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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E TOXICOLOGIA
APLICADA
HOMOCISTENA EM PACIENTES COM DOENA DE PARKINSON:
FATORES DETERMINANTES DE SUA CONCENTRAO PLASMTICA
Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre em Gentica e Toxicologia Aplicada
ELISEU FELIPPE DOS SANTOS
Orientador: Prof. Dr. Moacir Wajner
CANOAS 2007
Livros Grtis
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Milhares de livros grtis para download.
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Este trabalho foi desenvolvido nas instalaes do Laboratrio de Erros Inatos do Metabolismo da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), sendo financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e ULBRA.
3
Dedico este trabalho a minha querida
esposa e amiga Denise, que sempre me
incentivou e apoiou em minhas escolhas.
4
AGRADECIMENTOS
Os teus olhos me viram como substncia ainda informe, e no teu livro
foram escritos todos os meus dias, cada um deles escrito e determinado,
quando nenhum deles havia ainda.
Salmo 139:16
Agradeo a Deus por tudo que sou e pelo que aprendi e aprenderei ao longo
da vida.
Agradeo a minha Famlia de sangue e de f.
Ao Magnfico Reitor Ruben Eugen Becker, que com a coragem,
espiritualidade, sabedoria e discernimento conduz brilhantemente a Universidade
Luterana do Brasil.
Na pessoa da Prof. Dr. Heloisa Helena Rodrigues de Andrade,
Coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Toxicologia
Aplicada, agradeo a todos os queridos professores, que no foram somente
mestres, mas muito mais que isso, foram e continuam sendo amigos especiais.
A todos os colegas da Gentica e Toxicologia Aplicada pelo convvio
respeitoso e amigvel.
A gentil e atenciosa Srt. Fernanda Kieling Moreira, secretria do curso de
Ps-Graduao em Gentica e Toxicologia Aplicada.
Ao querido amigo Alexandre Gomes de Melo, pelo apoio e grande ajuda.
Ao querido amigo, deixo de lado todos seus ttulos para cham-lo apenas de
amigo: simptico, acolhedor, orientador, protetor, benigno, companheiro, e colega
da nossa querida ATM 73 FMUFRGS Prof. Dr. Moacir Wajner.
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SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
1. INTRODUO 19
1.1 DOENA DE PARKINSON 19
1.2 FATORES DE RISCO DA DOENA DE PARKINSON 21
1.3 MANIFESTAES CLNICAS 24
1.4 ETIOLOGIA (CAUSAS GENTICAS E AMBIENTAIS) 24
1.4.1 Radicais Livres 24
1.4.2 Estresse Oxidativo 25
1.4.3 Disfuno Mitocndrial 25
1.5 ACHADOS NEUROPATOLGICOS 26
1.5.1 Corpos de Lewy 27
1.5.2 Dopamina 28
1.6 TRATAMENTO 30
1.6.1 Levopoda 30
1.6.2 Carbipoda / Levopoda 31
1.6.3 Agonistas da Dopamina 31
1.6.4 Inibidores de MAO B 32
1.6.5 Inibidores da COMT 32
1.6.6 Amandatina 33
1.6.7 Anticolinrgicos 33
1.7 HOMOCISTENA 33
1.7.1 Metabolismo da Homocistena 35
1.7.2 Hiperhomocisteinemia 37
1.7.3 Homocistena e doenas Neurolgicas 39
1.8 CIDO FLICO 41
1.8.1 Metabolismo do cido Flico 44
1.8.2 cido Flico e Neurodegenerao 48
6
1.9 VITAMINA B 12 49
1.9.1 Metabolismo da Vitamina B12 50
1.9.2 Deficincia de Vitamina B12 e Neurodegenerao 53
2. OBJETIVOS 55
2.1 GERAL 55
2.2 ESPECFICOS 55
3. MATERIAL E MTODOS 56
3.1 MATERIAL 56
3.2 MTODOS 57
3.2.1 Determinao dos nveis plasmticos de Homocistena (Hcy) 57
3.2.2 Determinao dos nveis sricos cido flico, Vitamina B12, Uria,
Creatinina e cido rico 58
3.3 ANLISE ESTATSTICA 60
3.4 ASPECTOS TICOS 61
4. RESULTADOS 62
4.1 Caracterizao da amostra (controles e pacientes com doena de Parkinson)
quanto idade, sexo, estado civil, hipertenso arterial sistmica, cardiopatia
isqumica, diabete mlito, insuficincia renal, uso de tabaco e bebidas alcolicas
62
4.2 Comparao entre as concentraes sricas de homocistena, vitamina B12,
cido flico, uria, creatinina, cido rico e a idade em pacientes com a doena
de Parkinson em controles normais 63
4.3 Influncia do sexo e do uso de bebidas alcolicas sobre as concentraes
sricas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido rico
em pacientes com a doena de Parkinson e em controles normais 68
4.4. Influncia da hipertenso arterial sistmica, diabete mlito e uso de tabaco
sobre as concentraes sricas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria,
creatinina e cido rico em pacientes com a doena de Parkinson e em controles
normais 72
7
4.5. Influncia dos nveis sricos de cido flico sobre os nveis plasmticos de
homocistena em pacientes com doena de Parkinson e em indivduos normais 80
4.6 Influncia dos nveis sricos de homocistena sobre os nveis de cido flico,
vitamina B12, uria, creatinina e cido rico, bem como sobre a idade em
pacientes com doena de Parkinson 81
4.7 Influncia do uso de L-dopa sobre os nveis plasmticos de homocistena,
cido flico e vitamina B12 em pacientes com doena de Parkinson 82
4.8 Influncia do tempo de durao da doena sobre as concentraes
plasmticas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido
rico em pacientes com doena de Parkinson 83
4.9 Correlao entre as concentraes sricas de homocistena com as de
vitamina B12, cido flico, uria, creatinina, cido rico, bem como com a idade, o
peso, a altura, o ndice de massa corporal em pacientes com a doena de
Parkinson e em controles normais 84
5. DISCUSSO 93
6. CONCLUSES 101
REFERNCIAS 103
ANEXO I 114
ANEXO II 119
8
LISTA DE ABREVIATURAS
-CBT -Cetobutirato
AA Aminocidos
Ado B12 5Desoxiadenosil-Cobalamina
AG cidos Graxos
ATP Adenosina Trifosfato
AVC Acidente Vascular Cerebral
B2 Vitamina B2
B6 Vitamina B6
B9 Vitamina B9
B12 Vitamina B12
BHMT Homocistena Betana Metil Transferase
C677T Mutao da Enzima MTHFR (Metilenetetrahidrofolato redutase)
Cbl Cianocobalamina
CBS Cistationina Sintase
CH3THF Metiltetrahidrofolato
CIS Cistena
CL Corpos de Lewy
COMP Catecol-o-metiltransferase
CoQ10 Coenzima Q10
Cu Cobre
CYS Cistationina
DA Doena de Alzheimer
DCL Demncia com Corpos de Lewy
DHFR Dihidrofolato Redutase
DNA cido Desoxirribonuclico
DOPAC cido Dihidroxifenilactico
DP Doena de Parkinson
DTMP Timidinamonofosfato
9
DTN Defeito do Tubo Neural
DTT Ditiotreitol
DUMP Deoxiuridinamonofosfato
EDTA cido Etileno-Diamino-Tetra-Actico
FI Fator Intrinseco
GHS Glutatio Reduzido
GLI Glicina
H2O gua
H2O2 Perxido de Hidrognio
HAS Hipertenso Arterial Sistmica
HCY Homocistena
Hg Mercrio
HHCY Hiperhomocistenemia
HIV Vrus da Imunodefincia Humana
HVA cido Homovanlico
LCR Lquido Cefaloraquidiano
L-Dopa Levodopa
MAO Monoamidoxidase
MAO-B Monoaminoxidase B
Met Metionina
Metila-B12 Metilcobalamina
MMA cido Metilmalnico
Mn Mangans
MPP+ 1 Metil-4-Fenilpiridina
MPTP 1 Metil 4 Fenil 1, 2, 3, 6 Tetrahidropiridina
MS Metionina Sintase
MTH Metiltetrahidrofolato
MTHFR Metilenetetrahidrofolato Redutase
NAD+ Nicotinamida Adenina Nucleotdeo (Forma Oxidada)
NADH Nicotinamida Adenina Nucleotdeo
NADPH Nicotinamida Adenina Nucleotdeo Fosfato
10
O2 - Radical Superxido
OH - Radical Hidroxila
P5P Piridoxal 5Fosfato
R5P Riboflavina 5Fosfato
RL Radical Livre
RNA cido Ribonuclico
SAH S-Adenosilhomocistena
SAM S-Adenosilmetionina
SER Serina
SNC Sistema Nervoso Central
THF ou FH4 Tetrahidrofolato
11
LISTA DE FIGURAS
Figura I.1. Sistema Dopaminrgico no Crebro Humano 21
Figura I.2. Principais Vias do Metabolismo da Dopamina no Crebro 28
Figura I.3. Biosntese das Catecolaminas 29
Figura I.4. Aminocidos Sulfurosos e suas Estruturas Qumicas 34
Figura I.5. Metabolismo da Homocistena. SAM, S-Adenosil Metionina; SAH, S-
Adenosilhomocistena; HCY, Homocistena; Met, Metionina; Gly, Glicina, THF,
Tetrahidrofolato, MTHF, 5 Metiltetrahidrofolato; GSH, Glutatio Reduzido 36
Figura I.6. Estrutura Qumica do cido Flico 42
Figura I.7. Reduo do Folato (F) a Dihidrofolato (FH2) e, em seguida, a
Tetrahidrofolato (FH4), pela Enzima Dihidrofolato-redutase (DHFR) 44
Figura I.8. Absoro e ativao do Folato no Intestino 45
Figura I.9. Transferncia do grupo metila com a participao do Folato 47
Figura I.10. Metabolismo da metionina com a participao do cido Flico 48
Figura I.11. Estrutura da Vitamina B12 49
Figura I.12. Participao da Vitamina B12 no Metabolismo do Folato 51
Figura I.13. Formao de Sucinil-CoA 52
Figura IV.1. Nveis plasmticos de Homocistena (Hcy) em controles saudveis e
pacientes com doena de Parkinson(DP) 68
Figura IV.2. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e a
idade dos pacientes com doena de Parkinson 85
Figura IV.3. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os
nveis sricos de cido rico em pacientes com doena de Parkinson 86
Figura IV.4. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os
nveis sricos de cido Flico em pacientes com doena de Parkinson 87
Figura IV.5. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os
nveis sricos de Vitamina B12 em controles normais 88
12
LISTA DE TABELAS
Tabela I.1. Doses Recomendadas de Folato 44
Tabela IV.1. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
ao Sexo 64
Tabela IV 2. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
Raa 64
Tabela IV 3. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
ao Estado Civil 64
Tabela IV 4. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
Hipertenso Arterial Sistmica (HAS) 65
Tabela IV 5. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
a Cardiopatia Isqumica 65
Tabela IV 6. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
Diabete Mlito 65
Tabela IV 7. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
ao uso de Tabaco 66
Tabela IV 8. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto
ao uso do lcool 66
Tabela IV 9. Comparao entre as concentraes sricas de Homocistena,
Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e idade em pacientes
com doena Parkinson e controles normais 67
Tabela IV 10. Influncia do sexo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,
Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em pacientes
com doena de Parkinson 69
Tabela IV 11. Influncia do sexo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,
Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em controles
normais 70
Tabela IV 12. Influncia do uso de bebidas alcolicas sobre os nveis plasmticos
da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a
idade em pacientes com doena de Parkinson 71
13
Tabela IV 13. Influncia do uso de bebidas alcolicas sobre os nveis plasmticos
da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a
idade em controles normais 72
Tabela IV 14. Influncia da Hipertenso Arterial Sistmica (HAS) sobre os nveis
Sanguneos de Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina,
