Post on 24-Aug-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
ALINE DE SOUSA BARBOSA FREITAS PEREIRA
EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR
LIGADURA EM RATOS WISTAR
Natal/RN
2016
ALINE DE SOUSA BARBOSA FREITAS PEREIRA
EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR
LIGADURA EM RATOS WISTAR
Natal/RN
2016
Aline de Sousa Barbosa Freitas Pereira
EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR
LIGADURA EM RATOS WISTAR
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós Graduação em
Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito
para obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva com área de concentração em
Odontologia.
Aprovada em: ___/___/___
Banca examinadora
Prof. Dra Aurigena Antunes de Araujo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
Orientadora
Profa. Dra Leônia Maria Batista
Universidade Federal da Paraíba (UFPB)
Membro Externo
Prof. Dr. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
Membro Interno
AGRADECIMENTOS
À Deus, por todas as bênçãos recebidas e por ser meu refúgio e fortaleza, socorro
bem presente na angústia.
Ao meu amado, amigo, esposo Ivison. Sem você e seu apoio esse sonho não teria
sido realizado, obrigada pelo suporte diário e pelo nosso lindo presente que está por vir,
nosso amado Isaac. Nenhuma palavra será suficiente para expressar a minha gratidão pelo
teu companheirismo e paciência ao longo dessa jornada.
Aos meus pais, Adonias e Anabel, pelas orações, palavras de incentivo, amor e
por ter me mostrado o caminho da educação.
Ao meu irmão, Abner, cunhada e sobrinhos pela torcida e pelo amor que mesmo
não estando perto pode-se sentir.
Aos meus sogros, Ivo e Francisca, cunhada e família, pelas orações, incentivos e
carinho de filha e irmã.
As minhas primas, amigos (as) e demais familiares. Sei da torcida de cada um
(a) de vocês e sou grata por todas as palavras de apoio e carinho.
A minha orientadora, Profa. Aurigena Antunes, meu sincero respeito e
admiração por esta professora. Obrigada por me acolher e confiar na capacidade de
desenvolvimento do meu trabalho, pela paciência, horas dedicadas a mim e por todo
conhecimento passado.
A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, principalmente ao
departamento de Farmacologia, junto aos departamentos de Odontologia, Bioquímica,
Morfologia, Microbiologia e Parasitologia por ter proporcionado condições necessárias
para a realização desse trabalho.
A todos envolvidos na Base de Pesquisa em Farmacologia, em especial ao Prof.
Raimundo Araújo e a Profa. Caroline Addison pelos conhecimentos compartilhados.
A Lorena, Dona Neida, Flávio, César, Carla, Lourdinha, Helicarlos e outros
que colaboraram com tanto esforço e horas dedicadas para a realização dessa pesquisa.
Aos meus colegas de turma do PPGSCol, por contribuírem e fazer desse
momento tão importante e especial em minha vida.
Aos alunos de Iniciação científica, pelo apoio durante o desenvolvimento da
pesquisa.
A todos os funcionários dos Departamentos da UFRN envolvidos.
RESUMO
A periodontite é uma doença crônica caracterizada pela inflamação das gengivas,
degeneração dos ligamentos periodontais, osso alveolar e cemento. É considerada uma das
mais importantes causa da perda dentária em adultos. Estudos experimentais têm
apresentado novas alternativas farmacológicas para o tratamento da doença periodontal
com a finalidade de amenizar a inflamação e a perda óssea alveolar. O objetivo desse
estudo foi avaliar os efeitos da Metformina (MET) sobre a inflamação, o estresse oxidativo
e a perda óssea em um modelo de periodontite induzida por ligadura em ratos. Foram
utilizados 120 ratos, albinos, da linhagem Wistar. Os quais foram divididos aleatoriamente
em cinco grupos com 24 animais cada, com os seguintes tratamentos, por 10 dias: (NL)
ausência de ligadura + salina, (L) ligadura + salina, (MET 50) ligadura + 50 mg / kg de
MET, (MET 100) ligadura + 100 mg / kg de MET, e (MET 200) ligadura + 200 mg / kg de
MET. O tecido periodontal foi analisado para determinar a perda óssea e características
histológicas. A imuno-histoquímica foi utilizada para examinar a MMP-9, a COX-2, as
vias de RANK/RANKL/OPG, SOD-1 e da GPx. A análise de Espectroscopia UV-VIS foi
usada para examinar os níveis de malonaldeído (MDA), glutationa (GSH), IL-1β e TNF-α.
A reação da cadeia de polimerase de transcrição reversa foi usada para quantificar a
expressão do gene de AMPK, o NF-кB p65, e HMGB1. O valor de p <0,05 indicou uma
diferença estatística significativa. O tratamento com a MET 50 mg / kg reduziu
significativamente as concentrações de malonaldeído, IL-1β e TNF-α (p <0,05); nenhuma
das doses da MET apresentou diferença estatisticamente significativa (p>0,05) para o
aumento do GSH quando comparado ao grupo L; A dose de MET 50 mg/kg ainda
apresentou fraca coloração para a COX-2, MMP-9, RANK, RANK e SOD-1; exibindo
forte coloração para a GPx e OPG; houve aumento da expressão do AMPK e diminuição
da expressão de NF-Kβ p65 e HMGB1. Os achados revelaram que a Metformina diminui a
resposta inflamatória, o estresse oxidativo e a perda óssea na periodontite induzida por
ligaduras em ratos.
Palavras-chave: Periodontite. Metformina. Inflamação. Perda óssea. Estresse oxidativo.
ABSTRACT
Periodontitis is a chronic disease characterized by gum inflammation, degeneration
of periodontal ligaments, alveolar bone and cementum. It is considered one of the most
important cause of tooth loss in adults. Experimental studies have shown pharmacological
new alternatives for the treatment of periodontal disease in order to alleviate the
inflammation and alveolar bone loss. The aim of this study was to evaluate the effects of
Metformin (MET) on inflammation, oxidative stress and bone loss in a rat model of
ligature-induced periodontitis. Male Wistar albino rats were randomly divided into 5
groups of 24 rats each and given the following treatments for 10 days: (NL) no ligation +
saline, (L) ligation + saline, (MET 50) ligation + 50 mg/kg MET, (MET 100) ligation +
100 mg/kg MET, and (MET 200) ligation + 200 mg/kg MET. Periodontal tissue was
analysed to determine the bone loss and histopathological characteristics.
Immunohistochemical was used to examine MMP-9, COX-2, the RANK/RANKL/OPG
pathway and SOD-1 and GPx. Spectroscopic UV-VIS analysis was used to examine the
levels of Malonaldehyde, glutathione, IL-1β and TNF-α. Reverse transcription polymerase
chain reaction was used to quantify the gene expression of AMPK, NF-кβ p65 and
HMGB1. A p-value of <0.05 indicated a significant difference. Treatment with 50 mg/kg
MET significantly reduced concentrations of malonaldehyde, IL-1β and TNF-α (p < 0.05);
MET any of the doses statistically significant difference (p>0,05) in GSH increased
compared to Group L. Weak staining for COX-2, MMP-9, RANK, RANKL and SOD-1;
strong staining for GPx and OPG. Increased AMPK expression and decreased expression
of NF-кB p65 and HMGB1. Metformin decreases the inflammatory response, oxidative
stress and bone loss in ligature-induced periodontitis in rats.
Key-Words: Periodontitis. Metformin. Inflammation. Bone loss. Oxidative Stress.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Anatomia do periodonto ......................................................................... 9
Figura 2 - Visão esquemática dos biomarcadores chaves relacionados com a
progressão da Doença Periodontal............................................................. 17
Figura 3 - Estrutura química do Cloridrato de Metformina...................................... 23
Figura 4 - Metformina: mecanismo de ação proposto .............................................. 23
Figura 5 - Sequência de colocação da ligadura ........................................................ 30
Figura 6 - Gavagem com sonda de polipropileno .................................................... 31
Figura 7 - Divisão das amostras por grupos de 24 animais ...................................... 33
Figura 8 - Obtenção do Índice de Perda Óssea (IPO) .............................................. 34
Figura 9 - Aspectos macroscópicos da perda óssea alveolar ................................... 44
Figura 10 - Análise histopatológica dos grupos estudados ......................................... 45
Figura 11 - Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando
imunomarcações para RANK, RANK-L, OPG e Catepsina K ................ 48
Figura 12 - Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando
imunomarcações para MMP-9 COX-2, SOD-1 e GPx ............................ 49
Gráfico 1- Efeito da administração oral da Metformina sobre o índice de perda
óssea em ratos submetidos à ligadura................................................... 43
Gráfico 2 - Escores histopatológicos de acordo com o grupo de estudo ................. 46
Gráfico 3 - Efeito da Metformina sobre os níveis de MDA e GSH nos grupos
de estudo ...............................................................................................
50
Gráfico 4 - Efeito da Metformina sobre os níveis de IL-1β e TNF-α nos grupos
de estudo...............................................................................................
51
Gráfico 5 - Efeitos da Metformina na expressão gênica do AMPK, NF-кB p65 e
HMGB1em ratos com Doença periodontal............................................
52
Quadro 1 - Escores para análise histológica dos tecidos periodontais de suporte .. 36
Quadro 2 - Sequência de expressão gênica ............................................................. 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitros
µg Microgramas
ABP Osso alveolar propriamente dito
AP Osso alveolar
AG Ácidos graxos
AINES Anti-inflamatórios não esteróides
AMP Adenosina monofosfato
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
AMPK Proteína quinase ativada por AMP
BSA Albumina de soro bovino
CAT Catalase
CES Células do estroma da endometriose
COX-1 Cicloxigenase tipo 1
COX-2 Cicloxigenase tipo 2
GADPH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GCF Fluido crevicular gengival
DP Doença periodontal
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio de imunoabsorção
ERα Receptor de estrogênio alfa
GPx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa
GR Glutationa redutase
HE Hematoxicilina e eosina
HepG2 Hepatócitos humanos insulino-resistentes
H2SO4 Ácido sulfúrico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
Hmgb1 Proteína nuclear não-histona com elevada mobilidade
HOCL Ácido hipocloroso
IgG1 Imunoglobulina 1
IgG1 Imunoglobulina 3
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-6 Interleucina 6
IL-12 Interleucina 12
IL-18 Interleucina 18
i.p Intraperitoneal
IPO Índice de perda óssea
Kg Quilograma
LPO Peroxidação lipídica
LPS Lipopolissacarídeos
M Molar
ml Mililitro
mm Milímetro
MDA Malonaldeído
MET Metformina
MMP Metaloproteinases
Micro CT Microtomografia computadorizada
NF кB Fator de transcrição nuclear kappa B
NADPH Nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato
nm nanômetro
NO Óxido nítrico
OPG Osteoprotegerina
O2 Radical superóxido
OH Radical hidroxila
PBS Solução salina tamponada
PL Ligamento periodontal
pg Picograma
PGs Prostaglandinas
PGE2 prostaglandina da série E2
PMN Polimorfonucleares
RC Cemento radicular
RNA Ácido ribonucléico
RNAm RNA mensageiro
RANK Receptor de ativação do fator nuclear кB
RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear ҡB
RAR Raspagem e alisamento radicular
ROS Espécies reativas de oxigênio
r.p.m. Rotações por minuto
RT PCR Reação de transcrição reversa seguida da reação da polimerase em cadeia
SOD Superóxido dismutase
TIMP Inibidores teciduais de metaloproteinases
TLRs Receptores Toll-like
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
ºC Graus Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 7
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 9
2.1 ANATOMIA DO PERIODONTO ............................................................ 9
2.2 DOENÇA PERIODONTAL ...................................................................... 11
2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E PERIODONTITE ........................................ 12
2.4 PERIODONTITE E INFLAMAÇÃO ....................................................... 14
2.5 REMODELAÇÃO ÓSSEA E DOENÇA PERIODONTAL ..................... 19
2.6 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DA PERIODONTITE ......................... 21
2.7 METFORMINA (MET) ........................................................................... 22
2.8 EFEITOS PLEIOTRÓPICOS DA METFORMINA ................................. 24
3 OBJETIVOS ........................................................................................... 27
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 27
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 27
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................. 28
4.1 DESENHO DO ESTUDO ......................................................................... 28
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS .................................................................. 28
4.3 LOCAL DO EXPERIMENTO ................................................................. 28
4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS E GRUPOS ............................... 28
4.5 DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO ........................................ 30
4.5.1 Modelo Experimental da Doença Periodontal ...................................... 30
4.5.2 Tratamento Medicamentoso ................................................................... 31
4.5.3 Eutanásia dos animais ............................................................................. 32
4.5.4 Obtenção e preparo inicial do material para análise ............................ 32
4.6 TIPOS DE ANÁLISES ............................................................................. 33
4.6.1 Análise morfométrica e macroscópica da perda óssea alveolar .......... 33
4.6.2 Análise Histopatológica .......................................................................... 34
4.6.3 Análise Imunohistoquímica da expressão de RANK-L, RANK,
OPG, Catepsina K, COX-2, MMP-9, SOD-1 e GPx nos tecidos
periodontais de suporte ...........................................................................
36
4.6.4 ELISA para dosagem dos níveis de IL-1β e TNF-α nos tecidos
gengivais ....................................................................................................
