Post on 18-Oct-2020
Universidade Federal Fluminense
Instituto Biomédico
Trabalho de Conclusão de Curso
Biomedicina
Natália Spitz Toledo Dias
Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações
relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de
HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados.
Habilitação: Análises Clínicas
Orientadora: Caroline Cordeiro Soares
Coorientadora: Bárbara Vieira do Lago
Laboratório de Virologia Molecular – FIOCRUZ
Niterói
2014
Universidade Federal Fluminense
Instituto Biomédico
Trabalho de Conclusão de Curso
Biomedicina
Natália Spitz Toledo Dias
Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações
relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de
HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados.
Monografia apresentada, como pré-requisito
de conclusão do curso de Biomedicina, com
habilitação em Análises Clínicas, ao Instituto
Biomédico, da Universidade Federal
Fluminense, orientada pela Doutora Caroline
Cordeiro Soares e coorientada pela Mestra
Bárbara Vieira do Lago, realizado no
Laboratório de Virologia Molecular -
FIOCRUZ.
Niterói
2014
iii
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a minha família, principalmente aos meus pais, Ana Paula e
Dias, por sempre terem me apoiado, me confortado nos momentos em que pensava ter falhado. Eles
sempre me impulsionaram a tentar ser o melhor que eu podia tanto na vida pessoal quanto
acadêmica, meus pais são o meu exemplo de esforço e dedicação, e me deram as condições
necessárias para que eu chegasse até aqui. Quero agradecer as minhas irmãs, Aline e Letícia, que
sempre foram minhas cúmplices, minhas melhores amigas, com quem sempre pude contar pra me
dar apoio nos momentos difíceis e sempre me proporcionaram momentos divertidíssimos.
Quero agradecer a todos o Laboratório de Virologia Molecular, principalmente às minhas
orientadoras Drª Caroline Cordeiro Soares e Ms. Bárbara Vieira do Lago que sempre foram tão
atenciosas comigo, sempre com muita paciência me ensinaram a rotina e as técnicas do laboratório,
sempre estando a disposição quando eu precisava tirar alguma dúvida. Sem a ajuda delas
provavelmente eu não teria concluído essa monografia, elas revisaram, revisaram de novo, até que
tudo parecesse estar perfeito. Quero agradecer aos meus companheiros da sala B15, Maria Clara,
Jéssica, Ágatha, Vinícius, Flávia, Oscar e Dr. Júnior, pelas conversas sempre divertidas e
instrutivas, pelas dicas, pelo estímulo e apoio em todas as situações.
Quero agradecer a todos da turma 2010.1 de biomedicina da UFF por ter sido uma turma
maravilhosa todos esses anos, eu não poderia ter desejado uma turma melhor. Com eles eu me
sentia a vontade, saber que eu podia contar com eles tornou mais fácil superar a dificuldade de ficar
longe de casa. Fiz grandes amizades que pretendo levar para o resto da vida, sei que é inevitável
perder o contado com alguns deles, mas sempre vou guardar com grande carinho as lembranças dos
momentos que vivi com essas pessoas incríveis. Obrigada por me deixarem participar do
crescimento pessoal e profissional de cada um de vocês!
Aos meus amigos Mariana e Raphael, e ao meu namorado Bruno, por sempre me descontraírem
quando eu estava estressada com alguma prova ou situação. Por me darem suporte e sempre
torcerem e acreditarem em mim mesmo quando eu não acreditava.
Obrigada a todos que me ajudaram a chegar até este momento!
iv
Resumo
Aproximadamente 10% dos indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)
são portadores crônicos do vírus da hepatite B (HBV). O monitoramento destes pacientes merece
atenção especial, já que estes progridem mais rápido para cirrose e morte por doença hepática do
que os monoinfectados pelo HBV. Por esse motivo, a terapia antiviral contra os dois vírus é
prioritária na maioria dos casos. Algumas drogas atuam na transcriptase reversa (TR), enzima
importante na replicação de ambos os vírus e, por isso, podem ser eficazes no tratamento das duas
infecções. No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante a terapia, levando a
diminuição da eficácia das drogas utilizadas. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as
mutações de resistência à Lamivudina (3TC) em populações de HBV e HIV isoladas de pacientes
coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento. Quarenta e cinco amostras de soro de
pacientes HBV/HIV coinfectados foram submetidas à análise da mutação primária rtM204V/I e das
compensatórias rtV173L e rtL180M do HBV e da mutação M184V/I do HIV-1. Todas as amostras
foram submetidas a um ensaio de nested-PCR para amplificação de um fragmento da polimerase
viral do HBV e a um RT-PCR para amplificação da região da TR do HIV-1. Vinte e cinco amostras
foram amplificadas com sucesso para o HBV e submetidas ao pirosequenciamento das mutações de
resistência do HBV. O RNA do HIV foi amplificado em treze amostras, que foram submetidas a
análise da mutação M184V/I. O sequenciamento de Sanger da região genômica S do HBV foi
realizado em 15 amostras e da região do motivo YMDD do HIV foi realizado em 2 amostras, para
posterior comparação com os resultados do pirosequenciamento. A análise da mutação M204V/I foi
realizada com sucesso em 23 amostras. A maioria das amostras (69,6%; 16/23) apresentou uma
mistura de populações selvagens (M204) e mutantes (M204V/I). Apenas população mutante
M204V foi encontrada em 21,7% (5/23) e 8,7% (2/23) das amostras estudadas eram compostas
apenas por populações selvagens. A mutação V173L foi investigada em 20 amostras. Apenas
populações selvagens foram encontradas em 90% (18/20) das amostras e apenas populações
mutantes foram encontradas em 10% (2/20) das amostras. Nas amostras submetidas ao
sequenciamento de Sanger o resultado foi o mesmo em ambos os métodos, com exceção das
amostras que apresentaram população mista no pirosequenciamento, as quais o sequenciamento
padrão detectou apenas as populações majoritárias. A mutação L180M foi investigada em 15
amostras e apenas cepas selvagens foram encontradas, pelo método de pirosequenciamento, no
entanto, esse resultado foi desconsiderado devido a uma provável falha no oligonucleotídeo
utilizado para essa mutação, uma vez que o sequenciamento de Sanger detectou 4 amostras com
essa mutação. A mutação M184V/I do HIV foi investigada em 9 amostras, e apenas populações
v
selvagens foram encontradas. O mesmo resultado foi confirmado pelo sequenciamento. O
pirosequenciamento é uma técnica sensível que pode ser útil na detecção e quantificação de
subpopulações de vírus resistentes, que talvez não fossem detectadas por outros métodos. Porém
alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que foi encontrada nas
amostras analisadas apenas pela técnica de Sanger. A alta sensibilidade do pirosequenciamento
permite que se avalie a melhor conduta terapêutica para um paciente, pois é possível detectar a
proporção de cepas selvagens e mutantes infectando o indivíduo, permitindo uma intervenção
precoce durante o tratamento.
Palavras chave: HBV, HIV, Lamivudina.
vi
Abstract
Approximately 10% of individuals infected with human immunodeficiency virus (HIV) are chronic
carriers of hepatitis B virus (HBV). The monitoring of these patients deserves special attention, as
they progress more rapidly to cirrhosis and death from liver disease than HBV monoinfected. For
this reason, the antiviral therapy against the two viruses is a priority in most cases. Some drugs act
in reverse transcriptase (RT), an important enzyme in the replication of both viruses and, therefore,
can be effective in the treatment of both diseases. However, resistance mutations may be selected
during therapy, leading to reduced efficacy of the used drugs. The aim of this study was to detect
and quantify lamivudine (3TC) resistance mutations in isolated populations from HBV/HIV
coinfected patients by pyrosequencing technique. Forty -five serum samples from HBV/HIV
coinfected patients were analyzed for primary mutation rtM204V/I and compensatory mutations
rtV173L and rtL180M inHBV and M184V/I mutation in HIV–1 genomes. All samples were
subjected to a nested-PCR assay to amplify a fragment of HBV viral polymerase and an RT - PCR
amplification of the HIV-1 RT region. Twenty-five samples were successfully amplified for HBV
and subjected to pyrosequencing of HBV resistance mutations. The HIV RNA was amplified in
thirteen samples, which were submitted to analysis of the M184V/I mutation. The Sanger
sequencing of the HBV S genomic region was performed on 15 samples and the HIV YMDD motif
was performed on 2 samples for comparison with the results of pyrosequencing. The analysis of the
M204V/I mutation was successfully performed on 23 samples. Most samples (69.6%, 16 /23)
showed a mixture of wild populations (M204) and mutants (M204V/I). Only M204V mutant
population was found in 21.7 % (5 /23) and 8.7 % (2/23 ) of samples studied were composed only
of wild populations. The V173L mutation was investigated in 20 samples. Only wild populations
were found in 90 % (18/20) of the samples, and only mutant populations were found in 10% (2 /20)
of the samples. In the samples subjected to Sanger sequencing it was found the same results for both
methods, except for samples with mixed population in pyrosequencing, which the standard
sequencing detected only the majority populations. The L180M mutation have been investigated
only in 15 samples and only wild strains were found by pyrosequencing method , however , this
result was disregarded due to a likely failure of the primer used for this mutation, since the Sanger
sequencing detected this mutation in 4 samples. The M184V / I mutation of HIV was investigated
in 9 samples, and only wild populations were found by pyrosequencing. The same result was
confirmed by standard sequencing. The pyrosequencing is a sensitive technique that can be useful
in the detection and quantification of subpopulations of resistant viruses that may not be detected by
other methods. However, some adjustments must also be made for the detection of mutations
vii
rtL180M, which was found only in the samples analyzed by the Sanger technique. The high
sensitivity of pyrosequencing enables one to evaluate the best treatment for a patient, because it is
possible to detect the ratio of wild type and mutant strains infecting an individual, allowing early
intervention during treatment.
Key-words: HBV, HIV, lamivudine.
viii
Sumário
I. Introdução...........................................................................................................................................1
I.1. VÍRUS DA HEPATITE B (HBV)..................................................................................................1
I.1.1 – Histórico....................................................................................................................................1
I.1.2 - Propriedades gerais....................................................................................................................1
I.1.3 – Organização Genômica.............................................................................................................3
I.1.4 – Replicação do HBV...................................................................................................................6
I.1.5 – Transmissão............................................................................................................................. ..8
I.1.6 – Patogenia...................................................................................................................................9
I.1.7 – Aspectos clínicos e marcadores sorológicos...........................................................................10
I.1.8 – Tratamento...............................................................................................................................12
I.2 – VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV)............................................................14
I.2.1 – Histórico..................................................................................................................................14
I.2.2 – Propriedades Gerais................................................................................................................15
I.2.3 – Organização genômica............................................................................................................16
I.2.4 – Replicação do HIV..................................................................................................................18
I.2.5– Transmissão..............................................................................................................................21
I.2.6 – Patogenia.................................................................................................................................22
I.3.7 – Evolução clínica......................................................................................................................23
I.2.8 – Tratamento...............................................................................................................................24
I.3 – COINFECÇÃO HBV-HIV.........................................................................................................26
I.4 - A TRANSCRIPTASE REVERSA..............................................................................................27
I.5 – PIROSEQUENCIAMENTO E MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA...........................................28
II. Objetivos............................................................................................................................................31
II.1 - Objetivo Geral...........................................................................................................................31
II.2 - Objetivos específicos.................................................................................................................31
III. Metodologia
III.1 – Amostragem.............................................................................................................................32
III.2 – Extração de ácidos nucléicos................................................................................................. ..32
III.3 – Ensaios de PCR.................................................................................................... ...................33
III.4 – Eletroforese..............................................................................................................................33
ix
III.5 – Pirosequenciamento ................................................................................................................34
III.6 - Sequenciamento Padrão........................................................................................................ ...36
III.7 - Alinhamento das sequencias e análise filogenética .................................................................37
IV – Resultados e Discussão.............................................................................................................38
V – Conclusão...................................................................................................................................51
VI – Referências Bibliográficas.......................................................................................................52
x
Lista de figuras
Figura 1.1 - Estrutura do HBV........................................................................................................... 2
Figura 1.2 – Microscopia eletrônica das partículas virais infecciosas e não infecciosas
do HBV ............................................................................................................................................... 3
Figura 1.3 – Modelo esquemático do genoma do HBV .................................................................... 6
Figura 1.4 – Modelo esquemático do ciclo replicativo do HBV ....................................................... 8
Figura 1.5 – Perfil sorológico da infecção pelo HBV ..................................................................... 11
Figura 1.6 - Mutações de Resistência a antivirais na Polimerase do HBV ......................................13
Figura 2.1 - Estrutura do HIV-1 ....................................................................................................... 15
Figura 2.2 - Organização genômica do HIV-1 ................................................................................. 18
Figura 2.3 - Ciclo replicativo do HIV ............................................................................................. 21
Figura 3.1 – Resultado pirosequenciamento ................................................................................... 35
Figura 3.2 - Exemplo de um pirograma fornecido pelo software PyroMark ID no AQ mode ........ 36
Figura 4.1 - Árvore filogenética HBV ............................................................................................. 48
xi
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR ............................................................... 34
Tabela 2 - Oligonucleotídeos utilizados no pirosequenciamento ................................................................... 36
Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados no seqüenciamento do HBV ............................................ 37
Tabela 4 - Informação de origem e tratamento dos pacientes........................................................... 39
Tabela 5 - Resultados das análises da mutação rtM204V/I ............................................................. 41
Tabela 6 - Comparação seqüenciamento e pirosequenciamento...................................................... 43
Tabela 7 - Resultados das análises da mutação rtL180M................................................................ 44
Tabela 8 - Resultados das análises da mutação rtV173L................................................................. 46
Tabela 9 - Resultados das análises da mutação M184V................................................................... 49
1
I – INTRODUÇÃO
I.1 – Vírus da Hepatite B
I.1.1. – Histórico
Em 1965, Blumberg e colaboradores publicaram o que viria a ser uma das
maisimportantes revelações sobre as hepatites virais. O primeiro trabalho, que buscava
caracterizartraços polimórficos hereditários em amostras de soro de diversas regiões geográficas
domundo, identificou um antígeno que aparentemente estaria relacionado a um tipo de
hepatitesérica (Blumberg et al, 1965). Neste estudo foi identificado um antígeno em uma amostra
desoro de um aborígene australiano que reagia especificamente com um anticorpo presente nosoro
de um paciente hemofílico americano. Denominou-se, então, esse antígeno de Austrália(Au), o qual
era relativamente raro na América do Norte e Europa ocidental e prevalente empopulações africanas
e asiáticas e entre pacientes com leucemia, síndrome de Down e hepatite aguda (Blumberg et al,
1967; Bayer et al, 1968). Estudos posteriores (Okochi e Murakami,1968; Prince, 1968) mostraram
que este antígeno era exclusivamente encontrado no soro deindivíduos infectados pelo vírus da
hepatite B (HBV). Posteriormente, a purificação do HBVfoi realizada a partir do soro de portadores
do antígeno Au e a partícula completa do vírus foidetectada por microscopia eletrônica (Dane et al,
1970).
