the nursing. The tolerance and toxicant absence check to your
propolis medicinal value when administered to the animal organism. The mastitis
clinical was identified by the test of the mug of deep black color. The mastitis
subclinical was identified by California Mastitis Test (CMT), somatic count cells (SCC)
and exam microbiological. Four treatments were accomplished: Group 1: I use from
5mL of alcoholic extract of propolis to 30%, orally, for seven consecutive days; Group
2: besides the procedure described in the Group 1, it was used 5mL of propolis to 30%
added of liquid glycerin in equal volume in the pre-dipping and post-dipping; Group 3:
use of alcoholic extract of propolis to 30% in the pre-dipping and post-dipping and I
Group 4 (it controls): the animals were submitted to the pre-dipping procedures and
post-dipping, routine used by the property. The results were analyzed by the technique
of variance non parametric in level of 5% of probability, that demonstrated not to have
had difference between the treatments.
This study aimed at to verify the therapeutic and antiseptic activities of the
propolis in the control of bovine mastitis.
Keywords: Agroecology, milk, production organic, biodynamic.
ix
INTRODUÇÃO
O consumidor em diferentes países exige, cada vez mais, alimentos naturais e
de melhor qualidade. O uso de promotores de crescimento, como os antibióticos, já
está proibido pelo Mercado Comum Europeu, na avicultura e suinocultura, desde
janeiro de 2006. Há necessidade de se restringir o uso de antibióticos em humanos e
na produção animal (MC CARTNEY, 2005). A demanda por produtos orgânicos e
naturais cresce a cada ano, só em 2008 o mercado mundial de orgânicos movimentou
41,5 bilhões de dólares e o Brasil acompanha essa tendência mundial. O incentivo à
produção orgânica foi uma das metas do governo em 2005 e vem sendo incentivada
até a atualidade (ALVES, 2005). Além disso, a implantação de medidas de qualidade e
controle vem contribuindo para os avanços na produção de alimentos, inclusive sobre
a cadeia leiteira. Mudanças nos conceitos de produção exigem que o leite seja
produzido em condições higiênicas, por animais sadios e que não estejam eliminando
resíduos de antibióticos ou de outras drogas; essa preocupação não é recente e tem
sido demonstrada já há muitos anos (LOPES e VIANA, 1996).
A fim de garantir produtos de melhor qualidade na mesa do consumidor, a
instrução normativa 51 (BRASIL, 2002), regulariza a produção, transporte e venda do
leite e produtos lácteos, e está sendo implantada pelo Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento nos diferentes estados brasileiros, devendo estar
efetivamente implantada até 2012. É constituída de regulamentos técnicos que
padronizam a produção de leite, determinando parâmetros de identidade (leite A, B e
C) e qualidade (requisitos microbiológicos e físico-químicos), além de proibir a
presença de resíduos de antibióticos no leite.
A mastite bovina compromete a qualidade do leite pelo risco de veiculação de
agentes patogênicos, causando grandes prejuízos para a atividade, sendo citada
como a principal doença da bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA,
1998; PINTO et al., 2001; CARAVIELLO, 2004).
As maiores perdas estão relacionadas à diminuição da produção (BRITO e
BRESSAN, 1996; HOLANDA JÚNIOR et al., 2005), responsável por 66% das perdas
diretas. Porém, gastos indiretos com medicamentos, leite descartado, serviços
veterinários, descarte prematuro de animais, diminuição do valor comercial dos
animais e do leite quando se remunera por qualidade, além do aumento de mão de
obra para realização de tratamentos, devem ser contabilizados. Além disso, alterações
na composição do leite como diminuição de caseína, gordura e lactose (VEIGA, 1998),
prejudicam o rendimento industrial (BRIETZKE, 2004) e o tempo de conservação do
produto no comércio.
A mastite caracteriza-se por uma enfermidade multifatorial, e para ser
controlada, faz-se necessário rigoroso monitoramento dos animais, do homem,
ambiente, instalações, manejo de ordenha, entre outros (BRITO, 2000). Assim, esta
afecção apresenta difícil controle e erradicação. Quanto mais precocemente for
detectada, e tratada maiores chances de recuperação e menores chances de
proliferação e contágio entre os animais (SANTOS, 2005a). Animais doentes podem
contaminar outros por meio de resíduos nos equipamentos de ordenha, assim como
pelo contato direto entre eles (VEIGA, 1998; SANTOS, 2003). Portanto, toda
propriedade leiteira deve estabelecer rigoroso controle da mastite, incluindo a forma
subclínica (VEIGA, 1998), uma vez que o fator que mais contribui para o alto índice de
mastite é a duração das infecções (BRITO e BRITO, 2000).
Entretanto, a intervenção terapêutica nos casos subclínicos é pouco frequente
entre os produtores, principalmente pela necessidade de descarte do leite, quando se
utilizam produtos à base de antibióticos (SANTOS, 2000). A viabilidade econômica
desse tratamento só é demonstrada nos casos de apresentação simultânea de mastite
clínica em um ou mais quartos do mesmo animal, pois neste caso, já se teria o custo
do descarte do leite (SANTOS, 2005b). Além disso, ainda que se realize o tratamento
em apenas um quarto mamário, os outros também podem eliminar resíduos
antimicrobianos, devido à passagem sanguínea (BRITO, 2000). Assim, o tratamento
da mastite subclínica normalmente é protelado até o final da lactação e somente
instituído na fase de secagem. Portanto, o não tratamento da mastite subclínica tem
sido questionado, pois pode favorecer a evolução do quadro (SANTOS, 2005d), uma
vez que infecções crônicas são mais difíceis de se curar (BRITO e BRITO, 2000),
principalmente nas infecções por Staphylococcus aureus, que é o principal agente
causador de mastite bovina (SANTOS, 2000).
2
A necessidade de intervenção farmacológica é unânime, pois a taxa de cura
espontânea é baixa (SANTOS, 2005a) e as bactérias estão se tornando cada vez mais
resistentes aos tratamentos convencionais (SFORCIN, 1996; BRITO, 2000; TAYLOR
et al., 2002), porém, seu emprego gerou preocupação quanto à presença de resíduos
no leite.
Portanto, determinou-se a busca por soluções alternativas que tratem do
problema sem gerar descarte do leite. Se os meios alternativos forem eficientes no
controle da mastite e envolverem soluções naturais e ecologicamente favoráveis,
estarão em consonância com a demanda de um mercado consumidor cada vez mais
exigente, favorecendo inclusive maior lucratividade à atividade leiteira.
Ao longo da história o homem aprendeu a utilizar produtos naturais na
medicina e um dos produtos mais utilizados tem sido a própolis (PEREIRA, 2002). Sua
atividade antibacteriana (GARCIA et al.,2004a; GOULART, 2000; FERNANDES
JÚNIOR, et al., 1994, 2001, 2005) e antiinflamatória (ALMEIDA e MENEZES 2002;
ORSI et al., 2000; SFORCIN et al., 2002) foram extensivamente estudadas.
Porém, a despeito de diversos estudos comprovarem as propriedades
farmacológicas da própolis, a maioria ocorreu em condições controladas, geralmente
em animais de laboratório (MENEZES, 2005). Assim a necessidade de se realizar
ensaios clínicos capazes de determinar as doses a serem administradas e seu real
efeito in vivo, a campo, foi considerada (ALMEIDA e MENEZES 2002; MENEZES,
2005, LOGUERCIO et al., 2006 ). Além disso, a vegetação da região onde a própolis é
coletada (TEIXEIRA et al., 2006; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006) e a genética da
rainha (GHISALBERTI, 1979), podem influenciar sua composição e sua potência,
justificando assim, estudos regionalizados.
Portanto, objetivou-se no presente estudo avaliar as atividades terapêuticas e
anti-sépticas da própolis no controle da mastite bovina.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Atividade antimicrobiana da própolis
Os efeitos bacteriostáticos e bactericidas da própolis foram demonstrados tanto
em bactérias classificadas como Gram positivas como negativas, porém as primeiras
apresentaram maior sensibilidade (GOULART, 2000; PINTO et al.,2001; VARGAS et
al., 2005; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006). Efeito bactericida sobre bactérias Gram
negativas foi demonstrado por Orsi et al.(2005a), entretanto esses autores ressaltaram
que os resultados foram dependentes da região na qual a própolis foi coletada. Assim,
a atividade biológica da própolis varia conforme seu tipo (PARK et al., 1998; ALMEIDA
e MENEZES, 2002).
A própolis foi classificada, por meio de marcadores químicos, objetivando a
padronização do produto nas diferentes regiões brasileiras (MARCUCCI, 1995).
Observou-se efeito inibitório sobre os gêneros Streptococcus, Staphylococcus,
Bacillus e Mycobacterium, principais bactérias causadoras da mastite bovina
(GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al., 1996; KOO et al., 2002; MIORIN et al.,
2003) e efeito parcialmente efetivo em gêneros como Pseudomonas, Escherichia,
Klebsiella, Proteus e Salmonella (GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al.. 1996;
FERNANDES JÚNIOR et al., 1995, 1997, 2005).
Murakami (2007) utilizou o extrato alcoólico de própolis (EAP) e mel como
veículo, via intramamária para o tratamento da mastite subclínica em bovinos. Além da
utilização do EAP a 30% com glicerina líquida no pré-dipping e pós-dipping.
Efeito bactericida em Salmonella foi demonstrado ainda, no controle de rações
avícolas (MAZZUCO et al., 1996) e em amostras coletadas de alimento contaminado,
causador de enterite em humanos (ORSI et al., 2005a).
4
Garcia et al. (2004a) avaliaram a utilização de extrato alcoólico de própolis em
rações de coelhos, encontraram conversão alimentar e ganho de peso relativamente
melhores quando estes foram alimentados com rações contendo 0,1% do referido
extrato. A adição de própolis em pequenas quantidades à ração melhorou o
desempenho dos animais, prejudicando os mesmos quando adicionada em níveis
mais elevados (0,3%), porém, não houve alteração dos parâmetros bioquímicos
séricos dos animais quando ministrada na referida concentração. Em outro trabalho
Garcia et al. (2004b) utilizaram o extrato alcoólico de própolis em rações de coelhos
para controle da Pasteurella mutocida, e verificaram uma redução significativa da
carga bacteriana, demonstrado por meio de UFC/mL, presente no lavado
traqueobrônquico desses animais. Estes resultados podem ter interferido na melhor
conversão alimentar e ganho de peso.