38
4.6.5 Dosagem de Malonaldeído (MDA) ......................................................... 39
4.6.6 Dosagem de Glutationa (GSH) ............................................................... 39
4.6.7 Expressão gênica por RT PCR (PCR em tempo real) .......................... 40
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 42
6 RESULTADOS ........................................................................................ 43
6.1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR .. 43
6.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA ..................................................................... 44
6.3 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA OS MARCADORES DE
INFLAMAÇÃO E PERDA ÓSSEA ........................................................
47
6.4 EFEITO DO TRATAMENTO COM MET PARA OS MARCADORES
DE ESTRESSE OXIDATIVO ..................................................................
50
6.5 DOSAGEM DE IL-1β E TNF-α ............................................................... 50
6.6 EXPRESSÃO GÊNICA RT-PCR ............................................................ 52
7 DISCUSSÃO .......................................................................................... 54
8 CONCLUSÃO ........................................................................................ 60
REFERÊNCIAS ....................................................................................... 61
ANEXOS .................................................................................................. 72
1 INTRODUÇÃO
A doença periodontal (DP) é uma doença inflamatória, caracterizada pela ruptura do tecido
conjuntivo, perda da inserção e reabsorção do osso alveolar (BIJU et al., 2014). É uma das mais
importantes causas da perda dentária em adultos e a forma mais prevalente de patologia óssea
humana, além de ser um provável fator modificador da saúde sistêmica dos pacientes (GARLET et
al., 2006). Trata-se de uma doença de etiologia bacteriana, pois a cavidade oral abriga uma
quantidade substancial e em constante evolução de espécies microbianas (GRAVES; OATES;
GARLET, 2011). O biofilme bacteriano aderido à superfície dentária desencadeia uma reação
inflamatória intensa, onde as proteases degradam a matriz extracelular e ocasionam a reabsorção do
osso alveolar, conduzindo a uma perda irreversível da inserção do tecido periodontal (SORSA et al.,
2016).
O tratamento tradicional da doença periodontal envolve a raspagem e o alisamento radicular
(RAR), o qual reduz o biofilme e diminui o número de microorganismos (COBB, 2002). No
entanto, mesmo após o tratamento clínico bem-sucedido, ainda há uma grande chance de
reinfecção, causada por biofilmes residuais (CARVALHO et al., 2011). Assim, a associação da
RAR junto à antibioticoterapia local ou sistêmica tem sido sugerida, nesses casos, com a finalidade
de se obter os melhores resultados (PAQUETTE; RYAN; WILDER, 2008; KANER et al., 2007).
Os antiinflamatórios não esteroidais (AINES) também representam uma importante classe
farmacológica estudada há décadas como inibidores da resposta do hospedeiro frente à DP
(OFFENBACHER, 1996).
Eventualmente, outras terapias locais como o uso de clorexidina e óleos essenciais também
são empregadas no tratamento da periodontite. No entanto, essas terapias apresentam algumas
reações indesejadas: sensação de queimadura, sabor amargo, eventual coloração dos dentes e
resistência bacteriana (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010). Outro fator que frequentemente é
desconsiderado é que os antibióticos sistêmicos não penetram diretamente no biofilme subgengival
para eliminar as bactérias (KRAYER et al., 2010). Mediante a essas reações, outros fármacos vem
sendo estudados com a finalidade de eliminar os efeitos indesejáveis dos tratamentos
convencionais.
8
A investigação de novas formas de controle da doença periodontal é de relevante
interesse. Desta forma, alguns agentes moduladores são analisados como potenciais terapias
para a doença periodontal, como o hipoglicemiante oral Metformina (MET), que é uma
biguanida amplamente utilizada como agente antidiabético de primeira linha para o
tratamento de diabetes mellitus tipo 2 (BAK et al., 2010).
Esse fármaco pode apresentar outros benefícios, tais como efeitos antiendometriótico
(TAKEMURA et al., 2007), antiaterogênico (HATTORI et al., 2006), antitumoral
(SCARPELLO; HOWLETT, 2008) e efeitos antiobesidade (PARK et al., 2009). Além disso,
foi demonstrado também que a Metformina exerce um efeito osteogênico em osteoblastos
(CORTIZO et al., 2006). Esse resultado sugere que a MET exerce benefícios em tecidos
ósseos. Assim, baseado nessas informações o presente estudo teve por objetivo determinar o
efeito da Metformina na atividade anti-inflamatória, estresse oxidativo e na perda óssea
alveolar em ratos submetidos à doença periodontal induzida por ligadura.
9
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ANATOMIA DO PERIODONTO
O periodonto (peri=em torno de; odonto=dente) é também chamado de “aparelho de
inserção” ou “tecidos de suporte dos dentes”. Essa estrutura forma uma unidade de
desenvolvimento, biológica e funcional, a qual sofre alterações ocasionadas pela idade e, além
disso, está sujeita a alterações morfológicas relacionadas a modificações funcionais e no meio
bucal. Compreende os seguintes tecidos: (1) Gengiva (G), (2) Ligamento periodontal (PL), (3)
Cemento radicular (RC) e o (4) Osso alveolar (AP) (Figura 1) (LINDHE; KARRING;
ARAÚJO, 2010).
Figura 1. Anatomia do Periodonto
Fonte: Lindhe et al., (2010).
Fig. 1 Componentes Anatômicas do Periodonto: Gengiva (G), Ligamento Periodontal (PL), Cemento
Radicular (RC). O osso alveolar é constituído por dois componentes: Osso Alveolar Propriamente Dito
(ABP) e o Processo Alveolar. (AP).
10
A gengiva é a parte da mucosa mastigatória que cobre o processo alveolar e circunda a
região cervical dos dentes, consiste em uma camada epitelial e um tecido conjuntivo
subjacente, denominado lâmina própria. Ainda é dividida anatomicamente em marginal,
inserida e área interdental. Apesar de cada tipo de gengiva exibir considerável variação na
diferenciação, histologia e espessura, de acordo com a sua demanda funcional, todos os tipos
são especificamente estruturados para funcionar de forma adequada contra danos mecânicos e
microbianos (CARRANZA; NEWMAN, 2011).
O ligamento periodontal (PL) é o tecido conjuntivo frouxo, ricamente vascularizado e
celular, que circunda as raízes dos dentes e une o cemento radicular a lâmina dura ou ao osso
alveolar propriamente dito. O espaço do PL tem a forma de ampulheta e é mais estreito no
nível do terço médio da raiz, sua largura é de cerca de 0,25mm (0,2 - 0,4mm). A presença
dessa estrutura permite que forças produzidas durante a função mastigatória e outros contatos
dentários, sejam distribuídas e absorvidas pelo processo alveolar. Essencial, também, para a
mobilidade dentária (LINDHE; KARRING; ARAÚJO, 2010).
O cemento radicular (RC) é um tecido mineralizado, altamente especializado, que
recobre as superfícies radiculares. Presta-se ainda à inserção das fibras colágenas da inserção
conjuntiva e do ligamento periodontal. Estruturalmente, assemelha-se ao osso, mas difere em
vários aspectos funcionais como a ausência de inervação, não sofre remodelação e reabsorção
fisiológica, não contém vasos sanguíneos e linfáticos, porém se caracteriza pela formação
contínua ao longo da vida. Desempenha diferentes funções: inserir as fibras do PL na raiz e
contribui para o processo de reparo após danos à superfície radicular (LINDHE; KARRING;
ARAÚJO, 2010).
O osso alveolar é formado durante o desenvolvimento fetal por ossificação
intramembranosa, composto por células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos,
osteoclastos e colágeno, constituindo a matriz orgânica. Já a sua matriz inorgânica é formada
por água, fosfato, bicarbonatos, fluoretos e citratos (CARRANZA; NEWMAN, 2011). As
alterações morfológicas relacionadas a idades relatadas no osso alveolar espelham aquelas que
ocorrem em outros sítios ósseos.
11
2.2 DOENÇA PERIODONTAL
A doença periodontal é um termo bastante amplo atribuído a várias condições
patológicas, caracterizadas pela degeneração e inflamação das gengivas, ligamentos
periodontais, osso alveolar e cemento. Estágios mais graves da doença podem ocasionar
também a perda dentária (BIJU et al., 2014).
A forma mais comum da periodontite crônica afeta cerca de 50% da população adulta
no mundo, enquanto que sua forma mais agressiva afeta de 10 a 15% destes indivíduos.
Possui ainda uma alta prevalência em idosos, alcançando mais de 60% de pessoas acima dos
65 anos de idade (CHAPPLE; GENCO, 2013).
São ocasionadas por bactérias residentes no biofilme ao longo da superfície dentária e
da interface entre os tecidos gengivais e o dente, muitas das quais são gram-negativas e
anaeróbicas (PASTER et al., 2001). Os microoganismos fortemente associados como agentes
etiológicos incluem: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e
Bacteroides Forsythus (ORINGER, 2002).
A periodontite é causada pela infecção polimicrobiana, porém há evidências de que a
extensão da inflamação desta doença pode também resultar da interação entre as espécies
seletivas da microflora oral e da resposta imunitária do hospedeiro (CHEN et al., 2016). No
entanto, Porphyromonas gingivalis W50 é apontado como um dos patógenos mais
proeminentes e altamente associados à periodontite (DARVEAU, 2010; FISCHER et al.,
2013).
A lesão inicial é caracterizada pela resposta dos leucócitos residentes e células
endoteliais a presença do biofilme bacteriano. Nesta fase, não há sinais de inflamação clínica,
mas as alterações nos tecidos podem ser observadas histologicamente. Os produtos
metabólicos das bactérias acionam células do epitélio juncional para produzirem citocinas e
estimulam a produção de neuropeptídeos, que causam vasodilatação dos vasos sanguíneos
locais. Os neutrófilos deixam o ambiente vascular e migram para o local da inflamação em
resposta a quimiocinas liberadas (KAYAL et al., 2013). A lesão precoce segue com aumento
do número de neutrófilos no tecido conjuntivo e o aparecimento de macrófagos, linfócitos,
células plasmáticas, mastócitos e proteínas do complemento, também, são ativadas. Há uma
12
proliferação epitelial observada histologicamente e os sinais clínicos da inflamação gengival,
tais como hemorragia e aumento do fluido crevicular começam a ser visualizados (CEKICI et
al., 2014).
A etapa seguinte é a lesão estabelecida. Esta pode ser considerada como o período de
transição a partir da resposta imune inata para a resposta imune adquirida. Os macrófagos, as
células plasmáticas e os linfócitos T e B são dominantes, com imunoglobulinas (IgG1 e IgG3)
e subclasses de linfócitos B, também, estão presentes. Há um aumento da produção de
colágeno pelos fibroblastos. Clinicamente, observa-se nesta fase o sangramento, alterações de
cor e do contorno gengival. A etapa final é a transição para periodontite, a lesão avançada,
onde há uma reação inflamatória mais profunda e se percebe a perda óssea alveolar
(FIORELLINI; ISHIKAWA; KIM, 2006).
Uma vez aderido à superfície dentária, o biofilme bacteriano ocasiona uma reação
inflamatória intensa, originando proteases que degradam a matriz extracelular e provocam a
reabsorção do osso alveolar, levando assim a uma perda irreversível da inserção dos tecidos
periodontais (BAKER, 2000; KINANE; LAPPIN, 2001). O conhecimento dos mecanismos
imunológicos e como ocorre a regulação das respostas inflamatórios é de fundamental
importância para a compreensão da patogênese de doenças complexas, tais como a
periodontite.
2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E PERIODONTITE
Espécies reativas de oxigênio (ROS) e produtos da peroxidação lipídica são
produzidas em quantidades fisiológicas no corpo humano, porém em condições patológicas,
especialmente na inflamação crônica, ocorre a sua produção excessiva (HALLIWELL, 2000).
As ROS é um termo coletivo que inclui os radicais livres derivados de oxigênio (ODFR), tais
como o radical superóxido (O2), radical hidroxila (OH) e radical de óxido nítrico (NO), inclui
também radicais não derivados de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido
hipocloroso (HOCl) (BHATTACHARYYA et al., 2014).
13
A mitocôndria é o principal local de consumo de oxigênio intracelular e a principal
fonte de formação de ROS. As células dos organismos aeróbios produzem a maior parte de
sua energia química através do consumo de oxigênio em nível mitocondrial (AMES, 2004).
O processo do estresse oxidativo é originado a partir da existência de um desequilíbrio
entre compostos oxidantes e antioxidantes, provocando a produção excessiva de radicais
livres ou a diminuição da velocidade de remoção desses. Assim, esse processo conduz à
oxidação de biomoléculas e consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio
homeostático, em que a manifestação é o dano oxidativo potencial contra células e tecidos
(HALLIWEL; WHITEMAN, 2004).
