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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
MAIANE DE PAULA ALVES
OCORRÊNCIA DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS EM CATHARANTHUS ROSEUS
(VINCA) EM VIÇOSA - MG: NOVOS RELATOS
VIÇOSA – MINAS GERAIS
2016
MAIANE DE PAULA ALVES
OCORRÊNCIA DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS EM CATHARANTHUS ROSEUS
(VINCA) EM VIÇOSA – MG: NOVOS RELATOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à
Universidade Federal de Viçosa como parte
das exigências para a obtenção do título de
Engenheiro Agrônomo. Modalidade: trabalho
científico.
Orientador: Robert Weingart Barreto
Coorientadores: Adans Agustin Colman
Bruno Wesley Ferreira
Sara Salcedo Sarmiento
VIÇOSA – MINAS GERAIS
2016
MAIANE DE PAULA ALVES
OCORRÊNCIA DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS EM CATHARANTHUS ROSEUS
(VINCA) EM VIÇOSA - MG: NOVOS RELATOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à
Universidade Federal de Viçosa como parte
das exigências para a obtenção do título de
Engenheiro Agrônomo. Modalidade: trabalho
científico.
APROVADO: 09 de dezembro de 2016
Robert Weingart Barreto
(Orientador)
(UFV)
RESUMO
Catharanthus roseus, conhecida popularmente como vinca, é uma planta herbácea
perene, originária de Madagascar. É comumente utilizada como planta ornamental, mas tem
importância notável como planta medicinal. Desta espécie foram obtidos dois alcaloides de
grande valor para o tratamento de tumores e leucemia - a vimblastina e a vincristina.
Considerando a importância das doenças fúngicas como limitantes para cultivos de plantas de
interesse econômico, seria de se esperar que, pela relevância de C. roseus, uma ampla
literatura sobre patógenos fúngicos dessa espécie estivesse disponível. No entanto, há pouca
informação publicada a respeito para a vinca, indicando que esta espécie vegetal foi
negligenciada pelos fitopatologistas. No mundo se tem registro de 55 fungos relatados em C.
roseus. No entanto, para a maioria destes nem ao menos a demonstração de patogenicidade
pelos postulados de Koch foi feita. No Brasil, o único relato existente de fungo fitopatogênico
associado a vinca é de Botryosphaeria ribis. Recentemente um levantamento preliminar de
fungos associados a vinca cultivada como ornamental no campus da Universidade Federal de
Viçosa, revelou a presença de seis espécies fúngicas associadas a vários sintomas de doença.
Dois dentre esses foram identificados preliminarmente como Oidium – causando míldio
pulverulento e Botrytis – causando mofo cinzento. No presente trabalho um estudo foi feito
visando esclarecer melhor a identidade destes dois fungos. Um estudo da morfologia desses
dois taxa mostrou que o agente do míldio pulverulento pertence ao gênero Microidium e o do
mofo cinzento pertence à espécie comum e polífaga Botrytis cinerea. B. cinerea teve sua
patogenicidade demonstrada pela inoculação de plantas sadias e reprodução da doença. Para o
agente do míldio pulverulento é desnecessária tal demonstração, pois se trata de um parasita
obrigatório.