A susceptibilidade in vitro da Candida albicans à própolis, foi demonstrada por
Fernandes Júnior et al. (1994). No ano seguinte, apontaram pela ordem decrescente
de susceptibilidade, os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus , Cândida
albicans, Cândida guilliermondi, Cândida parapsilosis, Staphylococcus typhimurium,
Escherichia coli.
Azevedo et al. (1999) utilizaram própolis em candidíase oral em humanos e
verificaram sensibilidade em 95,71% das amostras utilizadas, porém observaram
resistência para as espécies C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata. Entretanto, sua
eficiência em C. albicans e C. tropicalis foi demonstrada mais tarde (SFORCIN et al.,
2001).
Biachini e Bedendo (1998) demonstraram seu efeito inibitório em bactérias
fitopatogênicas quando inoculadas em meio de cultura contendo 10% de extrato
aquoso de própolis.
2.2. Atividade antiinflamatória da própolis
Mirzoeva e Calder (1996) atribuíram ao ácido caféico, à quercetina, à
narigenina e ao éter fenílico do ácido caféico as propriedades antiinflamatórias da
própolis. Substâncias conhecidas capazes de inibir a inflamação como ácido salicílico,
apigenina, ácido felúrico e galangina foram identificadas na própolis por Krol et al.
(1996). A supressão de prostaglandinas e leucotrienos de macrófagos (MIRZOEVA e
CALDER, 1996; BORRELI et al., 2002) e incremento na liberação de histamina (ORSI
et al., 2005b) seriam os principais responsáveis por este efeito.
5
A síntese de prostaglandinas e óxido nítrico foram associados a processos
inflamatórios e carcinogênicos (LIANG et al., 1999). Esses autores demonstraram a
capacidade inibitória de diversos flavonóides, dentre eles a apigenina, sobre a
transcrição de RNAm na síntese de ciclooxigenase, enzima necessária à formação
desses elementos. Entretanto, Orsi et al. (2000) avaliaram o efeito da própolis sobre
ativação do sistema macrofágico pelo oxigênio, os resultados obtidos apontaram
discreta elevação de H2O2 e inibição sobre a formação de óxido nítrico, dependente de
sua concentração.
Almeida e Menezes (2002) realizaram extensa revisão sobre o efeito
antiinflamatório da própolis in vitro e verificaram a necessidade de maiores estudos in
vivo.
Sforcin (1996) comprovou ação imunoestimulante da própolis, demonstrando in
vitro, aumento da atividade lítica das células “natural killer” sobre células tumorais de
ratos tratados com extrato hidroalcoólico de própolis a 10%.
Adicionalmente, os flavonóides têm ação antioxidante, minimizando a
peroxidação lipídica e o efeito dos radicais livres, esta propriedade foi confirmada pela
inibição da oxidação do peróxido de hidrogênio no luminol, evidenciado por meio de
espectrofotometria eletrônica (MARCUCCI et al., 2005; KROL et al., 1990).
Arteriosclerose, cardiopatias e derrames são alguns problemas relacionados às
oxidações dos ácidos graxos poliinsaturados e que aparecem com menor risco
naqueles que ingerem maiores quantidades de flavonóides, como alimentos vegetais e
vinho tinto (MARCUCCI et al., 2005).
2.3. Extrato de própolis
A Instrução Normativa n0 3, de 19/01/2001, do Departamento de Inspeção de
Produtos de Origem Animal, do Ministério da Agricultura e Abastecimento (IN3),
padroniza a composição, propriedades físicas, químicas, características sensoriais,
além de regulamentar condição para comercialização e consumo dos extratos de
própolis.
A própolis bruta é obtida com auxílio de coletores ou por raspagem manual e
realizam-se a remoção de impurezas como restos de madeira, abelhas, favo, folhas,
traças e outras inclusões mais presentes, quando o processo de obtenção se dá por
meio de raspagem (GOULART, 2000; SILVA, 2003b).
A trituração ou fragmentação foi utilizada por diversos autores (SARTORI et al.,
1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000, DANTAS et al., 2006) a fim de aumentar as
superfícies de contato, apressando o processo de extração. A pulverização por alta
6
rotação não é recomendada por Silva (2003a), pois partes dos componentes ativos
podem ser destruídos pelo aquecimento e atrito entre a própolis e as pás do
equipamento (liquidificador).
Com a finalidade de prevenir o crescimento de microrganismos contaminantes,
conservam-se a própolis bruta, até o momento do preparo do extrato, a uma
temperatura que varia de -4oC a -10o C (SARTORI et al., 1994; SFORCIN, 1996;
GOULART, 2000; DANTAS et al., 2006).
A própolis bruta encontra-se no estado sólido e por ser uma resina, não é
solúvel em água (KONISHI et al., 2005). Para separar a porção resinosa da balsâmica,
ou seja, extrair os princípios ativos da própolis são necessários solventes e, de
preferência, inócuos ao consumo humano. Álcool de cereais e álcool neutro purificado
(obtido da cana de açúcar) podem ser utilizados, desde que contenham no máximo
70o GL (BRASIL, 2000), ou seja, 7 partes de álcool para 3 partes de água, o
equivalente a 70% de álcool absoluto (SILVA, 2003a), etanol (SAWAYA et al., 2004),
acetona (DANTAS et al., 2006), álcool etílico isolado (FERNANDES JÚNIOR, 1994;
SFORCIN, 1996; GOULART, 2000; ORSI et al., 2005) ou em associação a outras
substâncias como propilenoglicol, polissorbato 80, lauril sulfato de sódio (KONISHI et
al., 2005), também foram utilizados como solventes.
Extrato de própolis a 30% (30g de própolis bruta para cada 100 mL de
solvente) é frequentemente utilizado (GOULART, 2000; SFORCIN et al., 2001;
KONISHI et al., 2005; ORSI et al., 2005b). Porém maiores proporções, 50%, 60%,
70% e 80% também foram testadas (PARK et al., 1998; KOO et al., 1999; CUNHA et
al., 2004; VARGAS et al., 2004; DANTAS et al., 2006), sendo que maiores proveitos
foram obtidos a partir de extratos a 50% (SAWAYA et al., 2004) e 70% (CUNHA et al.,
2004). Park et al. (1998) verificaram que os extratos etanólicos de própolis entre 60 a
80% inibiram satisfatoriamente o crescimento microbiano e apresentaram ação
antioxidante a 70 e 80%. Essa proporção deverá ser obtida pela pesagem da própolis
e solvente, volume a volume ou peso a peso.
Porém essa percentagem se refere à base da matéria natural, sendo que a
base da matéria seca pode ser determinada por evaporação em estufa à 50oC durante
24 horas (GOULART, 2000), obtendo-se a concentração em g/mL. O Ministério da
Agricultura determina que o extrato deva apresentar no mínimo 11% de extrato seco,
também denominado de sólidos solúveis totais (SILVA, 2003a).
A maneira mais precisa de se quantificar compostos fenólicos e flavonóides é
utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (FUNARI,2006). Entretanto,
técnicas como espectrometria pode representar uma alternativa mais simples, de
7
menor custo e possibilitar análises rápidas, de amostras numerosas em laboratórios
mais modestos (ADELMANN, 2005).
Considerando-se que a composição química da própolis é extremamente
complexa e que pode variar em até 300 componentes (CASTRO et al., 2001 e
TEIXEIRA, et al, 2006), e considerando-se ainda que os compostos fenólicos e
flavonóides têm sido responsabilizados pelas principais atividades terapêuticas da
própolis (GHISALBERTI, 1979; GRANGE e DAVEY, 1990; MARCUCCI, 1995; PARK
et al 2000; MARCUCCI, et al. 2005; ANDRÉA, et al., 2005).
Para realizar a infusão do extrato de própolis, o frasco deve ser protegido do
calor e luz solar direta (SARTORI et al., 1994; FERNANDES JÚNIOR, 1995; GARCIA
et al., 2004a e b) a fim de se prevenir foto degradação. Entretanto, CUNHA et al.
(2004) não observaram efeito da luminosidade sobre a extração dos teores fenólicos
totais, que variou de 6,41 e 15,24% em extratos etanólicos (70% volume para volume)
obtidos pela maceração da própolis.
A agitação frequente em tempos variados foi realizada por GARCIA et al.
(2004a e b), três vezes ao dia (FERNANDES JÚNIOR, 1994) ou a cada três dias
(SILVA, 2003a). Para isso utiliza-se pá ou colher de material atóxico e inerte como
madeira, plástico (poliamida) ou aço inox (SILVA, 2003a). Esse período de infusão
pode variar de 7 dias (FERNANDES JÚNIOR, 1994; SFORCIN, 1996; GOULART,
2000), 10 a 30 dias (CUNHA et al., 2004, KONISHI et al., 2005), 35 a 45 dias (SILVA,
2003a). Após a última agitação, SILVA (2003a) recomendou deixar decantar por três
dias ou mais e remover com auxílio de sifão o sobrenadante. Realiza-se a seguir a
filtragem, embalagem e rotulagem do extrato, que deve possuir no mínimo 11% de
extrato seco (BRASIL, 2000).
Os primeiros resultados referente à qualidade da própolis foram os publicados
por Bankova et al. (1992), Bonvehi e Coll (1994) e Bonvehi et al. (1994). No Brasil,
utilizam-se as normas do “Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Extrato
de Própolis”, presentes na normativa Nº. 03, de 19 de Janeiro de 2001 do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA (BRASIL, 2001), que visa manter a
qualidade do extrato alcoólico de própolis brasileiro e determinar os requisitos mínimos
de qualidade destinada ao comércio nacional.