cido rico e a idade em pacientes com doena de Parkinson 74
Tabela IV 15. Influncia da Hiperteno Arterial Sistmica (HAS) sobre os nveis
plasmticos da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina,
cido rico e a idade em controles normais 75
Tabela IV 16. Influncia da Diabete Mlito sobre os nveis plasmticos da
Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a
idade em pacientes com doena de Parkinson 76
Tabela IV 17. Influncia da Diabete Mlito sobre os nveis plasmticos da
Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a
idade em controles normais 77
Tabela IV 18. Influncia do fumo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,
Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em controles
normais 78
Tabela IV 19. Influncia do fumo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,
Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em pacientes
com doena de Parkinson 79
Tabela IV 20. Comparao entre os nveis plasmticos de Homocistena em
pacientes com doena de Parkinson e controles normais com concentraes
sricas de cido Flico inferiores ou superiores a 13 ng/mL 81
Tabela IV 21. Efeitos dos nveis plasmticos de Homocistena sobre as
concentraes sricas de cido Flico, Vitamina B12, Uria, Creatinina, cido
rico e a idade dos pacientes com doena de Parkinson 82
Tabela IV 22. Influncia do uso de L-DOPA sobre os nveis plasmticos de
Homocistena, Vitamina B12 e cido Flico em pacientes com doena de
Parkinson 83
14
Tabela IV 23. Influncia do tempo de durao da doena sobre as concentraes
plasmticas de Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina e
cido rico em pacientes com doena de Parkinson 89
Tabela IV 24. Correlao entre as concentraes sanguneas de Homocistena (
mol/L) com as de Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico, bem
como a idade em pacientes com doena de Parkinson 90
Tabela IV 25. Correlao entre as concentraes plasmticas de Homocistena
(mol/L) com as de Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina e cido rico,
bem como a idade em controles normais 91
Tabela IV 26. Regresso mltipla entre os nveis plasmticos de Homocistena
(varivel dependente) com a idade e as concentraes sricas de Vitamina B12 e
cido Flico (variveis independentes) em controles normais 92
Tabela IV 27. Regresso mltipla entre os nveis plasmticos de homocistena
(varivel dependente) com a idade e as concentraes sricas de vitamina B12 e
cido flico (variveis independentes) em pacientes com doena de Parkinson
92
15
RESUMO
A doena de Parkinson (DP) uma doena neurolgica de etiologia
multifatorial. caracterizada por degenerao progressiva dos neurnios
dopaminrgicos da substncia nigra caracterizados pelo alto contedo de
dopamina. A doena somente se manifesta quando h perda (morte) de 75%
destes neurnios. Vrios fatores adquiridos, tais como exposio ambiental a
pesticidas, metais e hidrocarbonetos, disfuno mitocondrial, alteraes
relacionadas com a sntese, transporte e metabolismo da dopamina e a formao
de radicais livres parecem estar envolvidos com o dano e morte dos neurnios da
substncia nigra na DP. Mutaes no gene da alfa-sinuclena podem tambm ser
encontradas em uma parcela de afetados pela DP. Tendo em vista que alguns
trabalhos da literatura mostraram que o aminocido homocistena (Hcy)
apresenta-se com concentraes elevadas no sangue de pacientes com DP, o
presente trabalho visou verificar os nveis plasmticos no somente de Hcy, mas
tambm de vitamina B12 e cido flico, e determinar os fatores envolvidos com as
alteraes destes nveis, como o fumo, lcool, hipertenso arterial sistmica,
diabete mlito, cardiopatia isqumica, ingesto de L-DOPA, durao da doena e
outros. Enfatize-se que as associaes verificadas at agora entre os nveis de
Hcy no plasma de pacientes afetados por DP ainda no esto bem esclarecidas e
no estabeleceram se a Hcy fator causador da disfuno neurolgica ou apenas
um marcador dessa doena decorrente de alteraes de outros fatores.
Verificamos inicialmente que a Hcy estava aumentada em cerca de 30 % nos
afetados por DP, relativamente aos controles da mesma idade, sem qualquer
alterao nos nveis sricos de vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido
rico. Verificamos tambm que o uso de fumo estava associado com uma
deficincia de cido flico nestes pacientes e nos controles normais e, que a
deficincia desta vitamina estava inversamente associada ao aumento dos nveis
de Hcy. Os nveis plasmticos de Hcy estavam tambm inversamente
correlacionados com os de vitamina B12 e positivamente com a idade nos
pacientes com DP. J nos controles, a nica correlao significantiva foi dos
16
nveis de Hcy com os de vitamina B12 de forma inversa. Verificamos ainda
atravs de regresso mltipla que nos pacientes com DP o maior determinante
dos nveis plasmticos de Hcy foram os nveis de cido flico, enquanto que nos
controles normais foram os de vitamina B12. Alm disso, na comparao entre
pacientes e controles, a diferena dos nveis plasmticos de Hcy entre esses dois
grupos se acentuava (esses nveis aumentavam mais ainda nos pacientes)
quando os nveis de cido flico eram mais baixos. Observamos tambm em
nosso estudo que o uso de lcool, a diabete mlito, a hipertenso arterial
sistmica, a cardiopatia isqumica, o sexo, o uso de L-DOPA e a durao da
doena no alteraram os nveis plasmticos de Hcy, cido flico e vitamina B12
nos pacientes. Desta forma, tendo em vista os efeitos deletrios da Hcy sobre o
sistema nervoso central, preconiza-se que nos pacientes com DP seja
administrado cido flico para que os nveis de Hcy se normalizem, deixando de
ser um possvel agente neurotxico que juntamente com outros determinam uma
pior evoluo da doena.
17
ABSTRACT
Parkinsons disease (PD) is a neurological disorder of multifactorial etiology.
It is characterized by progressive degeneration of dopaminergic neurons of the
substantia nigra, which contains high amounts of dopamine. The disease is
clinically manifested when 75 % or more of these neurons are lost. Various
acquired factors, such as environmental exposure to pesticides, metals and
hydrocarbonides, mitochondrial dysfunction, deficient synthesis, transport or
metabolism of dopamine and free radical generation are involved in the damage
and death of substantia nigra neurons. Mutations in the alpha-sinuclein gene may
also be found in affectted patients with PD. Since some reports have shown that
the blood concentrations of the amino acid homocysteine (Hcy) are increased in
patients with PD, the present work aimed to measure the plasma levels of Hcy, as
well as vitamin B12 and folic acid, and to determine the factors involved in
alteration of these levels, such as smoke, hypertension, diabetes mellitus,
isquemic cardiopathy, L-DOPA and others. It should be emphasized that the
associations observed so far between Hcy plasma levels in patients with PD did
not establish whether Hcy causes neurological dysfunction or is a marker of this
disorder due to other factors. We initially observed that plasma Hcy levels were
increased at around 30 % in patients affected by PD compared to age matched
controls, without modifications on serum concentrations of vitamin B12, folic acid,
urea, creatinine and uric acid between these groups. We also verified that smoke
was associated with a deficit of folic acid in PD patients and in controls and that
deficiency of this vitamin was inversely correlated to the increase of Hcy levels.
Plasma Hcy levels were also inversely correlated with those of vitamin B12 and
positively correlated with the age of the patients. In controls, we found an inverse
correlation between plasma Hcy levels and vitamin B12 concentrations. We also
found that the major determinant of plasma Hcy levels in PD patients were folic
acid, whereas in the controls was vitamin B12. Besides, the difference between
plasma Hcy concentrations in PD patients and controls increased when serum
folic acid concentrations were low. We also observed in our investigation that
alcool, diabetes mellitus, hypertension, isquemic cardiopathy, sex, L-DOPA and
18
duration of the disease did not alter plasma Hcy, folic acid and vitamin B12 levels
in the patients. Therefore, considering the deleterious effects of Hcy on the central
nervous sytem, we postulate that folic acid should be supplemented to patients
affected by PD in order to normalize plasma Hcy levels, therefore avoiding a
possible neurotoxic agent that together with others determine a worse evolution of
this disease.
19
1. INTRODUO
1.1. Doena de Parkinson
A doena de Parkinson (DP) uma doena neurolgica de etiologia
multifatorial dependente da idade, bem como de fatores ambientais e genticos.
Foi descrita pela primeira vez, em 1817, pelo mdico ingls James Parkinson.
caracterizada por degenerao progressiva dos neurnios dopaminrgicos na
substncia negra, causando perda da pigmentao da substncia. Os neurnios
da substncia nigra contm quantidades altas de dopamina, sendo necessrio
que ocorra aproximadamente uma perda de mais ou menos 75% da dopamina ou
neurnios que contem dopamina, para que ocorram sintomas da DP. H uma
perda de axnios, que partem desta regio e se projetam para o neoestriado. A
leso da via dopaminrgica nigroestrial determina diminuio da transmisso
dopaminrgica no corpo estriado, especialmente no putmen (MARJAMA-LYONS
E SHOMON, 2003).
Vrios fatores adquiridos so suspeitos de estarem envolvidos com a DP,
tais como exposio ambiental a pesticidas, metais e hidrocarbonetos, disfuno
mitocondrial, alteraes relacionadas com a sntese, transporte e metabolismo da
dopamina e a formao de radicais livres (MOLACE et al. 2003; KLODOWSKA
DUDA et al 2005).
Em uma parcela de portadores de DP observa-se mutao no gene da
alfa-sinuclena, o que acarreta alterao molecular da protena, fazendo com que
haja agregaes anmalas entre protenas da mesma ou de outras classes.
Conforme estudos, em alguns grupos familiares portadores de doena de
Parkinson familial, pde-se observar uma importante mutao no gene da alfa-
sinuclena. Esta protena atpica possui uma substituio de uma alanina e uma
treonina na posio 53 (A53T). Uma hiptese proposta para explicar o surgimento
dos Corpos de Lewy (CL) seria que essa alterao molecular predisporia a alfa-
sinuclena a agregar-se entre outras protenas da mesma classe ou entre
20
protenas de outras classes (por exemplo: subunidades neurofibrilares)
(POLYMEROPOULOS et al., 1997). No entanto, em outro estudo, Higuchi et al.