Os sistemas biológicos são constituídos por sistemas antioxidantes altamente
protetores e que são eficientes o suficiente para neutralizar os radicais livres em excesso e
proteger as células contra efeitos nocivos (VALKO et al., 2007). Esses sistemas podem ser
divididos em: enzimáticos e não enzimáticos (PHAM-HUY L.; PHAM-HUY C.; 2008). As
enzimas antioxidantes mais eficazes também conhecidas como "enzimas primárias" são
representadas pela Glutationa Peroxidase (GPx), Catalase (CAT) e a Superóxido Dismutase
(SOD), que impedem a formação ou a neutralização dos radicais livres. Há também as
"enzimas secundárias", tais como a Glutationa Redutase (GR). Os antioxidantes não
enzimáticos são aqueles gerados endogenamente no corpo através de vias metabólicas,
incluindo antioxidantes tiol, melatonina, coenzima Q10, ácido úrico, bilirrubina, proteínas
quelantes de metais, etc. (PHAM-HUY L; PHAM-HUY C, 2008). Nutrientes antioxidantes
estão inclusos entre o sistema de defesa não enzimático, e são compostos exógenos, obtidos a
partir de alimentos ou suplementos alimentares naturais, tais como a vitamina C, a vitamina E,
carotenóides, oligoelementos (Selênio, Enxofre, Zinco), compostos polifenólicos etc
(ASLANI; GHOBADI, 2016).
A peroxidação lipídica (LPO) é um dos principais resultados da injúria tecidual
mediada pelas ROS (DEL RIO; STEWAR; PELLEGRINI, 2005). Quando as ROS interagem
com os ácidos graxos polinsaturados em membranas ou lipoproteínas, ocasionam profundas
alterações na integridade estrutural e função das membranas celulares. Devido a LPO ser um
resultado do estresse oxidativo, numerosos marcadores são utilizados para monitorar este
processo. O Malonaldeído (MDA) é o principal e um dos produtos mais estudados de
peroxidação de ácidos graxos polinsaturados (BALTACIOGLU et al., 2014).
14
A doença periodontal está associada com o aumento dos níveis de parâmetros de
estresse oxidativo. O papel efetivo do aumento do estresse oxidativo e a diminuição da
capacidade antioxidante na patogênese da ruptura do tecido periodontal, são demonstrados em
soro, saliva e no fluido crevicular gengival (GCF). Estes níveis podem ser aumentados de
acordo com o número e tipo de diferentes bactérias periodontais encontradas nas bolsas
periodontais (BALTACIOGLU et al., 2014). Estudos indicam que o excesso de ROS e o
esgotamento dos níveis de antioxidantes no GCF são responsáveis pela ativação local da
inflamação crônica nos tecidos periodontais e pela sua destruição (GHALLAB; HAMDY;
SHAKER, 2015).
Todas as células do corpo são capazes de gerar ROS. Os neutrófilos
polimorfonucleares são de primordial importância no que diz respeito à periodontite. Os
PMNs compreendem a primeira linha de defesa do hospedeiro e estão presentes nos locais da
invasão microbiana. Eles são ativados por mediadores inflamatórios e podem gerar um
aumento dos níveis de ROS, que não só destroem o periodonto, mas também os tecidos
circundantes (RAMESH et al., 2016). As ROS são geradas pelo sistema de nicotinamida-
adenina-dinucleótido fosfato (NADPH) oxidase (Nox) presente nos neutrófilos e que catalisa
a redução de oxigênio molecular para o radical superóxido. As reduções posteriores resultam
na produção de peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A literatura tem demonstrado que
as ROS regulam a formação e função dos osteoclastos, ou seja, a capacidade de reabsorção
óssea (LEAN et al., 2005).
Estudos relataram o papel das enzimas antioxidantes, incluindo Glutationa Peroxidase
(GPx), a Catalase (CAT), e Superóxido Dismutase (SOD), na periodontite em seres humanos
(AZIZ et al., 2013) e ratos (YAGAN; KESIM; LIMAN, 2014). A SOD pode ser localizada
dentro do ligamento periodontal humano e representa um importante mecanismo de defesa
dentro de fibroblastos gengivais contra a liberação de radicais superóxidos (JACOBY;
DAVIS, 1991).
Brock et al., 2004 observaram que a capacidade antioxidante total em pacientes com
periodontite é significativamente inferior quando comparados com os controles saudáveis.
Ainda há estudos em animais que mostram que a ação antioxidade é maior naqueles que
receberam algum tratamento farmacológico quando comparado aos doentes e não tratados
(ARAÚJO et al., 2014).
15
2.4 PERIODONTITE E INFLAMAÇÃO
Existem microrganismos específicos associados com as formas progressivas da DP.
No entanto, a presença desses microrganismos em indivíduos sem evidência de progressão da
doença sugere que essas alterações correspondem a resposta imunológicas do hospedeiro aos
processos inflamatórios, e não a simples presença dessas bactérias (CEKICI et al., 2014).
Localmente, bactérias e seus subprodutos metabólicos, a exemplo dos
lipopolissacarídeos, estimulam uma resposta imunitária celular na gengiva afetada,
representado por uma densa infiltração de neutrófilos, macrófagos e células linfóides (COBB,
2008). Estas respostas são destinadas para eliminar o desafio microbiano, porém essa reação
pode muitas vezes exacerbar os danos aos tecidos periodontais (MADIANOS; BOBETSI;
KINANE, 2005).
A resposta inflamatória é caracterizada pela secreção desregulada de mediadores
inflamatórios derivados do hospedeiro e pela degradação dos tecidos. Os mediadores mais
extensivamente estudados incluem interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), sendo
esses os primeiros a aparecerem na via patogênica da doença periodontal (GARLET, 2010), a
prostaglandina E2 (PGE2), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), ligante do receptor ativador
do fator nuclear ҡB (RANKL), e as metaloproteinases (MMPs; particularmente MMP-8,
MMP-9 e MMP-13), bem como as citocinas de células T reguladoras (por exemplo, IL-12,
IL-18) e as quimiocinas (PRESHAW; TAYLOR, 2011).
As MMPs constituem uma família de enzimas dependentes de zinco que são
classificadas de acordo com sua semelhança estrutural e seus substratos específicos
(GRENIER; MAYRAND, 2001). As MMPs são divididas em cinco grandes grupos:
colagenases (MMPs 1, 8 e 13); gelatinases (MMPs 2 e 9); estromelisinas (MMPS 3, 10 e 11);
MMPs tipo membrana (MMPs 14, 15, 16 e 17); e outras (SORSA; TJADERHANE; SALO,
2004; SORSA et al., 2006). Estas enzimas podem coletivamente degradar quase todos os
componentes da membrana da matriz extracelular e a membrana basal, a atividade
patologicamente excessiva leva à destruição dos tecidos periodontais (GESELL-SALAZAR et
al., 2013; SORSA; TJADERHANE; SALO, 2004; SORSA et al., 2006).
16
A atividade das MMPs é controlada por alterações no balanço delicado entre a sua
expressão e síntese, tendo como seus principais inibidores endógenos, inibidores teciduais de
metaloproteinases de matriz (TIMPs). O equilíbrio entre as atividades desses inibidores a as
MMPs determinam o grau de degradação da matriz extracelular. Uma variedade de
mediadores bioquímicos, também, influencia nesse equilíbrio como: fatores de crescimento,
hormônio, produtos oncogênicos, e os níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias (USHIDA
et al., 2000). São secretadas ou liberadas por uma variedade de células hospedeiras como:
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos, osso, células epiteliais e endoteliais
(RYAN; GOLUB, 2000).
As principais MMPs colagenolíticas associadas com a gravidade da doença
periodontal são MMP-8 e MMP-13 (SORSA et al., 2004; LEPPILAHTI et al., 2011). A
elevação da atividade de MMP-8 foi previamente associada com a conversão da gengivite
para periodontite e a progressão da periodontite estabelecida (MANTYLA et al., 2006). Tanto
a MMP-8, como a MMP-9 e a mieloperoxidase (MPO), são liberadas principalmente pelos
neutrófilos sob uma forma latente, são induzidas e ativadas durante a inflamação periodontal
por mediadores inflamatórios do hospedeiro como o TNF-α, IL-1β, espécies reativas de
oxigénio (ROS), incluindo o ácido hipocloroso MPO produzido (SAARI et al., 1990),
proteases microbianas e derivados do hospedeiro (SORSA et al., 1992).
As MMPs 2 e 9 são identificadas como predominantes em casos de DP inflamatória
em humanos e em ratos, estando relacionadas tanto com a gravidade da DP quanto com a
regulação da resposta inflamatória e da migração celular, presentes no processo de reparo
tecidual (ACHONG et al., 2003; SMITH et al., 2004). Um estudo transversal mostrou que os
níveis de MMP-8 e MMP-9 no fluído crevicular gengival foram correlacionados com a
periodontite crônica (BEKLEN et al., 2006).
Lipopolissacarídeos (LPS) presente na membrana de gram-negativos desencadeiam o
recrutamento de polimorfonucleados para o local. Assim, monócitos e macrófagos ativados
liberam várias citocinas pró-inflamatórias principalmente IL-1β e TNF-α que agem
diretamente na inicialização do processo destrutivo, tanto do tecido ósseo por catepsinas e
MMPs produzidas por osteoclastos, bem como, outras colagenases intersticiais que atuam no
tecido mole. Os Fibroblastos e PMN (neutrófilos polimorfonucleares) também podem liberar
MMP’s (GIANNOBILE, 2008) (Figura 2).
17
Figura 2. Visão esquemática dos biomarcadores chaves relacionados com a progressão da doença
periodontal.
Legenda: Eventos iniciais são acionados por LPS a partir do biofilme da placa gram-negativa na
superfície radicular. Como uma primeira linha de defesa, PMNs são recrutados para o local. Os
monócitos e macrófagos ativados respondem à endotoxina através da libertação de citocinas TNF e IL-
1, que regulam os processos mais destrutivos. MMP, potentes enzimas destruidoras de colágeno, são
produzidas por fibroblastos e pelos PMNs. O TNF, IL-1 e o ligante do receptor ativador do fator
nuclear ҡB (RANKL) são elevados em locais ativos e regulam a osteoclastogênese e a destruição
óssea (Adaptado de GIANOBILLE, 2008).
A IL-1β e a IL-6 são citocinas inatas e têm sido caracteristicamente associada com a
migração de células inflamatórias e a osteoclastogênese (GRAVES et al., 2008). O TNF-α é
uma citocina de múltiplos efeitos e que tem várias funções de migração celular para ocasionar
destruição dos tecidos. Ainda possui um alto impacto na migração de células, através da
indução do aumento da regulação de moléculas que promovem à rotação e à adesão dos
neutrófilos a parede do vaso, levando ao extravasamento. O TNF-α também estimula a
produção de quimiocinas envolvidas na migração de células para locais infectados e
inflamados (DINARELLO, 2000). Regula positivamente a produção de IL-1β e a IL-6
(DINARELLO, 2000; GARLET et al., 2007; GRAVES et al., 2008). Ainda está
DENTE
18
correlacionado com a degradação da matriz extracelular e a reabsorção óssea por meio de
ações de promoção da secreção de MMP’s e RANK-L (GARLET et al., 2004; GRAVES et
al., 2008).
Um ponto chave na expressão das citocinas pró-inflamatórias é a ativação celular do
fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). A família do NF-κB (ou família Rel) consiste
de cinco subunidades que incluem: p65 (RelA), cRel, RelB, p50 e p52. Este fator de
transcrição opera tanto em células malignas ou com potencial de malignidade quanto em
células inflamatórias. A forma mais prevalente do NF-ᴋB ativado é o heterodímero composto
por uma subunidade p50 ou p52 e pela subunidade p65, que contém o domínio de
transativação necessário para a indução do gene (LI et al., 2005).
Pode ser ativado por mais de 150 estímulos: radicais livres, citocinas pró-inflamatórias
(IL-1β e TNF-α), lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), substâncias cancerígenas, promotores
tumorais, radiação UV e mais de 150 genes são expressos em sua ativação (ROMIER et al.,
2008). As citocinas, tais como TNF-α e IL-1β são capazes de ativar o NF-ᴋB através da
proteína quinase C e outras cinases, que fosforilam a parte I-ᴋB do complexo citoplasmático,
liberando o NF-ᴋB rapidamente e sem a necessidade de longa síntese proteica, citocinas estas
muito importantes e que estão envolvidas na progressão da DP (CHAPPLE, 1996). A via
clássica ou canônica do NF-ᴋB é a principal via envolvida na sinalização pró-inflamatória e é
ativada por uma gama de estímulos, que incluem citocinas pró-inflamatórias, vírus, receptores
Toll-like (TLRs) e receptores de antígenos (ROMIER et al., 2008). Potenciais aplicações
terapêuticas de inbição do NF-ᴋB são investigadas em modelos animais de artrite reumatóide
(MCINTYRE; SHUSTER; GILLOOLY, 2003).
Essas informações sugerem que a sinalização da via NF-ᴋB deve ter um importante
papel nas doenças periodontais. E esse conceito é suportado não apenas por análise do perfil
de expressão gênica que demonstram aumento tanto de NF-ᴋB e de genes regulados pela via
NF-ᴋB em tecidos periodontais doentes (DEMMER et al., 2008), mas também por estudos in
vitro (CHEN et al., 2008) .