8
3. MATERIAL E METODOS
O presente estudo foi realizado na Granja Hepp, caracterizada como sistema
familiar, no município de Marechal Cândido Rondon na latitude de 24º33’40”S,
longitude 54º04’12” W e altitude média de 420m (IAPAR, 1978). A propriedade
apresenta área de 5,4 hectares destinada ao pastejo, dividida em 27 piquetes
formados por Tifton 85 (Cynodon sp).
Os trabalhos foram iniciados em Novembro de 2007 e finalizados em Fevereiro
de 2008. Avaliou-se 288 quartos mamários em 72 fêmeas pluríparas da raça Holandês
Preto e Branco e seus cruzamentos, entre três a seis lactações e em fase inicial da
lactação, até 90 dias do parto, com produção média diária de 20 litros de leite por
animal. Os animais foram ordenhados duas vezes ao dia por meio de ordenhadeira
mecânica canalizada e balde ao pé.
Foram excluídos todos os animais livres de mastite ou portadores da forma
clínica da doença. Para tanto, realizaram-se exames clínicos e complementares O
exame clínico especial foi realizado em duas etapas, antes e após a ordenha,
objetivando detectar diferenças no tamanho ou formato dos tetos, aumento de
linfonodo retro-mamário, reações inflamatórias, atrofia do aparelho mamário, entre
outros sinais
3.1. Análise do Leite
Inicialmente, foram utilizados teste da caneca de fundo preto e Califórnia
Mastite Teste (CMT) no diagnóstico da mastite clínica e subclínica respectivamente.
Optou-se pela realização do CMT por ser considerado um exame eficiente e prático
9
para ser executado durante a ordenha (VEIGA, 1998); sendo amplamente utilizado no
diagnóstico da mastite subclínica e se baseia na presença de células somáticas no
leite (SPEXOTO, 2003). O teste da caneca de fundo preto foi utilizado antes da
primeira ordenha do dia, a partir da coleta dos três primeiros jatos de leite de cada
quarto mamário, em um recipiente de fundo preto, para pesquisa de grumos, coágulos,
pus ou outras alterações.
O Califórnia Mastite Teste (CMT) foi realizado em recipiente plástico, com
quatro compartimentos iguais de 1,5cm de altura, onde foram coletados 2mL de leite
de cada quarto mamário separadamente. Foi adicionado, em igual volume, reagente
próprio (Lauril sulfato de sódio a 3%), detergente aniônico corado com Bromocresol
púrpura, e por meio de movimentos circulares realizou-se a mistura durante 20
segundos (SCHALM e NOORLANDER, 1957). O resultado foi utilizado para classificar
os animais em 4 categorias: 0( zero) representa todos os animais cujos exames não
apresentaram reação; 1 atribuído de acordo com leve reação e formação de gel
(escore +), 2 para formação mais espessa com mamilo central (escore ++) e 3
formação de gel muito espesso aderente ao fundo do recipiente (escore +++). O
quarto mamário foi considerado positivo para mastite subclínica quando apresentou
escores 1+, 2+ ou 3+ e negativo na ausência de reação.
Para as amostras de leite provenientes dos tetos que apresentaram resultados
positivos ao CMT, realizou-se a Contagem de Células Somáticas (CCS), além da
análise microbiológica individual. Para tanto, as amostras foram encaminhadas ao
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Campus de Botucatu.
Para a CCS utilizou-se aparelho eletrônico Somacount 300 (Bentley), e valores
maiores ou iguais a 200 mil células somáticas por mililitro de leite foram considerados
positivos para mastite subclínica, de acordo com Ruegg (2008).
O controle microbiológico foi realizado a partir de amostras de leite de cada
quarto mamário separadamente. Para realizar a coleta de leite e posterior isolamento
dos microrganismos presentes nas amostras de leite, as mãos do coletor foram
lavadas, desinfetadas (álcool 70%) e enluvadas. As tetas foram lavadas com água
para remoção de sujidades provenientes de camas, poeira, fezes, etc. e procedeu-se
secagem pelo uso de papel toalha. Posteriormente, foi realizada a desinfecção das
extremidades das tetas com algodão embebido com álcool 70%, conforme
recomendações de Brito e Brito (1999).
As coletas de leite foram realizadas antissepticamente, em frascos estéreis,
transportadas sob refrigeração em caixa térmica à temperatura de 4-5 °C e mantidas
congeladas à -18 °C. Após o término do período de coleta, as amostras congeladas
10
foram enviadas ao laboratório para realização da cultura, de acordo com Brito e Brito
(1999).
O controle microbiológico das amostras de leite de cada quarto mamário foi
realizado separadamente e posterior isolamento dos microrganismos presentes em
cada coleta. As coletas de leite foram realizadas assepticamente, em frascos estéreis,
mantidas refrigeradas à temperatura de 4-5 oC e enviadas ao laboratório de
microbiologia do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da UNESP,
Botucatu – SP em 24 horas para realização da cultura de acordo com Brito e Brito
(1999).
Neste laboratório, foram realizados cultivos microbiológicos com 0,1 mL de leite
em placas de Petri contendo meios de ágar-sangue ovino a 5% e Mac Conkey ágar,
incubando-se a 37°C. Realizaram-se as leituras das placas às 24, 48 e 72 horas,
observando-se a morfologia das colônias, além da quantidade desenvolvida.
Adicionalmente as amostras foram examinadas em lâminas de vidro, coradas
pelo método de Gram, para verificar-se ao microscópio ótico, além da morfologia
bacteriana sua característica morfotintorial. Os microrganismos foram repicados para
meio de caldo cérebro-coração (BHI) para realização das provas taxonômicas,
segundo Krieg e Holt (1984), Carter e Cole Junior (1990) e Quinn et al. (1994).
Todos os exames supracitados foram realizados no momento imediatamente
anterior ao início dos tratamentos (dia zero) e posteriormente, nos dias sete e 14 após
o início dos tratamentos. A eficácia da desinfecção dos tetos foi avaliada de acordo
com National Mastitis Concil (HOGAN et al.,1990).
Realizaram-se quatro tratamentos, onde os animais do grupo (1) foram
submetidos ao tratamento da mastite subclínica pelo uso de 10mL de extrato alcoólico
de própolis (EAP) a 30%, por via oral, durante 7 dias consecutivos, após cada
ordenha. Nos animais do grupo (2), além do procedimento descrito para o grupo 1, foi
utilizado 5ml EAP adicionado à água filtrada e fervida em igual volume para imersão
dos tetos, no momento imediatamente anterior ao procedimento da ordenha. Este
procedimento repetiu-se após a ordenha, entretanto, para esse momento, substituiu-se
o veículo aquoso por glicerina líquida em igual volume (5 mL). O tempo de imersão foi
de aproximadamente 30 segundos, alcançando todo comprimento dos tetos. Para os
animais constituintes do grupo (3), administrou-se álcool de cereais (10 mL), via oral,
por sete dias consecutivos, e os animais constituintes do grupo controle-testemunha
(4) não foram submetidos a nenhum tipo de tratamento, a não ser aquele
rotineiramente utilizado pela propriedade (limpeza das tetas com água de torneira e
secagem com toalha; antes da ordenha).
11
3.1. Preparo do extrato alcoólico de própolis
A própolis bruta foi coletada por raspagem, na região do município de Marechal
Cândido Rondon – PR; foi fragmentada, pesada e mantida à temperatura de -4°C até
o momento do preparo do extrato (SARTORI et al. 1994; SFORCIN, 1996; GOULART,
2000; DANTAS et al., 2006).
Para obtenção dos princípios ativos foi utilizado como solvente, álcool de
cereais na proporção de 30%, pesando-se tanto a própolis quanto o solvente, para
(GOULART, 2000; SFORCIN, et al. 2001; KONISHI, et al., 2005; ORSI, et al. 2005b).
O extrato foi acondicionado em frascos de coloração âmbar e mantido ao abrigo da luz
(SARTORI et al., 1994; FERNANDES JÚNIOR, 1995; GARCIA et al, 2004a e b).
Durante o período de extração procedeu-se agitação diariamente, em tempo de
trinta segundos, uma vez ao dia, durante os 30 dias consecutivos. Após esse período
o extrato de própolis foi obtido por meio de filtração. As análises físico-químicas foram
executadas de acordo com Orsi et al. (2000) e realizadas no laboratório de Tecnologia
de Produtos de Origem Animal (TPOA) da Universidade Estadual do Oeste do Paraná
(UNIOESTE)
3.1.2. Compostos Fenólicos (%)
Para a determinação da porcentagem de compostos fenólicos, foram pesados
2,5mL dos EAP (P1). Em seguida adicionou-se 7mL de álcool etílico e 0,5mL de
acetato de chumbo a 10%. A solução foi agitada e deixada em repouso por 24 horas,
em temperatura ambiente. Após este período de tempo, a solução foi filtrada em papel
de filtro, previamente pesado (P2), e mantido a temperatura ambiente por 12 horas.
Em seguida, o papel de filtro foi colocado em estufa a 50ºC por uma hora e novamente
pesado (P3). A porcentagem de compostos fenólicos foi determinada através da
seguinte fórmula:
Compostos Fenólicos (%) = ((P3 – P2)/P1) x 100
3.1.3. Teor de Flavonóides em Quercetina (%)
Uma alíquota de 0,4mL foi retirada dos EAP e transferida para balão
volumétrico de 25mL. Em seguida, acrescentou-se 0,5mL de cloreto de alumínio a 5%
em metanol absoluto, completando-se o balão com metanol. A solução foi agitada e
colocada em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz. Decorrido este período de
tempo, a solução foi colocada em espectrofotômetro de U.V. a 425nm, para leitura da
12
absorbância. Para zerar o aparelho, foi utilizado metanol absoluto. Para o preparo do
padrão, foi utilizada quercetina: 0,2mg/mL de quercetina foi transferida para balão
volumétrico de 25mL, acrescentando-se a seguir 0,5mL de cloreto de alumínio em
metanol a 5%. O balão foi completado para 25mL com metanol. A solução foi agitada
e mantida em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz (POPOVA, 2005). O teor de
flavonóides totais em quercetina foi determinado de acordo com a fórmula:
Teor de Flavonóides (mg/mL) = Leitura da amostra x Massa do Padrão
Leitura do padrão x Volume da amostra
3.2. Análise Estatística
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com
quatro tratamentos e 72 repetições ( ver se são os animais ou os tetos)
Para a análise estatística dos dados foi aplicado o teste não paramétrico Qui-
quadrado em nível de 5% de probabilidade.