Palavras-chave: Botrytis cinerea, medicinal, Microidium, míldio pulverulento, mofo cinzento,
oídio, ornamental, taxonomia
ABSTRACT
Catharanthus roseus, popularly known as vinca, is a perennial herbaceous plant,
native from Madagascar. It is commonly used as an ornamental but has great importance as a
medicinal plant. Two highly important alcaloids are obtained from that species which are of
great importance in the treatment of tumors and leukemia: vinblastine e a vincristine. Taking
into consideration the high importance of fungal diseases as limitations to the cultivation of
plants of economical relevance, it might be expected that a vast literature covering fungal
diseases of vinca might exist. Nevertheless, little has been published on this matter, indicating
that this plant species has been neglected by plant pathologists. Fifty five fungal species have
been recorded on C. roseus worldwide. Nevertheless, for the majority not even the
demostration of pathogenicity through Koch’s postulates has been performed. In Brazil the
sole fungal pathogen recorded on vinca was Botryosphaeria ribis. Recently, a brief survey of
ungi associated with vinca plants grown in the gardens in the campus of the Universidade
Federal de Viçosa revealed the presence of six fungal species associated with a range of
disease symptoms. Two were identified preliminarly as Oidium – podery mildew – and
Botrytis – gray mold. Here, a study was conducted aimed at better elucidating the identity of
these two fungi. Morphology of the two fungi has shown that the powdery mildew agent
belongs to the genus Microidium whereas the fungus behind the gray mold belongs to the
common polyphagous agent of gray molds - Botrytis cinerea. Pathogenicity of B. cinerea
was demonstrated through inoculation of healthy vinca individuals and the reproduction of the
disease. As for the agent of the powdery mildew, such exercise is unecessary since all fungi in
this group are obligate parasites.
Keywords: Botrytis cinerea, gray mold, medicinal plant, Microidium, powdery mildew,
oidium, ornamental plant, taxonomy
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 7
2. MATERIAL E MÉTODOS 8
3. RESULTADOS 11
4. DISCUSSÃO 12
5. CONCLUSÃO 14
6. REFERÊNCIAS 15
7. ANEXOS 21
7
1. INTRODUÇÃO
Catharanthus roseus (L.) G. Don (sinonímias Vinca rosea e Lochnera rosea)
conhecida popularmente como vinca, é uma planta perene tropical pertencente à família das
Apocynaceae. É uma espécie originária de Madagascar e está amplamente distribuída em
áreas tropicais e subtropicais (Lewis et al.,1977; Gajalakshmi et al., 2013).
Possui importância na ornamentação (Filippini et al., 2003) e na medicina popular em
muitos países (Ross IA, 1999), como África do Sul, China, Índia, México (Patel et al., 2012) e
Malásia (Ong et al., 2011), onde é utilizada como remédio para aliviar as complicações do
diabetes (Li et al., 2004).
Nos anos 50 houve interesse das indústrias farmacêuticas na utilização de
Catharanthus roseus baseado na medicina popular, nessa época observou-se a existência dos
alcaloides, vimblastina e vincristina. Mais tarde, na década de 70 a companhia Eli Lilly
patenteou a tecnologia de extração e purificação desses compostos (Jones WE, 1973). Tais
alcaloides são usados no tratamento de grande variedade de neoplasias e são recomendados
para doença de Hodgkin generalizada, linfoma linfocítico, linfoma histiocítico, micose
fungóide, carcinoma testicular avançado, leucemia infantil, sarcoma de Kaposi,
coriocarcinoma e câncer de mama (Robbers et al., 1997).
Catharanthus roseus é conhecida amplamente pelos fitopatologistas como uma planta
modelo para o estudo de interações planta-fitoplasma e como coleções vivas de fitoplasmas
com finalidade de pesquisas (Favali et al., 2008; Chen & Lin, 2011). Infecções naturais de
fitoplasmas já foram constatadas no Brasil, sendo os grupos 16SrII, 16SrIII, 16SrIV e
16SrXV (Barros et al., 1998; Bedendo et al., 1999; Montano et al. 2001a, 2001b). No entanto,
tais estudos são acadêmicos e não envolvem aspectos relacionados à fitossanidade da vinca
como planta cultivada.
Além de fitoplasmas, diversos vírus foram registrados associados à planta. No Brasil
foram relatadas algumas viroses, como Cucumber mosaic virus (CMV) e Catharanthus
mosaic virus (CatMV), causando sintomas de mosaico e má formação das folhas associadas
(Seabra et al., 1999; Maciel et al., 2011).
Além de vírus e fitoplasmas, pelo menos 55 fungos foram relatados em diversos países
do mundo associados à Catharanthus roseus (Farr et al., 2015). No Banco de dados brasileiro
de fungos de plantas, apenas Botryosphaeria ribis está listado como fitopatógeno em C.
8
roseus (CENARGEN, 2016). Reis & Henrique (2007) relataram Phytophora nicotianae e
Rhizoctonia solani, como causadores de doenças neste hospedeiro no Brasil.