Outra via envolvida na patogênese da doença periodontal envolve a síntese e
liberação de prostaglandinas (PGs) e outros metabólitos do ácido araquidônico dentro dos
tecidos periodontais (HOWELL; WILLIANS, 1993). Estas potentes moléculas estão
associadas à destruição dos tecidos, alterações no metabolismo dos fibroblastos e a reabsorção
19
óssea (KUMAR et al., 2013). As enzimas ciclooxigenases, COX-1 e COX-2, catalisam a
conversão do ácido araquidônico a prostaglandinas. A COX-1 é expressa constitutivamente e
leva à produção de PGs que são particularmente importantes na homeostase, enquanto que a
COX-2 é induzida e leva à formação de PGs envolvidas nos processos inflamatórios
(GARLET, 2010). A atividade das ciclooxigenases foi considerada aumentada em certos
estados inflamatórios, podendo ser induzida nas células por citocinas inflamatórias (SEIBERT
et al., 1994)
Offenbacher, Heasman, Collins (1993), relataram que os níveis de prostaglandina da
série E (PGE-2) no fluido crevicular gengival (GCF) estão correlacionados positivamente com
a inflamação periodontal e a destruição iminente de tecidos. A PGE-2 e o leucotrieno B-4
foram encontrados no fluido crevicular gengival de indivíduos com periodontite agressiva
localizada. Além disso, P. gingivalis estimula o aumento dos níveis PGE-2 e a expressão da
COX-2 no infiltrado de leucócitos in vivo (POULIOT et al., 2000).
Teoricamente, a maior parte da inflamação e alterações destrutivas periodontais que
ocorrem na DP, tais como vermelhidão gengival, edema, degradação do colágeno e perda
óssea poderiam ser causadas pela presença das ações diretas da PGE 2 (KUMAR et al., 2013).
2.5 REMODELAÇÃO ÓSSEA E DOENÇA PERIODONTAL
O osso, incluindo o osso alveolar, é continuamente remodelado por um processo
equilibrado de reabsorção pelos osteoclastos, seguido de deposição pelos osteoblastos
(BAKER, 2000). Os osteoclastos são células grandes multinucleadas envolvidas na
reabsorção óssea fisiológica e patológica. Suas células precursoras surgem a partir da
linhagem hematopoiética formada dentro da medula óssea (CAPPARIELLO et al., 2014). Já
os osteoblastos desempenham um papel crítico no processo de remodelação óssea, formando e
depositando novo material ósseo. Há ainda os osteócitos, que são considerados osteoblastos
terminalmente diferenciados, que tenham chegado ao fim do seu percurso de diferenciação e
estão incorporados dentro da microestrutura do osso (SCHAFFLER; KENNEDY, 2012;
PRICE et al., 2011).
20
Em condições patológicas, tais como periodontite, há um desequilíbrio nos processos
de formação e reabsorção resultando na perda óssea. Este desequilíbrio é devido não somente
a excessiva reabsorção óssea dos osteoclastos, mas também a supressão da diferenciação e
atividade dos osteoblastos (SOUZA; LERNER, 2013). O RANKL (ligante do receptor de
ativação do fator nuclear κβ), seu receptor celular, RANK (receptor de ativação do fator
nuclear кB) e osteoprotegerina (OPG) representam o sistema de regulação molecular chave
para a remodelação óssea. Os efeitos de RANKL são neutralizados pela OPG, que inibe
fortemente a reabsorção óssea pela prevenção do acoplamento RANK-RANKL (KATAGIRI;
TAKAHASHI, 2002).
Na doença periodontal, o aumento dos níveis de RANKL é encontrado em tecidos
doentes, e o seu desequilíbrio com a expressão de OPG pode determinar a gravidade da
doença (GARLET et al., 2004; VALVERDE; KAWAI; TAUBMAN, 2004).
O sistema RANK também contribui para a reabsorção óssea, induzindo a expressão da
Catepsina K, uma proteinase de cisteína produzidas por osteoclastos ativados e envolvidas no
processo de solubilização da matriz óssea (TEITELBAUM, 2000). A Catepsina K é
considerada, muitas vezes, como um importante alvo terapêutico para o direcionamento da
perda óssea em muitas doenças que apresentam a formação ou funcionamento excessivo de
osteoclastos, incluindo a artrite reumatóide, osteoporose pós-menopausa e doença periodontal
(CHEN, et al. 2016).
As citocinas inflamatórias, de modo geral, atuam tanto na iniciação quanto na
manutenção da resposta imune frente aos desafios bacterianos. Existem várias classes de
moléculas que ativam a resposta do hospedeiro e que podem estimular a osteoclastogênese,
direta ou indiretamente, incluindo mediadores à base de lípideos, tais como prostaglandinas
ou leucotrienos, citocinas e quimiocinas (GRAVES; LI; COCHRAN, 2011). O TNF-α está
envolvido na migração dos leucócitos para os tecidos periodontais, na reabsorção óssea
alveolar e na perda da inserção conjuntiva. A IL-1β ocasiona o aumento da secreção dos
níveis de MMPs e diminui a expressão dos TIMPS (inbidores teciduais de metaloproteinases),
desempenhando, portanto, um papel importante na degradação da matriz extracelular na
periodontite e um grande indutor de reabsorção óssea (GRAVES; COCHRAN, 2003).
Bloqueando-se a atividade do TNF-α, por meio de antagonistas ou anticorpos, não
somente há uma redução da resposta inflamatória como também pode haver uma inibição da
21
reabsorção óssea através da diminuição da atividade do RANKL presente no tecido. A
supressão da formação de osteoclastos tem sido observada em modelos animais de artrite
reumatóide através de várias combinações da inibição de TNF-α, IL-1β ou RANKL
(ZWERINA et al., 2004).
2.6 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DA PERIODONTITE
A raspagem e o alisamento radicular (RAR) são partes essenciais consideradas o
padrão ouro para tratamento das doenças periodontais (COBB, 1996). No entanto, uma
pequena proporção de indivíduos tratados e que não respondem a terapia continuam a
apresentar perda de inserção clínica (COLOMBO et al., 2012). Assim, a possibilidade de uma
reinfecção por microorganismos residuais é um forte argumento para a utilização de
tratamentos adjuvantes além da RAR (COBB, 2008).
A literatura tem discutido a possibilidade da terapia antimicrobiana como adjuvante a
terapia mecânica no tratamento da periodontite e tem indicado que o seu uso pode fornecer
benefícios adicionais (HEITZ-MAYFIELD, 2009). Historicamente, o primeiro antibiótico
utilizado como terapia local foi o Actisite (não disponível comercialmente). Actisite foi
fornecido como fibras ocas, não absorvíveis preenchidos com tetraciclina. A fibra era
introduzida na cavidade em torno do dente. O sistema do Actisite, embora muito eficaz,
tornou-se tedioso de usar e possuía a necessidade uma segunda visita para a sua remoção.
Estas questões impulsionaram o desenvolvimento de sistemas absorvíveis para aplicação do
antibiótico. O Atridox (Atrix Laboratories, Fort Collins, CO), foi o primeiro sistema de
antibióticos locais reabsorvíveis, composto por doxiciclina, que possui uma maior meia vida
do que a tetraciclina. Após 7 dias o medicamento era absorvido não sendo necessária uma
segunda visita para a sua remoção. Esse sistema melhorou a aplicação do antibiótico local,
permitindo a colocação do material numa maior profundidade da maioria das bolsas
periodontais, ao contrário das fibras sólidas de Actisite (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD,
2010).
Apesar de mais de 700 espécies bacterianas terem a capacidade de estar presentes no
sulco gengival, apenas um subconjunto de espécies são consistentemente encontradas e
22
associadas com sítios doentes. Com base no espectro de ação, um conhecimento prévio a
cerca do antibiótico e uma pesquisa sobre o perfil das espécies bacterianas no sulco gengival,
é possível escolher o antibiótico que deva ser um agente farmacológico eficaz
(SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2005). No entanto, deve-se ter um cuidado porque nenhum
destes antibióticos é eficaz como monoterapia no tratamento da DP.
A combinação do Metronidazol e Amoxicilina foi realizada para produzir uma maior
redução da profundidade da bolsa periodontal. Um regime de 7 dias de Metronidazol
sistêmico reduziu significativamente a porcentagem de sítios com sangramento em
comparação ao grupo controle (WINKEL et al., 2001). Outros relataram uma redução de 12
meses no sangramento no tratamento com uma combinação de Metronidazol-Amoxicilina em
comparação com um tratamento placebo (LOPEZ; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000).
Preocupações são frequentemente levantadas no que se refere à resistência bacteriana com o
uso do antibiótico sistêmico no tratamento da doença periodontal. Essa resistência pode
eliminar uma droga possivelmente importante ou essencial como possível opção de
tratamento de doenças com um maior potencial risco de vida do que a DP, isoladamente
(WALKER, 1996).
Os anti-inflamatórios não esteróides (AINES) também representam uma classe
farmacológica importante de agentes que têm sido estudados como inibidores da resposta do
hospedeiro na doença periodontal. Estes agentes são bem conhecidos pela capacidade de
prevenir a formação de prostanóides (OFFENBACHER, 1996). Outras terapias locais como
clorexidina e óleos essenciais também são empregadas no tratamento da periodontite. No
entanto, essas terapias apresentam algumas reações indesejadas: sensação de queimadura,
sabor amargo, e eventual coloração dos dentes (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010;
LOPES; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000).
2.7 METFORMINA (MET)
O cloridrato de Metformina faz parte de uma importante classe de hipogliceminantes
orais, as biguanidas (Fig.3). É o agente anti-hiperglicêmico oral mais comumente prescrito,
consumido anualmente por mais de 150 milhões de pessoas em todo o mundo (KONOPKA et
23
al., 2016). Utilizada para diminuir a concentração de glicose no sangue em diabéticos tipo 2,
aumentando a sensibilidade à insulina (GOODARZI; BRYER-ASH, 2005).
Figura 3. Estrutura química do Cloridrato de Metformina
Fonte: Farmacopéia Britânica, 2012.
O mecanismo de ação da Metformina ainda é controverso, podendo ter vários sítios de
ação como: diminuição da produção da glicose hepática, aumento da disponibilidade da
glicose periférica e redução da absorção intestinal da glicose (HUNDAL; INZUCCHI, 2003).
Reduz a gliconeogênese, promove a absorção de glicose e diminui a produção desse açúcar no
fígado (ZHOU et al., 2001). Em menor escala, os níveis de glicose no plasma são reduzidos
pela estimulação da sua captação pelos músculos esqueléticos periféricos e pelo tecido
adiposo, o que é provavelmente secundária à reversão de glicotoxicidade e não a um efeito
farmacológico direto (YU et al., 1999) (Figura 4).
Figura 4. Metformina: mecanismo de ação proposto
Fonte: Adaptado de Hundal e Inzucchi, 2003.
Fígado
Diminui a produção
hepática de glicose
(gliconeogênese)
Músculo esquelético
Melhora a absorção da
glicose periférica
Intestino
Diminuição do apetite
e consumo calórico;
pode diminuir a
absorção intestinal da
glicose
Pâncreas
Aumenta a secreção
de insulina
(provavelmente um
efeito secundário de
diminuição da
glicotoxicidade)
Gordura
Melhora a absorção
da glicose periférica
(provavelmente um
efeito secundário de
diminuiçao
daglicotoxicidade);
pode diminuir a
lipólise
24
Estudos mostram que a AMPK (Proteína quinase ativada por AMP) é uma enzima que
tem a capacidade de induzir uma cascata de eventos intracelulares em resposta a mudanças da
carga energética celular. É um componente-chave para a manutenção do equilíbrio entre
AMP-ATP (HARDIE, 2003; CARLING, 2004).
Trata-se de uma molécula heterotrimérica que contém uma subunidade catalítica (α),
com duas isoformas (α1 e α2), e duas subunidades regulatórias (β e γ), com as seguintes
isoformas (β1, β2, γ1 γ2 e γ3) (CARLING, 2004). Essa proteína é ativada pela fosforilação do
resíduo de treonina 172 da alça de ativação da subunidade α (WINDER et al., 2000). A
ativação é causada pelo decréscimo no conteúdo energético celular, uma vez fosforilada, a
AMPK ativa vias que geram o aumento de ATP, tais como a oxidação de ácidos graxos, ao
mesmo tempo em que inibe as vias anabólicas que consomem o ATP, tal como a síntese de
ácidos graxos (AG). Esses estímulos ativadores podem ser fisiológicos como exercício físico
e contração muscular ou patológicos como deprivação de glicose, hipóxia, estresse oxidativo,
choque osmótico, choque térmico, envenenamento metabólico, isquemia, diminuição do pH,
inibição da glicólise e desacopladores da fosforilação oxidativa (HARDIE, 2003).
A Metformina atua na ativação do AMPK in vitro e in vivo (HAWLEY et al., 2002).
Zang et al. (2004), mostraram que a Metformina estimula a atividade da AMPK no fígado e
no músculo esquelético. Também mostraram que essa enzima é ativada pela MET em cultura
de hepatócitos humanos insulino-resistentes (HepG2). Por fim, este fármaco reduz teor de
lipídios no fígado por ativar a AMPK, mediando assim os efeitos benéficos na hiperglicemia e
resistência à insulina.
Musi et al. (2002), realizaram uma pesquisa em indivíduos diabéticos tipo 2, onde foi
utilizado a Metformina durante 10 semanas. Observou-se que houve um aumento da atividade
da AMPK α2 no músculo esquelético nesses indivíduos.