A distribuição da ocorrência do CMT, segundo a intensidade nos grupos e
momento de avaliação, foi apresentada por meio da estatística descritiva envolvendo a
frequencia absoluta e percentual (ZAR, 1999).
O estudo do CMT e da CCS segundo os grupos e os tetos dos animais foi
analisado pela técnica de variância ANOVA não paramétrica para o modelo de
medidas repetidas em grupos independentes, complementada com os respectivos
testes de comparações múltiplas, no nível de 5% de significância (ZAR, 1999). A
indicação da significância foi realizada por meio de letras colocadas ao lado das
medidas descritivas [mediana (valor mínimo – máximo)]. Duas medidas seguidas de
uma mesma letra minúscula não diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos grupos
fixados o momento de avaliação, e duas medianas seguidas de uma mesma letra
maiúscula não diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos momentos de avaliação
dentro do grupo considerado.
A análise não paramétrica de Spearman à 5% de significância foi utilizada para
calcular a correlação entre CMT e CCS.
13
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Há muito a mastite bovina vem sendo citada como principal doença da
bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA, 1998; PINTO et al., 2001;
CARAVIELLO, 2004). Seu impacto econômico permite considerá-la como a mais
onerosa afecção desta atividade (BRITO e BRITO, 2000; CARAVIELLO,2004),
apresentando-se amplamente disseminada nos rebanhos (BRITO e BRITO, 2000).
Corroborando com esses achados, o presente estudo avaliou 72 fêmeas bovinas em
lactação e observou incidência em 98,70% dos animais.
Esta enfermidade pode apresentar-se sob a forma clínica e subclínica, neste
estudo foram observados sinais clínicos como hiperemia, edema e dor à palpação nas
glândulas afetadas por mastite clínica diferindo das ocorrências subclínicas, onde o
diagnóstico exige exames complementares. Porém, a forma subclínica representa
maior impacto na produtividade leiteira devido a sua maior prevalência (VEIGA, 1998;
RIBAS, 1999; FONSECA e SANTOS, 2000; BRITO e BRITO, 2000; SANTOS, 2005a).
Corroborando com isso, observou-se menor prevalência da forma clínica (5,26%) em
relação à subclínica (94,73%). Ribas (1999) verificou que 20 % das fêmeas em
produção de um determinado rebanho, apresentaram mastite em um ou mais quartos
do úbere, sendo 97% sob a forma subclínica. Fonseca e Santos (2000) verificaram
que em média, 40% dos animais do rebanho brasileiro apresentam mastite subclínica
e que o ideal seria não ultrapassar 15 a 20%.
14
4.1. California Mastite Teste (CMT)
Com relação aos resultados referentes ao Califórnia Mastite Teste, para o
presente experimento, não foram demonstrados diferenças entre os grupos e o
momento de avaliação (Tabela 1). Porém, Murakami (2007) observou uma diminuição
de 45% no grau de infecção do teto através do CMT, após sete dias de tratamento.
Tabela 1. Medidas descritivas (média aritmética, desvio padrão e mediana) em
porcentagem do Califórnia Mastite Teste segundo o grupo e o momento de avaliação
(T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e T14 - 14 dias após o início
dos tratamentos).
Momentos de avaliaçãoGrupo T0 T7 T14
Oral3,25 ± 0,89 3,00 ± 1,15 2,60 ± 1,37
4,00 aA 3,00 aA 2,00 aA
Oral e Imersão3,25 ± 0,88 3,62 ± 1,03 2,81 ± 1,28
3,50 aA 4,00 aA 3,50 aA
Álcool3,32 ± 0,85 3,04 ± 1,09 2,56 ± 1,22
4,00 aA 3,00 aA 2,00 aA
Controle3,46 ± 0,71 3,30 ± 0,92 2,84 ± 1,12
4,00 aA 4,00 aA 3,00 aAMédias com mesma letra na coluna e linha não diferem entre si
Médias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si
4.2. Contagem de Células Somáticas
A contagem de células somáticas é parâmetro para avaliação da qualidade do
leite (BRASIL, 2002) e está diretamente relacionada ao grau de infecção da glândula
mamária. Corroborando com estas informações, o presente estudo verificou que em
174 amostras de leite que apresentaram valores de CCS acima de 200 mil células/mL,
86,20% apresentaram infecção mamária clínica.
Costa et al (2007) consideraram que animais livres de mastite apresentam
contagens de até 100 mil células/mL. Já Veiga (1998), Thiers (1999), Brito e Brito
(2000), Souza (2005) e Ruegg (2008) consideraram valores acima de 200 mil
células/ml, indicativos de mastite subclínica. Fonseca e Santos (2000), admitiram o
intervalo de 200 a 400 mil células/ml; entretanto Paschoal et al. (2003) e Spexoto
(2003), indicaram apenas valores acima de 300 mil células/mL. Desta forma, o
15
presente estudo considerou o limite de 200 mil células/mL, como limite máximo para
animais sadios.
Com relação ao diagnóstico de infecção mamária, considerou-se que a síntese
e secreção do leite nos alvéolos mamários é um processo praticamente asséptico, e
que em geral a principal via de infecção é a ascendente pelo canal do teto
(HILLERTON, 1996). Porém, uma vez alcançado o interior da glândula mamária,
pequeno número de microrganismos já é suficiente para desencadear a infecção, já
que as condições são extremamente favoráveis ao seu desenvolvimento e
proliferação. Dessa forma, assim como considerado por Sargeant et al. (2001), para o
presente estudo, o mínimo de crescimento bacteriano observado nos meios de cultivo,
foi relacionado à ocorrência de infecção.
As medidas descritivas referentes à CCS foram avaliadas entre os grupos
(Tabela 2); observando-se diminuição significativa apenas após 14 dias do tratamento,
entretanto, essa diminuição ocorreu dentro dos grupos avaliados.
Em relação ao momento anterior aos tratamentos (T0), observou-se diminuição
na contagem de células somáticas em todos os grupos, inclusive no grupo controle, e
este fato provavelmente ocorreu devido aos maiores cuidados higiênicos despendidos
pelos ordenhadores, durante o período experimental. Provavelmente este fato foi
decorrente da presença de nossa equipe no ambiente da ordenha.
Tabela 2. Medidas descritivas (média aritmética, desvio padrão e mediana) números
absolutos da contagem de células somáticas (CCS x 10³) segundo o grupo e o
momento de avaliação (T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e
T14 - 14 dias após o início dos tratamentos).
Momentos de avaliaçãoGrupo T0 T7 T14
Oral583,60 ± 668,61 574,67 ±693,74 134,32 ± 168,76
395,50 aB 314,50 aB 67,00 aA
Oral e Imersão
514,00 ± 677,01 886,53 ± 1087,64 141,37 ± 190,60263,50 aB 482,50 aC 41,00 aA
Álcool543,08 ± 547,59 589,68 ± 696,91 158,64 ± 426,59
394,00 aB 0394,00 aB 49,00 aA
Controle535,03 ± 511,93 528,46 ± 510,03 97,96 ± 111,71
402,50 aB 445,50 aB 65,00 aAMédias com mesma letra na coluna e linha não diferem entre si
Médias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si
16
Murakami (2007) utilizando própolis para controle da mastite bovina observou
uma diminuição na CCS de 83% dos tetos após sete dias de tratamento quando
submetidos à imersão com própolis. Corroborando com o presente estudo, que
apresentou uma diminuição de 84,45% na CCS após quatorze dias de tratamento,
porém, nenhuma diferença significativa entre os grupos foi encontrada.
O manejo de desinfecção antes e após a ordenha e medidas de higiene como
manter tetos limpos e secos são medidas que contribuem profilaticamente para
amenizar o problema. A imersão de tetos em soluções anti-sépticas pode reduzir
novas infecções em 50 a 90% dos casos (PEDRINI e MARGATHO, 2003), desta
forma, um manejo preventivo utilizando o EAP a 30% na imersão dos tetos antes e
após a ordenha, demonstrou efetivo no controle da mastite.
4.3. Correlação entre CMT e CCS
Os resultados provenientes do CMT correspondem às variáveis qualitativas
ordinárias e os da CCS são variáveis quantitativas (Tabela 3), para se efetuar os
cálculos de correlação (r), procedeu-se a codificação da CCS conforme Barbosa, et al.
(2002) e realizou-se análise não paramétrica de Spearman à 5 % de significância.
Tabela 3- Correlação do Califórnia Mastite Teste (CMT) e Contagem de Células
Somáticas (CCS) nos momentos avaliados: imediatamente anterior ao tratamento
(T0), sete dias (T7) e 14 dias (T14) após o início dos tratamentos
Associação Oral (28) Prop+Pre (32) Álcool (25) Controle (26)
CMTT0xCCST0 0,839(P<0,01) 0,814(P<0,01) 0,823(P<0,01) 0,856(P<0,01)
CMTT7xCCS T7 0,839(P<0,01) 0,580(P<0,01) 0,721(P<0,01) 0,838(P<0,01)
CMTT14xCCST14 0,532(P<0,05) 0,588(P<0,01) 0,265(P>0,05) 0,124 P>0,05)
A correlação desses exames foi demonstrada em bovinos (BRITO et al., 1997;
BARBOSA et al., 2002), bubalinos (JORGE et al., 2005), caprinos (SILVA et al., 2001),
assim como pelo presente experimento, onde apresentou valores oscilantes, conforme
o momento de avaliação. Esses valores corresponderam a 0,71, 0,61 e 0,32 para os
momentos imediatamente anterior à aplicação dos tratamentos, 7 e 14 dias após,
respectivamente.
Correlações variadas também foram registradas por Brito et al., (1997). Esses
autores relataram que, apesar do CMT ser um ótimo teste para o diagnóstico de
mastite subclínica, possui caráter subjetivo e dependente da interpretação de quem o
17
realiza. Relataram que sua classificação em escores pode ocasionar tanto resultados
falsos positivos quanto falsos negativos, sendo indicada a CCS como método
diagnóstico mais seguro.
