Utilização de Utilização de Polimorfismos em Polimorfismos em Análises ForensesAnálises Forenses

Emmanuella RodriguesEmmanuella Rodrigues

Relembrando...Relembrando... Polimorfismo GenéticoPolimorfismo Genético É a coexistência de É a coexistência de

alelos múltiplos em um lócus cromossômico; alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas.entre as pessoas.

Polimorfismo de sítio de restrição (Polimorfismo de sítio de restrição (RFLPRFLP)) Polimorfismo de nucleotídeo único (Polimorfismo de nucleotídeo único (SNPSNP)) Polimorfismos de inserção/deleção (Polimorfismos de inserção/deleção (indelsindels)) Polimorfismos de minissatélites (Polimorfismos de minissatélites (VNTRVNTR)) Polimorfismos de microssatélites (Polimorfismos de microssatélites (STRSTR))

Qual a importância desses Qual a importância desses polimorfismos?polimorfismos?

Fonte de variabilidade;

Permitem construir um perfil genético indivíduo-específco “DNA fingerprint”;

importante em Medicina Forense

Por que analisar tais Por que analisar tais polimorfismos no DNA?polimorfismos no DNA?

Determinação de paternidade;Determinação de paternidade; Resolução de casos criminais envolvendo: Resolução de casos criminais envolvendo:

Estupro;Estupro;Homicídio;Homicídio;Rapto;Rapto;Troca ou abandono de crianças.Troca ou abandono de crianças.

De onde pode ser extraído o DNA?De onde pode ser extraído o DNA?

Sangue Sangue padrão-ouro; padrão-ouro; células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas

de cigarro, selos e envelopes, gomas de de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...;mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...;

Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar);capilar);

Unhas;Unhas; Esfregaços;Esfregaços;

De onde pode ser extraído o DNA?De onde pode ser extraído o DNA?

Manchas de material biológico: líquido seminal, Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue;urina, saliva, sangue;

Tecidos de biópsias cirúrgicas;Tecidos de biópsias cirúrgicas; Ossadas (carbonizadas ou não);Ossadas (carbonizadas ou não); Tecidos mumificados ou congelados;Tecidos mumificados ou congelados; Células deixadas por impressão digital;Células deixadas por impressão digital; Dentes;Dentes; outrasoutras

Como extrair o DNA?Como extrair o DNA?

Técnicas específicas para cada tipo de Técnicas específicas para cada tipo de amostra;amostra;

CUIDADO:CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraído quantidade de DNA extraído

Métodos disponíveis para Métodos disponíveis para utilização:utilização:

VNTRs estudados com sondas multilocais;VNTRs estudados com sondas multilocais;

STRs estudados com PCR;STRs estudados com PCR;

DNA mitocondrial (mtDNA);DNA mitocondrial (mtDNA);

STRs do Cromossomo Y;STRs do Cromossomo Y;

Técnicas mais recentes.Técnicas mais recentes.

VNTRs estudados com sondas VNTRs estudados com sondas multilocaismultilocais

Princípio do método: após clivagem por Princípio do método: após clivagem por endonucleases, cada indivíduo tem um endonucleases, cada indivíduo tem um padrão de bandas específico com tamanhos padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela presença, ou não, do sítio determinados pela presença, ou não, do sítio da enzima e pela quantidade de repetições da enzima e pela quantidade de repetições em tandem. Para que possa-se visualizar, em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqüência invariável.sondas radioativas de seqüência invariável.

VNTRs estudados com sondas VNTRs estudados com sondas multilocaismultilocais

Técnica de custo razoável;Técnica de custo razoável; DNA não degradado;DNA não degradado; Quantidade suficiente de DNA;Quantidade suficiente de DNA; Várias dificuldades inerentes à técnica.Várias dificuldades inerentes à técnica.

VNTRs estudados com sondas VNTRs estudados com sondas multilocaismultilocais

Teste de paternidade:Teste de paternidade:

VNTRs estudados com sondas VNTRs estudados com sondas multilocaismultilocais

 

Identificação de um criminoso:Identificação de um criminoso:

STRs estudados com PCRSTRs estudados com PCR

Princípio do método: Reação de PCR Princípio do método: Reação de PCR utilizada para copiar extensivamente utilizada para copiar extensivamente várias regiões de STR, fornecendo várias regiões de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqüenciamentopoliacrilamida ou por seqüenciamento

STRs estudados com PCRSTRs estudados com PCR

Recuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidosRecuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidos

Amostra (tecidos e Amostra (tecidos e fluidos)fluidos)