2.8 EFEITOS PLEIOTRÓPICOS DA METFORMINA
O efeito pleiotrópico nos sistemas biológicos é um fenómeno muito conhecido,
comumente atribuído à complexidade das redes de sinalização intracelulares ou as respostas
25
celulares em tecido específicos. Consequentemente, uma lista crescente de agentes
farmacológicos está sendo relatada para demonstrar o potencial terapêutico em determinadas
patologias que não são comumente relevantes com a sua utilização terapêutica atual
(CORBETT; WILLIAMS; BALLARD, 2015; LEE S; LEE J; NEEMENO, 2016).
A Metformina é um agente antidiabético amplamente utilizado que melhora a
sensibilidade à insulina (GOODARZI; BRYER-ASH, 2005). A literatura tem relatado outros
benefícios desse fármaco em outros locais de ação. O estudo de Takemura et al (2007),
mostrou a ação da Metformina no tratamento da endometriose, avaliou-se a resposta
inflamatória, a produção do hormônio estradiol e a proliferação de células do estroma da
endometriose (CES), por fim o estudo teve por resultado um efeito dose-dependente deste
fármaco.
Hattori et al (2006), relataram em seu trabalho que a MET possui ação antiaterogênica.
O medicamento inibiu a expressão de genes pró-inflamatórios e a adesão molecular por
bloquear o NF-ҡB por meio da ativação do AMPK em células endoteliais vasculares.
Um trabalho in vitro realizado por Kim et al (2016), mostrou que a MET possui
propriedades positivas em relação ao câncer de mama, um dos mecanismos anticancerígenos
da Metformina pode ser atribuído à repressão da expressão e da atividade transcricional do
ERα (receptor de estrogênio alfa). A Metformina pode ser um bom agente terapêutico para o
tratamento do câncer de mama ERα-positivos, inibindo a expressão e função desse receptor.
Uma revisão sistemática com meta-análise de ensaios clínicos randomizados
demonstrou que a Metformina tem uma eficácia moderada na redução do IMC (índice de
massa corpórea) e resistência à insulina em crianças obesas hiperinsulinêmicos e adolescentes
em um curto prazo de 6 meses. No entanto, maiores estudos com um prazo maior e em
populações diferentes são necessários para estabelecer o seu papel no tratamento de crianças
com excesso de peso (PARK et al., 2009).
A MET pode ocasionar um efeito osteogênico em cultura de osteoblastos, é o que
mostra o trabalho de Cortizo (2006). Este estudo avaliou os efeitos da metformina sobre o
crescimento e diferenciação dessa cultura de células, o tratamento de duas células semelhantes
a osteoblastos (UMR106 e MC3T3E1) com Metformina (25-500μM) conduziu a um aumento
dependente da dose da proliferação de células. Aumentou acentuadamente a formação de
26
nódulos de mineralização em 3 semanas em culturas do MC3T3E1. Marycz et al (2016),
realizaram um estudo em camundongos, onde os animais saudáveis foram submetidos a um
tratamento com a Metformina, durante 8 semanas, e posteriormente eutanasiados. Removeu-
se, por via subcutânea abdominal o tecido adiposo e as tíbias de cada animal. Obteve por
resultado que as ASC (células derivadas de tecido adiposo) apresentaram uma ação
proliferativa potencial, gerando uma rede robusta de projeções do citoesqueleto, reduziram a
expressão de marcadores associados à senescência celular e diminuíram a quantidade de
espécies reativas de oxigênio em comparação ao grupo controle. Além disso, demonstrou-se
que estas células possuíam maior potencial de diferenciação osteogênica. Assim a Metformina
aumenta a densidade óssea in vivo.
A MET mostrou inibir a formação de osteoclastos em ratos submetidos a lesões
periapicais experimentais. Os animais receberam o tratamento farmacológico via
intramuscular durante 2 a 4 semanas, após esse período foram eutanasiados e tiveram a
mandíbula removida. A Metformina inibiu as lesões periapicais, possivelmente, diminuindo a
proporção RANKL / OPG, e reduzindo posteriormente o número de osteoclastos e as áreas de
reabsorção óssea (LIU et al., 2012).
Bak et al (2010), realizaram um estudo em ratos, onde os animais foram submetidos
ao desenvolvimento de uma periodontite ocasionada por ligadura na região de primeiro molar
inferior, cada animal recebeu o tratamento farmacológico durante 10 dias e logo após tiveram
suas mandíbulas extraídas e analisadas. A análise foi realizada por Micro CT
(microtomografia computadorizada), mostrando que houve uma redução significativa na
perda óssea alveolar quando comparado ao grupo controle.
27
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a ação do Cloridrato de Metformina em ratos submetidos à Doença Periodontal
induzida por ligadura.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a ação do Cloridrato de Metformina sobre a perda óssea induzida pela
doença periodontal por meio da análise macroscópica e microscópica do periodonto.
Identificar possíveis mecanismos de ação para o Cloridrato de Metformina na doença
periodontal experimental por meio do estudo do seu efeito na expressão de citocinas
inflamatórias (dosagens de IL-1β e TNF-α) e sobre o estresse oxidativo (dosagem de
GSH e MDA).
Realizar a imunohistoquímica por meio de marcadores da inflamação (COX-2),
envolvidos na perda óssea (RANK, RANK-L, OPG, Catepsina K e MMP-9) e na
atividade antioxidante (SOD-1e GPx).
Analisar os efeitos da MET na DP por diferentes vias de sinalização (APMK, NF-кB
p65 e HMGB1).
28
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
Trata-se de um ensaio pré-clínico, in vivo, randomizado, cego e controlado por
placebo.
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A utilização e manipulação dos animais seguiu o protocolo aprovado pela Comissão de
Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da UFRN (CEUA), segundo o processo de número
066/2014 (em anexo).
4.3 LOCAL DO EXPERIMENTO
Os procedimentos experimentais e laboratoriais, incluindo o preparo e a manipulação dos
animais, a coleta de materiais orgânicos e os diferentes tipos de análises foram realizados pelo
laboratório de Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN, com o auxílio dos
Departamentos de Bioquímica, Morfologia, Microbiologia e Parasitologia do mesmo centro.
4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS E GRUPOS
O experimento utilizou 120 ratos Wistar com pesos entre 180 e 220g (aproximadamente
60 dias), provenientes do Biotério do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN). Os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas onde todos
receberam água e ração para animais de laboratório (Purina - Nuvilab CR-1autoclavável;
29
Nuvital, SP, Brasil) ad libitum. Permaneceram ainda sob as mesmas condições ambientais,
sala climatizada (22C° ±2°C), e com ciclo claro-escuro de 12-12 horas durante os
experimentos. Os mesmos foram divididos em 5 grupos com 24 animais cada, assim
distribuídos:
Grupo Não Ligado (NL) – Grupo cujos animais não foram submetidos à indução
da doença periodontal (DP). Os animais não receberam nenhum tratamento
farmacológico, sendo tratados apenas com gavagem de solução salina durante 10
dias (solução fisiológica 0,9%).
Grupo Ligado (L) – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por
ligadura. Os animais deste grupo não receberam nenhum tratamento
farmacológico, sendo tratados apenas com gavagem de solução salina durante 10
dias (solução fisiológica 0,9%).
Grupo MET 50 – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por
ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina
durante 10 dias (50 mg/kg/dia, via oral por gavagem).
Grupo MET 100 – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por
ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina
durante 10 dias (100 mg/kg/dia, via oral por gavagem).
Grupo MET 200 – Grupo, cujos animais foram submetidos à indução da DP por
ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina
durante 10 dias (200 mg/kg/dia, via oral por gavagem).
30
4.5 DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO
4.5.1 Modelo Experimental da Doença Periodontal
Os animais foram anestesiados por meio de injeção intraperitoneal (i.p) com
Cloridrato de Ketamina 10% (70 mg/kg Vetnil, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Xilazina
2% (10 mg/kg, Calmium, São Paulo, Brasil). A DP foi induzida pela inserção cirúrgica de um
fio de sutura de nylon 3-0 estéril (Polysuture, NP45330, São Paulo, Brasil) na região cervical
do segundo molar superior esquerdo. Este fio foi adaptado de modo que o nó cirúrgico ficasse
voltado para a face vestibular da cavidade oral do animal (Figura 5). Utilizou-se o modelo de
Doença Periodontal desenvolvido por vários autores (CRAWFORD; TAUBMAN; SMITH,
1978; SAMEJIMA; EBISU; KOIDE et al., 1995) e modificado pelo Laboratório de
Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, Faculdade de Medicina do Ceará (LIMA et al., 2000; MENEZES, 2003;
LEITÃO et al., 2004).
Figura 5. Sequência de colocação da ligadura (fio de nylon).
Fonte: Autor, 2016.
Legenda: Anestesia inicial i.p com Cloridrato de Ketamina 10% e Cloridrato de Xilazina 2%. Utilizou-
se o fio de sutura de nylon 3-0, na região cervical do segundo molar superior esquerdo. O nó foi
mantido na face vestibular e o fio inserido subgengivalmente.
31
4.5.2 Tratamento Medicamentoso
Um comprimido de Cloridrato de Metformina (Medley, Campinas, São Paulo, Brasil) 850
mg foi triturado diariamente com o grau e pistilo, em seguida adicionou-se água destilada na
proporção adequada para formação da solução. Cada animal recebeu a droga na concentração
indicada e individualizada, baseada em estudos in vivo, que examinaram a ação da droga em
ratos (REAGAN-SHAW; NIHAL; AHMAD, 2008). A administração da MET nas
concentrações de 50 mg/kg, 100 mg/kg ou 200 mg/kg foi realizada por via oral através de
gavagens diárias durante 10 dias. O procedimento da gavagem trata-se da inserção de uma
sonda de polipropileno para aspiração traqueal com o comprimento de 50 cm e calibre 08 F. A
sonda foi inserida por via oral até a porção gástrica do animal, a solução foi então
impulsionada através do auxílio de uma seringa descartável, o animal é imobilizado pelas
mãos do operador (Figura 6). No dia da indução da doença periodontal a gavagem foi
realizada 2 horas após o procedimento cirúrgico.
Figura 6. Gavagem com sonda de polipropileno
Fonte: Autor, 2016.
32
4.5.3 Eutanásia dos animais
Onze dias após o tratamento inicial, os animais foram eutanasiados por injeção i.p de
Tiopental 80mg /kg (0.5 g Cristália, São Paulo, Brasil), seguido do deslocamento cervical
procedendo-se à obtenção de amostras para as diferentes formas de análise.
4.5.4 Obtenção e preparo inicial do material para análise
Após a eutanásia dos animais as maxilas foram removidas e separadas em duas hemi-
maxilas, para cada grupo de 24 animais. As maxilas esquerdas de 5 animais foram destinadas
para processamento histopatológico e dessas mesmas maxilas, 3 foram utilizadas para o
processamento imunohistoquímico, essas amostras foram fixadas em formol tamponado a
10% por no mínimo 24 horas e, em seguida, submetidas ao tratamento para desmineralização
e inclusão em parafina. Os 19 animais restantes tiveram as duas hemi-maxilas extraídas e
fixadas em formol tamponado a 10% para avaliação do índice de perda óssea (IPO), sendo o
lado esquerdo o qual foi induzida a doença periodontal utilizado como teste e o lado direito
como controle para análise. As amostras dos tecidos gengivais (dos mesmos 19 animais, uma
amostra por animal) foram cuidadosamente removidas do tecido ósseo da região entre os
primeiros e segundos molares esquerdos na face vestibular e congeladas a - 80ºC e destinadas
para análise de citocinas (4 amostras), níveis de MDA (4 amostras) e níveis de GSH (4
amostras), exceto as amostras para a quantificação de RNAm (4 amostras) que previamente
foram armazenadas em reagente Trizol (Life Technologies, California, USA). A figura 7
representa um resumo das análises realizadas, para os diferentes grupos experimentais:
33
Figura 7. Divisão das amostras por grupos de 24 animais.
Fonte: Autor, 2016
4.6 TIPOS DE ANÁLISES
4.6.1 Análise morfométrica e macroscópica da perda óssea alveolar
Após a eutanásia, as hemimaxilas foram excisadas e fixadas em formol tamponado a
10% (19 amostras por grupo), durante 24 horas. Em seguida, todo tecido mole aderido ao
tecido duro foi cuidadosamente removido, sendo este último então imerso em azul de
metileno a 1%, por 5 minutos, para que se pudesse diferenciar a estrutura óssea do dente e,
macroscopicamente, investigar a presença ou não de reabsorção óssea com exposição
radicular. Para a quantificação da reabsorção óssea, as duas hemiarcadas foram acomodadas
com massa de modelar em lâminas. Em seguida, imagens foram capturadas através de um
aparelho de fotografia digital padronizada (Olympus SC30) com aumento de 4 vezes e
posteriormente salvas no formato JPG. As amostras foram colocadas com a face oclusal dos
dentes posicionada perpendicularmente ao aparelho digital. A perda óssea alveolar foi obtida
com o auxílio de um Software de imagem (Adobe Photoshop CS3), onde foi realizada a
medição da área compreendida entre a junção amelo-cementária (JAC) e as cristas ósseas
alveolares. As medidas foram calculadas inicialmente em pixels e posteriormente foram
24 Animais/grupo
19 Morfometria
4 MDA
4 GSH
4 Citocinas
4 RT PCR
5 histopatológico
3 Imunohistoquímica
34
convertidas em mm pelo uso de um padrão de milímetros fixado ao lado das maxilas. Três
medidas foram feitas ao logo da superfície radicular de cada um dos primeiros molares (3
raízes cada) e 2 medidas nos segundos e terceiros molares (duas raízes cada). A perda total do
osso alveolar foi obtida tomando a soma das medições dessas superfícies radiculares (IPO) em
região de maxila esquerda, subtraindo-se os valores do maxilar direito (controle sem
ligadura), em milímetros (CARVALHO et al., 2013) (Figura 8).