Vários vírus que possuem tropismo pelos hepatócitos são conhecidos
atualmente,sendo o HBV o primeiro identificado em 1970, seguido pelo vírus da hepatite A (HAV)
(Feinstone et al, 1973), vírus da hepatite D (HDV) (Rizzeto et al, 1977), vírus da hepatite E (HEV)
(Balayan et al, 1983) e vírus da hepatite C (HCV) (Choo et al, 1989). Outros vírus foram
identificados em indivíduos com quadro clínico de hepatite pós-transfusional não A-E, porém uma
correlação direta entre as hepatopatias e as infecções causadas por esses vírus ainda não pôde ser
confirmada. Dentre eles, destacam-se o vírus da hepatite G (HGV) (Simons et al, 1995), Torque
Teno vírus (TTV) (Nishizawa et al, 1997), Torque Teno Mini virus (TTMV) (Takahashi et al, 2000)
e Torque Teno Midi vírus (TTMDV) (Ninomiya et al, 2007).
I.1.2 – Propriedades gerais
O HBV pertence à família Hepadnaviridae, que engloba um pequeno número de
vírusde DNA que apresentam tropismo por células hepáticas. Esta família é dividida em
2
doisgêneros: Orthohepadnavirus, composto por vírus que infectam mamíferos, incluindo o vírusda
hepatite B humana e Avihepadnavirus, que compreende os vírus que infectam aves(Fauquet et al,
2005; ICTV, 2012).A partícula viral completa infecciosa, também conhecida como partícula de
Dane, éesférica, com diâmetro de aproximadamente 42 nm (Dane et al, 1970). Os vírions
sãoformados por um envelope externo de glicoproteínas que constitui o antígeno de superfície
dovírus (HBsAg) (Dane et al, 1970; Almeida et al, 1971; Robinson & Lutwick,1976). OHBsAg é
composto por três proteínas: L (large), M (middle) e S (small) distribuídas emquantidades distintas
pelo envelope (Tiollais et al, 1985). O nucleocapsídeo possui simetriaicosaédrica e é formado pela
proteína do core (HBcAg) (Almeida et al, 1971) e pelo genomaviral (Robinson et al, 1974) (Figura
1.1). Estima-se que o soro de indivíduos infectados peloHBV possa apresentar concentrações
superiores a 109 partículas virais por mL (Ganem, 1996).
Figura 1.1: Estrutura do HBV. Modelo esquemático de partícula de Dane. Disponível
em: <http://people.rit.edu/japfaa/infectious.html> [Acesso em 23 jun. 2013] (Figura adaptada para o
português).
3
Além das partículas completas infecciosas, no soro de pacientes infectados podem
serencontrados outros dois tipos de partículas não infecciosas, as esféricas e filamentosas, quesão
constituídas apenas pelo HBsAg e por alguns lipídeos oriundos da célula hospedeira(Figuras 1.2).
As partículas esféricas possuem cerca de 20 nm de diâmetro e as partículasfilamentosas possuem,
aproximadamente, 22 nm de largura e comprimento variável (Robinson et al, 1976; Laub et al,
1983). Elevados níveis destas partículas não infecciosas podem ser encontradas nas fases aguda e
crônica da infecção. Presentes em concentrações superiores a 1013
partículas por mL de soro, essas
partículas não promovem infecção, pois não possuem o genoma do vírus (Rizzetto, 1998). Apesar
disso, as partículas subvirais são altamente imunogênicas e eficientes em induzir a resposta
neutralizante de anticorpos anti-HBs (Ganem, 1996).
Figura 1.2:Microscopia eletrônica das partículas virais infecciosas e não infecciosas
do HBV.Disponível em: <http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html>. [Acesso em 23 jun.
2013](Figura adaptada).
I.1.3 – Organização Genômica
O genoma do HBV, um dos menores entre os vírus que infectam o homem,
éconstituído por uma molécula de DNA circular de fita parcialmente dupla, comaproximadamente
3.200 pares de base (pb) de tamanho. A fita mais longa é complementar aos RNAs virais e, por
convenção, possui polaridade negativa (Gerlish & Robinson, 1980). Na fita de polaridade positiva,
a posição da extremidade 5’ terminal é fixa, enquanto que a posição da extremidade 3’ terminal é
4
variável. Desta forma, o comprimento da fita positiva varia de 50% a 90% do comprimento da fita
complementar (Ganem, 1996).
O genoma do HBV possui quatro fases de leitura aberta (Open Reading Frames -
ORFs) designadas de pré-S/S, pré-C/C, P e X (Shafritz & Lieberman, 1984). As ORFs
sãototalmente codificantes e estão parcialmente sobrepostas, permitindo que o HBV codifique 50%
mais proteínas do que seria esperado devido ao reduzido tamanho do seu genoma (Heermann et al,
1984; Ganem & Varmus, 1987) (Figura 1.3).
O gene pré-S/S, inclui as regiões pré-S1, pré-S2 e S, com três códons de iniciação na
mesma fase de leitura. Este gene codifica as proteínas que compõe o HBsAg, a proteína estrutural
que forma o envelope viral. A proteína L ou large, a de maior tamanho, é codificada a partir do
códon de iniciação localizado no começo da região pré-S1 e sua síntese se estende pelas regiões
pré-S1, pré-S2 e S. A proteína M ou middle é codificada pelas regiões pré-S2 e S, a partir do
segundo códon de iniciação localizado no início da pré-S2 e a proteína S ou small, a menor das
proteínas, é codificada a partir do terceiro códon de iniciação localizado no início da região S.
Todas as proteínas têm sua síntese interrompida no mesmo códon de parada localizado no final da
região S (Seeger e Mason, 2000).
Essas proteínas não são encontradas de maneira uniforme entre os diferentes tipos de
partículas virais (Heermann et al, 1984). As partículas subvirais, não infecciosas, são compostas
predominantemente por proteínas S, apresentando quantidades variáveis de proteínas M e poucas
cadeias L. Entretanto, as partículas virais infecciosas são enriquecidas de proteínas L. Como essas
proteínas são as que possuem os sítios de ligação do HBV aos receptores dos hepatócitos (Neurath
et al, 1986; Klingmuller & Schaller, 1993), é compreensível que a partícula infecciosa possua um
número consideravelmente maior de proteínas L quando comparada às partículas não infecciosas, as
quais sendo mais numerosas poderiam competir com os vírions pelos sítios de ligação aos
hepatócitos (Ganem et al, 1996).
O gene pré-C/C apresenta-se como a região mais conservada do genoma
viral,possuindo dois códons de iniciação na mesma fase de leitura aberta. A proteína HBeAg,
umaproteína não estrutural, é sintetizada a partir do primeiro códon de iniciação localizado naregião
pré-C e sua síntese se estende por toda a região C. Essa proteína é um importante marcador
sorológico de replicação viral ativa (Garcia et al, 1988; Nassal & Rieger, 1993), no entanto, ainda
não se sabe ao certo seu papel na biossíntese viral. Alguns estudos atribuem ao HBeAg a função de
atenuar a resposta imunológica do hospedeiro à proteína do nucleocapsídeo (Chang et al, 1987),
diminuir e manipular as respostas adaptativa e inata (Chen et al, 2004), possui a capacidade de
cruzar a placenta para induzir tolerância in uteropromovendo, assim, a persistência após a infecção
5
perinatal (Milich et al, 1990). Já a proteína HBcAg, uma proteína estrutural que compõe o
nucleocapsídeo viral, é codificada a partir do segundo códon de iniciação localizado no início da
região C. Esta proteína é capaz de induzir a produção de anticorpos (anti-HBc) pelo hospedeiro,
sendo importante, assim como o HBsAg, no diagnóstico sorológico da infecção (Milich &
McLachlam, 1986).
O gene P, o maior dos genes do HBV, cobre aproximadamente ¾ do genoma viral
ecodificaa polimerase viral, uma enzima multifuncional com 832 aminoácidos. Essa proteína é
funcionalmentedividida em quatro domínios: o domínio amino-terminal, com atividade de DNA
primase,necessário para o início da síntese da fita de DNA de polaridade negativa; uma
regiãochamada de espaçadora, que parece não ter nenhuma função em particular; o domínio
datranscriptase reversa, que catalisa a síntese do genoma; e o domínio carboxi-terminal quepossui
atividade de RNAse H. No gene da polimerase está presente o motivo Tyr-Met-Asp-Asp (YMDD),
essencial para a atividade de transcrição reversa (Toh et al, 1983) e que é bem conservado em todas
as transcriptases reversas virais, constituindo o sítio mais comum de aparecimento de mutações de
resistência a fármacos (François et al, 2001; Gaillard et al., 2002; Kim et al., 2012).
O gene X codifica a proteína não estrutural HBx. Essa proteína é um regulador viral
multifuncional que modula a replicação do HBV, a transcrição celular, o sinal de transdução, a
atividade do proteossoma e progressão do ciclo celular (Kim et al, 1991; Xu et al, 2010), e pode
induzir a apoptose diretamente ou sensibilizar hepatócitos a uma variedade de estímulos apoptóticos
(Kim et al, 2005). HBx também tem sido relacionado a inflamação e imunomodulação. Em
linhagens celulares de hepatoma humano, HBx induz a transcrição de citocinas inflamatórias, tais
como TNF-α, IFN-c e IL-6 (Lara-Pezzi et al, 1998; Lee et al,2010; Xiang et al, 2011). HBx também
aumenta a expressão de moléculas que são importantes na resposta imune, como o complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) (Zhou et al, 1990).
Com base na divergência em pelo menos 8% da sequência nucleotídica do genoma
completo, o HBV foi classificado em sete genótipos (A a G) apresentando uma distribuição
geográfica distinta na população mundial (Norder et al, 1993; Norder et al, 1994; Stuyver et al,
2000; Arauz-Ruiz et al, 2002). O genótipo H apresenta uma divergência em seu genoma menor que
8% quando comparado a outro mais próximo, o genótipo F (Katoet al, 2005).Portanto, foi proposta
como critério de divergência no genoma completo, a utilização de 7,5% para a designação de novos
genótipos (Kramviset al, 2008; Kurbanov et al, 2010). Além disso, os genótipos A, B, C, D e F são
subdivididos em subgenótipos com propriedades virológicas e epidemiológicas características
(Schaefer, 2007).Recentemente, dois novos genótipos foram propostos: o genótipo I (Olinger et al,
2008) e o genótipo J (Tatematsu et al, 2009). A classificação do genótipo I parece ser bem aceita
6
(Tran et al, 2008; Colson et al, 2009; Zhang et al, 2010; Yu et al, 2010; Santos et al, 2010), no
entanto ainda são necessários mais estudos para que sejam justificadas tais classificações (Kurbanov
et al, 2010; Liu et al, 2010).
Figura 1.3:Modelo esquemático do genoma do HBV (Fonte: Gomes, 2003)
I.1.4 – Replicação do HBV
A replicação do HBV realiza-se por um mecanismo único dentre os vírus de
DNAanimais, uma vez que apresenta uma etapa envolvendo a produção de um intermediário
deRNA e a sua conversão em DNA pela ação da transcriptase reversa viral(Ganem, 1996; Nassal &
Schaller, 1996).
A infecção pelo HBV tem início a partir da adsorção viral ao aos receptores nos
hepatócitos e entrada do vírion na célula. Uma vez no citoplasma do hepatócito, o vírion perde seu
nucleocapasídeo e é transportado até o núcleo celular, onde ocorre a liberação do genoma viral
(Ganem et al, 1996).
Inicialmente, o DNA viral é convertido em uma forma de dupla fita circular
7
covalentemente ligada (cccDNA). Para tanto, a fita positiva é complementada pela DNA polimerase
celular. O cccDNA é transcrito em RNAs genômicos e subgenômicos pela RNA polimerase II
celular. Os RNAs subgenômicos atuam exclusivamente como RNAs mensageiros para a tradução
das proteínas do envelope e da proteína X. Já os RNAs genômicos servem tanto de molde para a
síntese de DNA viral (sendo chamado, neste caso, de RNA pré-genômico) como de RNAs
mensageiros para a tradução da proteína do core, da polimerase viral e do HBeAg. Os transcritos de
RNA são, então, transportados para o citoplasma celular onde serão traduzidos em suas respectivas
proteínas. Um sinal de encapsidação (ε), localizado na extremidade 5’ do RNA pré-genômico é
responsável pelo empacotamento, no citoplasma, deste RNA nos capsídeos imaturos durante a
replicação (Kidd-Ljunggren et al, 2002). A transcrição reversa é iniciada no interior do capsídeo,
onde a fita negativa é sintetizada a partir do molde de RNA viral, o qual é concomitantemente
degradado pela atividade de RNAse H da polimerase. A fita de polaridade positiva é sintetizada a
partir da fita negativa. Durante este processo, o genoma do HBV é circularizado com a
peculiaridade da fita positiva não ser completamente sintetizada, resultando em um genoma de fita
parcialmente dupla. O nucleocapsídeo pode, então, retornar ao núcleo, liberar o DNA viral (que
pode ser convertido novamente em cccDNA) para a amplificação de novos genomas (Tuttleman et
al, 1986) ou seguir para membranas intracelulares do retículo endoplasmático ou do complexo de
Golgi contendo as glicoproteínas do envelope do vírus para ser envelopado e posteriormente
secretado através da via de secreção constitutiva (Figura 1.4) (Pollack & Ganem, 1993;
Papatheodoridis et al, 2002; Ganem & Prince, 2004).
8
1.4:Modelo esquemático do ciclo replicativo do HBV (Fonte: Ganem & Prince, 2004 –
Figuraadaptada para o português).
I.1.5 – Transmissão
O HBV pode ser encontrado principalmente no sangue de indivíduos infectados. Além
disso, pode ser detectado em fluidos corporais, como urina, saliva, fluido nasofaringeano, sêmen e
fluido menstrual (Alter et al, 1977; Davison et al, 1987). A transmissão do HBV pode ocorrer por
exposição perinatal, através de relação sexual, por exposição a sangue ou derivados, transplante de
órgãos ou tecidos, seringas compartilhadas por usuários de drogas endovenosas, por lesões de pele,
objetos perfurocortantes ou através de outras exposições de origens desconhecidas (Gonçales, 1997;
Chakravarti et al, 2005; Lee et al, 2006; Gambarin-Gelwan, 2007).
9
I.1.6 – Patogenia
A infecção pelo HBV causa doença hepática em que o grau de severidade pode variar de
pessoa para pessoa. Isto ocorre tanto devido a fatores do hospedeiro, como as respostas imunes intata,
humoral e celular (Rehermann, 2003), como também devido a fatores virais, como certos genótipos,
mutaçõese a carga viral (Bertoletti, 2006). A resposta celular contra o HBV é mediada por linfócitos T, que
são responsáveis pela lesão hepática tanto na fase aguda como na fase crônica da doença (Ichiki et al,
2005).
Na infecção pelo HBV, a resposta inata é induzida após aprimeira semana de infecção e é
mediada pelas próprias célulasinfectadas que reconhecem a presença do vírus e respondemcom a produção
de interferon tipo I (INF-I) α/β que interferena síntese viral por indução de diversas proteínas (Samuel,
2001; Rehermann et al, 2005).