Quantidade Quantidade recuperadarecuperada

Análise de RFLPAnálise de RFLP Análise de STRAnálise de STR

1mL de sangue1mL de sangue 20 a 4020 a 40gg SIMSIM SIMSIM

Manchas de Manchas de sangue seco de sangue seco de 1cm1cm33

200ng200ng NÃONÃO SIMSIM

SêmenSêmen 150 a 300150 a 300g por g por mLmL

SIMSIM SIMSIM

Sêmen (esfregaço Sêmen (esfregaço vaginal pós-coito)vaginal pós-coito)

0 a 30 a 3g (DNA dos g (DNA dos espermatozóides)espermatozóides)

SIMSIM SIMSIM

Cabelo com raiz Cabelo com raiz (contendo bulbo (contendo bulbo capilar)capilar)

1 a 750ng por fio1 a 750ng por fio NÃONÃO SIMSIM

SalivaSaliva 1 a 101 a 10gpor mLgpor mL SIMSIM SIMSIM

Retirado de “Os exames de DNA nos Tribunais”, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº 169 - março/2001)

Vantagem sobre a técnica de VNTR: Vantagem sobre a técnica de VNTR: como o DNA é “amplificado”, a amostra a como o DNA é “amplificado”, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor.inicial muito menor.

Mesmo existindo contaminação por DNA Mesmo existindo contaminação por DNA de outras espécies, a técnica de PCR é de outras espécies, a técnica de PCR é específica o suficiente para amplificar específica o suficiente para amplificar apenas o DNA humanoapenas o DNA humano

STRs estudados com PCRSTRs estudados com PCR

OBS: Quantas regiões são necessárias?OBS: Quantas regiões são necessárias?

mtDNAmtDNA

Características importantes:Características importantes: Também contém regiões polimórficas que Também contém regiões polimórficas que

permitem a “individualização”;permitem a “individualização”; Descendentes recebem apenas da mãe Descendentes recebem apenas da mãe permite permite

traçar a linhagem materna de uma pessoa;traçar a linhagem materna de uma pessoa; É mais resistente à degradação que o DNA É mais resistente à degradação que o DNA

nuclear.nuclear. taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que

a do DNA nuclear a do DNA nuclear poucos mecanismos de poucos mecanismos de reparo permitem que as variações nos reparo permitem que as variações nos nucleotídeos sejam acumuladasnucleotídeos sejam acumuladas

Princípio do método: Reação de PCR com Princípio do método: Reação de PCR com o objetivo de copiar extensivamente o objetivo de copiar extensivamente regiões polimórficas presentes no DNA regiões polimórficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento sequenciamento

mtDNAmtDNA

mtDNAmtDNA

Utilizado quando a amostra em questão tem Utilizado quando a amostra em questão tem uma quantidade pequena ou não tem DNA uma quantidade pequena ou não tem DNA nuclear;nuclear;

mtDNAmtDNA

Utilizado na identificação de corpos em Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres grandes desastres comparar a seqüência comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos;irmãos ou ascendentes maternos;

Identificação de maternidade sem o pai (p/ Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas)filhos e filhas)

Não identifica um indivíduo específico;Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos.Estudos históricos ou evolutivos.

mtDNAmtDNA

STRs crYSTRs crY

Características importantes:Características importantes:Também contém regiões polimórficas que permitem a Também contém regiões polimórficas que permitem a

“individualização”;“individualização”;Homens recebem apenas do pai Homens recebem apenas do pai permite traçar a permite traçar a

linhagem paterna de um homem;linhagem paterna de um homem;Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre

os 2 cromossomos.os 2 cromossomos.

STRs crYSTRs crY

STRs crYSTRs crY

Identificação de paternidade sem o pai (p/ Identificação de paternidade sem o pai (p/ filhos);filhos);

Elucidação de estupro (mistura de DNA);Elucidação de estupro (mistura de DNA); Não identifica um indivíduo específico;Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos;Estudos históricos ou evolutivos;

Técnicas mais recentesTécnicas mais recentes

SNPsSNPs Minisseqüenciamento;Minisseqüenciamento; São muito numerosos;São muito numerosos; Baixa taxa de mutação;Baixa taxa de mutação; Requer maior nº de marcadores;Requer maior nº de marcadores;

IndelsIndels

Estudados em produtos de amplificação muito curtos (50pb ou menos) vantagem sobre STRs em estudos de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em estado avançado de decomposição ou carbonizado)

E no futuro...E no futuro...

Bancos completos de perfil de criminosos Bancos completos de perfil de criminosos OBS: OBS: InglaterraInglaterra CODIS – Combined DNA Index System (1994)CODIS – Combined DNA Index System (1994)

Amostra de DNA Amostra de DNA “retrato falado” “retrato falado”