Figura 8. Obtenção do Índice de Perda Óssea (IPO)
Legenda: A: Visualização de tecido dentário e ósseo em magnificação de 4X com o padrão em milímetros. B:
Medida, em sete pontos distintos, entre o nível de reabsorção óssea alveolar e a junção amelo-cementária
4.6.2 Análise Histopatológica
Após a eutanásia dos animais suas hemiarcadas (5 amostras por grupo) foram
removidas. Estas foram fixadas em formol tamponado a 10% durante 24 horas, sendo
posteriormente submetidas a tratamento com ácido nítrico a 5%, por aproximadamente 14
A
B
35
dias (trocas diárias do ácido), para a desmineralização. Subsequentemente, foi realizado
processamento histológico detalhado a seguir:
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
Álcool etílico 95°GL (2 minutos);
Álcool etílico I (PA) (5 minutos);
Passagem em xilol, 3 banhos de 1 hora cada;
Inclusão em parafina;
Cortes seriados de 4µm em micrótomo;
Montagem sobre lâminas de vidro;
Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos
cada);
Hidratação em cadeia descendente de etanóis:
Álcool etílico absoluto I (PA) (5 minutos);
Álcool etílico absoluto II (PA) (5 minutos);
Álcool etílico absoluto III (PA) (5 minutos);
Álcool etílico 95°GL (5 minutos);
Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
Lavagem em água destilada;
Coloração pelos métodos HE ou Tricrômio de Mallory;
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
Álcool etílico 95°GL (2 minutos)
Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
Passagens rápidas em xilol (3 trocas);
Montagem das lâminas em resina Permount®
Para análise microscópica das hemiarcadas com a coloração HE, foi considerada a
região entre os primeiros e segundos molares, sendo avaliados os aspectos avaliados: influxo
de células inflamatórias, integridade do osso alveolar e cemento. Foram atribuídos escores
analisados e classificados por um patologista de forma unicego (LEITÃO et al., 2005), de
acordo com o quadro a seguir:
36
Quadro 1 - Escores para análise histológica dos tecidos periodontais de suporte
Fonte: Quadro elaborado através de consulta ao artigo de LEITÃO et al (2005).
4.6.3 Análise Imunohistoquímica da expressão de RANK-L, RANK, OPG, Catepsina K,
COX-2, MMP-9, SOD-1 e GPx nos tecidos periodontais de suporte
Secções de tecido periodontal com 4 μm de espessura (3 amostras por grupo) foram
obtidas utilizando-se um micrótomo e transferidas para lâminas especiais cobertas por
gelatina. Cada amostra foi em seguida desparafinizada e reidratada.
Os cortes de tecido periodontal foram lavados e incubados com os seguintes
anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology, Interprise, Brasil): COX-2, 1: 400; MMP-9,
1: 400;RANK, 1:400, RANKL, 1: 400; OPG, 1: 400; Catepsina K: 1: 400; SOD-1, 1:400 e
GPx, 1:400. Os cortes foram lavados e incubados com os anticorpos secundários estrepto-
avidina conjugada com HRP (Biocare médicos, Concord, CA, EUA) durante 30 minutos. A
imuno-reatividade para MMP-2, RANK, RANK-L, OPG, COX-2, Catepsina K, SOD-1 e GPx
foi visualizada usando um kit para detecção colorimétrica seguindo as instruções do
fabricante (TrekAvidin-HRP rótulo + kit, Biocare médicos, Dako, EUA).
Escores Aspectos histológicos
0
Infiltrado celular ausente ou discreto,
restrito a gengiva marginal;
Processo alveolar preservado;
Cemento preservado
1
Infiltrado celular moderado, presente
na gengiva inserida;
Pequena reabsorção do processo
aveolar;
Cemento preservado
2
Infiltrado celular acentuado, presente
na gengiva e ligamento periodontal;
Processo alveolar com reabsorção
acentuada;
Destruição parcial do cemento
3 Infiltrado inflamatório acentuado;
Completa reabsorção alveolar;
Destruição acentuada do cemento
37
Segue o detalhamento das etapas para imunohistoquímica:
Amostras submetidas a cortes com 3 µm de espessura;
Transferência para lâminas silanizadas;
Desparafinização: 2 banhos em xilol à temperatura ambiente (10 minutos
cada);
Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
Álcool etílico absoluto II (5 minutos);
Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
Álcool etílico 95°GL (5 minutos);
Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Recuperação antigênica (Proteinase K);
Lavagem com PBS;
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% (10
volumes), em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena
tecidual (10 minutos cada);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Aplicação da proteína block por 10 minutos (BSA 0,05% em PBS);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Dupla lavagem com PBS;
Aplicação do anticorpo primário específico e incubação (overnight);
Remoção do excesso do anticorpo primário com a pipeta com PBS;
Aplicação do anticorpo secundário kit DAKO LAB (LSAB+System-HRP);
Dupla lavagem com PBS;
Strepto-avidina HRP (30 minutos);
Dupla lavagem com PBS;
Incubação com DAB (10 minutos);
Lavagem com água destilada;
38
Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5
minutos);
Lavagem com água corrente;
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
Álcool etílico 95°GL (2 minutos);
Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
Álcool etílico absoluto II (5 minutos);
Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
Passagens rápidas em xilol (3 trocas);
Montagem das lâminas em resina Permount®
4.6.4 ELISA para dosagem dos níveis de IL-1β e TNF-α nos tecidos gengivais
Amostras gengivais (4 amostras para cada grupo) foram obtidas da região vestibular
dos molares superiores esquerdos e armazenadas a -80°C para posterior análise. Em seguida
foram homogeneizadas e processadas. Os níveis de IL-1β (intervalo de detecção: 62.5–4000
pg/mL; limite mínimo de detecção: 12.5 ng/mL recombinante para ratos IL-1β) e TNF-α
(intervalo de detecção: 62.5–4000 pg/mL; limite mínimo: 50 ng/mL recombinante para ratos
TNF-α) foram determinados utilizando kits comerciais de ELISA (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA), método descrito por Kendall et al., 1983. Todas as amostras
tiveram medidas a 490 nm.
Placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 4°C com anticorpos de
ratos contra IL-1β e TNF-α. Em seguida as placas foram bloqueadas, as amostras e os padrões
foram adicionados em várias diluições em duplicata e incubadas a 4ºC por 24 horas. As placas
foram lavadas três vezes com tampão e os anticorpos foram adicionados aos poços
(biotinilado policlonal de ovelha anti-TNF-α, anti-IL-1β, diluídos a 1: 1000 com tampão de
ensaio de BSA a 1%). Em seguida incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora e
lavadas. Logo após, 50 mL de avidin-HRP (1:5000) foi adicionado. O reagente colorimétrico
o-fenilenodiamina (50 mL) foi acrescentado 15 minutos depois e as placas foram incubadas
39
no escuro a 37°C durante 15-20 minutos. A reação enzimática foi parada com H2SO4 e as
medidas foram realizadas com absorbância de 490nm. Os valores foram expressos em pg/mL.
4.6.5 Dosagem de Malonaldeído (MDA)
Malonaldeído (MDA) é um produto final da peroxidação lipídica, para quantificar o
aumento de radicais livres nas amostras gengivais. O conteúdo de MDA foi medido através do
ensaio descrito por Esterbauer e Cheeseman, 1990. As amostras (4 para cada grupo) foram
suspensas em tampão Trisma 1: 5 (w / v) e cortadas com tesoura durante 15 seg sobre uma
placa arrefecida com gelo. A suspensão resultante foi homogeneizada durante 2 minutos
através de um homogeneizador e foi centrifugada a 2500 x g a 4°C durante 10 min. Os
sobrenadantes foram testados para determinar o teor de MDA e colocadas em microplacas. A
absorbância de cada amostra foi medida a 586nm. Os resultados são expressos como
nanomoles de MDA por grama de tecido.
4.6.6 Dosagem de Glutationa (GSH)
Os níveis de GSH nos tecidos gengivais foram medidos para avaliar a atividade
antioxidante. Às amostras gengivais do tecido preparado foram adicionadas 0,02 M de EDTA,
4 por grupo, e armazenadas a – 80ºC até a sua utilização, método descrito por Costa et. al,
2006. Os tecidos gengivais foram homogeneizados (0,25 mL de 5% solução), adicionadas 320
ml de água destilada e 80 ml de TCA a 50%. As amostras foram centrifugados a 3000 rpm
durante 15 minutos em uma temperatura de 4ºC. Removeu-se o sobrenadante (400 µL) e
adicionou-se 800µL de 0,4 M de tampão Tris pH 8,9 e 20 µL de 0,01 M (5,59 ditiobis-ácido
2-nitrobenzóico) DTNB. A absorbância foi medida a 420 nm, e os resultados foram relatados
como unidades de GSH por miligrama de tecido.
40
4.6.7 Expressão gênica por RT PCR (PCR em tempo real)
A análise do RT-PCR quantitativo (reação de transcrição reversa seguida da reação da
polimerase em cadeia) foi realizada utilizando-se o Primer SYBR Green Master Mix. O RNA
total dos tecidos gengivais foi extraído utilizando-se o reagente Trizol (Life Technologies,
Califórnia, EUA) como descrito anteriormente por Chomczynski e Sacchi (2006). O
isolamento do RNA e o processo de purificação foram feitos com o uso do SV total RNA
Isolation System (Promega Corporation, EUA). A concentração de RNA foi determinada a
partir da densidade óptica a um comprimento de onda de 260 nm (utilizando OD260, unidade
equivalente a 40 µg / ml de RNA). Cinco microgramas do RNA isolado totalmente foram
convertidos para cDNA numa mistura reacional contendo 4µl x 5 tampão de reação, 2µl de
dNTP,(10mM), 20 unidades de inibidor de RNase, 200 unidades de vírus aviário-
mieloblastose (AMV) de transcriptase reversa e 0,5 µg de Primer oligo (dt) (High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit, Foster City, USA), em um volume total de 20µl. A mistura
foi incubada a 42°C durante 60 min, e a reação foi finalizada por um aquecimento a 70°C
durante 10 min. A expressão gênica foi avaliada por amplificação por PCR utilizando pares de
primers e sua sequência gênica (Quadro 2): GADPH- Rattus norvegicus, HMGB1, NF- кB e
AMPK (Biosystems, USA). Colocados em placas e em seguida inseridas em um
termociclador Step One Plus Plus (Applied Biosystems, EUA), de acordo com as instruções
do fabricante. Para cada 1 × PCR Master Mix, 2,5 ul de cDNA foi adicionado num volume
final de 20 ul. As condições de PCR foram realizadas como se segue: 95°C durante 5 min e
40 ciclos de 30s a 95°C, 30s a 52-60°C (com base no alvo), e 60s a 72ºC. A variação da curva
relativa quantitativa em comparação com o grupo controle (grupo sem ligadura + solução
salina) foi calculada usando o método comparativo Ct, onde Ct é o número do ciclo em que a
primeira fluorescência excede o limiar. Os valores do Ct de cada amostra foram obtidos
subtraindo-se os valores de Ct para o GADPH, do valor Ct do gene alvo. A especificidade dos
produtos resultantes do PCR foi confirmada por meio de curvas de Melting.
41
Quadro 2 - Sequência de expressão gênica
ANÁLISE PRIMER INICIADOR PRIMER REVERSO
GADPH AACTTGGCATCGTGGAAGG GTGGATGCAGGGATGATGTTC
Hmgb1 GAGTACCGCCCAAAAATCAA TCATCCTCCTCGTCGTCTT
NF- Kβ TCTGCTTCCAGGTGACAGTG ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT
AMPK AGCTCGCAGTGGCTTATCAT GGGGCTGTCTGCTATGAGAG Fonte: Autor, 2016
42
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram digitados em planilhas eletrônicas, utilizando-se o
Programa Excel (Microsoft Office 2010®), em seguida exportados para o programa
GraphPad Prism 5.0 (versão 5.0, La Jolla, CA, USA) e submetidos à estatística descritiva e
inferencial com intuito de testar as hipóteses levantadas na presente pesquisa. Os dados foram
apresentados por meio de médias ±desvio padrão, ou, quando mais apropriado, como
medianas. Testes de análise de variância (ANOVA) e de Bonferroni foram usados para
cálculo das médias (dados paramétricos) e testes Kruskall-Wallis e Dunn´s foram utilizados
para comparar medianas (dados não paramétricos). O valor de p ˂ 0.05 foi escolhido para
indicar a significância.