(1998) avaliaram a presena dessa mutao (A53T) em 329 casos espordicos
de doena de Parkinson (DP), Demncia com Corpos de Lewy (DCL) e doena de
Alzheimer e sua presena no foi observada em nenhum dos casos, o que sugere
o no envolvimento dessa mutao nessas doenas neurolgicas.
O termo parkinsonismo se refere a qualquer condio de anormalidade de
movimentos, com destruio dos neurnios dopaminrgicos, semelhantes DP.
O parkinsonismo secundrio pode ser causado por vrias situaes, tais como
acidente vascular cerebral, encefalite ou meningite. Outras doenas neuro
degenerativas tais como a paralisia supranuclear progressiva, a degenerao
corticoestriatal, podem tambm lesar esses neurnios dopaminrgicos, causando
essa patologia. Medicaes tais como o haloperidol, metoclopramida, fenotiazina,
pimozide, cinarizina, flunarizina, reserpina e alfametildopa so outras causas
comuns de parkinsonismo secundrio. Substncias txicas (MPTP, Cu, Mn, Hg),
acidentes vasculares, traumticos e tumores cerebrais tambm so causas de
parkinsonismo secundrio. Causas menos freqentes de parkinsonismo
secundrio incluem overdose de narcticos ou anestsicos utilizados em cirurgia,
exposio a toxinas e envenenamento por monxido de carbono, quando esses
agentes lesam os neurnios dopaminrgicos. O parkinsonismo secundrio
causado por antipsicticos geralmente reversvel, mas aquele causado por
toxinas, infeces, drogas ou outras doenas com dano cerebral podem no ser
reversveis. Os sintomas de parkinsonismo incluem a rigidez de tronco, braos,
pernas e regio facial, tremor fino, algumas formas de paralisia e anormalidades
de movimentos. O parkinsonismo secundrio mais freqentemente se associa a
dficit cognitivo resultando em demncia (HANG. et al, 2004)
Em resumo, fatores ambientais, exposio a substncias txicas,
alteraes genticas, alteraes hormonais e outros fatores tambm podem
desencadear a DP. A figura I.1 mostra o sistema dopaminrgico no crebro
humano, distinguindo a localizao da substncia nigra.
21
Figura I.1. Sistema Dopaminrgico no Crebro Humano
1.2. Fatores de Risco da doena de Parkinson
Sexo
A DP afeta ambos os sexos, mas vrios estudos encontraram a DP com
predominncia maior em homens. Na China, a DP ocorre trs vezes mais em
homens do que em mulheres (MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).
Outro estudo envolvendo africanos, hispnicos e caucasianos demonstrou
menor incidncia de DP em mulheres. Uma pesquisa mostrou um aumento de
duas vezes mais DP em homens italianos do que em mulheres italianas
(MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).
O hormnio estrgeno pode atuar como agente neuroprotetor das clulas
dopamnicas do crebro, evitando a morte das mesmas.
Fonte: DAVIS & GECK, 1974
22
Em mulheres portadoras de DP, observa-se menopausa precoce e baixa
reposio hormonal ps-menopausa (HIRAYAMA, 2006).
Idade
O envelhecimento est associado ao aumento do risco de adquirir-se a DP.
A incidncia da doena, para pessoas com idade inferior a 50 anos, de 10 por
100.000, entretanto a incidncia aumenta para 200 por 100.000 em pessoas com
idade entre 60 a 80 anos.
Estima-se que 5% a 10% de pacientes com DP experimentaram os
primeiros sintomas antes dos 45 anos e o pico da incidncia dos sintomas entre
55 e 60 anos. O nmero de pessoas diagnosticadas com DP diminui depois dos
80 anos, mostrando que no s o envelhecimento que leva DP (HIRAYAMA,
2006).
Etnia
Estudos mostram que h uma prevalncia maior da DP na populao
caucasiana, em torno de 100 a 300 casos por 100.000 pessoas na Amrica do
Norte e Europa. Na sia e na frica a prevalncia menor, com 50 casos por
100.000. Entretanto recentes estudos com imigrantes asiticos e africanos,
residentes na Amrica do Norte, mostram uma prevalncia e incidncias
semelhantes aos caucasianos americanos, mostrando a importncia do meio
ambiente e de outros fatores (HIRAYAMA, 2006).
Geografia
A DP mais predominante em certas regies. As causas podem ser muitas
e devem ser mais bem estudadas. Neste particular, 31 por 100.000 pessoas, que
residem na Lbia so portadores de DP, enquanto em Bombaim, na ndia, as
taxas so de 328 por 100.000 pessoas. Alm disso, h um aumento da incidncia
23
de DP em pessoas que vivem no meio rural que pode, possivelmente, estar
relacionado com o contato com herbicidas e outras substncias txicas
(MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).
Produtos Txicos
Herbicidas e pesticidas, drogas, alumnio, metais pesados (cobre, chumbo,
ferro, mangans), monxido de carbono, solventes orgnicos e outras
substncias txicas desencadeiam morte das clulas dopamnicas levando o
aparecimento da DP.
MPTP 1 Metil 4 Fenil 1,2,3,6 Tetrahidropiridina
Em 1982, um grupo de viciados jovens na Califrnia repentinamente
desenvolveu uma forma grave de DP (Sndrome do Viciado Congelado) e a causa
foi atribuda MPTP (1 metil 4 fenil 1,2,3,6, tetrahidropiridina), droga substituta da
herona, que causou a destruio irreversvel dos neurnios dopaminrgicos
nigroestriatais.
A droga MPTP metabolizada pela MAO-B (monoaminoxidase B)
produzindo MPP+ e altas taxas de Radicais livres (RL), diminuindo formao de
ATP, devido inibio da enzima NADH (nicotinamida adenina nucleotdeo
hidrognio). Com a diminuio da formao de ATP, que a chave energtica
molecular da clula, ocorre a morte celular (HANG. 2004)
Genticos
Alteraes genticas decorrentes de mutaes acarretam alteraes no
DNA, alterando a sntese protica. Este parece ser a causa em algumas formas
familiares de DP. Neste sentido, alguns estudos indicam que a DP pode dever-se
a defeitos nas protenas envolvidas na degradao das protenas alfa-nuclena e
ou parkina. Da, na DP considerada de origem gentica, o erro est localizado nos
24
genes da alfa-nuclena ou parkina. Tais defeitos levariam ao aumento dessas
protenas, ao decorrer do tempo, sob a forma de Corpos de Lewy.
1.3 Manifestaes Clnicas
A DP caracterizada clinicamente por sintomas neurolgicos como tremor
de repouso, rigidez muscular e lentido anormal de movimentos (bradicinesia).
Encontramos tambm outros sintomas, como depresso, ansiedade, irritabilidade,
perda olfatria, dificuldade na escrita, perda das funes cognitivas, alteraes da
voz com dificuldade na articulao das palavras, alteraes urinrias, restrio
respiratria com diminuio da amplitude torcica e disfuno ertil.
1.4 Etiologia (Causas Genticas e Ambientais)
As causas da DP esto relacionadas a vrios fatores, tais como a idade,
vrus, substncias txicas (pesticidas, metais, hidrocarbonetos), mutaes que
alteram a expresso gnica, estresse oxidativo e outros. O uso do tabaco,
radiaes, processos inflamatrios e aumento de radicais livres tambm podem
desencadear a DP.
1.4.1 Radicais Livres (RL)
So estruturas qumicas que possuem um eltron desemparelhado
ocupando um orbital atmico ou molecular. So altamente reativos, podendo
combinar-se com molculas integrantes da estrutura celular e agregarem-se
anomalamente com protenas citoplasmticas causando neurodegenerao.
25
O metabolismo normal do neurotransmissor dopamina produz radicais
hidroxilas (OH) e perxido de hidrognio (H2O2), os quais na presena de
depsitos de ferro, no crebro, podem inibir a cadeia respiratria celular e
ocasionar neurotoxicidade.
1.4.2 Estresse Oxidativo
Quando ocorre um desequilbrio entre a formao de RL e enzimas
antioxidantes, ocorre o estresse oxidativo, devido ao aumento da quantidade de
RL, acarretando alteraes celulares, com efeitos deletrios sobre o DNA,
alterando a transcrio gnica e a sntese de protecas (LlESUY, 2002).
Danos oxidativos em cidos nucleicos causam neurodegenerao
dopaminrgica da substncia nigra, liberando a hidroxiguanosina (8-HGO) que
est elevada em pacientes com DP.
Quando a quantidade de dopamina na substncia nigra diminui, ocorre
interao com vrias molculas (perxidos) formando RL txicos. O processo
oxidativo com a formao aumentada de RL prejudicial aos neurnios da
substncia nigra, podendo lev-los morte.
No metabolismo da dopamina h gerao de perxido de hidrognio o qual
forma RL e para combater a formao dos radicais hidroxilas e superxido
existem processos que envolvem a enzima superxido-dismutase que catalisa a
converso do radical superxido (O2) em H2O2, que sofrer ao da enzima
glutationa peroxidase, liberando H2O e glutationa-disulfeto que a forma oxidada
da glutationa. Em crebros saudveis, os perxidos so detoxificados na
presena da glutationa.
1.4.3 Disfuno Mitocondrial
26
Mitocndrias so organelas citoplasmticas que existem em todos vegetais
e animais, em quantidades proporcionais s atividades aerbicas de cada um,
sendo varivel nas diferentes clulas (CONRADT, 2006). A funo das
mitocndrias fundamentalmente produo de energia, respirao celular com
concomitante produo energtica, localizando-se preferencialmente nas regies
onde existe grande consumo energtico (LY & VERSTREKEN, 2006).
Alteraes no DNA mitocondrial, associadas ao estresse oxidativo,
aumento das taxas de ferro e disfunes genticas contribuem para o surgimento
da DP e de outras patologias neurodegenerativas. Descobriu-se que o uso da
droga MPTP (1 metil 4 fenil 1, 2, 3, 6, tetrahidropiridina) em humanos e animais
desencadeava a morte neuronal no crebro, com grande diminuio da taxa de
dopamina.
A droga MPTP metabolizada pela MAO-B (monoaminoxidase B),
produzindo MPP+ e altas quantidades de RL, que diminuem formao de ATP,
devido inibio da enzima NADH desidrogenase ou complexo I da cadeia
respiratria. Com a diminuio da formao de ATP, ocorre a morte celular. Todo
este processo ocorre no da mitocndria.
A coenzima Q 10 (CoQ10) chamada de ubiquinona, que atua como
antioxidante, captando os RL txicos, est deficiente na DP. Vrios herbicidas
como a rotenona, que inibe o complexo I da cadeia respiratria, podem causar DP.