O HBV fica quiescente até 4-7 semanas da infecção, quando inicia multiplicação vigorosa que
geralmente é controlada por linfócitos T, tanto CD4+ como CD8+ específicos que podem ser detectados
durante o aumento da replicação viral (Bertoletti et al, 2003). A diminuição da replicação viral é observada
com o aumento proporcional das transaminases, que é indicativa de injúria hepática mediada por linfócitos
T (Rehermann et al, 2005; Bertoletti et al, 2003). A eliminação do HBV na infecção aguda está associada
auma resposta vigorosa, policlonal e multiespecífica dos linfócitos TCD4+ e CD8+ aos epítopos do HBV;
(Rehermann et al, 2003; Ichikiet al, 2005). Na resposta agudaauto-limitada a maior parte dos virions do
HBV são eliminadosna fase de incubação sem a destruição das células do fígadodevido a ação de citocinas
antivirais TNFα e INFγ produzidaspela resposta inata e adaptativa por mecanismo não citolítico mediado
por células não T (Ferrari et al, 2003)
Na fase crônica do HBV, alguns pacientes conseguemeliminação tardia devido a produção de
grandes quantidades de citocinas e linfócitos TCD8+ específicos que diminuem a carga viraldo HBV
(Rehermann et al, 2003).A persistência do HBV pode estimularcontinuamente os linfócitos T específicos
que por sua vez, previnemre-infecções, mas a recuperação e proteção contra re-infecçõesnão estão
necessariamente associadas a imunidade perene(Rehermann et al, 2003). Os pacientes cronicamente
infectados que adquirem HBV na idade adulta geralmente apresentam um defeito na respostaespecífica dos
linfócitos T (Bertoletti et al, 1994). Diversos mecanismos têm sidopropostos para explicar a disfunção dos
linfócitos T, como a tolerânciaimunológica do fígado, a exaustão dos linfócitos T devido a altos níveisde
antígenos HBsAg e HBeAg (Ferrari et al, 2006) e a supressão da respostapelos linfócitos T regulatórios
(Bertoletti, 2006).
O tipo de inóculo e a cinética de replicação do HBV podeminduzir a uma grande resposta
imune caso o vírus infecterapidamente a maioria dos hepatócitos, mas a infecção desítios extra-hepáticos
10
pode não ser acessível aos linfócitos Tespecíficos contra o HBV. O escape viral e o aparecimento
demutações também dificultam o reconhecimento dos epítopos virais. A alta incidência de cronificação na
transmissãovertical do HBV pode decorrer de uma imaturidade do sistemaimune do recém nascido
determinando diminuição da ação dos linfócitos T, com menor secreção de TNFα e INFγ no fígado
(Nakamuraet al, 2001),com uma fase de imunotolerância que pode se prolongar pordécadas permitindo
altos níveis de DNA-HBV, HBeAg etransaminases normais.
Diversos trabalhos com chimpanzés demonstraram que as manifestações hepáticas da hepatite
B aguda ocorrem quando os níveis de DNA-HBV tornam-se indetectáveis, ou seja, a lesão resulta da ação
dos linfócitos T CD4+ e CD8+ bem como da indução das citocinas como TNFα e INFγ no fígado,
evidenciando o caráter não citopático da doença (Guidottiet al, 1999). Como conseqüência do dano
hepático repetido, verifica-se a tendência para instalação do quadro de cirrose. Esse quadro representa uma
associação direta entre o grau de comprometimento dos hepatócitos e o tempo de infecção (Lee et al,
1997).
I.1.7 – Aspectos clínicos e marcadores sorológicos
O HBV pode causar hepatites aguda, fulminate e crônica, podendo, nesse caso, haver
evolução para um quadro de cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (Gonçales et al, 1997).
A hepatite B aguda caracteriza-se pela presença de anticorpos anti-HBc da classe IgM,
além dos antígenos HBs, principal marcador de infecção presente, e HBe, marcador de replicação
viral ativa, no soro do paciente infectado. Concomitantemente, o DNA pode ser detectado (Sjogren
et al, 1994).
Durante a fase de convalescença, os títulos de anti-HBc IgM decaem, ao passo que os
títulos de anti-HBc IgG aumentam, normalmente permanecendo detectáveis por toda a vida. Nessa
fase, o HBsAg e o HBeAg tendem a desaparecer, e surgem os anticorpos anti-HBe e anti-HBs. Esse
último, um anticorpo protetor que neutraliza o vírus após infecção aguda (figura 1.5 A e B). Os
marcadores de replicação viral e as manifestações clínicas evoluem de forma dependente da
interação vírus-hospedeiro (Sjogren et al, 1994).
11
Figura 1.5: Perfil sorológico da infecção pelo HBV. A – Marcadores da infecção aguda. B –
Marcadores da infecção crônica. Fonte:
<http://www.infekt.ch/index.php?catID=14&artID=644>[Acesso em 22 maio 2013] (Figura
adaptada para o português).
A associação da hepatite B a casos de carcinoma hepatocelular ocorre normalmente em
indivíduos com sorologia positiva para o HBsAg e para o Anti-HBc. Pode estar muitas vezes
associado ao genótipo do vírus infectante e acaracterísticas particulares do hospedeiro. A integração
do DNA viral ao hospedeiro parece ser o evento inicial, capaz de induzir alterações celulares e no
genoma do HBV, desencadeando processos de mutagênese e carcinogênese (Zhou et al, 1988).
Os portadores crônicos constituem o principal reservatório do HBV, devido à persistência
viral no organismo. Em função disso, pacientes com a infecção crônica representam um sério risco
de transmissão da doença(Coursaget et al, 1991; Elghouzzi et al, 1995).
Os principais fatores associados à progressão da hepatite crônica incluem a idade na qual
o indivíduo foi infectado, que é inversamente proporcional ao risco de cronicidade, e o status
imune, destacando-se a imunossupressão, como a que ocorre em indivíduos portadores do vírus da
imunodeficiência humana (HIV), pacientes renais crônicos que fazem hemodiálise, pacientes renais
12
crônicos pós-transplante e leucêmicos. A infecção dos recém-nascidos, apesar de geralmente
assintomática, representa um risco de cerca de 90% de evolução para a forma crônica da doença.
Acredita-se que o estado de imaturidade do sistema imune nos muitos jovens seja importante no
desenvolvimento desse tipo de infecção (Strauss et al, 2003).
I.1.8 – Tratamento
A terapia temcomo objetivo mais importante a prevenção da mortalidade e morbidade
hepática como ocarcinoma hepatocelular e complicações cirróticas (Wong & Chan, 2013).
Nas últimas décadas, o desenvolvimento de agentes antivirais permitiu um
avançonaterapia contra o HBV. Entre esses agentes, análogos de nucleot(s)ídeos sãoimportantes e
potentes supressores virais. Os análogos de nucleot(s)ídeos são moléculas que atuam como
terminadoras de cadeia, pois impedem a replicação por não possuírem o grupo 3’hidroxila da ribose
que faz ligação fosfodiéster, impedindo portanto o ataque nucleofílico do fosfato 5’ do nucleotídeo a
ser adicionado à hidroxila 3’, e consequentemente a extensão da cadeia nascente (Yarchoan et al,
1989; Hart et al, 1992; Vivet-Bodou et al, 2006). No entanto, quando administrados sozinhos,
elesnão são capazes de abolir definitivamente o vírus, sendo necessária a manutenção da terapia a
longo prazo para que haja eficácia terapêutica. Porém, o tratamento prolongado é
frequentementerelacionado ao surgimento de mutantes resistentes a drogas (Chien, 2010)
(Figura1.6).
Sete drogas estão atualmente disponíveis para o tratamento da hepatite B
crônica:interferon α (IFN-α) e interferon peguilado α-2a (PEG-IFN α-2a) e os análogos
denucleot(s)ídeos lamivudina (3TC), adefovir dipivoxil (ADV), entecavir (ETV), telbivudina(L-dt)
e tenofovir (TDF) (Hoofnagle et al, 2007; Lok & McMahon, 2007; Marcellin, 2009).
No caso de resistência a análogos de nucleot(s)ídeos é necessário iniciar uma terapia de
resgate com o antiviral mai efetivo e que não compartilhe resistência cruzada para minimizar o risco
de induzir cepas multiresistentes (EASL, 2012). Segundo os guias de tratamento da AASLD
(American Association for the Study of Liver Diseases) de 2009 e EASL (European Association for
the Study of the Liver) de 2012, a terapia de resgate de pacientes resistentes a Lamivudia deve ser
realizada por meio da adição de Adefovir ou Tenofovir ao tratamento. Em casos de resistência ao
adefovir oProtocolo Clínico e DiretrizesTerapêuticas para o Tratamentoda Hepatite Viral Crônica B
e Coinfecções brasileiro (Brasil, 2010) recomenda que pacientes que já estejam em uso de adefovir
eapresentem evidências de resistência devem ser resgatadospreferencialmente mediante sua
substituição por tenofovirassociado à lamivudina, desde que não a tenham utilizadopreviamente. Já
13
a EASL (2012) recomenda a troca por entecavir, ou tenofovir, ou tenofovir mais emtricitabina.
Foram descritos poucos casos de resistência ao entecavir, mas nesses casos adiciona-se o tenofovir
ao esquema de tratamento (ETV+TDF) (Sherman et al, 2007; Sherman et al, 2008).
O tratamento contra a infecção pelo HBV não é indicado para todas as fases dainfecção,
sendo restrito aos casos onde ocorre dano hepático. Segundo oProtocolo Clínico e
DiretrizesTerapêuticas para o Tratamentoda Hepatite Viral Crônica B e Coinfecçõesbrasileiro
(Brasil, 2010) os critérios utilizados para tratamento da hepatite B são positividade para o HBeAg e
alterações nos níveis de aminotransferases hepáticas (ALT/AST), assim como preconizado pelas
sociedades europeia (EASL, 2012) e americana (AASLD, 2009).
Figura1.6: Mutações de Resistência a antivirais na Polimerase do HBV. Fonte: Lok et al, 2007
(Figura adaptada para o português).
14
I.2 – Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
I.2.1 – Histórico
A AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida) foi identificada pela primeira vez em
1981 nos Estados Unidos da América após relatos de imunodeficiência em homossexuais jovens do
sexo masculino (Gottlieb et al, 1981). Posteriormente, foi descrito um quadro clínico semelhante
em pacientes hemofílicos que haviam recebido hemoderivados previamente purificados e filtrados
em filtros bacteriológicos. Como os filtros bacteriológicos não impediam a passagem de vírus, o
fato chamou atenção para que o possível agente etiológico da AIDS pudesse ser um vírus
(Montagnier, 2010).
Em 1983, um grupo de pesquisadores do Instituto Pasteur isolou um novo retrovírus
citopático para linfócitos, que ficou conhecido como LAV (Lymphadenopathy-Associated virus)
(Barre-Sinoussi et al, 1983). Concomitantemente, Robert Gallo conseguiu isolar o HTLV-1 de
alguns casos (2 de 33) de pacientes com AIDS, falhando em estabelecer a causa da doença (Gallo et
al, 1984). No ano seguinte seu grupo conseguiu isolar o retrovírus responsável, sob o nome de
HTLV-3 (Popovic et al, 1984). Neste mesmo ano, foi isolado um retrovírus a partir de pacientes
doentes de AIDS de diferentes grupos de risco, que recebeu a denominação de ARV (AIDS-
Associated Retrovirus) (Levy et al, 1984).
Em 1985, análises das sequências de nucleotídeos dos vírus HTLV-3, LAV e ARV
isolados de diversos pacientes com AIDS demonstraram que os mesmos eram muito semelhantes e
pertenciam à mesma família de retrovírus. Em 1986, o International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV) renomeou estes agentes como Human Immunodeficiency Virus (HIV) (Coffin et al,
1986). Desta forma, o agente causador da AIDS foi isolado e descrito como um lentivírus da família
Retroviridae e ficou conhecido como Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (Barre-Sinoussi et
al, 1983; Levy et al, 1984; Popovic et al, 1984).
Em 1984, foram relatados vários casos de imunodeficiência na África central entre
pacientes sem histórico de comportamento de risco (Clumeck et al, 1984; Piot et al, 1984; Van de et
al, 1984). Mais tarde, em 1990, nesta mesma região, o vírus da imunodeficiência símia (SIV) foi
isolado no macaco Cercocebus atys e um lentivírus muito semelhante ao HIV-1 foi identificado em
chimpanzés (Huet et al, 1990). Hoje, a origem do HIV-1 é atribuída ao Vírus da Imunodeficiência
Símia (SIVcpz) encontrado em chimpanzés da espécie Pan troglodytes troglodytes (Gao et al,
1999). Mais recentemente, outro SIV (SIVgor) com muitas propriedades biológicas necessárias para
a infecção em humanos foi descoberto em gorilas selvagens (Gorilla gorilla gorilla) (Van et al,
15
2006; Takehisa et al,2009 ).
A evidência mais antiga de infecção pelo HIV-1 em seres humanos data de 1959 em um
homem que faleceu devido infecção por Pneumocistis jiroveci (Williams et al, 1983). Este estudo
indica que o HIV-1 atravessou a barreira das espécies e começou a se disseminar entre humanos
anteriormente a esta data. Estudos baseados em taxa de evolução pelo relógio molecular, estimaram
que por volta do ano de 1908 o SIVcpz atravessou a barreira das espécies, infectou o ser humano
múltiplas vezes e se diversificou (Bailes et al, 2003).
I.2.2 – Propriedades Gerais
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) pertence à família Retroviridae,
subfamília Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus. As partículas do HIV são envelopadas, esféricas
com diâmetro entre 125 e 145 nm (Briggs et al, 2003; 2006) e apresentam um nucleocapsídeo em
forma de cone constituído pela proteína p24. Dentro do nucleocapsídeo existem duas moléculas
idênticas de RNA de fita simples, não covalentemente ligadas, com polaridade positiva. Enzimas
virais como DNA polimerase-RNA dependente (TR/p64), integrase (IN/p32), protease (PR/p10) e a
proteína do nucleocapsídeo p6 estão associadas às moléculas de RNA viral.A parte interna do
envelope é circundada por uma capa protéica (p17) ligada ao ácido mirístico, que fornece a matriz
para a estrutura viral e é vital para a integridade do vírion. A superfície do vírus é formada por
espículas constituídas por glicoproteínas (gp120 e gp41) presentes no envelope (revisado por Wigg,
2008) (figura 2.1).
Figura 2.1: Estrutura do HIV-1. Fonte: Kuby, 2007 (figura adaptada para o português).
16
A análise filogenética do HIV em humanos divide o grupo em dois tipos: HIV-1 e
HIV-2, com diferentes organizações do genoma.O HIV-1 está intimamente relacionado ao Vírus da
imunodeficiência de símios de chipanzés (SIVcpz) e o HIV-2 é geneticamente semelhante ao Vírus
da imunodeficiência de símios que é endêmico entre macacos mangabeys - SIVsm (Gao et al.,
1999; Sharp et al., 1999; Lemey et al., 2003).