43
6 RESULTADOS
6.1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR
Animais com doença periodontal induzida por ligadura (L), MET 100 mg / kg e MET
200 mg / kg apresentaram perda óssea alveolar significativa em comparação com o NL (NL =
0.25 ± 0.1 mm; L = 5.0 ± 1.4 mm; MET 100mg/kg= 4.8 ± 1.9; MET 200mg/kg= 5.0 ± 1.8, p
< 0.001). Observou-se que o tratamento com a MET de 50 mg / kg diminuiu o processo de
perda óssea alveolar causada pela DP (MET 50 mg/kg 3.9 ± 1.3; p < 0.05) .Gráfico 1.
Gráfico 1. Efeito da administração oral da Metformina sobre o índice de perda óssea em ratos
submetidos a ligadura .
Legenda: Índice de perda óssea em mm para os grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50
(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met
200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). Os valores são expressos como médias ± DP
(comparação com L *** p <0,001, * p <0,05).
Estes dados também podem ser visualizados na figura 9A, que mostra o aspecto
macroscópico do grupo NL, sem reabsorção do osso alveolar. A figura 9B mostra a aparência
macroscópica do periodonto submetido a doença periodontal, já a figura 9C apresenta o grupo
tratado com MET 50 mg / kg, em que a diminuição da perda óssea foi observada.
44
Figura 9. Aspectos macroscópicos da perda óssea alveolar
Legenda: A) Grupo NL (não ligado) demostrando ausência de reabsorção óssea alveolar. B) Grupo L (ligado)
apresenta severa reabsorção óssea com exposição radicular (setas). C) Grupo tratado com MET 50 mg/kg
demonstra diminuição na perda óssea alveolar (setas). Imagens foram obtidas com magnificação original de 4X.
6.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
A análise histológica da região entre os primeiros e segundos molares do grupo NL
mostra que a estrutura do periodonto está preservada e que a gengiva, o ligamento
periodontal, osso alveolar e cemento podem ser observados (Figura 10 A, D, G). Já o
histopatológico dos animais do grupo L, que não receberam nenhum tratamento, revelou a
infiltração de células inflamatórias juntamente com grave destruição do cemento e processo
alveolar, recebendo assim um escore 3 (Figura 10 B, E, H).
A B C
45
Figura 10. Análise histopatológicas dos grupos estudados
Legenda: A, D e G: Periodonto Normal. B, E, H: Periodonto de um rato com periodontite (tratados com solução
salina) mostrando osso alveolar e reabsorção do cemento (cemento descontínuo) e infiltração de células
inflamatórias. C: Periodonto de um rato com periodontite (tratado com MET, 50 mg / kg) apresentando
inflamação reduzida e diminuição da perda de osso alveolar F: tratado com MET (100 mg / kg) e I: O tratamento
com MET (200 mg / kg), não apresentando redução de inflamação e aumento da perda de osso alveolar. Os
cortes foram corados com H e E. PL, ligamento periodontal; D, dentina; AB, osso alveolar; c, cemento; a, perda
de massa óssea; b, reabsorção de cemento; c, processo inflamatório; e, diminuição do processo inflamatório.
A perda óssea alveolar foi reduzida nos animais tratados com MET 50 mg / kg em
comparação com o grupo L que não recebeu nenhum tratamento, recebendo um escore médio
NL L
MET 50
MET 100
MET 200
46
Esco
res
his
top
ato
lógi
cos
de 1 (1-1.5; p <0,001) e 3 (3- 3), respectivamente (Gráfico 2). Histopatologicamente pode-se
observar: discreto infiltrado celular restrito à região da gengiva marginal, preservação do osso
alveolar, e cemento intacto no grupo tratado com MET 50 mg / kg (Figura 10C). Os grupos
tratados com MET 100 e 200 mg / kg revelaram uma infiltração de células inflamatórias com
destruição grave do cemento e processo alveolar, os animais deste grupo receberam um escore
de 3 (2-3) e 3 (3-3), respectivamente, (Figura 10 F,I).
Gráfico 2. Escores histopatológicos de acordo com o grupo de estudo.
Legenda: Escores histopatológicos para os grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50 (Ligado
e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met 200
(Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg)
47
6.3 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA OS MARCADORES DE INFLAMAÇÃO E
PERDA ÓSSEA
Os tecidos periodontais do grupo submetido à doença periodontal e sem tratamento
(L) apresentaram imunocoloração acentuada quando comparado ao grupo NL, para os
seguintes anticorpos: RANK, RANK-L, Catepsina K, MMP-9, a COX-2, SOD-1 e GPx
(grupo NL- Figura 11/12 A, D, G, J; grupo L- Figuras 11/12 B, E, H, K; grupo MET 50-
Figuras 11/12 C, F, I, L). Enquanto que se observou uma leve coloração para a OPG (Figura
11H). Já o grupo tratado com MET (50 mg / kg) reduziu a imunocoloração para o RANK,
RANKL, Catepsina K, COX-2, MMP-9 e da SOD-1 nos tecidos periodontais de ratos
submetidos a DP (Figura 11 C, F, L, e Figura 12 C, F, I). Foi observada uma imunomarcação
intensa para OPG e GPx-1, no grupo tratado com MET 50 mg / kg (Figura 11 I; 12 L,
respectivamente).
48
Figura 11. Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando imunomarcações para
RANK, RANK-L, OPG e Catepsina K
Legenda: Ratos do grupo NL (A, D, G, J); Ratos submetidos à ligadura (B, E, H, K); Ratos submetidos a
ligadura e tratados com MET (50 mg / kg) (C, F, I, L). As imagens são mostradas na ampliação de 40X. Barra =
100 um. A seta indica elevada ou moderada imunomarcação no ligamento periodontal ou no osso alveolar.
Asterisco indica coloração leve no ligamento periodontal ou o osso alveolar. Triângulo e asterisco indicam
coloração leve de OPG nos osteoclastos. Triângulo e seta indicam alta imunomarcação dos osteoclastos.
Triângulo indica intensa marcação da Catepsina K no osso alveolar. Asterisco e triângulo indicam leve marcação
de Catepsina K no osso alveolar.
NL L MET50
49
Figura 12. Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando imunomarcações para MMP-
9 COX-2, SOD-1 e GPx.
Legenda: Ratos submetidos a solução salina (A, D, G, J); ratos do grupo ligadado (B, E, H, K); ratos submetidos
a ligadura e tratados com MET (50 mg / kg) (C, F, I, L). As imagens são mostradas na ampliação de 40X. Barra
= 100 um. A seta indica coloração alta ou moderada no ligamento periodontal ou o osso alveolar. Asterisco
indica imunomarcação leve no ligamento periodontal ou o osso alveolar.
NL L MET50
50
MD
A (
nm
mo
l/g
de
te
cid
o)
GSH
(m
g d
e N
PH
S/g
de
teci
do
)
6.4 EFEITO DO TRATAMENTO COM MET PARA OS MARCADORES DE ESTRESSE
OXIDATIVO
O tratamento da DP experimental com todas as doses de MET reduziu a atividade de
MDA (p <0,05) (Gráfico 3 A). Foi demonstrado efeito dose-dependente para esse produto da
peroxidação lipídica. O tratamento da DP com MET não reduziu os níveis de GSH (p> 0,05)
em comparação com o grupo L (Gráfico 3 B).
Gráfico 3 . Efeito da Metformina sobre os níveis de MDA e GSH nos grupos estudados.
Legenda: A: Níveid de MDA; B: níveis de GSH. Grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50
(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met
200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). (*p <0.05, ***p < 0.01)
6.5 DOSAGEM DE IL-1β E TNF-α
Os níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β diminuíram no grupo tratado com 50 mg /
kg MET (P <0,05) quando comparado ao grupo L. Entre os grupos tratados com as diferentes
concentrações da Metformina, o grupo MET 50 mg/kg também apresentou os menores níveis
de TNF- α (p <0,05). Gráfico 4.
A B
51
Gráfico 4. Efeito da Metformina sobre os níveis de IL-1β e TNF-α nos grupos estudados.
Legenda: A: Níveis de IL-1β; B: níveis de TNF-α. Grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50
(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met
200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). (*p<0,05).
IL-
1β
(p
g/m
l)
TN
F-
α (
pg
/ml)
A
B
52
6.6 EXPRESSÃO GÊNICA RT-PCR
A dose de MET 50 mg/ kg aumentou a expressão do AMPK em comparação com o
grupo L e NL (p <0,05), mas as doses de MET 100 e 200 mg / kg não obtiveram nenhum
aumento significativo para este gene (Gráfico 5 A). Os grupo tratados com todas as doses de
MET reduziu a expressão de NF-Kβ p65 (p <0,01) (Gráfico 5B) e o grupo com a maior dose
(MET 200 mg/kg) também reduziu a expressão do HMGB1 (p <0,05) em comparação com o
grupo L (Gráfico 5C).
Gráfico 5. Efeitos da Metformina na expressão gênica do AMPK, NF-KB p65 e HMGB1 em ratos
com Doença periodontal.
Ex
pre
ss
ão
re
lati
va
RN
Am
AM
PK
A
53
Legenda: A expressão do RNAm do AMPK foi aumentada em MET 50 mg / kg (* p <0,01 gráfico
5A) e diminuiu em L e no grupo NL. A expressão do RNAm do NF-KB p65 foi diminuída em todos
os grupos tratados com MET e o grupo NL em comparação ao grupo L (* p <0,05 gráfico 5C). Os
níveis de RNAm do HMGB1 diminuiu em todos os grupos, inclusive o grupo NL em comparação com
o grupo L.
Ex
pre
ss
ão
rela
tiva
RN
Am
NF
-KB
p65
E
xp
res
são
rela
tiva
RN
Am
HM
GB
1
B
C
54
7 DISCUSSÃO
A periodontite é uma doença inflamatória caracterizada pela perda de suporte dos
tecidos periodontais e consequente perda dentária (BALTACIOGLU et al., 2014). A literatura
indica que essa doença é causada pela infecção polimicrobiana presente nos tecidos
periodontais, porém há evidências de que a extensão da inflamação pode também resultar da
interação entre as espécies seletivas da microflora oral e da resposta imunitária do hospedeiro
(CHEN et al., 2016).
A raspagem e o alisamento radicular é a técnica mecânica mais comumente
empregada para o tratamento da periodontite, no entanto, mesmo após o tratamento clínico
bem-sucedido, ainda há uma grande chance de reinfecção, causada por biofilmes residuais
(CARVALHO et al., 2011). Nesses casos, por meio do conhecimento da patogênese da DP
pode-se lançar mão de terapias sistêmicas (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010). Essas
terapias associadas à RAR podem apresentar algumas reações indesejadas como sensação de
queimadura, sabor amargo, eventual coloração dos dentes e resistência bacteriana (KRAYER
et al, 2010; LOPES; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000). Buscando-se eliminar os efeitos
adversos produzidos por fármacos convencionalmente empregados no tratamento da
periodontite, uma nova série de agentes terapêuticos tem sido estudada como auxiliares no
controle dessa doença (BAK et al., 2010).
Neste trabalho, avaliou-se o efeito do Cloridrato de Metformina no estresse oxidativo,
perda óssea alveolar, na atividade anti-inflamatória em um modelo de doença periodontal
experimental em ratos Wistar. Bak et al. (2010), em seu estudo em ratos com periodontite,
demonstrou que a Metformina pode reduzir o nível do infiltrado inflamatório celular através
da análise histopatológica, além da perda óssea alveolar verificada pela técnica do micro-CT.
Esse achado pode corroborar com os resultados encontrados neste trabalho, em que a
Metformina na dose de 50mg/kg diminuiu a progressão da DP, bem como regulou o infiltrado
inflamatório celular, preservando as estruturas do cemento e osso alveolar.
Evidências sugerem que a liberação de ROS está diretamente relacionada à progressão
da DP (BROCK et al., 2004; GHALLAB; HAMDY; SHAKER, 2015). Os leucócitos PMN
induzidos por agentes patogênicos são responsáveis pelo aumento da produção desses radicais
livres (anion superóxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila, etc) (BROCK et al.,
2004).
55
A atividade do H2O2 sobre o NF-ᴋB é responsável pela transcrição de várias
citocinas pró-inflamatórias importantes para a patogênese da doença periodontal, incluindo a
IL-2, IL-6, IL-8, interferon-β e o TNF-α. A ativação de NF-ᴋB pode também ser realizada por
endotoxinas bacterianas, IL-1 e pelo TNF- α (CHAPPLE, 1996).
Os lípideos encontram-se entre os substratos mais facilmente oxidáveis e o aumento
da peroxidação lipídica pode ser uma consequência dos danos ocasionados pelas ROS. As
ROS possuem um tempo de vida muito curto e não são facilmente detectadas na destruição
dos tecidos, assim produtos oriundos da peroxidação lipídica, tais como o malonaldeído são
investigados (DEL RIO; STEWAR; PELLEGRINI, 2005). Os níveis de MDA são mais
elevados em pacientes com periodontite crônica ou periodontite agressiva quando comparado
a um grupo saudável (GHALLAB; HAMDY; SHAKER, 2015). O presente estudo mostrou
que o grupo L apresentou altos níveis de liberação do MDA, enquanto que os três grupos
tratados com a Metformina reduziram a liberação desse produto, mostrando efeito regulador
da Metformina para este importante marcador de estresse oxidativo. O estudo de Araújo et al.