Além disso, nem sempre foi possível demonstrar similaridade entre os
resultados do CMT e CCS (ZAFALON et al., 2005; FERREIRA et al., 2007). Zafalon et
al., (2005) observaram ainda que a eficiência diagnóstica de 81,0% e 87,1% para
ambas as provas foi maior quando a mastite subclínica era causada por
Staphylococcus aureus. Porém quando comparada com infecções causadas por
Corynebacterium bovis demonstrou eficiência de 60,5% para CMT e 76,7% para CCS.
Enquanto Ferreira et al., (2007) avaliaram 26 animais em três momentos e não
observaram correlação entre os resultados do CMT e CCS.
4.3. Análise Microbiológica do Leite
A qualidade microbiológica do leite pode indicar a qualidade sanitária do
rebanho e condições higiênicas da produção (FONSECA e SANTOS, 2000), sendo
que a identificação dos microrganismos causadores da mastite é importante tanto para
implementação de mecanismos de controle como para monitoramento do rebanho
(SANTOS, 2005c).
Brito e Brito (2000), recomendaram o acompanhamento dos rebanhos, por
meio de exames microbiológicos e testes quantitativos (CCS) como medida preventiva
à mastite, além da realização de exames bacteriológicos em animais de reposição,
antes de serem incorporados ao rebanho. A pesquisa de agentes causadores da
mastite contribui para taxa de cura, uma vez que há relação entre os microrganismos
encontrados e os locais nos quais estão presentes, possibilitando a implantação de
medidas de controle específicas e direcionadas (VEIGA, 1998).
A mastite bovina caracteriza-se por processo inflamatório da glândula mamária,
podendo ser de origem traumática, infecciosa, tóxica e alérgica (HOLANDA JÚNIOR et
al., 2005), contudo, a causa bacteriana é considerada mais frequente. Corroborando
com essas informações, no momento imediatamente anterior ao início do presente
estudo, registrou-se crescimento bacteriano em 79,81% das amostras, após análise
individual do leite proveniente de 109 tetos mamários.
Entretanto, esse crescimento bacteriano, ocorreu apenas nas amostras
inoculadas no meio de cultura Agar sangue, ressaltando que 100% das amostras
foram negativas para o cultivo em Mc Conkey ágar.
Considerando-se que o meio Agar sangue é apropriado para o crescimento de
bactérias aeróbias, principalmente enterobactérias e considerando-se ainda que o
18
meio Mac Conkey ágar destina-se à detecção e isolamento de coliformes, geralmente
presentes na mastite clínica, a ausência de crescimento neste meio concorda com os
resultados apresentados pelo CMT e teste da caneca preta; uma vez que um dos
critérios utilizados para seleção dos animais foi ausência de mastite clínica.
Os patógenos mais comuns da mastite podem ser divididos naqueles que
causam infecções subclínicas, de longa duração, como Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactie, Mycoplasma bovis, Corynebacterium bovis e os que estão
presentes no ambiente, por não encontrarem-se totalmente adaptados à glândula
mamária, causam mastite clínica de curta duração, como Escherichia coli, espécies de
Klebsiella, Enterobacter além de outros Streptococcus (não agalactie). Esses últimos
são os coliformes gram-negativos mais comumente associados à mastite bovina
(HILLERTON, 1996; BRITO e BRITO, 2000).
Corroborando com esses achados, a Tabela 4 apresenta os patógenos e suas
respectivas frequências, em percentagem, nos diferentes momentos experimentais, na
qual o Staphylococcus aureus continua sendo apontado como principal agente
causador de mastite bovina (SANTOS, 2000, ALBERTON, 2000). O presente estudo
observou ocorrência de Staphylococcus aureus em 47,22% das amostras, valor este
semelhante ao encontrado por Vieira-da-Motta et al. (2001), que foi de 39,7%.
Tabela 4. Principais microrganismos isolados das amostras de leite com suas
respectivas ocorrências em porcentagem nos diferentes grupos experimentais, antes
da aplicação dos tratamentos (T0), sete (T7) e 14 (T14) dias após
Momentos
Microrganismos T0 T7 T14
Staphylococcus ssp 20,19 24,03 20,19Staphylococcus aureus 42,3 33,65 40,38
Streptococcus agalctiae 19,23 3,84 3,84
Streptococcus dysgalactiae 8,65 12,5 8,65
Streptococcus uberis 14,42 8,65 3,84
Streptococcus intermedius 0,00 1,92 0,00
Corynebacterium bovis 6,73 10,57 8,65*T0 - antes da aplicação dos tratamentos, T7 - sete e T14 - 14 dias após aplicação dos tratamentos.
19
4.4. Análise Físico-química da Própolis
4.4.1. Teores de Compostos Fenólicos e Flavonóides
O presente estudo utilizou própolis, proveniente da região de Marechal Cândido
Rondon – PR, e indicou teores de 55,5% e 11,92% de compostos fenólicos e
flavonóides, respectivamente.
O mínimo de compostos fenólicos e flavonóides, exigido é 0,50% e 0,25%
respectivamente (BRASIL, 2001). Dessa forma, pode-se observar que a amostra
avaliada enquadra-se nos padrões de qualidade. Além disso, esses valores estão de
acordo com as médias encontradas por diferentes pesquisadores, embora haja
variação dependente de inúmeros fatores como: época do ano (SILVA et al., 2006;
CASTRO et al., 2007), tipo de abelha (FERNANDES JÚNIOR et al., 2001), região
onde a própolis foi produzida (KOSALEC et al., 2005; FERNANDES JUNIOR et al.,
2006; MULI et al., 2007) e procedimento utilizado no preparo do extrato (CUNHA et al.,
2004; SAWAYA et al., 2004; MULI et al., 2007).
Bonhevi e Cool (1994) encontraram valores de compostos fenólicos em torno
de 10,1% para própolis brasileira, valor semelhante ao encontrado neste estudo.
Maldonado (2000) que encontra valores de compostos fenólicos, variando entre 0,42%
a 36,04%. Massuda (2003) obteve porcentagem de compostos fenólicos, em extratos
alcoólicos de própolis, variando de 5,09 a 5,48%, e Sato (2003) observou variação
entre 0,01% e 9,30%.
Cunha et al., (2004) verificaram variação entre 6,41% e 15,24%, nos teores de
fenóis totais de extrato etanólico de própolis a 70%, proveniente de São Paulo e Minas
Gerais, enquanto Silva et al., (2006) encontraram valores de ácidos fenólicos variando
de 2,93 a 8,13% e de flavonóides 0,19 a 0,38% em amostras de própolis do Estado da
Paraíba.
Gonsales et al. (2006), verificaram variações entre 0,5 a 0,63% nos teores de
flavonóides em extrato etanólico de própolis a 70%, em São Paulo, e Pavanelli et al.
(2007), analisaram três tipos de extrato etanólico de própolis coletados em Campo
Grande – MS, e encontraram valores médios de 40,15 % para compostos fenólicos e
3,16% para flavonóides.
Souza et al. (2007) verificaram o teor de flavonóides totais em amostras de
própolis provenientes do Estado de São Paulo (região de Franca) e Minas Gerais
(região de Passo) e encontraram valores de valores de 0,06% a 0,38% para São Paulo
e entre um amplitude de variação de 0,12 a 2,11% para os teores de flavonóides
totais, também nas regiões de São Paulo e Minas Gerais.
20
Essa elevada variabilidade de compostos fenólicos na própolis deve-se
provavelmente a diferentes fontes de exsudado vegetal, bem como à localização do
apiário (MOURA, 2001). Entretanto, apesar dessa variação, verificou-se que própolis
de diferentes regiões, mantiveram suas propriedades antibacteriana (KUJUMGIEV et
al., 1999; GONSALES et al., 2006), antifúngica (KUJUMGIEV et al., 1999) e antiviral
na maioria das amostras avaliadas (KUJUMGIEV et al., 1999).
Dessa forma a ação química e biológica da própolis, depende de diferentes
combinações (FARNESI, 2007). Sforcin et al. (2005) e Scazzocchio et al. (2005), já
haviam abordado múltiplos mecanismos sinérgicos envolvidos na atividade
antimicrobiana da própolis, indicando interação entre seus constituintes. Assim, apesar
do esforço de diferentes grupos de pesquisa nesta área, a farmacodinâmica da
própolis ainda não foi completamente elucidada (SALANTINO, et al. 2005).
Dessa forma, apesar dos valores aqui determinados terem sido de médio teor,
e semelhantes às médias estabelecidas por diferentes pesquisadores, esses teores
isoladamente podem não ter sido eficientes para avaliação quanto à eficácia biológica
das amostras de própolis analisada, pois mediram a quantidade e não a qualidade
(ADELMANN, 2005) e este fato provavelmente contribuiu para os resultados aqui
alcançados.
4.4.2. Propriedade Antioxidante
Substâncias flavonóides e compostos fenólicos, presentes nos extratos de
própolis, são reconhecidos pela ação antioxidante (KROL et al., 1990, MARCUCCI, et
al., 2005, SOUZA e GONÇALVES, 2008). Para confirmar esses resultados, o presente
estudo, verificou atividade antioxidante do EAP a 30% pela solubilidade positiva para
acetato de chumbo e ao NaOH.
Atividade antioxidante para extratos alcoólicos de própolis foi confirmada na
Argentina (MALDONADO, 2000) e em diferentes estados brasileiros (GONSALES et
al., 2005). Souza et al. (2007) registraram essa atividade em amostras provenientes de
São Paulo (região de Franca) e Minas Gerais (região de Passo).
21
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As atividades biológicas da própolis propiciam grandes perspectivas ao
tratamento de diferentes afecções, tanto na medicina humana como na veterinária. A
alta diversidade em sua composição química, além da complexidade dos múltiplos
mecanismos sinérgicos envolvidos em suas atividades biológicas, faz-se necessários
outros ensaios clínicos a fim de se determinar, dose, dosagem e vias da administração
capazes de determinar seus benefícios terapêuticos in vivo.