A infecção pelo HIV-1 é predominante no mundo, enquanto o HIV-2 parece ser restrito
ao oeste Africano e a poucas áreas da Ásia (Hughes & Conte, 1998; Marx et al., 2000; Yamaguchi
et al., 2000; Wigg et al., 2008).Esta diferença na distribuição epidemiológica entre os subtipos pode
ser justificada pela baixa carga viral e transmissibilidade do HIV-2(Hughes & Conte, 1998; Popper
et al., 1999; Shanmugam et al., 2000; Wigg et al., 2008).
Com base em análises filogenéticas das sequencias dos genes env e gag, o HIV-1 é
classificado em quatro grupos: M (major), O (outlier), N (não M/não O) e P (proposto
recentemente) (Plantier et al, 2009 ; Ivanov et al, 2013). Atualmente são reconhecidos nove
subtipos do grupo M de HIV-1(A–D, F–H, J e K) e ainda alguns sub-subtipos como F1, F2 e A1-
A4. Além disso, uma grande variedade de formas recombinantes circulantes e formas
recombinantes únicas tem sido identificadas, demonstrando a complexidade genética do HIV-
1(Hemelaar J, 2012; Ivanov et al, 2013). Assim como o HIV-1, o HIV-2 também é classificado em
oito subtipos (A-H) (Peterson et al, 2011; Cunha et al, 2012). Esses subtipos genéticos têm impacto
na susceptibilidade a drogas, na emergência de mutações de resistência a drogas e no desempenho
de testes de laboratório para diagnóstico e determinação de carga viral (Cunha et al, 2012).
I.2.3 – Organização genômica
O genoma do HIV-1, de aproximadamente 10 Kb, é constituído por nove genes
flanqueados por duas regiões denominadas LTR (Long Terminal Repeats), onde estão presentes
elementos de controle para integração do DNA proviral ao genoma da célula hospedeira, transcrição
e poliadenilação dos mRNAs (Veronesi et al., 1999; Snustad & Simmons, 2001).
Os genes podem ser divididos em dois grupos, os que codificam proteínas estruturais:
gag, pol e env (Freed et al., 1998; Turner & Summer, 1999) e os que codificam proteínas não-
estruturais: tat, rev, nef, vif, vpu e vpr (Emerman & Malim, 1998; Sleasman & Goodenow, 2003).
Estes últimos recebem ainda a seguinte classificação: regulatórios ou funcionais (tat e rev), que são
necessários para a replicação viral in vitro, e acessórios (vif, vpu, vpr e nef), que embora não
essenciais para replicação in vitro, contribuem para o processo in vivo. Este último grupo de genes é
17
exclusivo do gênero Lentivirus, estando ausente no genoma de outros retrovírus (Trono, 1995).
O gene pol codifica uma poliproteína de 160 kilodaltons (KD) que após clivagem
proteolítica origina as enzimas virais transcriptase reversa (TR), protease (PR) e integrase (IN). A
TR é constituída por dois monômeros: p51e p66, e representa uma enzima fundamental para o ciclo
replicativo do HIV- 1, uma vez que é responsável pela síntese de DNA (ácido desoxirribonucléico)
a partir do RNA viral (Connor & Ho 1992).
Em razão da ausência de capacidade de reparo, a TR não é capaz de corrigir erros que
ocorrem durante a retrotranscrição, o que consequentemente leva a uma alta taxa de mutações. A PR
viral está envolvida no processamento pós-traducional das poliproteínas gag (para produzir as
proteínas estruturais p24, p17 e p7 do core viral) e gag-pol (para produzir enzimas essenciais como
TR e IN). Este processamento gera várias proteínas e enzimas virais, e a PR é necessária para o
ciclo replicativo do vírus e importante alvo de terapia antirretroviral (TARV) (Gavin & Yogen
2002).
A IN é essencial para incorporação do DNA viral ao DNA celular. O genoma viral
integrado é denominado ―provírus‖ e serve de molde para a geração de RNAs genômicos e
mensageiros quando a célula infectada for ativada e começar a transcrever seus próprios genes
(Connor & Ho 1992). A IN também é responsável por outras funções no ciclo replicativo que
incluem cooperação na transcrição reversa, importação nuclear dos complexos pré-integração e
produção de partículas do vírus (Mulder et al. 2002).
O gene gag codifica uma proteína de 55kD, a qual, após clivagem, origina proteínas
da matriz (p17), do capsídeo (p24) e do nucleocapsídeo (p7/p9) (Connor & Ho 1992).
Entre os três genes estruturais, o gene env é o que revela maior variabilidade genética.
Variações nas sequências dos genes gag e pol podem levar à formação de vírus inviáveis, mas as
sequências env aceitam um grande número de substituições, muitas das quais auxiliam no escape à
resposta imune do hospedeiro (Connor & Ho 1992).
As LTRssão sequências idênticas que se localizam em cada extremidade do genoma
(5’ e 3’) e regulam a integração do genoma viral ao genoma da célula do hospedeiro, a expressão de
genes virais, bem como sua replicação (Peng et al. 1989). O gene tat regula a transcrição destas
LTRs pela ligação aos RNAs recém-transcritos.
O gene rev promove o transporte do RNA mensageiro (RNAm) do núcleo para o
citoplasma para tradução de novas proteínas de env, gag e pol. O gene nef está envolvido na
replicação do HIV-1 in vivo. O gene vif desempenha um papel importante na fase de maturação viral
mediante o desenvolvimento da estrutura cônica do capsídeo, que está envolvida na infecciosidade
dos vírions. O gene vif também pode interromper a atividade antiviral da enzima humana APOBEC,
18
umacitidina desaminase que modifica osácidos nucléicos virais por degradação proteossômica, ao
formar um complexo com essa enzima impedesua entrada nos vírions, impedindo-a de causar seu
efeito letal de hipermutação nos vírions. O gene vpu atua na liberação de vírions de células
infectadas através dobrotamento das partículas virais recém produzidas. O gene vpr se liga ao
complexo de pré-integração facilitando o transporte do material genético até o núcleo e parece estar
envolvido nareplicação do HIV nas células do hospedeiro que não estão em divisão(Barre-Sinoussi
1996, Miller et al. 2007, HIV Database, 2010a). A organização genômica do HIV-1está representada
na figura 2.2.
Figura 2.2: Organização genômica do HIV-1. MA= Matriz; CA=capsídeo;NC=nucleocapsídeo;
PR=protease; RT=Transcriptase Reversa; IN=integrase; SU=superfície; TM=Transmembrânica.
Disponível em: <http://www.stanford.edu/group/virus/retro/2005gongishmail/HIV-1.html>[Acesso
em 21 out. 2013] (Figura adaptada para oportuguês).
I.2.4 – Replicação do HIV
Os principais eventos do processo de entrada do vírus na célula do hospedeiro são
divididos entre os eventos de ligação com os receptores e co-receptores e eventos de fusão do
envelope do vírus com a membrana da célula alvo. A unidade funcional do envelope é um trímero
de gp41 e um trímero de gp120, as quais são associadas por interações não-covalentes. A associação
não-covalente destas subunidades permite mudanças significativas na conformação destas
19
glicoproteínas. A gp120 deve ser flexível para permitir a mudança conformacional e ao mesmo
tempo manter contato com a gp41. Esta flexibilidade garante a integridade do trímero após ligação
com a molécula CD4 e permite as transições da gp41 durante o processo de fusão (Pancera et al,
2010). A molécula CD4 é necessária para adsorção viral à célula hospedeira, no entanto, é
insuficiente para assegurar a entrada do HIV-1que requer co-receptores (Doranz et al., 1996; Feng
et al., 1996; Chapham & Weiss, 1997; Moore, 1997; Snustad & Simmons, 2001).
Os dois principais co-receptores, CCR5 e CXCR4, respectivamente receptores de β-
quimiocina e α-quimiocinas, são expressos diferentemente em subpopulações de células CD4+,
incluindo linfócito T, timócitos e células dendríticas (Doms, 1997; Snustad & Simmons, 2001).
Os vírus diferem na habilidade de atacar os grupos de co-receptores. Por exemplo,
aqueles que usam CCR5 infectam preferencialmente macrófagos e subpopulações de células T de
memória. Têm o crescimento relativamente lento in vitro e são infectados principalmente durante a
fase assintomática da infecção, sendo essa linhagem denominada macrófago trópica (M- trópico) ou
não indutores de sincício - NSI (Samson et al., 1996; Cecília et al., 2000; Sleasman & Goodnow,
2003).
Já os vírus que usam CXCR4 têm tropismo preferencial por linfócito T CD4+ e células
T transformadas. São altamente citopáticos e têm crescimento acelerado, sendo essa linhagem
denominada linfócito trópica (T- trópico) ou indutores de sincícios - SI (Luster et al., 1998;
Garzino-Demo et al., 2000).
A entrada do vírus se inicia com a ligação da gp120 com o primeiro domínio Ig-like
da molécula CD4 da célula alvo. A ligação com o CD4 resulta em uma reconfiguração da molécula
gp120. O ―assoalho‖ da molécula se estabiliza e a alça V3 é exposta. Os domínios da alça V3
interagem com a segunda alça extracelular dos co-receptores CCR5 ou CXCR4. Após interação
com o co-receptor, peptídeos hidrofóbicos da gp41 (peptídeos de fusão) são inseridos na membrana
da célula alvo. Este evento ancora o vírus na membrana da célula do hospedeiro, e a gp41 age como
uma ponte entre o vírus e a membrana celular. As regiões C- e N-terminal das regiões hepta-
repetidas da gp41, conhecidas como HR1 e HR2 se emparelham formando um complexo pré-
fusional estável composto por seis α-hélices do tipo helicoidal. Este emparelhamento da HR1 com a
HR2 promove a aproximação e contato entre a membrana celular e o envelope viral, formação de
poros de fusão e liberação do capsídeo no citoplasma da célula hospedeira (Eckert & Kim, 2001).
Existem outros co-receptores para HIV-1 descritos, como o CCR2 e o CCR3 que são
receptores fisiológicos para as quimiocinas MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7, MCP-
4/CCL13, eotaxina-2/CCL24, eotaxina-3/CCL26 expresso em eosinófilos e nas células da
microglia, podendo resultar em doença do sistema nervoso central (He et al., 1997; Ross & Cullen,
20
1998).
Após a entrada do vírus na célula, o RNA viral é transcrito em DNA proviral pela TR.
O processo de transcrição reversa ocorre no citoplasma da célula, 4-6 horas após a infecção. Como
há um intenso e rápido turnover do HIV-1, pode ocorrer erros de incorporação de nucleotídeos pela
transcriptase reversa levando a inserções, deleções e substituições durante a transcrição do RNA
viral em cDNA (Bebenek et al., 1989). A TR também tem baixa afinidade pela fita molde de RNA
que permite a enzima saltar de uma fita para outra gerando uma fita de cDNA com alterações e
consequentemente gerar recombinantes intra ou intersubtipos contribuindo para a alta diversidade
genética do vírus (Stuhlmann & Berg, 1992).
O cDNA viral é transportado para o núcleo a partir de complexos de pré-integração e é
então integrado ao DNA da célula hospedeira mediante ação da enzima viral IN. O genoma viral
integrado ao genoma da célula hospedeira é denominado ―provirus‖. O DNA proviral integrado ao
genoma da célula hospedeira servirá de molde para a geração de RNAs genômicos quando a célula
infectada for ativada e começar a transcrever seus próprios genes.
As células infectadas pelo HIV-1 e com DNA proviral integrado podem ser ativadas
por citocinas da resposta imune celular, como IL-2 e fator de necrose tumoral (TNF), desencadeada
pelo próprio processo infeccioso gerado pelo HIV-1 (Freed, 2001). A ativação celular resulta na
ativação da expressão gênica e ativação da RNA polimerase que inicia o processo de transcrição
gênica. No entanto, as RNA polimerases são incapazes de transcrever sequências maiores que
algumas centenas de nucleotídeos. Assim, a proteína viral tat liga-se ao RNAm e aumenta a
capacidade de transcrição da RNA polimerase, permitindo a formação de RNAm virais funcionais
que são transportados para fora do núcleo para serem traduzidos.
Durante a tradução, primeiramente são sintetizados os genes reguladores e acessórios e
depois os genes estruturais (Turner & Summers 1999, Swanson et al. 2004).
A montagem das partículas virais infecciosas ocorre mediante o empacotamento do
genoma viral, das proteínas codificadas pelo gene gag (p17, p24 e p7/p9) e das enzimas codificadas
pelo gene pol (TR, PR e IN). O complexo núcleo-proteína é inserido em um envelope contendo as
glicoproteínas virais gp120 e gp41. A liberação dos vírions ocorre por brotamento da membrana
plasmática da célula infectada e as novas partículas virais liberadas são capazes de infectar outras
células após o processo de maturação que ocorre no meio extracelular, dando continuidade ao ciclo
infeccioso (Turner & Summers 1999, Freed, 2001). A replicação do HIV está representada na figura
2.3.
21
Figura 2.3: Ciclo replicativo do HIV. Disponível em:
<http://soumaisenem.com.br/biologia/programa-de-saude/programas-de-saude-viroses-aids>
[Acesso em 22 out. 2013]
I.2.5– Transmissão
Sabe-se que a transmissão do HIV pode ocorrer por três vias: i) relações sexuais não
protegidas com parceiros contaminados; ii) Por contato com sangue ou hemoderivados,
contaminação via sanguínea, típica em usuários de drogas intravenosas que partilham seringas com
pessoas contaminadas ou indivíduos que fazem uso de transfusões sanguíneas ou hemoderivados
sem um controle específico; e iii) transmissão materno-infantil que pode ocorrer durante a
gravidez, parto ou aleitamento materno (Nishimoto et al, 2005).
22
I.2.6 – Patogenia
Durante a fase aguda da infecção pelo HIV-1 ocorre um controle inicial alcançadopelo
sistema imunológico do hospedeiro, que pode ser observado pela queda daviremia e pelo
desenvolvimento de linfócitos TCD8+ com atividade citotóxica (CTLs)antes mesmo do
aparecimento de anticorpos neutralizantes, sugerindo a participaçãode uma imunidade celular no
controle inicial do vírus (Koup et al., 1994). A este quadro associa-se a participação de citocinas
pró-inflamatórias para as quais um aumento é observado na fase inicial da infecção (Cohen et al.,
1997, Hogan et al., 2001).
O achado de que o HIV é confinado aos leucócitos CD4+ e é citopático para as células
T CD4+ estabeleceu a hipótese de que o HIV causa imunodeficiênca diretamente por matar as
células T CD4+ e impedir sua renovação (Fauci et al, 1996). Os mecanismos moleculares
involvidos na morte das células T CD4+ pela infecção do HIV tem sido bastante estudado, levando
a nova compreenção sobre os efeitos a jusante da infecção abortiva e a integração viral na morte da
célula (Douek et al, 2002; Doitsh et al, 2010; Cooper et al, 2013 ). Entretanto, o aumento das taxas
de apoptose nos indivíduos HIV-infectados não está restrito as células T CD4+ infectadas, mas
também é observado nas células T CD4+ não infectadas e em células que não são alvo da infecção
por HIV, sugerindo que o efeito citopático não é causado apenas pelo HIV (Meyaard et al, 1992;
Finkel et al, 1995).