Foram conduzidas buscas de plantas doentes de Catharanthus roseus na Universidade
Federal de Viçosa, com o objetivo de descrever a micobiota presente. Os fungos
fitopatogênicos identificados foram Cercospora sp., Colletotrichum siamense, Colletotrichum
truncatum, Corynespora cassiicola e Lasiodiplodia theobromae.
Buscando continuar o trabalho da descrição dos fungos associados à Catharanthus
roseus, constatou-se a presença de duas novas espécies fúngicas associadas à planta.
Objetivos:
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar morfologicamente os patógenos
Botrytis cinerea e Microidium sp. associados à Catharanthus roseus em Viçosa – MG.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostras coletadas:
As amostras de Catharanthus roseus com supostos sintomas das doenças, foram
coletadas em Viçosa (Minas Gerais) no campus da Universidade Federal de Viçosa, entre
outubro e novembro de 2016. As amostras foram encaminhadas para análise na Clínica de
Doenças de Plantas (Departamento de Fitopatologia – UFV), onde foram analisados sob
microscópio estereoscópico (Motic, LED – 60T) para confirmação da presença de estruturas
fúngicas.
2.2 Obtenção de cultura pura:
Para o fungo Microidium sp. esta etapa não foi realizada, por se tratar de um fungo
biotrófico, que por definição, depende de seus hospedeiros vivos para sobreviver, pois
necessita de nutrintes específicos (Lopes et al., 2005).
Cultura pura de Botrytis cinerea foi obtida a partir da transferência asséptica de
conídios, coletados sobre as colônias formadas em lesões, utilizando uma agulha de ponta
fina, esterilizada, para placas contendo meio batata dextrose ágar (BDA). As culturas puras
9
foram preservadas em sílica-gel, como descrito por Dhingra e Sinclair (1995) e mantidas à -
80°C em glicerol. O isolado foi depositado na coleção de culturas Octávio Almeida
Drummond (COAD), da Universidade Federal de Viçosa.
2.3 Testes de Patogenicidade:
Duas plantas sadias foram inoculadas com suspensão de esporos de Botrytis cinerea,
na concentração de 1,0 x 106
conídios/ mL (concentração ajustada com o auxílio de uma
Câmara de Neubauer) coletadas a partir de colônias crescidas em meio caldo de vegetais ágar
(CVA). A inoculação foi realizada com o auxílio de um pulverizador. Após inoculação, as
plantas foram acondicionadas sob câmara úmida (FIGURA 1), por um período de 48 horas.
Após este período, as plantas foram retiradas da câmara úmida e deixadas dentro da casa de
vegetação para observação diária da constatação de sintomas da doença. Uma planta foi
pulverizada apenas com água destilada estéril e colocada sob as mesmas condições que as
demais, servindo como testemunha. Todas as plantas inoculadas apresentaram sintomas 2 dias
após a inoculação, e sinais 3 dias após a inoculação. O patógeno foi então, reisolado.
FIGURA 1: plantas acondicionadas em câmara úmida
10
2.4 Caracterização Cultural e Morfológica
A morfologia da colônia foi descrita após os fungos serem crescidos por 4 dias em
placas contendo os meios batata-cenoura-ágar (BCA) e batata-dextrose-ágar (BDA). Um
conjunto de placas foi colocado em uma incubadora a 25±2°C com um regime de luz diária de
12 horas, fornecida por um conjunto de 2 lâmpadas fluorescentes de 20W (General Electric) e
uma lâmpada de 15W de luz azul negra (Gran Light). O outro conjunto de placas foi
envolvido por papel alumínio e colocado na incubadora com as mesmas condições. As cores
das colônias foram descritas seguindo a terminologia de Rayner (Rayner, 1970). Estruturas
fúngicas formadas em cultura ou no tecido do hospedeiro foram montadas em lâminas com
lactofucsina ou lactofenol e observadas sob microscópio óptico. A morfologia foi estudada e
dados biométricos foram obtidos a partir da medição de pelo menos 30 estruturas.