22
6. CONCLUSÃO
Para as condições avaliadas, não foi possível observar diferenças entre os
tratamentos nas atividades terapêuticas e anti-sépticas da própolis no controle da
mastite bovina.
23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADELMANN, J. Própolis: variabilidade composicional, correlação com a flora e bioatividade antimicrobiana / antioxidante. Dissertação de Mestrado. Curitiba, PR. 186p. 2005.
ALBERTON, L. R. Controle da mastite em vacas leiteiras com bacterina de Staphylococcus aureus isolados do próprio rebanho, aplicada repetidamente durante a lactação. Scientia Agraria, v.1, n.1 – 2, p. 83 – 84, 2000.
ALMEIDA, E. C., MENEZES, H. Anti-inflamatory activity of propolis extracts: a review. Journal of Venomous Animals and Toxins, v.8, n.2, 2002.
ALVES, A. A. Panorama atual da produção orgânica de leite no Brasil. Agroecologia Hoje, n.29, p.24-25. 2005.
ARNAO, M.B. Some methodological problems in the determination of antioxidantactivity using chromogen radicals: a practical case. Trends in Food Science &Technology, v. 11, p. 419-421, 2000.
AZEVEDO, R. V. P., KOMESU, M. C., CANDIDO, R. C. et al. Candida sp in the oral cavity with and without lesions: maximal inhibitory dilution of propolis and periogard. Revista de Microbiologia, v.30, n.4, p.335-341, 1999.
BANKOVA, V.; DYULGEROV, A.; POPOV, S.; EVSTATIEVA, L.; KULEVA, L.; PUREB, O.; ZAMJANSAN, Z. Propolis produced in Bulgaria and Mongolia phenolic compounds and plant origin. Apidologie, v.23, p.79-85, 1992.
BARBOSA, C. P., BENEDETTI, E., RIBEIRO,S. C. A., et al. Relação entre contagem de células somáticas (CCS) e os resultados do California Mastitis Test (CMT), no diagnóstico de mastite bovina. Bioscinencia Journal, v.18, n.1, p.93-102. 2002.
BIACHINI, L., BEDENDO, I. P. Efeito antibiótico da própolis sobre bactérias fitopatogênicas. Scientia Agrícola, v.55, n.1, 1998.
BONVEHI, J.S. and COLL, F.V.V. Phenolic composition of propolis from China and South América. Z. Naturforsc., v.49, p.712-8, 1994.
24
BONVEHI, J.S.; COLL, F.V.V.; JORDA, R.E. The composition, active components and bacteriostatic activity of propolis in dietetics. Journal of the American Oil Chemists, v.71, p.529-32, 1994.
BRASIL. Ministério de Agricultura e do Abastecimento. Instrução normativa n0 51 de 18 de setembro de 2002. Regulamentos técnicos de produção, identidade, qualidade coleta e transporte de leite. Diário Oficial da União, Brasília, D.F. Secção 1, p. 23-57.
BRASIL. Ministério de Agricultura e do Abastecimento. Instrução normativa N.o 3, de 19 de janeiro de 2001. Diário Oficial da União, Brasília, D.F. 23 de jan 2001, Seção 1, p. 18-23. http://www.extranet.agricultura.com.br
BRASIL. Instrução Normativa n0 11, de 20/10/2000 da SDA/DISPOA.
BRITO, J. R. F., BRESSAN, M. A. V. P Controle integrado da mastite bovina. Embrapa-CNPGL: Juiz de Fora, 1996. 111p.
BRITO, J. R. F., CALDEIRA, G. A. V., VERNEQUE, R. S., BRITO, M. A. V. Sensibilidade e especificidade do Califórnia Mastitis Test como recurso diagnóstico da mastite sub-clínica em relação à contagem de células somáticas. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.17, n.2, p. 49-53, 1997.
BRITO, M. A. V. P., BRITO, J. R. F. Diagnóstico microbiológico da mastite. Circular Técnica. Juiz de Fora: Embrapa-CNPGL, 1999. 26p.
BRITO, M. A. Resíduos de antimicrobianos no leite. Circular Técnica. Juiz de Fora: Embrapa-CNPGL, 2000. 28p.
BRITO, J. R. F., BRITO, M. A. P. Mastite Bovina. In: BRESSAN, M. Práticas de manejo sanitário em bovinos de leite. Circular Técnica. Juiz de Fora: Embrapa-CNPGL, p. 7-15, 2000.
BRIETZKE, A. L. Contribuição de células somáticas no controle de qualidade do leite: uma questão de saúde pública. Monografia apresentada à Universidade Estadual do Oeste do Paraná como trabalho de conclusão do curso de graduação em Zootecnia. Marechal Cândido Rondon. 2004. 53p.
CARAVIELLO, D. Seleção genética e mastite. Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br> 2004. Acesso em: 26/6/2004.
CARTER, G.R., COLE JUNIOR,, J.R. Diagnostic procedures in veterinary bacteriology and mycology. 5. ed. New York: Academic Press, 1990. 620p.
CASTRO, S. L. Propolis: biologycal and pharmacological activities. Therapeutic uses of this bee-product. Annual Review of Biomedical Science, v.3, p. 49-83, 2001.
CASTRO, M. L., CURY, J. A., ROSALEN, P. L. Química Nova, no prelo, 2007.
CUNHA, I. B. S., SAWAYA, A. C. H. F., CAETANO, F. M., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of Brazilian Chemical Society, v. 15, n.6, 2004.
25
DANTAS, A. P., SALOMÃO, K., BARBOSA, S. L. de C. The effect of Bulgarian against Trypanossoma cruzi and during its interection with host cells. Memórias do Instituo Oswaldo Cruz, v. 101, n. 2, p.207-211. 2006.
FERNANDES JÚNIOR , A., SUGIZAKI, M. F., FOGO, M. L., et al. Suscetibilidade “in vitro” de Cândida a própolis. IV Congresso Iberolatinoamericano de Apicultura. 1994. Anais. Córdoba - Argentina.
FERNANDES JÚNIOR, A., SUGIZAKI, M. F., FOGO, M. L., et al. In vitro activity of propolis against bacterial and yeast pathogens isolated from human infections. Journal of Venomous Animals and Toxins., v1, n.2, p. 65-69, 1995.
FERNANDES JÚNIOR,A., LOPES, C. A. M., SFORCIN, J. M., et al. Population analysis of susceptibility to propolis in reference strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Journal of Venomous Animals and Toxins, v 3, n.2, p. 287-294, 1997.
FERNANDES JÚNIOR, A., LEOMIL, L., FERNANDES, A. A. H., et al. The antibacterial activity of propolis produced by Apis mellifera L. and Brazilian stingless bees. Journal of Venomous Animals and Toxins, v.7, n.2, p. 173-182, 2001.
FERNANDES JÚNIOR, A., BALESTRIN, E. C., BETONI, J. E. C., et al. Propolis: anti-Staphylococcus aureus activity and synergism with antimicrobial drugs. Memórias do instituto Oswaldo Cruz, v.100, n.5, 2005.
FERNANDES JÚNIOR, A., LOPES, M. M. R.; COLOMBARI, V.; et al. Atividade antimicrobiana de própolis de Apis mellifera obtidas em três regiões do Brasil. Ciência Rural, v.36, n.1, p. 294-297, 2006.
FERREIRA, A. M. S. C., COSTA, J. N., BRITO, A. P. C., et al. Suplementação com vitamina E (acetato de DL – alpha-tocoferol) e a ocorrência de mastites em vacas Jersey. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v.8, n.2, p. 71-82, 2007.
FARNESI, A. P. Efeitos da própolis de abelhas africanizadas e meliponíneos em microrganismos. Dissertação Mestrado – Universidade Estadual de São Paulo. 2007. 89p.
FONSECA, L. F. L., SANTOS, M. V. Qualidade do leite e controle de mastite. São Paulo: Lemos Editorial, 2000. 175p.
FONTANA, J.D.; PASSOS, M.; SANTOS, M.H.R.D.; FONTANA, C.K.; OLIVEIRA, B.H.; SCHAUSE, L.; PONTAROLO, R.; BARBIRATO, M.A.; RUGGIERO, M.A.; LANÇAS, F.M. Profiling propolis flavonoids by means of micellar electrokinetic capillary chromatography, capillary gas chromatography and bactericidal action. Chromatographia, (Wiesbaden), Alemanha, v. 52, n. 3/4, p. 147-151, 2000.
FUNARI,C.S., FERRO,V.O. Análise de própolis. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v 26, n 1, p. 171-178, 2006.
GATTO, M.T.; FALCOCCHIO, S.; GRIPPA, E.; MAZZANTI, G.; BATTINELLI, L.; NICOLOSI, G.; LAMBUSTA, D.; SASO, L. Antimicrobial and anti-lipase activity of quercetin and its C2-C163-O-acyl-esters, Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.10, p.269–72, 2002.
26
GARCIA, R. C., SÁ, M. E. P. de, LANGONI, H., et al. Efeito do extrato alcoólico de própolis sobre o perfil bioquímico e o desempenho de coelhas jovens. Acta Scientiarum Animal Sciences, v.26, n.1, p.57-67, 2004a.
GARCIA, R. C., SÁ, M. E. P. de, LANGONI, H., et al. Efeito do extrato alcoólico de própolis sobre a Pasteurella multocida in vitro”. Acta Scientiarum Animal Sciences, v.26, n.1, p.69-77, 2004b.
GHISALBERTI, E. Propolis: a review. Bee World, v. 60, p. 59-84, 1979.
GONSALES, G. Z.; ORSI, R. O.; RODRIGUES, P.; FUNARI, S.R.C. Análises físico-químicas de extrato alcoólico de própolis. Boletim de Indústria Animal, v.62, p.215-9, 2005.
GONSALES, G. Z., ORSI, R. O., FERNANDES JÚNIOR, A., et al. Antibacterial activity of própolis collected in diferent regions of Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, v. 12, n.2, p. 276-284, 2006.