(2013), relatou que os níveis do MDA em animais tratados com a Atorvastatina diminuíram o
MDA, apresentando efeito dose-dependente.
A SOD catalisa a reação de dismutação do radical superóxido a peróxido de
hidrogênio. Uma vez que a SOD acelera a criação de H2O2, deve atuar em conjunto com a
GPx, que remove esse radical (NOVAKOVIC, 2013). Lipopolissacarídeos bacterianos
também estimulam a liberação de O2 (radical superóxido) a partir de fibroblastos teciduais
durante a inflamação (ZUABI et al., 1999). O estudo de Novakovic et al. (2013), revelou que
pacientes com periodontite crônica após o tratamento com a RAR (raspagem e alisamento
radicular) apresentaram redução da atividade da SOD na saliva (p>0.05). Akalin et al. (2005),
observaram que a atividade da SOD foi significativamente maior no grupo com a periodontite
crônica do que nos controles (p<0.05). Neste estudo o grupo tratado com MET 50 mg / kg
mostrou baixa imunomarcação para a SOD, ou seja, a propria metformina pode contribuir
com a redução dos radicais livres, o que explica os baixos níveis de SOD. O aumento da
formação de radicais superóxidos, na presença da doença periodontal sem tratamento, pode
levar a uma alta atividade da SOD a fim de estabelecer um equilíbrio entre o estress oxidativo
e a proteção antioxidante.
Novakovic et al. (2013), revelaram que a GPx, na saliva de pacientes com periodontite
crônica e tratados com a RAR, apresentou uma alta atividade. Patel, Rao e Pradeep (2012),
56
verificaram que os níveis de GPx no soro e no GCF (fluido crevicular gengival) foram
maiores nos pacientes com periodontite em comparação com os controles saudáveis. Os
autores destes estudos explicam este fenômeno como um mecanismo compensatório
antioxidante que ocorre em resposta ao aumento de peróxido orgânico sob a ação de radicais
livres no tecido periodontal doente. O grupo tratado com a MET 50mg/kg, neste estudo,
obteve uma imunomarcação mais intensa no que se refere atividade da GPx juntamente com o
grupo grupo L, ou seja, maior atividade de GPx quando comparado ao NL, mostrando que
essa enzima antioxidante deverá manter-se elevada na DP tratada, visto que a doença nesse
período de tratamento (10 dias) está sendo controlada e não aniquilada.
A GSH é um potente antioxidante que evita danos mediados pelas ROS nos
componentes celulares e atua como um cofacor enzimático da GPx na destruição das ROS.
Pacientes com periodontite relataram ter reduzida capacidade antioxidante total na saliva e
menores concentrações de glutationa reduzida (GSH) no soro e no GCF, quando comparados
a indivíduos saudáveis. As altas concentrações de GSH presente no GCF em condições
saudáveis são semelhantes aos encontrados extracelularmente no pulmão e podem representar
uma estratégia anti-inflamatória e de defesa antioxidante importante comum às superfícies
epiteliais expostas (CHAPPLE et al., 2002). Em nosso estudo, o tratamento da DP com
diferentes doses da MET não aumentou significantemente os níveis de GSH (p>0.05) em
comparação ao grupo L (doente e sem tratamento farmacológico), esse achado está em
consonância com o trabalho de Araújo et al., 2014, onde o tratamento da DP com a
Alzizartana não reduziu os níveis de GSH (p> 0,05) em comparação aos animais do grupo L.
A infecção por bactérias periodontopatogênicas é o fator etiológico primário na DP. A
presença desses microorganismos ocasiona uma série de reações químicas em nível celular
onde serão ativadas cadeias de sinalizadores inflamatórios e imunológicos a partir da
produção de citocinas (KAYAL, 2013). Os mediadores envolvidos na via patogênica da DP
incluem a IL-1β, IL-6, PGE2, TNF-α, RANKL e as metaloproteinases (MMPs;
particularmente MMP-8, MMP-9 e MMP-13), bem como as citocinas de células T
reguladoras (por exemplo, IL-12, IL-18) e as quimiocinas (PRESHAW; TAYLOR, 2011).
Constituintes do biofilme estimulam as células hospedeiras para a produção de citocinas pró-
inflamatórias incluindo IL-1β e TNF-α que podem induzir a destruição do tecido conjuntivo e
osso alveolar. Estas citocinas estão presentes nos tecidos periodontais doentes e no fluido
crevicular gengival (GCF) (GEMMELL; MARSHALL; SEYMOUR, 1997).
57
O TNF-α está envolvido na migração dos leucócitos para os tecidos periodontais, na
reabsorção óssea alveolar e na perda da inserção conjuntiva. A IL-1β ocasiona o aumento da
secreção dos níveis de MMPs e diminui a expressão dos TIMPS (inbidores teciduais de
metaloproteinases), desempenhando um papel importante na degradação da matriz
extracelular e um grande indutor de reabsorção óssea (GRAVES; COCHRAN, 2003). Kose et
al., (2016), em uma pesquisa com DP experimental em ratos tratados com a Fucoxantina,
mostrou que houve uma ligeira diminuição na expressão TNF-α e da IL-1β. Esse resultado
também pode ser observado na pesquisa de Kang et al., (2013), em que ratos com artrite e
tratados com a Metformina diminuíram os níveis dessas citocinas pró-inflamatórias. No
presente trabalho, o grupo tratado com a MET 50mg/kg diminuiu expressivamente os níveis
da IL-1β e do TNF- α, apresentando assim propriedades que regulam a inflamação.
Bloqueando-se a atividade do TNF-α não somente há uma redução da resposta inflamatória
como também pode haver uma inibição da reabsorção óssea pela diminuição da atividade do
RANKL (ZWERINA et al., 2004)..
A inflamação observada na periodontite é mediada por ações diretas das
prostaglandinas, particularmente a PGE2 a qual está associada a maior eritema, edema
gengival e intensa perda óssea alveolar (GARLET et al., 2006). As enzimas ciclooxigenases,
COX-1 e COX-2, catalisam a conversão do ácido araquidônico a prostaglandinas (GRAVES;
OATES; GARLET, 2011). Araújo et al. (2014), mostraram que ratos com periodontite sem
tratamento apresentaram imunomarcações acentuadas de COX-2 quando comparados aos
saudáveis. A COX-2 pelo método da imunohistoquímica neste trabalho apresentou resultados
semelhantes.
O sistema RANKL, RANK e OPG representa a regulação molecular chave para a
remodelação óssea. Os efeitos do RANKL são neutralizados pela OPG, que inibe fortemente a
reabsorção óssea por meio da prevenção do acoplamento RANK-RANKL (KATAGIRI;
TAKAHASHI, 2002). As MMPs também podem coletivamente degradar quase todos os
componentes da membrana da matriz extracelular e a membrana basal, a atividade
patologicamente excessiva das MMP’S leva à destruição dos tecidos periodontais (GESELL-
SALAZAR et al., 2013). Dentre as MMPs, a MMP-2 e a MMP-9 têm sido fortemente
associadas com a destruição dos tecidos periodontais (GARLET et al., 2006). Estudo em in
vivo (tíbia de ratas) e in vitro sugerem que a Metformina reduz o RANKL e estimula a
expressão de OPG em osteoblastos, inibe a diferenciação dos osteoclastos e previne a perda
58
óssea em ratas ovarectomizadas (MAI et al., 2011). Esses estudos corroboram com o
resultado desta pesquisa, pois a análise da imunomarcação deste trabalho demonstrou que o
grupo L apresentou forte coloração para o RANK, RANK-L, MMP-9 e fraca coloração para a
OPG. Já a dose de 50mg/kg apresentou fraca imunomarcação para esses anticorpos, assim a
Metformina apresentou a propriedade de regulação do mecanismo da osteoclastogênese e
consequente perda óssea.
A Catepsina K é uma proteinase de cisteína produzidas por osteoclastos ativados e que
estão envolvidas no processo de solubilização da matriz óssea, sendo assim um importante
marcador para atividade de osteoclastos (TEITELBAUM, 2000). Garg, Pradeep e Thorat
(2009) estudaram a relação da Catepsina K com a doença periodontal, observaram que o
grupo com a periodontite apresentou alto nível de atividade para esse marcador no GCF, ao
mesmo tempo em que o grupo tratado com a RAR diminuiu os níveis de Catepsina K.
Indicando assim que houve um acúmulo de osteoclastos nos sítios doentes e uma
amplificação dos sinais de reabsorção no periodonto inflamado pelas citocinas pró-
inflamatórias, TNF-α e IL-1β. Nossos achados estão de acordo com o trabalho citado, pois o
grupo L obteve uma imunomarcação acentuada para a Catepsina K, enquanto que a MET 50
diminuiu esses níveis.
Diferentes tipos de estresses celulares podem conduzir à ativação do AMPK
(HARDIE, 2003). A Metformina ativa a AMPK indiretamente através da inibição da cadeia
respiratória mitocondrial (HAWLEY et al., 2010). Essa enzima suprime a sinalização do NF-
kB indiretamente, através da estimulação de mediadores, SIRT1 (sirtuína 1), PGC-1α
(coativador receptor gama ativado pelo proliferador de peroxissoma), p53 (proteína 53) e
FoxO (fator de transcrição), os quais subsequentemente reprimem a expressão de fatores
inflamatórios (SALMINEN; HYTTINEN; KAARNIRANTA, 2011). AMPK desempenha um
papel importante no metabolismo ósseo regulando o RANK-L (YOKOMOTO-UMAKOSHI
et al., 2016). Tokuda et al. (2012), investigaram ativação da AMPK na síntese de IL-6
estimuladas por trombina nas células MC3T3-E1 semelhantes a osteoblastos e concluíram que
essa enzima regula o metabolismo ósseo.
O presente estudo demonstrou reduções na produção de citocinas pró-inflamatórias,
IL-1β e TNF-α, provavelmente devido ao aumento induzido pela MET na expressão do gene
da AMPK, que por sua vez inibe a expressão do NF-KB p65. O envolvimento da atividade do
59
AMPK na regulação do metabolismo ósseo pode ser demonstrado pela redução da
imunomarcação para o RANKL e o aumento da marcação para OPG, indicando uma maior
atividade dos osteoblastos.
HMGB1 é uma proteína nuclear não-histona com elevada mobilidade, liberada pelos
macrófagos no meio extracelular. Exerce um papel essencial na imunidade inata, esta função é
mediada, pelo menos em parte, pelo receptor para produtos finais de glicação avançada
(RAGE), ou seja, está relacionado à patogênese de múltiplas doenças inflamatórias. O
HMGB1 aumenta o número de moléculas de adesão em células endoteliais, ativa células
dendríticas e as células T e estimula a diferenciação de precursores de osteoclastos na
presença de RANK-L (ZHOU et al., 2008). A via de sinalização HMGB1 pode também ativar
o NF-kB, que aumenta a expressão de diversas citocinas pro-inflamatórias (por exemplo,
TNF-α, IL-1β, IL-6), a proliferação de células e a quimiotaxia (SHEN; LI, 2015). A ativação
do AMPK foi considerado como um dos mecanismos que contribuem para inibição da
atividade do HMGB1, a Metformina melhorou a sobrevivência em um modelo de
endotoxemia letal em ratos inibindo a liberação de HMGB1 (TSOYI et al.,2011). Em nosso
estudo, o tratamento com MET reduziu a expressão do gene do HMGB1, o que representa
uma outra via que envolve a produção de RANKL.
A Metformina apresenta atividade anti-inflamatória, atua na redução do estresse
oxidativo e na perda óssea alveolar. Porém, outros estudos são necessários para efetiva
caracterização dos mecanismos moleculares envolvidos na relação entre o uso dessa
importante droga com doença periodontal. A elucidação destes mecanismos contribuirá para o
desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas voltadas para o controle da
prevalência e da severidade das doenças periodontais, visto que a Metformina é um
hipoglicemiante comumente utilizado, sendo o padrão ouro para o tratamendo da Diabetes
mellitus tipo 2.
60
8 CONCLUSÃO
Esse estudo revelou que o tratamento da doença periodontal induzida por ligadura em
ratos com o Cloridrato de Metformina, na dosagem 50 mg/kg, é efetivo. Essa dose ocasionou
a redução da perda óssea alveolar e da inflamação nos tecidos periodontais, pois os níveis das
citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, foram reduzidos; reduziram os níveis de
Malonaldeído (MDO), diminuíram a expressão de MMP-9, COX-2, RANK, RANKL, SOD-1
e obteve uma maior expressão de OPG e GPx. A dose de MET 50 mg/kg ainda aumentou a
expressão gênica para o AMPK e diminuiu a expressão do NF-KB p65 e HMGB1
comparando-se ao grupo doente e não tratado. Diante disso, observou-se que a Metformina
(50 mg/kg) apresentou efeitos positivos na regulação do estresse oxidativo, ação anti-
inflamatória e osteoproteçã no modelo da periodontite experimental em ratos Wistar.
Contudo, mais estudos são necessários para avaliar a ação da Metformina no contexto clínico.
61
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