1.5 Achados Neuropatolgicos
Aps a manifestaes clinicas, a DP afeta os gnglios da base e mais
especificamente a substncia nigra, caracterizando-se por perda de neurnios
dopaminrgicos. Pode ocorrer tambm degenerao das terminaes nervosas
no corpo estriado, acarretando diminuio de dopamina no corpo estriado. No
crebro humano, os ncleos da base (substncia nigra, estriado, globus pallidus,
ncleo subtalmico e tlamo) conectam entre si as partes do crebro que
controlam as funes motoras com o crtex motor.
27
Quando uma parte deste sistema no funciona adequadamente, como
acontece na DP, todo o sistema afetado. O resultado final com a diminuio da
dopamina no sistema nervoso central a inibio dos sinais eltricos do crtex
motor. Esta parte do crebro tem tantas conexes com funes motoras
sensitivas e de raciocnio, incluindo o tronco cerebral, onde se pensa que muitas
alteraes presentes na DP, incluindo as vrias conexes e sinais, possam levar
aos sintomas motores tais como bradicinesia, tremores e rigidez e cognitivos da
doena.
Medicamentos e tratamento cirrgico tentam restaurar a atividade e funo
dopaminrgica normal do circuito motor para permitir o retorno das habilidades
motoras normais.
1.5.1 Corpos de Lewy
Os corpos de Lewy (CL) so formados por um grupo de protenas que
pode ser encontrado dentro do citoplasma de algumas clulas cerebrais,
tipicamente em pacientes com DP. Os CL so arredondados e identificados pela
colorao hematoxilina-eosina ou atravs de imunocitoqumica pela antiubiquitina.
Podem se apresentar fora dos neurnios com formas ovais ou alongadas em
vrias regies do crebro, entretanto quando se localizam na via nigroestrial so
patognomnicos da DP. Os CL, embora raramente, podem tambm ser
visualizados em clulas neurais de pessoas no portadoras de DP, como por
exemplo, em idosos com envelhecimento normal.
As protenas que compem os CL so as alfa-sinuclena e a ubiquitina-
ligase.
A alfa-sinuclena, ou condies fisiolgicas, reage com fosfolipdios de
membranas, regula a diferenciao celular, participando da morfologia e fisiologia
sinptica e da neurotransmisso dopaminrgica.
28
A ubiquitina-ligase uma importante enzima que desdobra e decompe as
cadeias polipeptdicas grandes e anormais, com a finalidade de eliminar essas
protenas que no so necessrias para a funo cerebral.
Acredita-se que os CL podem ser o resultado da degenerao dos
neurnios.
1.5.2 Dopamina
Em um adulto normal existe cerca de 400.00 neurnios dopaminrgicos no
Sistema Nervoso Central (SNC), os quais liberam dopamina para estimular os
receptores do sistema motor. A dopamina elaborada por uma srie de reaes
bioqumicas e degradada por duas importantes enzimas, a MAO
(monoaminoxidase) e a COMT (catecol-o-metiltransferase), levando formao
dos produtos o cido diidroxifenilactico (DOPAC) e o cido homovanlico (HVA).
Figura I.2. Principais vias do Metabolismo da dopamina no crebro
Fonte: HANG, 2004
29
A dopamina encontrada em quantidades mais abundantes no corpo
estriado, relacionado com a coordenao dos movimentos, mas tambm ocorre
em altas concentraes em certas partes do sistema lmbico e hipotlamo.
A sntese da dopamina consiste na converso da tirosina em DOPA,
seguida de descarboxilao para formar dopamina.
Figura I.3. Biosntese das catecolaminas
Fonte: HANG, 2004
30
1.6 Tratamento
Os medicamentos usados para tratar a DP so divididos em:
Medicamentos para substituir, estimular e aumentar a atividade
dopaminrgica, com o objetivo de melhorar a funo motora (levodopa);
Medicamentos que mimetizam a ao da dopamina nos receptores D1, D2
ou D3 (bromocriptina, pergolida, lisurida, promipexol);
Medicamentos que inibem a MAO - B (selegilina);
Medicamentos que inibem a COMT (tolcapone e entacapone);
Medicamentos que liberam a dopamina (amantadina);
Medicamentos antagonistas do receptor colinrgico muscarnico
(benzatropina).
1.6.1 Levodopa
um aminocido (3,4 dihidroxi - fenilalanina) precursor da dopamina,
que sob a ao da enzima dopadescarboxilase d origem a dopamina. A
administrao da Levodopa aumenta as quantidades de dopamina no crebro.
No deve ser usada isoladamente no inicio da doena, ento se usam
medicamentos menos potentes.
uma droga importante, considerada de primeira linha, entretanto no
passado foi usada, unicamente, com resultados no muito satisfatrios. Por isso
usam-se de modo concomitante inibidores da dopadescarboxilase que agem
perifericamente (carbidopa, benserazida).
A levopoda bem absorvida na parte proximal do intestino delgado. No
entanto, alimentos gordurosos e ricos em protena, ingeridos prximos ao horrio
da ingesto do medicamento dificultam sua absoro. Uma poro importante da
31
levopoda metabolizada em dopamina antes de atingir o crebro, pela
dopadescarboxilase.
Alguns pacientes respondem bem ao tratamento nos primeiros 4 5 anos,
pois ainda existem neurnios com condies de armazenar a dopamina produzida
pela medicao. Com a evoluo da doena, diminui a capacidade de
armazenamento de dopamina nas clulas cerebrais devido degenerao das
mesmas e a eficcia do medicamento diminui.
Novas drogas devem ento ser utilizadas para aumentar a ao da
levodopa.
1.6.2 Carbidopa / Levodopa
considerado o mais efetivo medicamento para controlar tremor, rigidez e
bradicinesia; esta associao reduz a dose necessria em 10 vezes menos,
todavia, com o passar do tempo, a eficcia vai gradativamente diminuindo.
bem absorvido no intestino delgado, embora uma poro importante seja
desativada pela MAO da parede intestinal, entretanto, no geral muito benfica
ao paciente.
Apresenta alguns efeitos colaterais indesejados tais como discinesia
(movimentos involuntrios de contoro), efeito liga-desliga (piora e melhora os
sintomas em poucas horas), nuseas, anorexia, hipotenso e alteraes
psicolgicas, na forma de alucinaes.
1.6.3 Agonistas da Dopamina
So substncias com aes semelhantes dopamina, entretanto no
necessitam de transformaes enzimticas para atuarem. No so to potentes
32
como a dopamina. Agem nos receptores da dopamina que se localizam nas
clulas do estriado. Existem receptores D1, D2, D3 e outros subtipos.
Os principais agonistas utilizados foram os derivados do ergot (derivados
do esporo do centeio). Os principais so: bromocriptina (Parlodel, Bagren),
pergolida (Celance), lisurida (Dopergin) e cabergolina.
Recentemente foram lanados agonistas no derivados do ergot tais como
o pramipexol (Mirapex, Sifrol) e ropinerol (Requip), que possuem maior eficcia.
1.6.4 Inibidores de MAO B
A enzima MAO-B age no crebro, na transformao da dopamina em seu
metablito, o cido homovanlico. responsvel pela remoo natural da
dopamina e atua diminuindo a velocidade de remoo da dopamina, aumentando
o tempo de vida til e elevando as taxas de dopamina.
Pode ser administrada com a levopoda, aumentando a eficcia temporal da
droga, entretanto no deve ser usada a noite, pois ocasiona insnia.
1.6.5 Inibidores da COMT
Outra enzima de grande importncia no metabolismo da dopamina catecol-
o-metil-transferase (COMT) responsvel juntamente com a MAO-B pela
remoo da dopamina, todavia tambm age sobre a levodopa, transformando-a
em 3-o-metildopa, sem efeito teraputico, ocasionando perda significativa da
levopoda. Medicamentos como o tolcapone (Tasmar) e o entacapone (Comtan)
so utilizados para aumentar a eficcia da levodopa. O tolcapone atua tanto fora
como dentro do crebro, o entacapone atua apenas fora do crebro. Os efeitos
colaterais so semelhantes aos da levodopa, podendo surgir hipotenso arterial e
diarria, que quase sempre obriga a retirada do medicamento.
33
1.6.6 Amandatina
A amandatina foi introduzida como frmaco antiviral, sendo descoberta em
1969, como benfica para a DP. Atua como antagonista de receptores excitatrios
nos gnglios da base. A droga ainda est sendo estudada, sabe-se que menos
eficaz que a levopoda ou bromocriptina e seus efeitos colaterais so semelhantes
levodopa. tida como dopamina endgena e usada na busca de novas
alternativas.
1.6.7 Anticolinrgicos
At a levodopa ser descoberta, a atropina e correlatos foram usados no
tratamento da DP. Os receptores muscarnicos da acetilcolina exercem efeitos
excitatrios, contrrios aos da dopamina, em neurnios do estriado e tambm
desempenham papel inibitrio pr-sinptico sobre as terminaes dopaminrgicas.
A supresso desses efeitos compensa os efeitos da dopamina, restabelecendo o
equilbrio entre acetilcolina e dopamina.
O biperdeno (Akineton, Akineton-R) e trihexifenedil (Artane) so as drogas
disponveis deste grupo de medicamentos.
1.7 Homocistena
Homocistena (Hcy) um aminocido sulforoso que no um constituinte
diettico e no forma protena. A Hcy exclusivamente derivada da desmetilao
da metionina, um aminocido abundante em protenas de plantas e animais. H
uma semelhana entre a Hcy com a metionina e a cistena, sendo os trs
34
aminocidos portadores de enxofre e esto metabolicamente ligados entre si
(Figura I.4).
Fonte: HANG, 2004
Figura I.4. Aminocidos sulfurosos e suas estruturas qumicas
Fonte: HANG, 2004
DNA
35
1.7.1. Metabolismo da Homocistena
O metabolismo da homocistena ocorre nos rins e no fgado. A nica fonte
de Hcy em seres humanos a desmetilao do aminocido essencial metionina
atravs de dois compostos intermedirios, a S-adenosilmetionina (SAM) e a S-
adenosilhomocistena (SAH) (FINKESLTEIN e MARTIN, 1986). A SAM doadora
de grupos metila para mais de 100 reaes qumicas envolvendo
metiltransferases, incluindo aquelas do DNA, RNA, protenas e lipdios (SCOTT et
al., 1994). A metilao do DNA tem um papel crtico na expresso e regulao
gnicas (FRISO et al., 2002). Com a transferncia do grupo metila, a SAM
transforma-se em SAH que depois de convertida em Hcy e adenosina pela SAH
hidrolase que est amplamente distribuda nos tecidos. A Hcy pode ser
metabolizada atravs de duas rotas alternativas: 1) sendo irreversivelmente
degradada atravs de transulfurao em cistationina e aps em cistena (principal
rota) ou 2) remetilada a partir de 5-metiltetrahidrofolato para metionina. Essas
reaes ocorrem principalmente no fgado e no rim e utilizam os cofatores cido
flico, vitamina B6 e vitamina B12. No entanto, a remetilao de Hcy uma fonte
importante de grupamentos metila no crebro (SCOTT et al., 1994). Neste
particular, numerosas reaes de metilao ocorrem no crebro, tais como a
sntese e a degradao de neurotransmissores, fosfolipdos de membrana e
metilao de DNA (Figura I.5). Alm disso, conhecido que a enzima cistationina
sintase (CBS) tem sido detectada no crebro humano (ICHINOHE et al., 2005).