GOODMAN, L. A. Simultaneous confidence intervals for contrasts among multinomial populations. Annals of mathematical statistics, v. 35, n.2, p.716-725. 1964.
GOODMAN, L. A. On simultaneous confidence intervals for multinomial proportiones. Technometrics, v. 7, n.2, p. 247-254. 1965.
GOULART, C. S. G. Estudo da atividade antimicrobiana da própolis e do dimetilsulfóxido (DMSO) frente a microrganismos isolados de otite externa em cães. Dissertação Mestrado – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. 2000. 100p.
GRANGE, J. M. e DAVEY, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. v. 83, march, 1990.
HEGAZI, A.G.; HADY, F.K.A.E.; ALLAH, F.A.M.A. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Z. Naturforsc, v.55C, p.70-5, 2000.
HILLERTON, J. E. Controle da mastite bovina. In: BRITO, J. R. F. e BRESSAN, M. Controle integrado da mastite bovina. Embrapa-CNPGL: Juiz de Fora, 1996. p.10-52.
HOLANDA JR., MADALENA, F. E., HOLANDA, et al. Impacto econômico da mastite em seis fazendas de Araxá – Minas Gerais, Brasil. Archivos Latinoamerican Product Animal. 2005. v.13, n.2, p.63-69.
HOGAN, J. S. R. J, GALTON, D. M., HARMON, R. J., et al. Protocols to evaluating efficacy of postmilking teat dips. Journal of Dairy Science, v. 73, p. 2580 – 2585, 1990.
JORGE, A. M., ANDRIGHETTO, C., STRAZZA, M. R.B., et al. Correlação entre o Califórnia Mastitis Test (CMT) e a contagem de células somáticas (CCS) do leite de búfalas Murrah. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 34, n.6,p. 2039-2045, 2005.
KONISHI, S., SAWAYA, A. C. H. F., CUSTÓDIO, A. R., et al. Análise da influência de agentes solubilizantes na atividade antimicrobiana de extratos de própolis e de uma formulação de spray hidroalcoólico. 2005 Disponível em: <http://www.apacame.org.br/mensagemdoce/75/artigo.htm> Acesso em: 12/3/2006.
27
KOO, H., ROSALEN, P. L., CURY, J. A., et al. Effect of Apis mellifera propolis from two brazilian regions on caries development in desalivated rats. Caries research, v.33, n.5, p.393-400, 1999.
KOO, H., ROSALEN, P. L., CURY, J. A., et al. Effects of compounds found in propolis on Streptococcus mutans, Antimicrobial agents and chemotherapy, v.46, n.5, p. 1302-1309, 2002.
KOSALEC, I., PEPELJNJAK, S., BAKMAZ, M., et al. Flavonoides analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis products. Acta pharmaceutica Zagreb, v.55, n. 4, p. 423 -430, 2005.
KRIEG, N.R., HOLT, J.G. Bergeys manual of systematic bacteriology. 9. ed. Baltimore: William & Wilkins, 1984.
KROL, N., CZUBA, Z., SCHELLER, S. Anti-oxidant property of ethanolic extract of propolis (EPP) as evaluated by inhibiting the chemiluminescence oxidation of luminal. Biochemistry international., v. 21, p. 593-597, 1990.
KROL W., SCHELLER S., CZUBA Z., MATSUMO T., ZYDOWICZ G., SHANI J., MOS M. Inhibition of neutrophils' chemiluminescence by ethanol extract of propolis (EEP) and its phenolic components. Journal. Ethnopharmacol, v. 55, p. 19-25, 1996.
KUJUMGIEV, A., TSVETKOVA, I., SERKEDJIEVA, Y., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. Journal of Ethnopharmacology, v. 64, p. 235-240. 1999.
LANGONI, H., DOMINGUES, P. F., FUNARI, C. J., et al. Efeito antimicrobano in vitro da própolis. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.48, p. 227-229, 1996.
LEWIN, C.E. Treatment of multiresistant Salmonella infection. The Lancet, v.337, p.47, 1991.
LIANG, Y., HUANG, Y. T., TSAI, S. H., et al. Supression of inducible cyclooxigenase and induciblenitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages. Carcinogenesi, v, 20, n. 10, p. 1945-1952, 1999.
LIMA, C.I.P. Regulamentos técnicos para fixação de identidade e qualidade de própolis. Mensagem Doce, v.52, p.13-14, 1999.
LOGUERCIO,A. P., GROFF, A.C.M., WITT,N.M., et al. Atividade in vitro do extrato de própolis contra agentes bacterianos da mastite bovina. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 41, n.2, p.347-49, 2006.
LONGUINI, R., RAKSA, S. M., OLIVEIRA, A. C.P., et al. Obtenção de extrato de própolis sob diferentes condições e avaliação de sua atividade antifúngica. Revista. Brasileira de Farmacognosia, v.17, n.3, p.388-395, 2007.
LOPES, E. O., VIANA, A. K. M. Controle da mastite em rebanhos leiteiros - enfoque técnico da iniciativa privada. In: BRITO, J. R. F. e BRESSAN, M. Controle integrado da mastite bovina. Embrapa-CNPGL: Juiz de Fora, 1996. p.52- 67.
28
MALDONADO, L. Perfil de los propoleos argentinos. CONGRESO INTERNACIONAL DE PROPOLEOS, 2000. Anais...Congresso internacional de propoleos, Buenos Aires, Argentina, 2000, p11-7.
MARCUCCI, M. C. Propolis: chemical composition, biological properties and terapeutic activity. Apidologie, v. 26, p.83-89, 1995.
MARCUCCI, M. C., WOISKY, R. G., SALATINO. Uso de cloreto de alumínio na quantificação de flavonóides em amostras de própolis. 2005. Disponível em: <http://www.bichoonline.com.br/artigos/apa0014.htm> Acesso em: 6/5/2006.
MASSUDA, K.F. Parâmetros físico-químicos e atividade biológica da própolis submetida a diferentes tipos de extração. Monografia de conclusão de curso, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, Brasil. 2003.
MC CARTNEY, E. A barreira dos antibióticos na União Européia. Entrevista. Ave World, 3, n. 18, p. 8-11, 2005.
MENEZES, H. Própolis: uma revisão dos recentes estudos de suas propriedades farmacológicas. Arquivos Instituto Biologia, v.72, n.3, p.405-411, 2005.
MERESTA, L. and MERESTA, T. Sensitivity of bovine mastitis bacteria to propolis in vitro. Medycyna-weterynaryjna, v.41, p.489-92, 1985.
MIORIN, P. L., LEVY JUNIOR, N. C., CUSTODIO, A. R., et al. Antibacterial activity of honey and propolis from Apis mellifera and Tetragonisca angustula against Staphylococcus aureus. Journal of Applied Microbiology, v. 95, n.5, p.913, 2003.
MIRZOEVA, O. K., CALDER, P. C. The effect of propolis and its components on eicosanoiod production during the inflamatory response. Prastaglandins Leukot Fatty Acids, v.55, p. 441 – 449, 1996.
MIRZOEVA, O.K.; GRISHANIN, P.C.; CALDER, P.C. Antimicrobial action of propolis and some its components: the effects on growth, membrane potential and motility of bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v.152, p.239-46, 1997.
MOURA, L.P.P. 2001. Longevidade, produção de própolis e áreas de desenvolvimento de colméias de Apis mellifera africanizada, submetida a quatro técnicas de coleta, em quatro períodos do ano. Tese de Doutorado, em Zootecnia. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista, Brasil. 111p., 2001.
MULI, E. M., MAINGI, J.M. Antibacterial activity of Apis mellifera L. propolis collected in three regions of Kenya. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, v. 13, n.3, p. 655-663, 2007.
MURAKAMI, F.Y. Utilização do extrato alcoólico de própolis na mastite bovina. Monografia apresentada à Universidade Estadual do Oeste do Paraná como trabalho de conclusão do curso de graduação em Zootecnia. Marechal Cândido Rondon. 2007. 29p.
ORSI, R. O., FUNARI, S. R. C., SOARES, A. M. V. C., et al. Immunomodulatory action of propolis on macrophage activation. Journal of Venomous Animals and Toxins, v.6, n.2, p.205-219, 2000.
29
ORSI, R. O., SFORCIN, J. M , RALL, V. L. M., et al. Susceptibility profile of Salmonella against the antibacterial activity of propolis produced in two regions of Brasil. Journal of Venomous Animals and Toxin including tropical diseases, v.11, n.1, p.109-116, 2005a.
ORSI, R. O., SFORCIN, J. M., FUNARI, S. R. C., et al. Effect of propolis extract on guines pig luna mast cell. Journal of Venomous Animals and Toxins, v.11, n.1, 2005b.
ORSI, R.O.; SFORCIN, J.M.; FUNARI, S.R.C.; FERNANDES JR., A.; BANKOVA, V. Synergistic effect of propolis and antibiotics on the Salmonella Thypi. Brazilian Journal of Microbiology, v.37, p.108-12, 2006.
PARK, Y. K., IKEGAKI, M., ABREU, J. A. S., et al. Estudo da preparação dos extratos de própolis e suas aplicações. Ciência Tecnologia de Alimentos, v.18, n.3, p. 313-318, 1998.
PARK, Y.K; IKEGAKI, M.; ALENCAR, S.M. Classificação das própolis brasileiras a partir de suas características físico-químicas e propriedades biológicas. Mensagem doce, v.58, p.2-7, 2000.
PARK, Y. K., IKEGAKI, M., ALENCAR, S. M. Determinação das atividades citotóxicas e anti HIV dos extratos etanólicos de própolis coletadas em diferentes regiões do Brasil. 2000. Disponível em: <http://www.apacame.org.br/mensagemdoce/56/artigo.htm> Acesso em: 12/3/2006.
PASCHOAL, J. J., ZANETTI, M. M., CUNHA, J. A. Suplementação de selênio e vitamina E sobre a contagem de células somáticas do leite de vacas da raça holandesa. Revista Brasileira de Zootecnia, v.32, n.6, p.2032-2039, 2003.
PAVANELLI, D. M., GALINDO JÚNIOR, J. B., BANDEIRA, M. C. E. Avaliação qualitativa de extratos de própolis do cerrado Sulmatogrossense. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química – SBQ . Anais … 2007.