A deterioração do sistema imune em consequência da infecção viral, tanto quantitativa
quanto funcional parece inevitável, culminando no desenvolvimento da AIDS. O advento da Terapia
Antirretroviral Altamente Ativa (Highly Active Antiretroviral Therapy– HAART) trouxe uma boa
perspectiva de controle da replicação viral e a consequente recuperação imunológica com a
reposição de células CD4+ nos indivíduos infectados, embora em longo prazo a evolução do HIV
no hospedeiro leve ao mecanismo de resistência e à reativação da replicação do vírus.
A capacidade de evolução do vírus, com mecanismos de escape como reservatório da
infecção com vírus em latência em pool de células CD4+ e o mecanismo de resistência do vírus
àsdrogas dificultam o controle da infecção(Pantaleo e Fauci, 1996; Rambaut et al,.2004). No
entanto, as pessoas que tem acesso aHAART prolongam o tempo além de obterem melhorias na
qualidade de vida.
23
I.2.7 – Evolução clínica
A doença causada pelo HIV é caracterizada por três fases: doença primária aguda,
doença crônica assintomática e doença crônica sintomática. A taxa de progressão de uma fase para
outra é altamente variável.O espectro clínico da infecção pelo HIV-1 é amplo, variando desde
formas assintomáticas até as bem estabelecidas, com riquezas de sintomas e evolução para o óbito
(Leão et al., 1997; Grant & Cock, 2001).
Após a transmissão, inicialmente o HIV se replica em linfonodos regionais. Isso
resulta em um rápido aumento na carga viral plasmática para níveis superiores a um milhão de
cópias / mL.Esta fase é acompanhada por disseminação do HIV para órgãos linfóides, intestino e do
trato genital (Embretsonet al, 1993).Seguindo o pico de viremia, carga viral no plasma diminui
coincidente com o desenvolvimento de respostas imunes celulares hospedeiras (Koup et al, 1994).
O pico de carga viral no plasma e o desenvolvimento de respostas imunes celulares estão associados
com uma doença sintomática em 60-90% dos pacientes (Tindall et al, 1988; Pedersenet al,1989).
Na ausência de tratamento, o tempo médio para desenvolver AIDS é 10-11 anos
(Rutherfordet al, 1990;Mellorset al, 1997). A sobrevida média após AIDS na ausência de terapia
anti-retroviral combinada depende da contagem de células CD4 no diagnóstico da AIDS: 3,7 anos
se a contagem de células CD4 for menor que 200 células/µL e 1,3 anos se a contagem de células
CD4 for menor que 70 células/µL (Fauci et al, 1996). No entanto, as taxas de progressão da doença
para AIDS variam de rápida progressão dentro de seis meses de soroconversão(Demarest et al,
2001), a não progressão significativa. Indivíduos sem progressão da doença foram previamente
referidos como não progressores de longo prazo. Por definição, estes indivíduos têm contagem de
células CD4 acima de 500 células/µL e foram assintomáticos apesar de mais de 10 anos de infecção
sem receber tratameto anti-HIV específico. Entre 1-5% das pessoas com infecção por HIV caem
nessa categoria(Strathdeeet al, 1995). Entretanto, com mais tempo de acompanhamento eo uso de
melhores modelos prognósticos, essas pessoas irão eventualmente experimentar a progressão da
doença.
O termo controladores de elite se refere às pessoas que mantém níveis virais
indetectáveis na ausência de terapia antiviral. Aproximadamente 0,6% das pessoas infectadas com
HIV são consideradas controladores de elite (Lambotte et al, 2005). Tem sido mostrado que essas
pessoas possuem respostas imunes HIV específicas mais fortes quando comparados com pessoas
que não controlam a replicação viral. Os fatores genéticos que se sabe estarem associados com a
progressão lenta da doença doHIV foram detectados em menos de 25% destas pessoas (Pereyra et
al, 2008), 10% das quais tinham contagem de células CD4 menor do que 350 células/ µL e 3%
24
tinham AIDS (Hunt et al, 2008). Controladores de elite tiveram níveis aumentados de
lipopolissacarídeo associados com aumento dos níveis de ativação imunológica, quando
comparados com controles HIV-negativos (Hunt et al, 2008).
Quando usado corretamente, a HAART resulta num rápido controle do HIV e restaura
parcialmente a função imune, levando a prevenção de várias complicações que definem a AIDS.
Entretanto o tratamento não restaura a saúde completamente. Os resultados de estudos realizados
em países de alta renda mostraram que adultos infectados com HIV que tiveram supressão do HIV
durável mediada por tratamento estão sob risco de desenvolver diversas disordens não-AIDS,
incluindo doenças cardiovasculares, câncer, doença renal, doença hepática, osteopenia ou
osteoporose e doença neurocognitiva (Deeks et al, 2013).
Pacientes HIV-infectados também estão sob o risco de doenças como hipertensão e
diabetes, ambos os quais são cada vez mais reconhecidos como os principais problemas de saúde
em toda a África (Murray et al, 2012).
I.2.8– Tratamento
O desenvolvimento de drogas antirretrovirais (ARV)eficazes que proporcionam
importantesopções de tratamento para o HIV-1 foi um progresso significante na luta contra o HIV.
A terapia antirretroviral tem como objetivo reduzir a viremia plasmáticaa níveis indetectáveis,
resgatar e preservar o sistema imunológico, reduzir a progressão clínica e mortalidade e diminuir a
transmissão do HIV-1 (Hammer et al. 2008).
Uma ampla variedade de combinações de drogas antirretrovirais encontra-se em uso
atualmente. Combinações de medicamentos potentes tornou-se o padrão usual de tratamento para os
indivíduos infectados pelo HIV-1. Atualmente os compostos disponíveis anti-HIV atuam nas
seguintes enzimas: transcriptase reversa, protease, proteínas de fusão e integrase.
Os inibidores de TR nucleosídicos (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor -
NRTIs) compreendem sete drogas: Zidovudina (AZT), Stavudina (d4T), Emtricitabina (FTC),
Lamivudina (3TC), Didanosina (ddl), Abacavir (ABC) e Tenofovir (TDF); que são moléculas que
atuam como terminadoras de cadeia, pois impedem a replicação por não possuírem o grupo
3’hidroxila da ribose que faz ligação fosfodiéster, impedindo portanto o ataque nucleofílico do
fosfato 5’ do nucleotídeo a ser adicionado à hidroxila 3’, e consequentemente a extensão da cadeia
nascente (Yarchoan et al, 1989; Hart et al, 1992; Vivet-Bodou et al, 2006).
São utilizados também três inibidores de TR não-nucleosídicos (Non-Nucleoside
25
Reverse Transcriptase Inhibitors - NNTRIs): Nevirapina (NVP), Efavirenz (EFV) e Etravirine
(ETR); essa classe liga-se de modo não-competitivo e reversível a transcriptase reversa, alterando
assim sua função.
Estão disponíveis no mercado dez medicamentos capazes de inibir a enzima protease:
saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), indinavir (IDV), lopinavir (LPV/r), nelfinavir, amprenavir,
atazanavir (ATV), fosamprenavir (FPV), tipranavir e darunavir (Souza & Almeida, 2003).Os
inibidores da protease interferem no processamento das poliproteínas no vírion em brotamento e
resultam em partículas não-infecciosas. O maior problema encontrado para este fármaco, é que eles
causam lipodistrofia (redistribuição de gordura, de modo que os membros tornam-se magros e a
gordura é depositada ao longo do abdômen e do dorso superior) e hiperglicemia (Strohl et al, 2004).
A enzima integrase é fundamental no processo de replicação viral, sendo responsável
pela integração do DNA viral ao cromossomo hospedeiro, permitindo assim a continuação do ciclo
da replicação viral (Souza& Almeida, 2003).Aparentemente estes compostos têm a capacidade de
prevenir o processo de integração mesmo após a formação do chamado complexo pré-integrativo,
formado pelo DNA viral, integrase e outras proteínas (Peçanhaet al, 2002).Raltegravir foi um dos
primeiros medicamentos pertencentes a essa classe, aprovado pela FDA em 2007.
O Protocolo Clínico e DiretrizesTerapêuticas Para Manejo Da Infecção Pelo HIV Em
Adultos (Brasil, 2013) recomenda como primeira linha de tratamento a combinação
TDF+3TC+EFV, sendo o efavirenz (EFV) recomendado na apresentação de dose fixa combinada,
sempre que disponível.
Embora as taxas de sucesso do tratamento antiviral sejam elevadas, pacientes em falha
virológica normalmente necessitamde alterações em seus esquemas antirretrovirais, sendo o novo
tratamento denominado ―esquema de resgate‖. Oreconhecimento precoce da falha virológica e a
escolha adequada e oportuna do novo tratamento são fundamentaispara minimizar as consequências
da supressão viral parcial ou incompleta. Um dos fatores relacionados a falha terapêutica é o
surgimento de mutações de resistência. Na terapia de resgate de indivíduos com resistência a
lamivudina é recomendado a manutenção dessa droga.
Embora a mutação no códon 184 da transcriptase reversa (M184V) leve à resistência
ao 3TC, sua presença aumentaa atividade inibitória da zidovudina (AZT) e do tenofovir (TDF),
podendo reverter parcialmente a resistência a essesmedicamentos. Mesmo na presença dessa
mutação, ainda existe uma atividade residual do 3TC. Adicionalmente,essa mutação tem impacto
favorável no fi tness viral. Assim, recomenda-se a manutenção do 3TC, mesmo com amutação
M184V, em esquemas de resgate com AZT ou TDF. Por outro lado, na presença dessa mutação, o
uso do3TC pode prejudicar a resposta ao abacavir (ABC) e, possivelmente, à didanosina (ddI), nos
26
esquemas de resgate (Brasil, 2013).
I.3 – Coinfecção HBV-HIV
O vírus da hepatite B é um dos principais problemas de saúde pública mundial, apesar
da existência de uma vacina eficiente. Estima-se que 2 bilhões de pessoas já tenham sido infectadas
e que existam no mundo cerca de 240 milhões de portadores crônicos (Ott et al, 2012). O vírus da
imunodeficiência humana (HIV-1) possui, atualmente, 34 milhões de portadores, dentro dos quais, 3
milhões também apresentam algum marcador sorológico para o HBV (Soriano et al, 2009). Devido
às vias de transmissão compartilhadas (exposição ao sangue ou hemoderivados contaminados, por
via sexual, pela injeção intravenosa e transmissão vertical), a infecção pelo HBV em pacientes HIV
positivos possui uma alta prevalência (Konopnicki et al.,2005). As duas principais consequências da
hepatite B crônica são cirrose e carcinoma hepatocelular, ambas podem levar a morte. A história
natural da hepatite B é complexa e a progressão para fibrose avançada pode variar muito. A
coinfecção com o HIV complica a história natural do HBV, promovendo elevadas taxas de casos
crônicos, após a exposição aguda, aumentando os níveis de replicação do HBV em pacientes
crônicos e diminuindo a incidência de clearence dos antígenos virais (HBeAg e HBsAg)
(Carbonero & Poveda, 2012).
A doença hepática em pacientes positivos para HIV-1 é umas das principais causas de
morbi-mortalidade, uma vez que esses indivíduos são mais propensos a tornarem-se portadores
crônicos e apresentam níveis de replicação do HBV mais elevados (Koblin et al, 1992). Uma baixa
contagem de células CD4+ em pacientes coinfectados tem sido associada ao risco de cirrose e
carcinoma hepatocelular(Clifford et al, 2008; Thio, 2009; Martín-Carbonero et al, 2011). Além
disso, a presença de infecção crônica por HBV tem um impacto negativo na progressão da AIDS,
aumentando a replicação do HIV e intensificando a perda de células CD4 (Idoko et al, 2009; Dore
et al, 2010).
Um obstáculo que pode comprometer o sucesso do tratamento antirretroviral em
pacientes HBV/HIV coinfectados está relacionado ao risco aumentado de hepatotoxicidade
relacionada ao antirretroviral (Sulkowski et al, 2000; Aceti et al, 2002; Sorianoet al, 2008). O
aparecimento de hepatotoxicidade pode complicar o gerenciamento desses pacientes, entretanto,
não se deve suspender ou contra-indicar o uso do medicamento, uma vez que a HAART reduz a
mortalidade relacionada a complicações hepáticas em pacientes HBsAg positivos com infecção por
HIV (Bonacini et al, 2004). A maioria das diretrizes recomenda a introdução precoce do tratamento
contra HIV em todos os pacientes HBV/HIV coinfectados. (Soriano et al, 2008; Department of
27
Health and Human Services, 2013; European AIDS Clinical Society, 2013).O tratamento anti-HBV
com análogos de nucleos(t)ídeos pode melhorar ou parar completamente a progressão da fibrose
hepática em pacientes HBV/HIV coinfectados.Pacientes com indicação de tratamento para hepatite
B, e para os quais o interferon não estejarecomendado, devem iniciar mais precocemente a TARV,
com esquema contendo TDF e 3TC (Brasil, 2013).
A taxa de eventos de descompensação hepática e morte diminuíram nesta população,
como resultado do uso generalizado de TDF, 3TC ou FTC, resultando na não detecção prolongada
de HBV-DNA no soro da maioria dos pacientes. (Vries-Sluijs et al, 2010; Martín-Carbonero et al,
2011).
I.4 - A transcriptase reversa
A transcriptase reversa (TR) é uma enzima importante na replicação dos dois vírus e
alvo constante no tratamento antirretroviral. No HBV, a transcriptase reversa é codificada pelo gene
da polimerase viral (ORF P), que cobre um espaço de 80% do genoma completo, e ainda se
sobrepõe a outras três ORFs: pré-S/S, C e X. A ORF P codifica um produto de 90kDa com quatro
domínios: proteína terminal, espaçador, transcriptase reversa e Rnase H. O domínio TR propicia a
atividade RNA polimerase – DNA dependente, onde se situa o motivo de aminoácidos YMDD (Tyr-
Met-Asp-Asp), que é essencial para a replicação viral (Toh et al, 1983; Das et al, 2001). Existe uma
homologia entre as polimerases virais. Em particular, essas enzimas compartilham o motivo
YMDD. A transcrição reversa é um processo sujeito a erros e, desse modo, conforme ocorre nos
retrovírus como o HIV-1, este processo resulta na seleção de quasi-espécies num indivíduo
infectado pelo HBV (Domingo and Holland 1997; Negroni, et al 2001; Fallot et al2012).
A região pol do HIV-1 codifica duas enzimas criticamente importantes: TR e protease.