36
Figura I.5. Metabolismo da Homocistena. SAM, S-Adenosil Metionina; SAH, S-
Adenosilhomocistena; HCY, Homocistena; Met, Metionina; Gly, Glicina, THF,
Tetrahidrofolato, MTHF, 5 Metiltetrahidrofolato; GSH, Glutatio Reduzido.
Fonte: PANIZ et al. 2005.
As concentraes intracelulares de Hcy esto sob controle efetivo, que
atuam principalmente nas enzimas de remetilao e transulfurao. Quando a
Hcy penetra na corrente sanginea, devido alta reatividade do seu grupo tilico,
rapidamente oxidada ou se une a outra molcula de Hcy, formando homocistina
ou ento a grupos tilicos de outras molculas, tais como a cistena, gama-
glutamilcistena, glutatio ou protenas, formando pontes dissulfetos. Em
condies normais, apenas 1 a 2 % da Hcy se encontra no plasma como tal,
sendo que a maior parte (98 %) est sob forma oxidada (ANDERSSON et al.,
1995). O fgado e o rim so os rgos que mais degradam e excretam Hcy.
No que se refere s concentraes de Hcy no plasma e no LCR, as
concentraes plasmticas desse aminocido so cerca de 20 a 100 vezes
maiores do que as do lquido cfalo raquidiano (LCR). Estudos em animais de
experimentao indicam que a Hcy transportada para o crebro por um receptor
37
especfico saturvel e tambm por difuso simples (GRIEVE et al., 1992;
GRIFFITHS et al., 1992). Esse transportador pode importar Hcy do plasma para o
crebro e vice-versa, sendo considerado um transportador bidirecional (GRIEVE
et al., 1992). Alm disso, foi demonstrado em cultura de neurnios que a Hcy
pode ser produzida dentro do crebro e que esse aminocido pode alterar a
integridade da barreira hemato-enceflica (HO et al., 2002).
O metabolismo da Hcy envolve vrios cofatores, tais como folatos,
vitaminas B2, B6 e B12, que so usados na remetilao. A vitamina B6 usada
na via transulfurao. Carncia de folato, ou vitaminas B6 e B12, causam
alteraes no metabolismo da homocistena, acarretando hiperhomocisteinemia.
FIG. 1.5 .
Mutaes genticas que envolvam as enzimas metilenetetrahidrofolato
redutase (MTHFR), a metionina sintase (MS) e a cistationina--sintase (CBS)
tambm produzem hiperhomocisteinemia. Mutaes que atinjam dois alelos
idnticos podem desencadear alteraes, resultando uma severa
hiperhomocisteinemia e levando a uma doena rara chamada homocistinria.
A Hcy sintetizada atravs da S-adenosilmetionina (SAM) e S-
adenosilhomosisteina (SAH). O grupo metila transferido para a homocistena
formando a metionina, este processo realizado pelas enzimas metionina sintase
(MS) e homocistena-betana metiltransferase (BHMT) dependentes de vitamina
B12.
A homocistena tambm convertida cistena atravs da via de
transulfurao, iniciada pela vitamina B6 dependente-cistationina sintase (CBS).
O ciclo de folato forma 5-metiltetrahidrofolato (CH3, THF) para a remetilao da
Hcy para metionina.
1.7.2 Hiperhomocisteinemia
A hiperhomocisteinemia corresponde a uma situao com aumento das
concentraes circulantes de Hcy total em jejum, devendo-se principalmente a
38
defeitos da remetilao da Hcy. Nveis elevados de Hcy geralmente resultam de
um distrbio no metabolismo intracelular deste aminocido, que dependente da
atividade das enzimas intimamente envolvidas com o seu metabolismo, bem
como de seus cofatores cido flico, vitamina B12 e vitamina B6.
A hiperhomocisteinemia se deve a fatores adquiridos e/ou genticos
(FOWLER et al., 1987). Na primeira categoria a hiperhomocisteinemia leve a
moderada, devendo-se a fatores nutricionais como concentraes baixas de
algumas vitaminas do complexo B, que participam no metabolismo da Hcy, como
cofatores ou substratos, sendo considerados estes como as mais comuns causas
de hiperhomocisteinemia moderada (HAYNES, 2002). Neste particular, as
concentraes plasmticas de Hcy esto inversamente correlacionadas com as
concentraes plasmticas de vitamina B12, vitamina B6 e principalmente de
folato, que dependem fundamentalmente da ingesto adequada dessas vitaminas
(GRAHAM e OCALLAGHAN, 2002). Por outro lado, as concentraes
plasmticas de Hcy em jejum, se regularizam nesses casos pela restrio
diettica de Hcy e pela suplementao de cido flico e de vitamina B12, mas no
de vitamina B6 (Homocysteine Lowering Trialists Collaboration, 1998). A
insuficincia renal tambm provoca hipermocisteinemia devido a menor filtrao
glomerular (WOLLESEN et al., 1999). O sexo tambm influncia os nveis
plasmticos de Hcy, sendo maiores nos indivduos do sexo masculino e
parecendo estar relacionado com a atividade da remetilao e transmetilao da
Hcy (BOSTON e CULLETON, 1999). Neste particular, verificou-se um aumento
dos nveis plasmticos de Hcy aps a menopausa e uma diminuio desses
nveis aps suplementao de estrgenos a transexuais, refletindo a influncia de
hormnios estrognios (GILTRAY et al., 1998). Alm disso, acredita-se que os
nveis circulantes diferenciais de Hcy, em ambos os sexos, poderiam se dever a
massa muscular maior nos homens. A idade outro fator que influencia os nveis
plasmticos de Hcy, sendo que esses nveis praticamente dobram da
adolescncia a velhice. Neste particular, no se pode ignorar a diminuio da
funo renal e da ingesto de vitaminas como causa dos nveis elevados de Hcy
no idoso. H outros fatores que alteram a concentrao plasmtica de Hcy que
diminui durante a gestao e aumenta em tabagistas, sedentrios, bem como no
39
alcoolismo e com o uso de anticonvulsivantes. Outro achado interessante que
consumidores moderados de lcool possuem nveis mais baixos de Hcy
(LIEVERS et al., 2003).
J a hiperhomocisteinemia severa ocorre em doenas genticas ou ento
pelo tratamento com metotrexate, que provoca uma queda nos nveis de folato.
Nestes casos, o quadro clnico caracterstico de sintomas neurolgicos agudos
como convulses e psicose. As doenas genticas mais comuns que causam
esta forma de hiperhomocisteinemia so as deficincias da cistationina sintase
(CBS), conhecida como homocistinria, de 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase
(MTHFR) (SIBANI et al., 2000), deficincia funcional de metionina sintase (MS),
metionina sintase redutase (MSR), bem como defeitos do metabolismo
intracelular de cianocobalamina (Cbl) indiretamente afetando a atividade da MS.
Os achados clnicos caractersticos de pacientes afetados por estes distrbios
incluem problemas vasculares e neurolgicos.
1.7.3 Homocistena e doenas Neurolgicas
O efeito do metabolismo alterado da Hcy sobre o sistema nervoso central e
perifrico uma rea de pesquisa nova que est se expandindo e que necessita
ser mais bem explorada. Assim, pouco se tem investigado sobre o papel da Hcy e
da hiperhomocisteinemia sobre doenas neurodegenerativas, embora haja alguns
relatos na literatura demonstrando que a hiperhomocisteinemia leve a moderada
est relacionada de alguma forma, no esclarecida, com algumas doenas
neurodegenerativas. De particular interesse a evidncia recente de que
pacientes confirmados histologicamente com doena de Alzheimer possuem
nveis plasmticos significativamente maiores de Hcy do que grupos controles. Foi
verificado tambm que nveis elevados de Hcy ocorrem no sangue de pacientes
com doena de Parkinson, demncia vascular e nos distrbios cognitivos da idade,
bem como em algumas doenas psiquiticas do tipo esquizofrenia e depresso
(SELHUB et al., 2000; SESHADRI et al., 2002; ISOBE et al., 2005). A
40
hiperhomocisteinemia foi particularmente demonstrada em pacientes com doena
de Parkinson tratados com levodopa e em pacientes epilpticos tratados com
drogas anticonvulsivantes (LAMBERTI et al., 2005). Por outro lado, estudos
epidemiolgicos e longitudinais sugerem uma relao causal entre Hcy e dficit
cognitivo, no somente devido ao dano endotelial e cerebrovascular, mas tambm
a mecanismos neurotxicos prprios da Hcy (NURK et al., 2005; SACHDEV,
2005). Outros trabalhos demonstraram uma reduo dos nveis plasmticos de
cido flico e vitamina B12 e/ou B6 na demncia do idoso, mas no evidenciaram
se a deficincia dessas vitaminas ou a hiperhomocisteinemia secundria estaria
relacionada com o dficit cognitivo nesses indivduos (GOODWIN et al., 1983). De
fato, embora se saiba que deficincias de cido flico e vitamina B12 podem
causar alteraes neurolgicas, pouco se sabe sobre as associaes dessas
deficincias com o acmulo de Hcy sobre o dano cerebral. Alguns estudos
sugerem que a Hcy est envolvida com dano cerebral e com o declnio cognitivo e
da memria, porm no foi esclarecido se os aumentos desse aminocido ou se
as deficincias nos cofatores que levam a esse acmulo, so os mecanismos
fisiopatolgicos desses quadros clnicos.