PEDRINI , S.C.B.; MARGATHO, L.F.F. Sensibilidade de microrganismos patogênicos isolados de casos de mastite clínica em bovinos frente a diferentes tipos de desinfetantes. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.70, n.4, p.391-395, out./dez., 2003.
PEREIRA, A. S., SEIXAS, F. R. M. S., AQUINO NETO, F. R. Própolis: 100 anos de pesquisa e suas perspectivas futuras. Química Nova. 2002. v.25, n.2, p.321-326.
PINTO, M. S., FARIA, J. E., MESSAGE, D., et al. Efeito de extratos de própolis verde sobre bactérias patogênicas isoladas do leite de vacas com mastite. Brazilian Journal of Veterinary Animal Science, v.38, n.6, p. 278-283, 2001.
POPPE, C.; ARYOUD, M.; OLLIS, G.; CHIRINO-TREJO, M.; SMART, N.; QUESSY, S.; MICHEL, P. Trends in antimicrobial resistance of Salmonella isolated from animals, foods of animal origin, and the environment of animal production in Canada, 1994-1997. Microbial Drug resistance, v.7, p.197-212, 2001.
QUINN, P.J., CARTER, M.E., MARKEY, B. et al. Mastitis. In: ____. Clinical Veterinary Microbiology. London: Mosby-Year Book Europe Limited, 1994. Cap.36, p.327 - 344.
30
RIBAS, N.P. Importância da contagem de células somáticas para a saúde da glândula mamária e qualidade do leite. In: SIMPOSIO INTERNACIONAL SOBRE PRODUCAO INTENSIVA DE LEITE, 4., 1999, Caxambu, MG. Anais... São Paulo: Instituto Fernando Costa, 1999. p.36-43.
RUEGG, P. L., PANTOJA, J., APPARAO, D. Treatment of subclinical mastitis infections. XII Cursos novos enfoques na produção e reprodução de bovinos. Uberlandia – MG. Anais...2008.
SALANTINO, A., TEIXEIRA, E. W., NEGRI, G. Origin and chemical variation of brazilian própolis. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, v. 2, n.1, 2005.
SANTOS, F. A., BASTOS, E. M. A. F., MAIA, A. B. R. A., et al. Brazilian propolis: physicochemical properties, plant origin and antibacterial activity on periodontopathogens. Phytotherapy Research,v.17, n.3, p.285-289. 2003.
SANTOS, M. V. Tratamento contra mastite: qual a sua importância em um programa de controle – Parte 2. Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br> 2000. Acesso em: 6/3/2006.
_____ A mastite sub-clínica deve ser tratada durante a lactação? – Parte 1. Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br> 2005a. Acesso em 5/2/2006.
_____ Tratamento da mastite subclínica utilizando terapia simultânea. Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br> 2005b. Acesso em 6/3/2006.
_____ Resistência contra mastite: uma característica cada vez mais procurada Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br> 2005c. Acesso em 6/3/2006.
_____ Utilizando a CCS e a CBT como ferramenta em tempos de pagamento por qualidade do leite. In: CARVALHO, M. P., SANTOS, M. V. Estratégia e competitividade na cadeia de produção de leite. Passo fundo, 2005d, v.1, p. 246-260.
SARGEANT, J. M., LESLLE, E. K., SHILEY, T. J. E., et al. Sensitive and Specificity of Somatic Cell Count and California Mastitis Test for identifying intramamary infeccion in early lactation. Journal Dairy Science, v. 84, p. 2018-2024, 2001.
SARTORI, A., NAGAHASHI, A. M., YOSHIDA, E. L. A., et al. Efeito leshanicida da própolis. IV Congreso Iberolatinoamericano de Apicultura, I Foro Expo-comercial Internacional de Apicultura. Anais… 1994.
SATO, P. M. Inter-relações das características físicas, químicas e biológicas de própolis das regiões sul e sudeste do Brasil. Monografia de conclusão de curso. Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, Brasil. p.52, 2003.
SAWAYA, A. C. H. F., SOUZA, K. S., MARCUCCI, M. C., et al. Analysis of the composition of brazilian propolis extracts by chromatography and evaluation of their in vitro activity against gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, n.35. p. 104-109, 2004.
SCAZZOCCHIO, F., DÁURIA, F. D. D., ALESSANDRINI, D., et al. Multifactorial aspects of antimicrobial activity of propolis. Microbiological research, v. 161, n. 4, p. 327-333, 2006.
31
SCHALM, O.W., NOORLANDER, D.D. Experiments and observations leading to development of the California Mastitis Test. Journal American Veterinary Medical Association, v.130, p.199 - 204, 1957.
SFORCIN, J. M. Efeito da sazonalidade sobre as propriedades imunomoduladora e antibacteriana da própolis e perfil bioquímico de ratos. Tese de Doutorado – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.1996. 59p.
SFORCIN, J. M., NOVELLI, E.L.B., FUNARI, S.R.C. Seasonal effect of Brazilian propolis on seric biochemical variables. Journal of Venomous Animals and Toxins. v.8, p.244-54, 2000.
SFORCIN, J. M., FERNANDES JÚNIOR, A., LOPES, C. A. M., et al. Seasonal effect of brazilian propolis on Candida albicans and Candida tropicalis. Journal of Venomous Animals and Toxins, v. 7, n. 1, p. 139-144, 2001.
SFORCIN, J. M., KANENO, R., FUNARI, S. R. C. Absence of seasonal effect on the immunomodulatory action of Brazilian propolis on natural killer activity. Journal of Venomous Animals and Toxins, v.8, n.1, p. 19-29, 2002.
SFORCIN, J., ORSI, R. O., BANKOVA, V. Effect of propolis, some isolated compounds and its source plant and antibody production. propolis on experimental gastric ulcers in rats. Journal of Ethnopharmacology, v.96, n.3, p.301-305, 2005.
SILVA, E. C. A. Preparo do extrato de própolis legal. 2003 Disponível em: < http://www.apacame.org.br/mensagemdoce/70/artigoprópolis.httm> Acesso em:16/12/2005.
SILVA, E. R., ARAÚJO, A. M., ALVES, F. S., et al. Associação entre California Mastitis Test e a Contagem de Células Somáticas na avaliação da saúde da glândula mamária caprina. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. v.38, n. 1, p.46-48. 2001.
SILVA, R. A., RODRIGUES, A. E., MARCUCCI, M.C.R., et al. Características físico-químicas e atividade antimicrobiana de extratos de própolis da Paraíba, Brasil. Ciência Rural, v. 36, n.6, p. 1842-1848, 2006.
SOUZA, G. N., Mastite, contagem de células somáticas e os novos parâmetros para comercialização do leite cru no Brasil. Circular Técnico 70. Embrapa Gado de Leite: MG. 2005.
SOUZA, J. P. B., FURTADO, N. A. J. C., JORGE, R. et al. Perfis físico-quimico e cromatográfico de amostrar de própolis produzidas nas micro-regiões de Franca (SP) e Passos (MG), Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.17, n. 1, p.85-93, 2007.
SOUZA, J. A. M., GONÇALVES, G. M.S. Avaliação da ação antioxidante de substâncias ativas comésticas destinadas à prevenção da fotoenvelhecimento cutâneo. XIII Encontro de Iniciação Científica da PUC. Anais... 2008.
SPEXOTO, A. A. Aplicação do sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) em propriedades leiteiras. Dissertação de Mestrado. Pirassununga, SP. 157p. 2003.
32
STONER M.C.; FORSYTHE R.; MILLS A.S.; IVATURY R.R.; BRODERICK T.J. Intestinal perforation secondary to Salmonella Typhi: case reported and review of the literature. Amer. Surg, v.66, p.219-22, 2000.
TAKAISI-KIKUNI N.B. and SCHILDER H. Electron microscopic and microcalorimetric investigations of the possible mechanism of the antibacterial action of a defined propolis provenance. Planta Med, v.60, p.222-7, 1994.
TAYLOR, P. W., STAPLETON, P. D., LUZIO, J. P. New ways to treat bacterial infections. Drug Discovery Today. V. 7, n. 21, p. 1086-91. 2002.
TEIXEIRA, E. W., MESSAGE, D., NEGRI, G., et al. Bauer-7-Em-3-YL acetate: a major constituent of unusual samples of brazilian propolis. Química Nova, v.29,n.2, p.245-246, 2006.
THIERS, F. O. Análise do conteúdo de células somáticas de amostras de leite de bovinos leiteiros em diferentes fases da lactação e do tangue de expanção de propriedades produtoras de leite do estado de SP e MG. São Paulo. 1999. Dissertação de Mestrado - USP.
THRELFALL, E.J. Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food and water-borne infections. FEMS Microbiology Reviews, v.26, p.141-8, 2002.
VARGAS, A. C., LOGUERCIO, A. P., WITT, N. M., et al., Atividade antimicrobiana “in vitro”de extrato alcóolico de própolis. Ciência Rural, v. 34, n.1, p.159-163, 2004.VASCONCELOS, A. Produtos ecologicamente responsáveis. Agroecologia Hoje, n.29, p.26. 2005.
VEIGA, V. M. O. Diagnóstico da mastite bovina. Embrapa-CNPGL: Juiz de Fora, 1998. 24p.
VIEIRA-DA-MOTTA, O.; FOLLY, M.M.; SAKYIAMA, C.C.H. Detection of different Staphylococcus aureus strains in bovine milk from subclinical mastitis using PCR and routine techniques. Brazilian Journal of Microbiology. v.32, p.27-31, 2001.
ZAFALON, L. F.; NADER FILHO, A.; OLIVEIRA, J.V.; RESENDE, F.D. Comparação entre o Califórnia mastits test e a contagem de células somáticas como métodos auxiliares para o diagnóstico da mastite subclínica bovina por Staphylococcus aureus e Corynebacterium spp. Boletim de Indústria Animal, v. 62, n. 1, p.63-69, 2005.
ZAR, J. H. Bioestatistical analysis. 1999. 4 ed. Pretince Hall: New Jersey, 663p.
33