A TR é um heterodímero que possui duas subunidades, uma de 51-kDa e outra de 66-kDa. Como a
TR do HBV, ela possui as atividades de DNA polimerase e de RNase H, responsáveis pela
conversão de uma fita-simples de RNA genômico viral em uma fita dupla de DNA viral na célula
hospedeira. O domínio YMDD da p66 é necessário para a função de polimerase da TR. Análises
mutacionais do YMDD da p51 indicam sua importância na montagem e interação da subunidade
durante a formação da TR em um heterodímero ativo (Mulky et al, 2004). Variações intra e inter-
clados dentro da região da polimerase são particularmente relevantes porque é sobre esta região que
muitos medicamentos antivirais são dirigidos (Spira et al, 2003).
28
I.5 – Pirosequenciamento e mutações de resistência
O tratamento simultâneo das infecções HBV/HIV-1 é delicado. As moléculas
utilizadas no tratamento antirretroviral podem ser hepatotóxicas (Altfeld et al, 1998; Wit et al,
2002) e há inúmeras interações entre as drogas utilizadas contra os dois vírus (Perronne, 2006).
Durante a última década, o desenvolvimento de análogos de nucleosídeo/nucleotídeo (NRTI) com
potencial terapêutico e boa tolerabilidade levou a grandes avanços na terapia da hepatite B e da
AIDS.No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante o tratamento, levando a
perda da susceptibilidade às drogas utilizadas. As mutações de resistência podem ser divididas em
primárias e secundárias. A resistência primária é diretamente responsável pela perda da
susceptibilidade e as mutações secundárias tendem a ser compensatórias e restauram a aptidão dos
mutantes inicialmente selecionados.
A Lamivudina (3TC) é um análogo de nucleosídeoque inibe a TR e seu uso é
preconizado na ação contra o HIV-1 e contra o HBV (Bessesen et al, 1999). É uma droga bem
tolerada, mas a eficácia contra o HBV é limitada devido ao aparecimento de vírus com mutações
relacionadas à resistência. Reativações da replicação do HBV, muitas vezes fatais, após a
emergência de mutantes de resistência ou após a interrupção do tratamento têm sido relatadas
(Bonacini 1997; Bessesen et al, 1999; Manegold et al, 2001; Taramasso et al, 2011). A frequência
de resistência geralmente é de 24% após 1 ano e 70% após 4 anos de terapia (Liaw et al., 2000;Lai
et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo, 2008). A seleção de resistência a lamivudina no HBV é
o maior problema entre os pacientes HBV/HIV coinfectados. Variantes HBV resistentes a
lamivudina desenvolvem-se mais rapidamente nessa população do que em pacientes HBV
monoinfectados (Benhamou et al,1999).
As mutações (rtL180M e rtM204V/I) estão relacionadas ao domínio da transcrição
reversa no gene da polimerase do HBV, sendo que mais de 90% dos pacientes coinfectados com
HIV-1/HBV em tratamento com 3TC apresentam essa dupla mutação (Liaw et al, 1999; Thibault et
al, 1999; Leung et al, 2001; Lai et al, 2003). Uma terceira mutação de resistência (rtV173L) pode
ser encontrada. Esta mutação e a rtL180M (mutações compensatórias) restauram parcialmente a
replicação viral cuja a capacidade é afetada pela mutação primária rtM204V/I (William et al, 2003;
Zoulim and Locarnini, 2009; Yuen and Locarnini, 2009). No gene pol do HIV-1, a mutação M184V
é a mais comum de resistência aos NRTI e pode aparecer em até 12 semanas de uso da droga
(Schuurman et al, 1995; Johnson et al, 2008).
Até o momento, o método mais comumente utilizado para detecção de resistência a
drogas é o sequenciamento direto dos produtos amplificados por PCR através do método de
29
Sanger.Além de ser um método laborioso e demorado, o sequenciamento direto é limitado por sua
incapacidade de detectar variantes presentes em quantidades minoritárias numa população
heterogênea. Portanto, outras técnicas molecularescomo o Real-Time PCR, pirosequenciamento,
RFLP(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição), seqüenciamento por
hibridização e INNO-LiPA (Innogenetics)têm sido utilizadas para discriminar misturas de
populações (Shaw et al, 2006; Shendure and Ji, 2008)
A mutação rtM204V/I é caracterizada por uma substituição de A por G no códon ATG
(metionina)no motivo YMDD gerando uma valina (YVDD) e qualquer substituição no nucleotídeo
G do mesmo códon ATG, leva a codificação do aminoácido isoleucina (YIDD). A substituição de
uma leucina na posição 180 do domínio da transcrição reversa no gene da polimerase por uma
metionina ocorre quando há uma substituição do T ou C (códons T/CTG - leucina) por A (códon
ATG – metionina), caracterizando a mutação rtL180M.A substituição do G da 1a posição do códon
GTG (valina) por T ou C na posição 173 do domínio da transcrição reversa no gene da polimerase
causa a substituição de valina por uma leucina (T/CTG), caracterizando a mutação compensatória
rtV173L.
A mutação de resistência a Lamivudina do HIV M184V/I é causada pela substituição
de um C por um G, T ou A no códon TAC na posição 184, causando uma mutação de metionina
para isoleucina. Ocorre mutação de metionina para valina quando ocorre a substituição de T por C
no códon TAC na posição 184.
O pirosequenciamento é um método de sequenciamento que quantifica a atividade da
DNA polimerase através da detecção de pirofosfato liberado pela adição de um dNTP ao extremo 3’
de um primer. Isto permite a determinação da sequencia de uma simples fita de DNA através da
síntese de uma fita complementar, uma base de cada vez, detectando qual base é adicionada a cada
etapa. O pirosequenciamento é o método mais rápido e, provavelmente, o mais sensível, atualmente
disponível para detecção de pequenas subpopulações de vírus resistentes e o único capaz de
apresentar dados quantitativos das sequencias obtidas (Mello et al., 2012).
A reação do pirosequenciamento é iniciada quando oligonucleotídeos específicos de
cada região se hibridizam com o DNA amplificado, em seguida a DNA polimerase adiciona o dNTP
a fita de DNA e cada incorporação libera uma molécula de pirofosfato (PPi).A ATP sulfurilase
converte o PPi em ATP na presença de adenosina 5’ fosfosulfato (APS). Esta ATP conduz a
conversão, mediada pela luciferase, da luciferina em oxiluciferina, que gera luz visível em
quantidades que são proporcionais à quantidade de ATP. A luz produzida na reação catalisada pela
luciferase é detectada por um chip CCD (charge coupled device) e vista como um pico na saída de
dados (Pyrogram). A altura de cada pico (luz de sinal) é proporcional ao número de nucleotídeos
30
incorporados.Apirase, uma enzima nucleotídeo-degradante, degrada continuamente nucleotídeos
não incorporados e ATP. Quando a degradação é completa, é adicionado outro nucleotídeo (Qiagen,
2013).
Esta técnica detecta populações minoritárias que representam pelo menos 5% do total
da população circulante, enquanto que o sequenciamento de Sanger detecta apenas populações
minoritárias presentes em mais de 20% do total da população da amostra (Melloet al, 2012).As
moléculas variantes com mutações de resistência a drogas, muitas vezes não detectadas, são
clinicamente relevantes, pois podem gerar a falha no tratamento antirretroviral (Wang et al, 2005;
Metzner et al, 2009). Diante disso, o pirosequenciamento apresenta-se como uma ferramenta
importante, uma vez que se propõe a detectar subpopulações virais inferiores a 10%(Leet al, 2009;
Margeridon-Thermet et al, 2009).
31
II - OBJETIVOS
Objetivo geral
Analisar o perfil de mutações de resistência à lamivudina de isolados de HBV e HIV-1
de pacientes coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento.
Objetivos específicos:
Detectar e quantificarmutações de resistência à3TC nas posições rtM204V/I, rtL180M e
rtV173L do HBV e M184V/I do HIV-1, de indivíduos coinfectados, utilizando a técnica de
pirosequenciamento.
Sequenciar os isolados de HBVe HIV através dométodo de Sanger e compararcom os
resultados obtidos pelo pirosequenciamento.
Genotipar os isolados de HBV.
32
III – METODOLOGIA
Amostragem:
Quarenta e três amostras de pacientes coinfectados HBV/HIV em duas instituições
diferentes foram selecionados. Além destas, duas outras amostras provenientes de um estudo prévio
em uma população de homens que fazem sexo com homens, também foram incluídas. Este estudo
foi aprovado pelos comitês de ética de cada local de coleta.
1- Trinta pacientes provenientes do Instituto de Pesquisa Evandro Chagas (IPEC), Rio de Janeiro.
Três pacientes possuem duas datas de coleta com intervalos de coleta de 6 meses a um ano.
2- Treze pacientes provenientes do Hospital Dia ―Esterina Corsini‖ do Núcleo do Hospital
Universitário (UFMS), tendo sido obtida a autorização institucional,Campo Grande, Mato Grosso
do Sul.
3- Dois pacientes provenientes de um estudo de prevalência de DSTs e AIDS previamente realizado
na região metropolitana de Campinas.
Todos os pacientes eram HBsAg positivos no momento da coleta.Todas as amostras de
sangue foram centrifugadas para obtenção do soro e o material foi, então, catalogado e
acondicionado em freezer a -20°C até sua utilização.
Extração de ácidos nucléicos:
A extração do material genético viral (DNA e RNA) foi realizada através do kit
comercial High Pure Viral Nucleic Acid kit (Roche Applied Science, Alemanha), utilizando-se
200µL de soro.O princípio desse método se baseia na lise do vírus presente no soro, plasma ou
sangue total ao ser incubado com Binding Buffer e Proteinase K. Em seguida, os ácidos nucléicos
se ligam especificamente a superfície das fibras de vidro presentes na coluna fornecida pelo kit. A
reação de ligação ocorre em segundos devido ao rompimento da estrutura organizada das moléculas
de água e a interação dos ácidos nucléicos com a superfície das fibras de vidro, sendo essa ligação
específica para ácidos nucleicos. Os ácidos nucléicos ligados são lavados com um tampão
removedor de inibidores, para descartar possíveis contaminantes inibidores da PCR (Reação da
Polimerase em Cadeia). Depois são purificados para descartar sais, proteínas e outras impurezas
celulares por meio do processo de lavagem. Em seguida os ácidos nucléicos são recuperados
utilizando-se um tampão de eluição.
33
Ensaios de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia):
HBV: A região pré-S/S do HBV, que se sobrepõe à região da polimerase que possui os
sítios de mutação, foi amplificada com oligonucleotídeos específicos pela reação em semi-nested
PCR. A 1a etapa de amplificação foi realizada utilizando-se os oligonucleotídeos PS1 (senso) e uma
mistura equimolar de oligonucleotídeos anti-senso (Tabela 1) S2 e S22 na mesma reação. Dois
microlitros de DNA foram adicionados à mistura de reação contendo 20 mM de Tris-HCl pH 8.4,
50 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 10 pmol de cada oligonucleotídeo e 1 U de
Taq DNA polimerase, com volume final de 25uL. A mistura foi submetida às seguintes condições:
94°C – 3 min seguido de 30 ciclos (95°C - 30 seg, 52°C - 40 seg, 72°C - 2 min), seguidos de uma
elongação final de 7 minutos a 72°C. Na 2a etapa, utilizou-se 1µl do produto amplificado na reação
anterior com os oligonucleotídeos S24 (senso) e S25 biotinilado (antisenso), nas seguintes
condições: 94°C – 3 min seguido de 35 ciclos (94°C – 30 seg, 52°C – 30 seg, 72°C – 30 seg),
seguidos de uma elongação final de 7 minutos a 72°C. O fragmento resultante da amplificação
apresenta 218 pb e serve de molde para o pirosequenciamento. Os produtos do PCR foram
analisados em gel de agarose a 2% para verificar se houve a amplificação do fragmento de
interesse.
HIV:A obtenção do cDNA pela transcrição reversa foi realizada pelo kit SuperScript®
III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen), com os
oligonucleotídeos específicos M184V F (biotinilado) e M184V R (Tabela 1) para amplificação da
região que contém a possívelmutação que será analisada (M184V do gene pol). Foram adicionados
cinco microlitros de RNA a mistura de reação contendo 2 mMMgSO4, 200µM de dNTPs, 10 pmol
de cada oligonucleotídeo e 2 U de SuperScript® III RT/ Platinum® Taq Mix num volume final se
50 µL.A mistura foi submetida às seguintes condições: um ciclo de 50ºC por 30 min, um ciclo de
94ºC por 2 min seguido de 40 ciclos (94ºC por 15 seg, 55ºC por 30 seg e 68ºC por 30 seg).O
fragmento resultante possui 123 pb e serve de molde para o pirosequenciamento.
Eletroforese:
Os produtos das PCRs foram submetidos a uma eletroforese em gel de Agarose a 2%.
O gel foi feito utilizando-se 2g de Agarose/100 ml de TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1X/ 5µL de
Brometo de Etídio. As corridas foram realizadas numa cuba com o tampão de corridaTAE 1X.Essa
técnica se baseia na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e
34
carga. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa
global de uma fita de DNA. Portanto, íons livres, moléculas de DNA ou fragmentos de DNA em
uma solução podem ser separados aplicando–se uma determinada voltagem. Ao final do processo as
cadeias de DNA estarão próximas ao catodo, que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga
negativa.
Tabela 1: Oligonucleotídeosutilizados na amplificação por PCR
Vírus Oligonucleotídeo Sequência Direção Posição
HBV PS1 5’- CCA TAT TCT TGG GAA CAA GA – 3’ Senso nt 2826 - 2845
HBV S2 5’ - GGG TTT AAA TGT ATA CCC AAA GA – 3’ Antisenso nt 841 - 819
HBV S22 5’ - GTA TTT AAA TGG ATA CCC ACA GA – 3’ Antisenso nt 841 - 819
HBV S24 5’- TTG CAC CTG TAT TCC CAT -3 Senso nt 594-611
HBV S25 Biotinilado 5’- biotina-AAA ATT GGT AAC AGC GGT AWA AA -3’ Antisenso nt 812-791
HIV M184 F 5’-biotina- CAC CAG CAA TAT TCC ARA GTA GCA -3’ Senso nt 3016 - 3040
HIV M184 R 5’- TGC CCT ATT TCT AAG TCA GAY CC-3’ Antisenso nt 3139 - 3116
Pirosequenciamento – PyroMark Q96ID
Os oligonucleotídeos para o sequenciamento do HBV (S24-S25Bio) e HIV (M184V F
e M184V R) utilizados neste procedimento flanqueiam os genes da TR, especialmente no motivo
YMDD, onde estão presentes as mutações de resistência a 3TCpara ambos os vírus.
Para a realização do pirosequenciamento é necessário fazer a solução de
estreptavidinana seguinte proporção para uma reação: 3µL de estreptavidina (Streptavidin
Sepharose™ High Performance, GE Healthcare, UK) + 40 µL de Binding Buffer (Qiagen,
Germany) + 17 µL de água (UltraPure™DEPC-treated Water, Invitrogen,San Diego, CA, USA). 60
µL dessa solução são adicionados a 20 µL do produto de PCR biotiniladoem cada poço, em uma
placa de 96 cavidades. Todas as amostras foram feitas em duplicata para garantir a confiabilidade da
análise. A placa contendo a solução e amostras é lacrada com uma fita adesiva e vortexada para que
o material genético amplificado se ligue às moléculasde estreptavidina através da biotina presente
nos produtos de PCR.Em seguida, o oligonucleotídeo específico para cada mutação de interesseé
adicionado em uma nova placa(Tabela2).Para a análise das mutações do HBV são utilizados os
primers S26 para a mutação rtM204V/I, S27 para a mutação rtV173L e S28 para rtL180M. Para
35
analisar a mutação do HIV foi utilizado o primer M184V seq (Tabela 2).Após a ligação da
estreptavidinaao produto de PCR, essa solução é purificada e adicionada à placa que contém os
oligonucleotídeos.