Relativamente aos mecanismos neurotxicos da Hcy, acredita-se que ela
possa causar distrbios na metilao e/ou alterao no potencial redox celular,
resultando em influxo de clcio, apoptose e morte neuronal. Alm disso, a Hcy
um agonista de receptores ionotrpicos e metabotrpicos, alm de causar
estresse oxidativo (HO et al., 2003) e dficit do metabolismo energtico em tecido
cerebral (STRECK et al., 2002, 2003). Tambm foi verificado que alguns efeitos
neurotxicos da Hcy podem ser prevenidos, ao menos parcialmente, pelo uso de
suplementao de folato, enfatizando o papel neurotxico da deficincia de cido
flico ou pela restaurao dos nveis normais de Hcy atravs da suplementao
com esse cofator. Antagonistas de receptores glutamatrgicos ou antioxidantes
tambm reduziram os efeitos neurotxicos da Hcy, refletindo a importncia do
sistema glutamatrgico e da gerao de espcies reativas nesta ao. Por outro
lado, no se pode tambm descartar que os metablitos da Hcy (cido
homocisteico, etc.) tambm atuem como agentes neurotxicos, visto que eles
tambm podem estar em concentraes elevadas em situaes com
41
hyperhomocisteinemia. Assim, foi demonstrado que a Hcy e alguns de seus
metablitos parecem atuar sobre a funo neuronal ativando receptores
glutamatrgicos ionotrpicos e metabotrpicos (LIPTON et al., 1997; SHI et al.,
2003; ZIEMINSKA et al., 2003; SELLEY, 2003). No entanto, enfatize-se que no
est ainda estabelecido se os metablitos da Hcy causam disfuno neuronal em
menor ou maior grau que a prpria Hcy e tambm em que concentraes isso
ocorre (fisiolgicas ou suprafisiolgicas). No entanto, devemos considerar que as
maiorias dos estudos sobre os mecanismos neurotxicos da Hcy foram feitos em
neurnios cultivados e com concentraes suprafisiolgicas de Hcy, assim como
em animais de experimentao e no em seres humanos. Desta forma, as
diferenas metablicas e genticas entre roedores e seres humanos podem
limitar a extrapolao dos dados obtidos em roedores para a espcie humana, o
que salienta o valor da presente investigao em seres humanos.
Tendo em vista que alguns trabalhos da literatura mostraram que a Hcy
induz a produo de radicais livres, produzindo dano oxidativo em crebro
(STARKEBAUM e HARLAM, 1986; STRECK et al., 2003) e j que o estresse
oxidativo tem sido encontrado em tecidos de pacientes com doenas
neurodegenerativas e mais especificamente com a doena de Parkinson, o
presente trabalho visou determinar os nveis plasmticos no somente de Hcy,
mas tambm de vitamina B12 e cido flico, e determinar fatores envolvidos com
alteraes destes nveis, como o fumo, lcool, hipertenso arterial sistmica,
diabete mlito e outros nesta doena. Enfatize-se que as associaes verificadas
at agora entre os nveis de Hcy no plasma de pacientes afetados pela doena de
Parkinson no estabeleceram se a Hcy fator causador da disfuno neurolgica
ou apenas um marcador dessa doena decorrente de alteraes de outros fatores.
1.8 cido Flico
O cido flico foi inicialmente estudado, na dcada de 1930, por Wills e
colegas, sendo chamado de fator de Wills, o qual foi retirado de extratos crus de
42
fgado. Em 1943, o cido flico (pteroilglutmico) foi purificado por Stokstad. Foi
cristalizado por Pfiffner e colegas tambm em 1943. Em 1945, Angier e colegas
sintetizaram e determinaram a sua estrutura (Figura I.6).
Figura I.6. Estrutura qumica do cido flico
O cido flico, folacina ou cido pteroilglutmico um derivado da vitamina
B, tambm conhecido por vitamina B9, hidrossolvel, eficiente no combate
anemia e s doenas cardiovasculares. A carncia de cido flico acarreta
diminuio do crescimento, anemia megaloblstica e outros distrbios sangneos,
glossites e distrbios no trato gastrointestinal. O cido flico est envolvido em um
grande nmero de processos bioqumicos essenciais para a vida, tem importante
papel na metilao do DNA e na sntese de purinas e pirimidinas. Tem ao
importante na converso de homocistena em metionina, tendo a vitamina B12
como cofator, na converso da serina em glicina, na sntese do timidilato e no
metabolismo da histidina.
Vrios agentes quimioterpicos inibem a enzima dihidrofolato redutase, tais
como: metotrexato, trimetoprim e pirimetamina. Os compostos mais conhecidos
que interferem com a absoro, utilizao e armazenagem dos folatos so os
contraceptivos orais, o lcool, a colestiramina (anticolesterolmico), os
antiepilpticos (barbituratos e difenil-hidantona) e a sulfasalazina (sulfonamida
usada no tratamento da colite ulcerativa). Medicamentos que reduzem a acidez
intestinal, tais como anticidos e antiulcerosos, interferem na ao do cido flico.
Fonte: Gregory, 1998
43
Vitaminas do grupo B e vitamina C contribuem para uma boa funo do cido
flico.
O cido flico pode diminuir o risco de mal-formaes congnitas. Tem
grande importncia na diminuio das ocorrncias de defeitos no fechamento do
tubo neural (DTN). Alm disso, o uso teraputico do cido flico reduz as
concentraes de homocistena.
O cido flico tambm age na preveno e na melhora da colite ulcerativa
e tambm tem sido usado no tratamento do vitiligo e na diminuio dos processos
inflamatrios bucais e gengivais.
Causas genticas ou deficincia desta vitamina tm sido relacionadas ao
cncer (BALUZ et al., 2002).
Os folatos orais so geralmente disponveis em duas formas: cido flico e
cido folnico. A administrao do cido folnico proporciona que sejam
ultrapassadas as etapas de desdobramentos e reduo, requeridas para o cido
flico, sendo, portanto mais metabolicamente ativo, capaz de aumentar a eficcia
em relao ao cido flico, diminuindo o tempo intermedirio gasto na reduo
dos folatos.
O etilismo agudo ou crnico, o suplemento diettico inadequado e o
estresse provocado por vrias doenas neoplsicas causam deficincia de folato.
As fontes do cido flico so: espinafre, vegetais de folhas verdes, fgado,
levedo de cerveja, feijes, fermento, sementes de trigo, beterraba, leite e
derivados, po integral, suco de laranja, cenoura, gema de ovo, aveia e algumas
frutas. O folato dos alimentos altamente sensvel a agentes fsico-qumicos
como: oxidao, calor e luz ultravioleta. O cozimento prolongado pode destruir
90% do folato destes alimentos. A absoro destes alimentos ocorre pela ao de
uma carboxipeptidase das membranas das clulas mucosas. A forma reduzida
absorvida metilada pela dihidrofolato redutase, presente em abundncia na
poro proximal do intestino delgado (duodeno e jejuno proximal). Doenas que
acometem o jejuno podem acarretar deficincia de folato (espru no-tropical e
tropical).
O cido flico a forma mais estvel de folato, mas no encontrada
naturalmente em tecidos vivos; precisa ser reduzido in vivo, o que resulta em di-
44
hidrofolato e tetra-hidrofolato pela adio de tomos de hidrognio no anel
pirazina da pteridina, nas posies 7, 8 e 5, 6, 7 e 8 respectivamente (Figura I.7).
Figura I.7. Reduo do folato (F) a dihidrofolato (FH2) e, em seguida, a
tetrahidrofolato (FH4), pela enzima dihidrofolato-redutase (DHFR)
Fonte: HANG, 2004
A tabela I.1 Doses dirias recomendadas de folato na alimentao.
Tabela I.1. Doses recomendadas de folato
Homens 200g/dia
Mulheres 180 g/dia
Gravidez 400 g/dia
Lactao 600 g/dia (OMS)
Bebs 20-40 g/dia
Crianas 50-150 g/dia
1.8.1. Metabolismo do cido Flico
O cido flico age como coenzima de processos de oxidao, reduo e
transferncia de radicais metila. Estes processos esto relacionados com a
45
ingesto de folato, vitaminas B6 e B12 e a ao da enzima MTHFR
(Metilenetetrahidrofolatoredutase).
O folato participa efetivamente de reaes de metilao, envolvidas nas
etapas de sntese de purinas e pirimidinas, no metabolismo de aminocidos e na
liberao do radical metila, onde a SAM (s-adenosilmetionina) participa em mais
de uma centena de reaes de transferncia da metila, doando ou recebendo o
radical. Na falta do folato as reaes de metilao ficam comprometidas.
No plasma, o folato endgeno liga-se a protenas de baixa afinidade, tais
como a albumina, que responsvel por mais de 50% do folato ligado. Nos
tecidos, o folato liga-se a receptores de folato reduzidos e seus anlogos inativos.
O cido flico geralmente bem absorvido pelo homem, entretanto o
processo de converso para uma coenzima metabolicamente ativa complexo. O
cido flico inicialmente desdobrado nas clulas da parede intestinal em
monoglutamato (figura I.8).
Figura I.8. Absoro e ativao do folato no intestino
Fonte: GREGORY, 1998
46
No fgado, este composto reduzido a dihidrofolato (DHF, FH2) e
tetraidrofolato (THF, FH4) atravs da ao da dihidrofolatoredutase. H
necessidade de NADPH (nicotinamida adenina nucleotdeo fosfato) como cofator.
O prximo passo requer o aminocido serina, para combinar com o fosfato de
piridoxol (vitamina B6) e transmitir o grupo hidroximetil ao tetrafolato (FH4). O
resultado a formao do composto 5-10 metilenetetrahidrofolato e glicina.
O 5 -10 metilenetetrahidrofolato tm grande importncia neste processo,
proporcionando que o precursor metabolicamente ativo, 5 metilenetetrahidrofolato,
seja utilizado, na remetilao da homocistena.
O folato sob as formas ativas e inativas excretado em mdia de 100
g/dia na urina e bile dos humanos.
A primeira metilao FH4 (THF) necessita da serina, que se converte em
glicina, de grande importncia nas etapas de sntese do DNA. Nesta reao com
a ao da enzima MTHFR (metilenetetrahidrofolatoredutase) ocorre sntese do
composto 5 -10 metilenetetrahidrofolato, do qual ser doado o grupamento metila
(5 metila THF) para a homocistena, sob ao catalizadora da enzima
metilasintase (MS) formando a metionina. Esta etapa chamada de remetilao,
um ciclo de regenerao metionina homocistena metionina.
Na carncia de folato, ocorre o aumento das taxas de homocistena
(hiperhomocisteinemia) e o mecanismo de regulao se faz atravs da
transulfurao. Nesta via, a homocistena convertida em cistationina, na
seqncia ocorre a transformao em -cetoglutarato e cistena, isto ocorre
devido a ao da cistationina sintetase (CBS) e vitamina B6.
A cistena participa de vrias vias metablicas, podendo dar origem
taurina, ao sulfato inorgnico ou ser eliminada pela urina.
O SAM (s-adenosilmetionina) age tanto na remetilao como na
transulfurao, inibindo a MTHFR (remetilao) ou ativando a CBS
(transulfurao), dependendo da quantidade da metionina ou folato ingerida. A
SAM tem grande importncia na sntese do DNA, sendo o folato o cofator, doando
metila para a metilao do DNA.
Durante o processo de doao do grupo metila (metila FH4) a homocistena,
gerando a metionina, ocorre a utilizao do FH4 em outra etapa reativa, formando
47
o timidilato, que converte o DUMP (deoxiuridinamonofosfato) em DTMP
(timidinamonofosfato) e em purinas (Figura I.9).