Os resultados do pirosequenciamento podem ser dados em três níveis de qualidade
diferentes: alta, moderada e baixa. A seguir (Figura 3.1) está uma imagem de como o software
apresenta esses níveis de qualidade.
Figura 3.1: O canto superior esquerdo possui um esquema da placa com o nível de qualidade de
cada amostra, as amostras em vermelho evidenciam uma baixa qualidade, as em laranja evidenciam
qualidade moderada e as em azul evidenciam ótima qualidade. No canto superior direito ficam
detalhes da corrida de cada amostra, incluindo a porcentagem de cada nucleotídeo adicionado.
O software também possibilita obtenção de um pirograma (Figura 3.2)onde é possível
observar os picos e a porcentagem de cada nucleotídeo adicionado.
36
Figura3.2:Exemplo de um pirograma fornecido pelo softwarePyroMark ID no AQ mode.
As amostras foram feitas em duplicata, para melhorar a confiabilidade da reação, dessa
maneira foram consideradas apenas as duplicatas que obtiveram resultados de alta qualidade.
Tabela 2: Oligonucleotídeosutilizados no pirosequenciamento.
Vírus Oligonucleotídeos Mutação Sequência do primer Direção Posição
HBV S26 rtM204V/I 5’- GTT TGG CTT TCA GYT AT -3’ Senso nt 724-736
HBV S27 rtL180M 5’- GCC TCA GYC CGT TTC T -3’ Senso nt 651-667
HBV S28 rtV173L 5’- GSA AAA TWC CTA TGG GA -3’ Senso nt 631-647
HIV M184V seq M184V/I 5’- GAT CCT ACA TAC AAA TCA TC-3’ Antisenso nt 3121-3102
Sequenciamento Padrão de nucleotídeos:
As sequências nucleotídicas referentes à região genômica S do HBV e a região do
motivo YMDD na região pol do HIVforam determinadas pela técnica de seqüenciamento. Os
produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit comercial QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen, Chatsworth, CA, EUA), de acordo cominstruções do fabricante.A reação de
seqüenciamento foi preparada numa placa de 96 poços, onde foi adicionado aproximadamente100
ng de DNA, oligonucleotídeos internos para o HBV e para o HIV na concentração de 3,2 pmol e
37
água MiliQ quando necessário, num volume final de 7,5 µL. Os oligonucleotídeos utilizados para o
sequenciamento do HBV foram o S1, S4, S7 e S2, descritos na Tabela 3. Já para o HIV, os
oligonucleotídeos utilizados foram o M184V F e M184V R (Tabela1). Utilizou-se reagentes e
protocolos do kit comercialBig Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA).A reação foi submetida às seguintes condições: 94˚C por 10 segundos,
50˚Cpor 5 segundos e 60˚C por 4 minutos; 40 repetições desse mesmo ciclo.Após a reação de
sequenciamento foi feita uma precipitação com isopropanol 75% (Merck) das amostras para
retiradade ddNTPs livres que podem interferir na leitura da sequência de DNA noanalisador de
DNA.A reação de sequenciamento de nucleotídeos e a leitura automática dassequências foram
realizadas com o equipamento ABI 3730 DNA Analyzer da Applied Biosystems (Plataforma Multi-
usuário da Fiocruz).
Alinhamento das sequencias e análise filogenética:
As sequências forameditadas e alinhadaspelo Clustal W no software MEGA 4.0
(Tamura et al, 2007).A genotipagem do HBV foi realizada a aprtir da construção de uma árvore
filogenética construída pelo método Neighbor-joiningcom 3000 replicatas, utilizando sequencias
referências para os genótipos.
Tabela 3:Oligonucleotídeosutilizados no seqüenciamento do HBV
Oligonucleotídeos Sequencia do Oligonucleotídeos Direção Posição
S1 5’ - CTT CTC GAGGAC TGGGGA CC – 3’ Senso nt 124 - 143
S4 5’ - TGC TGC TAT GCC TCA TCT TCT CC – 3’ Senso nt 416 - 436
S7 5’ - TGA GCC AGG AGA AAC GGG CT CC – 3’ Antisenso nt 676 - 656
S2 5’ - GGG TTT AAA TGT ATA CCC AAA GA CC – 3’ Antisenso nt 841 - 819
38
IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Quarenta e cinco amostras coletadas de pacientes com coinfecção HBV/HIV foram
submetidas aensaios de semi-nestedPCR para amplificação parcial do gene da proteína de envolope
do HBV. Apenas 25 (55% - 25/45) amostras foram amplificadas com sucesso. Essa baixa taxa de
detecção do DNA do HBV pode ser explicada pelo fato de alguns pacientes estarem sob tratamento
antiviral, portanto, com uma pressão supressora da replicação viral. As duas amostras obtidas de um
estudo prévio para detecção de hepatite B em homens que fazem sexo com homens foram
amplificadas com sucesso. Informações sobre tratamento não estavam disponíveis para todas as
amostras. A Tabela 4 mostra as informações disponíveis para as 25 amostras amplificadas.
As amostras amplificadas pela PCR foram submetidas ao pirosequenciamento, onde
foram analisadas substituições de nucleotídeos únicos (SNPs) associadas à resistência à lamivudina.
Substituições na metionina do motivo YMDD (rtM204V ou rtM204I) assim como as mutações
compensatórias rtL180M e rtV173L foram analisadas em reações separadas.
O sequenciamento pelo método de Sanger da região S do HBV foi realizado em 15
amostras. Os resultados obtidos foram comparados aos encontrados pela técnica de
pirosequenciamento para as mutações rtM204V/I, rtL180M e rtV173L do HBV. A árvore
filogenética gerada está demonstrada do na Figura 4.1. O resultado da análise da mutação rtM204V/I
pelo seqüenciamento padrão encontra-se na Tabela 9.
39
Tabela 4:Informação de origem e tratamento dos pacientes.
Amostra Local de origem Tratamento
HSH 489 HSH - Campinas X
HSH 553 HSH - Campinas X
LVM 1 - 31/08/2005 IPEC AZT+3TC+TDF+ATVr
LVM 1 - 15/03/2006 IPEC D4T+3TC
LVM 9 IPEC D4T+3TC+ LPV/r +RTV+NVP
LVM 5 IPEC TDF+3TC+LPVr
LVM 6 - 17/10/2005 IPEC TDF+3TC+ATVr
LVM 6 - 04/04/2006 IPEC TDF+3TC+ATVr
LVM 7 - 03/05/2006 IPEC Sem terapia
LVM 7 - 07/08/2006 IPEC Sem terapia
LVM 12 IPEC TDF+3TC+LPV/r
LVM 8 IPEC X
LVM 2 IPEC X
LVM 11 IPEC X
LVM 10 IPEC X
LVM 3 IPEC X
LVM 4 IPEC X
HBC 31 UFMS TDF, 3TC e AZT
HBC 126 UFMS 3TC+AZT e LPV/r +RTV
HBC 369 UFMS 3TC, LPV/r +RTV
HBC 454 UFMS 3TC ,TDF
HBC 461 UFMS 3TC, EFZ e TDF
HBC 462 UFMS Sem terapia
HBC 764 UFMS 3TC+AZT e LPV/r +RTV
HBC 786 UFMS 3TC+AZT+EFZ
X – sem informação de tratamento.
AZT- Zidovudina; 3TC- Lamivudina; TDF-Tenofovir; ATVr- Atazanavir; D4T-Estavudina; NVP- Nevirapina;
LPV/r- Lopinavir; RTV- Ritonavir; EFZ- Efavirenz.
40
Todas as amostras amplificadas nos ensaios de PCR foram submetidas a diferentes
reações de pirosequenciamento para análise das mutações escolhidas para este estudo. Em 23
amostras, referentes a 20 pacientes, foram obtidos resultados com alta qualidade para análise da
mutação M204V/I. Os resultados, descritos na Tabela 5, mostram que apenas duas amostras (LVM
3 e LVM 7) não apresentaram nenhuma mutação no motivo YMDD. O paciente LVM 7 não estava
em tratamento no momento da coleta, corroborando com os achados neste estudo. Não foi possível
obter informações sobre tratamento o paciente LVM 3, porém, pode-se especular que este também
não estava sob terapia antiviral ou a terapia era recente, uma vez que estudos demostraram o
aparecimento de mutações de resistência a lamivudina numa frequência geralmente de 24% após 1
ano e 70% após 4 anos de terapia (Liaw et al., 2000;Lai et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo,
2008).
Mutações de resistência à lamivudina (YVDD ou YIDD) foram encontradas nas 21
amostras restantes (91,3%) em variadas proporções. Cinco amostras (LVM 6,LVM 8, HBC 31,
HBC 126 e HBC 454) apresentaram população 100% mutante YVDD. O paciente LVM 6 estava
sob terapia (Tenofovir + Lamivudina + Atazanavir) nos dois momentos de coleta. Na primeira
coleta, foi observada uma população composta apenas por cepas YVDD. Dados sobre utilização ou
não de terapia antiviral não estavam disponíveis para o paciente LVM 8, porém pode-se especular
que o paciente estava em tratamento ou que já foi infectado por uma cepa mutante. A prima-
infecção com vírus mutantes já foi descrita na literatura em pacientes renais sujeitos a hemodiálise e
em pacientes com hepatite B aguda (Motta et al, 2010; Coppola et al, 2013) . No momento da
coleta, os pacientes HBC 31, 126 e 454 estavam sob tratamento com lamivudina há 12, 36 e 108
meses, respectivamente, corroborando com a literatura que descreve o aparecimento de mutações de
resistência a lamivudina com frequência geralmente de 24% após 1 ano e 70% após 4 anos de
terapia (Liaw et al., 2000;Lai et al, 2003; Wright, 2004; Zoulim&Perrillo, 2008).
41
Tabela 5: Resultados das análises da mutação rtM204V/I, indicando a porcentagem de moléculas
selvagens ou com substituições nucleotídicas.
1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas; 2 intervalo de 6 meses entre as coletas; 3
intervalo de 3 meses entre as coletas. Wt- Wild Type. (?) – Pode estar presente ou não. Em negrito amostras 100%
mutantes ou selvagens.
Amostra Posição 1(A/GTG) Posição 3 (ATG/C/A/T) Resultado População
A (wt) G G (wt) C A T
HSH 489 86.6% 13.4% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 86,6% YMDD
13,4% YVDD Selvagem/mutante
HSH 553 85.5% 14.5% 94.9% 0.0% 0.0% 5.1% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante
LVM 11 - 31/08/2005 78.1% 21.9% 96.4% 0.0% 0.0% 3.6% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante
LVM 11 - 15/03/2006 100.0% 0.0% 93.0% 0.0% 0.0% 7.0%
93% YMDD
7% YIDD Selvagem/mutante
LVM 5 44.2% 55.8% 90.7% 0.0% 0.0% 9.3% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante
LVM 62 - 17/10/2005 0.0% 100.0% 95.9% 0.0% 0.0% 4.1% 100% YVDD Mutante YVDD
LVM 62 - 04/04/2006 100.0% 0.0% 97.7% 0.0% 0.0% 2.3%
97,7% YMDD
2,3%YIDD Selvagem/mutante
LVM 73 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100% YMDD Selvagem YMDD
LVM 73 - 07/08/2006 100.0% 0.0% 86.5% 0.0% 0.0% 13.5%
86,5% YMDD
13,5% YIDD Selvagem/mutante
LVM 8 0.0% 100.0% 89.8% 0.0% 0.0% 10.2% 100% YVDD Mutante YVDD
LVM 2 100.0% 0.0% 97.3% 0.0% 0.0% 2.7% 97,3% YMDD
2,7%YIDD Selvagem/mutante
LVM 3 100.0% 0.0% 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100% YMDD Selvagem YMDD
LVM 4 100.0% 0.0% 92.8% 0.0% 0.0% 7.2% 92,8% YMDD
7,2% YIDD Selvagem/mutante
LVM 9 100.0% 0.0% 89.4% 0.0% 0.0% 10.6% 89,4% YMDD
10.6%YIDD Selvagem/mutante
LVM 10 5.7% 94.3% 93.2% 0.0% 5.5% 1.3% YMDD, YVDD, YIDD(?) Selvagem/mutante
LVM 11 100.0% 0.0% 90.8% 0.0% 0.0% 8.6% 90,8% YMDD
8,6% YIDD Selvagem/mutante
HBC 31 0.0% 100.0% 96.9% 0.0% 0.0% 3.1% 100% YVDD Mutante YVDD
HBC 126 0.0% 100.0% 90.6% 0.0% 0.0% 9.4% 100% YVDD
Mutante YVDD
HBC 454 0.0% 100.0% 93.5% 0.0% 0.0% 6.5% 100% YVDD
Mutante YVDD
HBC 461 100.0% 0.0% 97.4% 0.0% 0.0% 2.6% 97,4% YMDD
2,6% YIDD Selvagem/mutante
HBC 462 100.0% 0.0% 97.3% 0.0% 0.0% 2.7% 97,3% YMDD
2,7% YIDD Selvagem/mutante
HBC 764 100.0% 0.0% 94.6% 0.0% 0.0% 5.4% 94,6% YMDD
5,4% YIDD Selvagem/mutante
HBC 786 100.0% 0.0% 98.0% 0.0% 0.0% 2.0% 98% YMDD
2% YIDD Selvagem/mutante
42
Três pacientes (LVM 1, 6 e 7) tiveram duas amostras coletadas com intervalos de 7, 6
e 3 meses, respectivamente. Análises da primeira coleta do paciente LVM1 demonstraram a
presença de populações mistas de vírus selvagens e mutantes (V e I), sendo que não se pode afirmar
a presença da mutação YIDD. Na segunda coleta, aparentemente a mutação que codifica a
isoleucina prevaleceu e neste momento apenas amostras selvagens e mutantes YIDD foram
observados. Esse resultado foi inesperado, pois a estabilidade da mutação rtM204I foi descrita num
estudo de Zöllner et al em 2004, em que pacientes carreando esta mutação foram monitorados por 1
ano, para observar o padrão mutacional com a continuidade do tratamento com lamivudina. Neste
estudo foi observado a alteração da mutação rtM204I para a mutação rtM204V após um intervalo
de 3 a 12 meses. O mesmo resultado já havia sido observado em estudos anteriores (Bartholomewet
al, 1997; Zöllneret al, 2000; Gutfreundet al, 2000).