Figura I.9. Transferncia do grupo metila com a participao do folato
Fonte: HANG, 2004
48
Figura I.10. Metabolismo da metionina com a participao do cido flico
Fonte: MOHAMED, 1999.
1.8.2 cido Flico e Neurodegenerao
H poucos estudos sobre a influncia da deficincia de cido flico nos
processos neurodegenerativos. Neste contexto, acredita-se que a deficincia
dessa vitamina um fator determinante da atrofia cortical na doena de Alzheimer
(SNOWDOWN et al., 2000; HEIJER et al., 2003).
O caminho metablico da metionina, THF tetrahidrofolato; 5-10-Me-THF, 5-10- metilenetetrahidrofolato; 5-10-Me-THFR, 5-10-metilenetetrahidrofolato redutase; 5-MTHF, 5-metiltetrahidrofolato.
49
1.9 Vitamina B12
A vitamina B12 uma substncia complexa, que faz parte de uma famlia
de compostos denominados genericamente de cobalaminas (figura I.11).
Fonte:PANIZ,2005.
uma vitamina hidrossolvel, sintetizada exclusivamente por
microorganismos (GILLHAM, 1997) e encontrada em alimentos de origem animal,
tais como a carne (fgado), peixes, ovos e lacticnios. A vitamina B12 utilizada
como medicamento a hidroxicobalamina.
Todas as cobalaminas, tanto dietticas quanto teraputicas, devem ser
convertidas em metilcobalaminas (metila - B12) ou 5 desoxiadenosil-
cobalamina (ado B12) para a sua ativao e ao no organismo.
A vitamina B12 liga-se ao fator intrnseco (FI), protena produzida pelo
estmago, formando um complexo resistente a enzimas proteolticas intestinais e
ligando-se aps, aos receptores das clulas epiteliais do leo terminal, sendo
finalmente ligada a um transportador plasmtico (transcobalamina) e lanada
finalmente na circulao sangunea. A vitamina B12 absorvida no leo
distribuda pelo corpo e o FI eliminado pelo intestino. A vitamina B12
Figura I.11. Estrutura da vitamina B12
50
armazenada principalmente no fgado, sendo 4 mg a quantidade total de vitamina
B12 no corpo.
A vitamina B12 no organismo age como cofator humano para a realizao
de duas reaes bioqumicas principais:
Converso do metil FH4 em FH4
Isomerizao do metilmalonil CoA em succinil-CoA
A maioria das reaes em que a vitamina B 12 participa envolve a
redistribuio de hidrognios e carbonos. Qualquer processo que altere a
absoro da vitamina B12 acarreta deficincia da mesma, o que muito freqente
em idosos, vegetarianos e em indivduos que adotam baixa dieta protica. Na
deficincia gentica do FI, a absoro da vitamina B12 comprometida, tambm
levando as baixas concentraes da mesma.
Doenas gstricas, que reduzem as secrees gstricas importantes na
absoro tambm ocasionam a diminuio da vitamina B12. A deficincia de
vitamina B12 pode levar as alteraes hematolgicas (anemia perniciosa),
neurolgicas, psiquitricas e gastrintestinais. As causas desta deficincia incluem:
doena de Crohn e Whipple, gastrectomia parcial, espru, esclerodermia,
alcoolismo, hipertoreoidismo, anemia hemoltica, alimentao exclusivamente
vegetariana, linfoma, exposio a xido ntrico e HIV (VASCONCELLOS et al.,
2002).
1.9.1 Metabolismo da vitamina B12
A vitamina B12 age como cofator essencial para duas enzimas: metionina
sintase e L-metilmalonil-CoA mutase, ambas direta ou indiretamente envolvidas
no metabolismo da homocistena (PANIZ, ET AL., 2005).
A importncia da vitamina B12 na formao do folato est especificada
abaixo (figura I.12).
51
Figura I.12. Participao da Vitamina B12 no Metabolismo do Folato
Fonte: HANG, 2004
A vitamina B12 e o cido flico participam da sntese do DNA. O processo
inicial consiste na transformao da metila-FH4 em FH4 e metila-B12,
convertendo a homocistena em metionina. A enzima envolvida na reao a
homocistena-metionina-metiltransferase, sendo necessria a presena de
vitamina B12 como cofator e de metila-FH4, sendo o grupo metila transferido para
a homocistena, formando a metionina. O FH4 forma o formil-FH4 que finalmente
origina o poliglutamato.
Outra reao com a utilizao da vitamina B12 a isomerizao da
metilmalonil-CoA em succinil-CoA. Este processo transforma o propionato em
succinato. Os cidos graxos de cadeia mpar de carbonos, o colesterol, alguns
aminocidos e a timina originam a metilmalonil-CoA que aps ser convertida em
sucinil-CoA oxidada no ciclo de Krebs. Na deficincia de vitamina B12, ocorre
acmulo de metilmalonil-CoA, com a conseqente formao do cido
metilmalnico (MMA), levando a neurodegenerao (Figura I.13).
DNA
52
Figura I.13. Formao de Sucinil-CoA
Fonte: PANIZ, 2005.
A metionina sintetase participa da metilao da homocistena
transformando-a em metionina. O 5-metiltetraidrofolato (5MTHF) doador do
grupo metila e a metila-B12 participa como cofator. A metionina interage com ATP
formando a S-adenosilmetionina (SAM). A reao de desmetilao forma a S-
adenosilhomocistena (SAH) para, aps a hidrolise, liberar a homocistena e a
adenosina. A metilao da homocistena feita para compensar a baixa
quantidade de metionina ingerida, elevando assim as quantidades do SAM, o qual
doador do grupo metila. A deficincia da vitamina B12 acarreta aumento das
quantidades de homocistena e diminuio da SAM, que levar a desmielinizao
no sistema nervoso. Uma alterao diminuindo o processo de metilao,
relacionado com a converso da homocistena em metionina, acarreta a no
converso do 5MTHF em THF adequadamente.
Quando h um aumento de metionina, por deficincia de vitamina B12, a
reao de remetilao da homocistena comprometida e surge uma nova
alternativa metablica (transulfurao) para a homocistena, que se combina com
Reaes envolvendo a vitamina B12 e sntese de Hcy e MMA, 1. reao e metilao da homocistena (metionina sintase); 2. doao de grupamentos metil; 3. reao de isomerao do metilmalonil-coA para succinil-coA (L-metil malonil-CoA mutase); 4. reaes da via de transulfurao dependentes de vitamina B6 (cistationina--sintase e cistationina-y-liase) SAM, S-adenosil metionina; SAH, S-adenosil homocistena; CYS, cistationina; CIS, cistena; -CBT, -cetobutirato; PRP-CoA, propionil-CoA; THF, tetrahidrofolato; 5-MTHF, 5-metiltetrahidrofolato; 5,10-MTHF, 5,10 metileno tetrahidrofolato; AA, aminocidos; AG, cidos graxos
53
a serina formando cistationina, sendo esta reao catalisada pela cistationina
sintase.
A cistationina hidrolisada e forma cistena e cetobutirato. Estas etapas
so dependentes da vitamina B6. A metionina e a SAM ativam a enzima
cistationina sintase, para eliminar o excesso de homocistena e metionina. Na
rota metablica da transulfurao ocorre a participao da enzima L-metilmalonil-
CoA mutase a qual age catalisando a transformao da metilmalonil coenzima A,
para succinil coenzima A, tendo adenosilcobalamina como cofator (HERRMANN
et al, 2000).
1.9.2 Deficincia de Vitamina B12 e Neurodegenerao
A deficincia da vitamina B12 afeta os tecidos com rpida renovao
celular, tais como a medula ssea. Assim, alteraes na diferenciao dos
eritroblastos e eritropoiese defeituosa na medula ssea so decorrentes de
deficincia de vitamina B12. A vitamina B12 tambm essencial para sntese do
DNA. Com deficincia desta vitamina, ocorre diminuio na sntese do DNA e
conseqentemente alteraes na proliferao celular. A anemia megaloblstica
caracterizada por distrbio na diferenciao dos eritrcitos e na eritropoiese
alterada, na medula ssea, com maturao anormal.
As alteraes neurolgicas que a deficincia de vitamina B12 causa so
decorrentes de danos crnicos e progressivos dos sistemas nervosos central e
perifrico, manifestando-se com polineurites, ataxias, reflexo de Babinski,
distrbios esfincterianos e diminuio da acuidade visual, devido a atrofia ptica.
A carncia de vitamina B12, tambm se manifesta por alteraes
neuropsiquitricas, sendo a mais comum degenerao combinada subaguda da
medula espinhal. No sistema nervoso central, a ao patolgica mais acentuada
na mielina, causando degenerao esponjosa e desmielinizao difusa das
colunas lateral e posterior da medula, as mais tpicas alteraes patolgicas. Nos
hemisfrios cerebrais as alteraes so semelhantes (SILVA, et al., 2000).
54
Na deficincia da vitamina B12, encontramos comumente alteraes de
memria, disfunes cognitivas, demncia e alteraes depressivas.
A deficincia de vitamina B12, em gestantes, aumenta o risco de m
formao fetal, ocasionado defeito no tubo neural, constituindo-se numa das mais
comuns alteraes congnitas (KIRKE, et al., 1993).
55
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Determinar os nveis plasmticos de homocistena e os fatores
determinantes dos mesmos em pacientes com doena de Parkinson.
2.2 Especficos
1) Estudar se os nveis plasmticos de homocistena (Hcy), vitamina B12 e cido
flico esto alterados em pacientes afetados pela doena de Parkinson (DP)
quando comparados aos de controles normais com idade semelhante;
2) Investigar se nveis plasmticos de Hcy se correlaciona com os nveis sricos
de vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido rico, bem como com a
idade dos pacientes com DP;
3) Investigar se nveis plasmticos de Hcy esto associados ao uso de L-DOPA e
durao da doena;
4) Investigar se nveis plasmticos de Hcy se correlacionam com o uso de
bebidas alcolicas, tabagismo, raa, diabete mlito, cardiopatia isqumica ou
hipertenso arterial sistmica.
56
3. MATERIAL E MTODOS
3.1 Material
Nossa amostra consistiu de 69 pacientes com doena de Parkinson (DP) e
52 indivduos controles com idade semelhante. O diagnstico de DP foi
estabelecido por um neurologista dos Servios de Neurologia do Hospital de
Clnicas de Porto Alegre ou do Hospital So Lucas de Porto Alegre e foi baseado
na presena de pelo menos dois sinais cardinais e resposta ao tratamento com L-
DOPA (Unified parkinsons disease Rating Scale (UDPRS) motor scale (FAHN et
al., 1987; HOEHN e YAHR, 1967; GELB et al., 1999). Os critrios de excluso
foram por algumas condies que poderiam afetar os nveis de Hcy, tais como
depresso ou demncia, histria de toxicidade por drogas, com alucinaes,
delrio ou confuso mental, histria de AVC e outra doena neurolgica do que a
DP, ou outras doenas srias concomitantes, tais como insuficincia renal ou
deficincias de vitaminas B6, B12 ou cido flico, doena vascular, psiquitrica,
cncer, desnutrio, uso de anticonvulsivantes ou de antifolatos, e quando todas
as causas de parkinsonismo secundrio (demncia, uso de neurolpticos, etc)
tinham sido excludas. A maioria dos pacientes utilizava L-DOPA. Os grupos
controles normais foram parentes ou amigos dos pacientes com idade semelhante
aos mesmos, sem histria de doena neurolgica ou de outras condies que
poderiam alterar os nveis plasmticos de Hcy. Durante as visitas aos Servios de
Neurologia acima mencionados, foram preenchidos questionrios (Anexo I), bem
como assinados Termos e Consentimento Livre e Esclarecido para todos os
indivduos que concordaram com esta investigao (Anexo II) e a investigao
somente foi realizada com os indivduos (DP e controles) que assinaram os
termos).
57
3.2 Mtodos
3.2.1 Determinao dos nveis plasmticos de Homocistena (Hcy)
Amostras de sangue venoso perifrico foram colhidas aps 12 horas de
jejum. Para a medida da Hcy plasmtica, as amostras de sangue foram coletadas
em tubos, contendo EDTA e colocadas em um refrigerador a 4oC em tempo
inferior a 15 min aps a coleta. As amostras de plasma foram separadas em
menos de 2 horas da coleta e armazenadas a -70oC por menos de 2 meses at a
anlise ser realizada.
A determinao quantitativa de homocistena (Hcy) foi feita inicialmente
pelo equipamento IMMULITE 2000 (APC Medlab.). O mtodo trata-se de um
imunoensaio competitivo (nmero de catlogo L2KHO2 (200 testes), cdigo do
teste: HCY). As amostras de plasma ou soro so inicialmente pr-incubadas por
30 min com S-adenosilL-homocistena (SAH) hidrolase e ditiotreitol (DTT), sendo
posteriormente transferidas para um tubo contendo SAH-ligada a partculas na
fase slida (beads) e um anticorpo especfico para SAH marcado com fosfatase
alcalina. Aps 30 min de incubao, a SAH da amostra de plasma ou soro
compete com a SAH imobilizada pela ligao com o anticorpo. O conjugado de
enzima no ligado removido por lavagem com centrifugao. O substrato
adicionado e a quantidade de Hcy determinada pela emisso de luminescncia.
Os nveis sricos de Hcy foram tambm medidos atravs de
espectrometria de massa em Tandem de acordo com Magera e colaboradores
(1999). O primeiro passo foi quantificar 40 amostras de plasma (20 de indivduos
normais e 20 de pacientes com doena de Parksinson) pelos dois mtodos.
Verificamos que as dosagens feitas pelos dois mtodos eram essencialmente as
mesmas. Aps isto, utilizamos apenas a espectrometria em massa Tandem para
quantificar as outras amostras de plasma. Brevemente, 100 l das amostras de
plasma foram misturadas com 20 l da soluo do padro interno (2 nmol de
58
homocistina). A reduo dos disulfetos foi feita pela adio de 20 l de 500
mmol/L de dieritritol com reao a temperatura ambiente de 15 min. Aps, as
protenas da amostra foram precipitadas com 200 l de 1mL/L de cido frmico e
0,5 mL/L de cido trifluoractico em acetonitrito. A amostra foi centrifugada e o
sobrenadante utilizado para a medida de Hcy em um espectrmetro de massa em
Tandem (perki-elmer). A curva de calibrao foi preparada com concentraes de
Hcy variando de 0 a 60 mol/L. Os coeficientes de variao intra e intraensaios
foram respectivamente de 2,1 e 3,2 respectivamente.
3.2.2 Determinao dos nveis sricos cido flico, vitamina B12, uria,
creatinina e cido rico
Para a determinao de cido flico, vitamina B12, uria, creatinina e cido
rico, o procedimento de armazenamento e separao das amostras foi
semelhante ao utilizado para a dosagem de Hcy. No entanto os tubos de coleta
no continham anticoagulante e as determinaes desses parmetros foram,
portanto, feitas em soro. Todos esses parmetros foram medidos por mtodos
automatizados usando um aparelho COBAS.
A determinao quantitativa de cido flico foi feita pelo teste Folato ADVIA
Centaur que um imunoenasio competitivo que utiliza tecnologia
quimioluminescence direta. O folato na amostra compete com o folato marcado
com ster de acridina no Reagente Lite por uma quantidade limitada de protena
ligadora de folato marcada com biotina. A protena ligadora de folato marcada
com biotina se liga a avidina, que covalentemente ligada a partculas
paramagnticas na Fase Slida. No teste Folato ADVIA Centaur, a amostra pr-
tratada para liberar o folato a partir das protenas ligadoras endgenas na amostra.
O sistema realiza automaticamente as seguintes etapas:
Adio 150L de amostra em uma cubeta;
Adio 50L de DDT/agente de liberao;
59
Adio 100L de Protena ligadora de folato e 200L de Fase Slida e
incuba durante 5,0 minutos a 37oC;
Adio 100L de Reagente Lite e incuba durante 2,5 minutos a 37oC
Separa, aspira e lava as cubetas com gua reagente;
Adio 300L de Reagente cido e a mesma quantidade de
Reagente Bsico para iniciar a reao quimiluminescncia;
Adio os resultados de acordo com a opo selecionada, conforme
descrito nas instrues operacionais do sistema ou no sistema de
ajuda on-line.
Existe uma relao inversa entre a quantidade de folato presente na
amostra do paciente e a quantidade de unidades relativas de luz (RLUs)
detectadas pelo sistema.
Tendo em vista que os folatos so sensveis luz, exposio luz deve
ser minimizada durante o manuseio e o armazenamento da amostra.
Os nveis de vitamina B12 foram determinados pelo teste VB12 ADVIA
Centaur que consiste em um imunoensaio competitivo que utiliza tecnologia
quimioluminescente direta. Neste teste, a vitamina B12 proveniente da amostra do
paciente compete com a vitamina B12 marcada com ster de acridina no reagente
lite por uma quantidade limitada do fator intrnseco purificado, que est
covalentemente ligado a partculas paramagnticas da Fase Slida. O teste utiliza
um agente de liberao (hidrxido de sdio) e DTT para liberar a vitamina B12
das protenas ligadoras endgenas na amostra e cobinamida para evitar a
religao aps a adio da Fase Slida amostra.
O sistema realiza automaticamente as seguintes etapas:
Lava a sonda do reagente auxiliar com 100 L de reagente auxiliar
para T3/T4/VB12;
Adio 100L de amostra em uma cubeta;
Adio 115L de DTT/agente de liberao;
Adio 200L de Fase Slida e incuba durante 5,0 minutos a 37oC;
Adio 200L de Reagente Lite e incuba durante 2,5 minutos a 37oC;
Separa, aspira e lava as cubetas com gua reagente;
60
Adio 300L de Reagente cido e a mesma quantidade de
Reagente Bsico;
Mostra os resultados de acordo com a opo selecionada, conforme
descrito nas instrues operacionais do sistema ou no sistema de
ajuda on-line.
Existe uma relao inversa entre a vitamina B12 na amostra e as unidades
relativas de luz (RLUs) detectadas pelo sistema.
Os coeficientes de variao intra e interensaio foram respectivamente 3,5 e
3,8 % para a vitamina B12 e de 3,9 e 4,5 % para o cido flico.
3.3. Anlise estatstica
As variveis so apresentadas como mdias erro padro da mdia
(contnua) ou nmero e percentagem (categricas). Para os objetivos desse
estudo, definimos concentraes plasmticas altas de Hcy como superiores a 15
mol/L. Uma vez que os nveis plasmticos de Hcy no diferiram
significativamente por sexo, esse cut off foi utilizado para homens e mulheres. As
concentraes sricas de cido flico foram categorizadas em altas quando acima
de 13 nmol/L e de vitamina B12 superiores a 251 pmol/L.
As associaes entre Hcy, cido flico, vitamina B12 e outros parmetros
bioqumicos foram feitas por coeficiente de correlao linear e por anlise de
regresso mltipla. O teste t de Student para amostras independentes e a anlise
de varincia de uma via tambm foram utilizados para vrias anlises
quantitativas, bem como o chi-quadrado para a comparao de variveis
qualitativas. Todas as anlises foram feitas usando o programa SPSS verso 15.0.
nveis de significncia foram considerados quando o P < 0,05.
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3.4. Aspectos ticos
A presente investigao foi aprovada pelo Comit de tica do Hospital de
Clnicas de Porto Alegre (processo GPPG nmero 06-419). Todos os
participantes (controles e pacientes com doena de Parkinson) do projeto
assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
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4. RESULTADOS
4.1 Caracterizao da amostra (controles e pacientes com doena de
Parkinson) quanto idade, sexo, estado civil, hipertenso alterial sistmica,
cardiopatia isqumica, diabete mlito, insuficincia renal, uso de tabaco e
bebidas alcolicas
Inicialmente procuramos caracterizar nossa amostra (controle e pacientes
com doena de Parkinson DP) em relao idade, sexo, estado civil, HAS,
cardiopatia isqumica, diabete mlito e tabagismo e uso de lcool. As tabelas IV.1
(sexo), 2 (cor), 3 (estado civil), 4 (HAS), 5 (cardiopatia isqumica), 6 (diabete
mlito), 7 (uso de tabaco) e 8 (uso de bebidas alcolicas). Verificamos que havia
mais indivduos do sexo masculino nos pacientes com DP do que nos controles
[Chi-quadrado = 6,557; P < 0,01] e que os indivduos normais (controles)
consumiam mais bebidas alcolicas (Chi-quadrado = 5,223; P < 0,05), enquanto
os outros parmetros (idade, estado civil, HAS, cardiopatia isqumica, diabete
mlito, insuficincia renal e uso de tabaco) no variaram entre os dois grupos.
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4.2 Comparao entre as concentraes sricas de homocistena, vitamina
B12, cido flico, uria, creatinina, cido rico e a idade em pacientes com a
doena de Parkinson e em controles normais
Logo a seguir investigamos se os nveis sricos de homocistena (Hcy) e
de outros parmetros bioqumicos, tais como cido flico, vitamina B 12, uria,
creatinina e cido rico, bem como a idade diferiam em indivduos portadores da
doena de Parkinson (DP), quando comparados ao controle. Verificamos que as
concentraes sricas de Hcy estavam significativamente maiores nos afetados
pela doena de Parkinson (DP) do que nos controles (t (78)= 2,688; P < 0,01]
(Figura IV.1), enquanto os outros parmetros bioqumicos e a idade no diferiram
entre os dois grupos(Tabela IV.9).
Tais resultados sugerem que o aumento da Hcy observado nos pacientes
com DP provavelmente no se deveu idade, as alteraes nos nveis de
vitamina B