As análises das duas coletas da amostra LVM 6 demonstrou a presença apenas de
mutantes YVDD na primeira coleta e população mista (selvagem/YIDD) na segunda coleta. Este é
um resultado inesperado, uma possível justificativa seria a de as datas da coleta terem sido trocadas.
O paciente LVM 7 no primeiro momento analisado apresentou uma população 100%
selvagem, sem evidência do surgimento de mutantes resistentes, no entanto, na segunda amostra,
coletada 3 meses depois, foi demonstrada a presença de mutantes YIDD em uma proporção de
13,5%. Este paciente não estava em tratamento no momento da coleta. Este resultado é corroborado
pela literatura, o surgimento espontâneo de mutações de resistência no motivo YMDD em pacientes
sem tratamento já foi descrito na literatura (Tsubota,2006; Wang et al, 2009; Tanet al, 2012).
Não foi possível realizar o sequenciamento de todas as amostras submetidas ao
pirosequenciamento devido à falta de material genético suficiente ou pela falta de sucesso em
amplificar a amostra. Analisando os resultados observados na Tabela 6 em conjunto com a Tabela
5, percebe-se que o sequenciamento realizado através do método de Sanger da mutação rtM204V/I,
conseguiu identificar apenas as populações majoritárias nas amostras de população mista. Nas
amostras onde a população era 100% mutante ou selvagem, o resultado obtido no
pirosequenciamento foi igual ao obtido no sequenciamento pelo método de Sanger. Esse resultado
comprova a aplicabilidade do pirosequenciamento como um método de detecção e quantificação de
subpopulações resistentes a lamivudina (Mello et al, 2012).
43
Tabela 6: Comparação seqüenciamento e pirosequenciamento. A população majoritária no
pirosequenciamento está destacada.
WT – wild type. * Subpopulação YIDD pode estar presente ou não.
As mutações compensatórias rtL180M e rtV173L também foram analisadas nas vinte
e cinco amostras amplificadas com sucesso pela PCR. Num primeiro momento observou-se
resultados com alta qualidade em 15 amostras na análise da rtL180M pelo pirosequenciamento. A
Tabela 7 demonstra que nenhuma substituição que provocaria o aparecimento de uma metionina na
posição 180 aconteceu no códon que codifica a leucina (TTA, TTG, CTA, CTT, CTG, CTC),
apesar de populações mistas compostas pelos códons TTG e CTG terem sido observadas.
No entanto, a mutação rtL180M, que não foi detectada nos ensaios de
pirosequenciamento, foi encontrada em 4 amostras (LVM 10, LVM 8, LVM 6- 17/10/2005 e LVM
5) no ensaio convencional. É plausível a especulação de que a falha tenha ocorrido por causa do
oligonucleotídeo S27, já que para as outras regiões a técnica funcionou de maneira bastante
satisfatória. Com o resultado do sequenciamento, observou-se que as amostras LVM 10, LVM 8,
LVM 6- 17/10/2005 e LVM 5, 100% mutantes YVDD ou com população majoritária YVDD,
apresentaram a dupla mutação rtM204V e rtL180M (esta última não detectada pelo
pirosequenciamento). Assim, foi possível comprovar a presença da dupla mutação, associada com
frequencia aos casos de resistencia à 3TC (Liaw et al, 1999; Thibault et al, 1999; Leung et al, 2001;
Amostra Pirosequenciamento Sequenciamento Genótipos
M204V/I
HSH 489 Mista (wt e YVDD) YMDD F
HSH 553 Mista (wte YV/IDD*) YMDD F
LVM 1 - 31/08/2005 Mista (wte YVDD) YMDD A
LVM 1 - 15/03/2006 Mista (wt e YIDD) YMDD A
LVM 5 Mista (wt e YV/IDD*) YVDD F
LVM 6 - 17/10/2005 YVDD YVDD A
LVM 7 - 03/05/2006 YMDD YMDD D
LVM 7 - 07/08/2006 Mista (wt e YIDD) YMDD D
LVM 8 YVDD YVDD A
LVM 2 YMDD YMDD A
LVM 9 Mista (wt e YIDD) YMDD A
LVM 10 Mista (wt e YVDD) YVDD A
LVM 11 Mista (wt e YIDD) YMDD D
LVM 3 YMDD YMDD A
LVM 4 Mista (wt e YIDD) YMDD A
44
Lai et al, 2003; Taramasso et al, 2011).A mutação compensatória rtL180M é predominantemente
detectada em associação com a mutação primária rtM204V/I, funcionando como a principal
mutação compensatória com habilidade de restaurar o fitness de replicação do HBV a valores
próximos aos selvagens, além de aumentar a resistência a laminudina (Fu and Cheng, 1998;
Melegari et al, 1998; Deng and Tang, 2011).
Tabela 7: Resultados das análises da mutação rtL180M, indicando a porcentagem de moléculas
selvagens ou com substituições nucleotídicas.
Amostra L180M A/TTG ou A/CTG
T (wild type) C (wild type) A (mut)
HSH 489 0.0% 100.0% 0.0%
HSH 553 0.0% 100.0% 0.0%
LVM 11 - 31/08/2005 23.6% 76.4% 0.0%
LVM 11 - 15/03/2006 25.2% 74.8% 0.0%
LVM 2 13.7% 86.3% 0.0%
HBC 461 0.0% 100.0% 0.0%
HBC 462 0.0% 100.0% 0.0%
HBC 764 20.2% 79.8% 0.0%
HBC 786 25.1% 74.9% 0.0%
LVM 3 26.4% 73.6% 0.0%
LVM 4 26.3% 73.7% 0.0%
LVM 9 31.8% 68.2% 0.0%
LVM 7 - 03/05/2006 30.9% 69.1% 0.0%
LVM 7 - 07/08/2006 27.8% 72.2% 0.0%
LVM 11 33.5% 66.5% 0.0%
1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas;
2 amostra do mesmo
paciente com um intervalo de 3 meses entre as coletas.
As mesmas 25 amostras também foram submetidas à análise da mutação rtV173L e
resultados com alta qualidade foram obtidos em 20 amostras (Tabela8). A análise dos resultados
demonstrou que 90% (18/20) das amostras apresentaram apenas populações selvagens e 10% (2/20)
das amostras analisadas apresentou apenas populações mutantes (substituição do G por C).Essa
45
mutação é observada numa frequência menor do que as mutações rtM204V/I e rtL180M, e é
observada apenas acompanhada da dupla mutação rtM204V/I/rtL180M.Um estudo realizado por
Delaney e colaboradores (Delaney et al, 2003), demonstrou in vitro que a mutação compensatória
rtV173L juntamente com a dupla mutação rtM204V/I/rtL180M restaura a replicação viral a valores
próximos aos dos vírus selvagens(cerca de 90%), enquanto que o vírus que possui apenas da dupla
mutação rtM204V/I/rtL180M apresenta apenas 40% dos níveis de replicação selvagem.
É possível observar na Tabela 8 que o pirosequenciamento detectou duas amostras
(HBC 31 e HBC 126) 100% mutantes rtV173L. Devido a falta de material genético não foi possível
a realização do sequenciamento convencional dessas amostras para que uma comparação fosse feita
entre os resultados. Apenas amostras que apresentaram população 100% selvagem no
pirosequenciamento tiveram material genético suficiente para serem sequenciadas. Esse resultado
foi confirmado através do sequenciamento pelo método de Sanger.
46
Tabela 8: Resultados das análises da mutação rtV173L, indicando a porcentagem de moléculas
selvagens ou com substituições nucleotídicas.
Amostra V173L C/T/GTG
G (wild type) C (mut) T (mut)
HSH 489 100.0% 0.0% 0.0%
HSH 553 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 11 - 15/03/2006 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 11 - 31/08/2005 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 7 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 8 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 10 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 11 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 454 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 461 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 462 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 786 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 3 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 9 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 5 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 6 - 17/10/2005 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 764 100.0% 0.0% 0.0%
LVM 4 100.0% 0.0% 0.0%
HBC 31 0.0% 100.0% 0.0%
HBC 126 0.0% 100.0% 0.0%
1 Amostras do mesmo paciente com um intervalo de 7 meses entre as coletas
O limite de detecção de subpopulações mutantes pela técnica de Sanger segundo
Mello e colaboradores (2012) é de 20%. A análise dos resultados obtidos neste estudo revelou que a
grande maioria das amostras (16/21) nas quais mutantes foram detectados, essas subpopulações
estavam presentes em taxas menores do que 20%. Ou seja, tais subpopulações não seriam
detectadas pelo sequenciamento convencional. Ainda, em algumas amostras populações mutantes
em porcentagens menores que 5% foram detectadas, corroborando com o estudo de Mello et al,
2012 onde observou-se a detecção de populações mutantes rtM204V/I em pequenas porcentagens
pelo pirosequenciamento. Entretanto, essas populações minoritárias podem se tornar majoritárias
com a continuidade do tratamento, podendo ocasionar na falha do tratamento desses
47
pacientes(Wang et al, 2005; Metzner et al, 2009). Por este motivo é importante a detecção dessas
populações mutantes quando ainda estão em baixa porcentagem, para que seja feita a escolha da
terapia mais adequada.
Uma árvore filogenética foi construída para o HBV, podendo-se observar que 20%
(3/15)das amostras pertencem ao genótipo F, 60% (9/15)ao genótipo A e 20% (3/15)ao genótipo D
(Tabela 6). Esse resultado corrobora com a literatura, uma vez que os genótipos do HBV mais
encontrados no Brasil são o A, F e D. (Araujoet al. 2004, Viana et al. 2005, Ribeiro et al. 2006).
De 3 amostras HBV/D, 2 apresentaram população mista, sendo a população selvagem majoritária e
1 apresentou apenas população selvagem. Todas as amostras HBV/F (n=3) são compostas por
população mista, sendo em duas delas, a população selvagem majoritária e em uma a população
majoritária YVDD. Das 9 amostras HBV/A, 5 são compostas por população mista: 4 possuem
população selvagem majoritária e 1 possui população YVDD majoritária. Das restantes, 2 possuem
apenas população YVDD e 2 possuem apenas população YMDD. As informações obtidas não
foram suficientes para que fosse feita uma correlação das mutações com os genótipos do HBV. No
entanto, já foi descrito na literaturauma maior prevalência da mutação rtM204V no genótipo A do
que no genótipo D, o qual apresenta frequência maior da mutação rtM204I (Zöllneret al, 2004).
48
Figura 4.1:Árvore filogenética HBV.Árvore filogenética gerada a partir do alinhamento das
sequencias parciais da região S do HBV, construídas pelo método Neighbor-joining com 3000 replicatas. As
sequencias obtidas neste estudo estão marcadas com cores. Em azul, sequencias HBV/A1; em verde,
HBV/A2; em vermelho, HBV/D e em amarelo, HBV/F.
49
Todas amostras amplificadas com sucesso na PCR para detecção do HBVforam submetidas
ao RT-PCR para detecção do HIV (n=25) e o RNA do HIV foi detectado em 11 amostras.
Adicionalmente, duas amostras não amplificadas para o HBV foram incluídas e o RNA viral foi
detectado. As 13 amostras amplificadas foram submetidas à reação de pirosequenciamento,
paraanálise de substituições de nucleotídeos únicos (SNPs) associadas a resistência à 3TC.
Substituições na metionina do motivo YMDD (M184V ou M184I) foram analisadas. A substituição
de um C por um G, T ou A no códon TAC na posição 184 causa uma mutação de metionina para
isoleucina. Ocorre mutação de metionina para valina quando ocorre a substituição de T por C no
códon TAC na posição 184.Resultados com alta qualidade foram obtidos em nove amostras. Os
resultados apresentam-se na Tabela 9, onde é possível observar que apenas populações selvagens
foram encontradas.
Tabela9:Resultadosdas análises da mutação M184V, indicando a porcentagemde moléculas
selvagens ou com substituições nucleotídicas.
M184V/I
Posição 1 Posição 2
TAC/G/T/A C/TAC
Amostra C G T A C T
(WT) (Mut) (Mut) (Mut) (Mut) (WT)
HSH 489 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
HSH 553 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
LVM 5 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
HBC 249 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
HBC 250 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
LVM 7 - 03/05/2006 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
LVM 2 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
LVM 7 - 07/08/2006 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
HBC 462 100.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 100.0%
O sequenciamento do HIV foi realizado em duas amostras com o intuito de comprovar
se o resultado obtido pelo pirosequenciamento para o HIV estava correto, uma vez que não foi
possível a obtenção de um controle positivo que possuísse a mutação M184V/I para validar a
eficácia da detecção desta mutação por pirosequenciamento. Em ambas as metodologias usadas,
pirosequenciamento e sequenciamento padrão, foram detectaram apenas populações selvagens nas
50
amostras de HIV. Porém, sem um controle positivo da mutação M184V/I no pirosequenciamento e
sabendo que o sequenciamento padrão não detecta populações mutantes em pequenas porcentagens,
não é possível afirmar que essas amostras realmente não possuem cepas mutantes em baixas
proporções.
O pirosequenciamento se mostrou uma técnica muito útil na detecção das mutações
estudadas, porém alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que
foi encontrada nas amostras analisadas pela técnica de Sanger. Essa técnica é de rápida execução,
pouco trabalhosa e fornece resultados quantitativos, que permitem a elaboração de uma estratégia
terapêutica adequada para pacientes coinfectados.
Uma limitação do pirosequenciamento é que poucos laboratórios têm acesso a esse
equipamento, enquanto muitos laboratórios têm acesso a máquinas de senquenciamento de Sanger
automáticas. Uma limitação inerente da técnica de pirosequenciamento é que o curto comprimento
de leitura (40pb) comparado com o seqüenciamento Sanger (500pb). No entanto, para a análise de
mutações pontuais como as de resistência a lamivudina no HBV e HIV esta característica não é um
problema. Dessa forma, o pirosequenciamento é bem adequado para o rastreio de mutações
pontuais conhecidas em larga escala, mas não para exploraçãode regiões maiores em um genoma
viral.
51
V – CONCLUSÃO
A presença da mutação primária rtM204V/I foi detectada em proporções variáveis em
91.3% das amostras. A presença dessa mutação em mais de 90% das amostras representa a grande
freqüência com que essa mutação aparece em pacientes em tratamento continuado com a
lamivudina, demonstrando a importância da detecção dessa mutação em pacientes em tratamento
prolongado.
A mutação rtL180M não foi detectada pelo pirosequenciamento nas amostras
estudadas, no entanto, pelo método de Sanger, observou-se a presença dessa mutação em 4
amostras.
A mutação rtV173L foi encontrada apenas em duas amostras, pela técnica de
pirosequenciamento, como a única população detectada.
A mutação M184V/I, analisada nas amostras RNA-HIV e DNA-HBV positivas, não
foi detectada por nenhum dos métodos utilizados.
Os genótipos de HBV encontrados no presente estudo foram A1 (n=8), A2 (n=1), D
(n=3) e F (n=3) e não foi possível associá-los a nenhum perfil de mutações de resistencia à
lamivudina.
A técnica de pirosequenciamento foi capaz de detectar mutações que estão em
pequenas quantidades, que não foram detectadas pelo sequenciamento de Sanger.
52
VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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