2.5 Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento de patógeno fúngico
DNA genômico foi extraído a partir de cultura pura de Botrytis cinerea cultivada em
CVA a 25° C sob um regime de luz de 12 horas (condições descritas anteriormente) durante 5
dias. Aproximadamente 50-80 mg de micélio foi raspado da superfície do CVA e colocados
num ependorf esterilizado, contendo esferas de zircônio. O ependorf foi colocado no
equipamento L-Beader-3 (Locus Biotecnologia) a uma velocidade de 4000 rpm, 2 ciclos de
30 s cada. A extração foi realizada de acordo com o protocolo Wizard Genomic DNA Kit®
130 (Promega, Madison, EUA) seguindo a recomendação do fabricante para todos os
isolados. Diferentes regiões genômicas foram amplificadas e sequenciadas de acordo com
relevância taxonômica para cada taxa fúngica estudada, conforme indicado dados
morfológicos. Essas regiões incluíram: a primeira região interna Transcrito Espaçador (ITS1),
o gene de rRNA 5,8S ITS-2 e a segunda região ITS (ITS2), utilizando os iniciadores ITS4 e
ITS5 (White et al., 1990). A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando
um volume total de 25 μL em reações com mistura contendo 30 ug de DNA, 0,2 M de cada
iniciador e 1X mistura principal DreamTaq DNA conforme recomendado pelo fabricante
(Thermo Fisher Scientific®). A PCR para ITS foram 4 min a 94 °C, depois 40 ciclos de 94 °C
durante 30s, 60 °C durante 30s, 72 °C durante 45s, e depois 7 min a 72 °C. As temperaturas
de recozimento diferiram para os outros genes, com o melhor para CAL: 55 °C. Os produtos
de PCR foram purificados utilizando um ExoSAP-IT kit de purificação (USB 148 Corp) de
11
acordo com as recomendações do fabricante. Os fragmentos amplificados foram sequenciados
por Macrogen Inc. (Coreia).
3. RESULTADOS
3.1 Taxonomia
Botrytis cinerea
Os sintomas iniciais em Catharanthus roseus apresentavam-se como lesões irregulares
com aspecto úmido, que se desenvolviam rapidamente formando uma necrose extensa nos
tecidos. Flores infectadas caiam com o desenvolvimento da doença. O fungo associado a
estas lesões, apresentava crescimento cotonoso, com esporulação acizentada sobre o tecido
atacado; conidióforos 300 – 1500 x 80 – 150 µm, ramificados, subcilíndricos, lisos, marrom
claro, pálido próximo ao ápice; células conidiogênicas ampuliformes, 9 –20 x 7 – 10 µm;
conídios 10 – 14 x 6 – 9µm, solitários, elipsoides ou subesféricos, com hilo ligeiramente
protuberante, lisos, castanho claro ou sub-hialino.
Em cultura: Rápido crescimento da colônia (7,8 – 8,0 cm de diâmetro em BDA e 6,5 –
6,7 cm em BCA aos 4 dias). Colônias planas, lanosas; margens fimbriadas a inteiras; textura
lanosa; cor branca com um anel intermediário buff (BDA) de micélio cotonoso (BDA escuro)
e cor inteiramente branca com anel intermediário de micélio ralo (BCA escuro). (FIGURA
2A e 2B )
FIGURA 2A: colônia em BDA FIGURA 2B: colônia em BCA
12
Material examinado: Brasil, estado de Minas Gerais, Viçosa, campus da Universidade
Federal de Viçosa, em folhas de Catharanthus roseus, 30 de outubro de 2016, DOA (VIC e
COAD).
Microidium bauhinnicola (U. Braun & Dianese) U. Braun & D, comb. nov. (?)
Colônias de aspecto esbranquiçado, cotonoso e pulverulento em folhas e frutos.
Ocorrência posterior de amarelecimento e queda das folhas. O fungo encontrado associado à
Catharanthus roseus apresentava a seguinte morfologia: Micélio externo solto, de 2,5-3,75
μm de diâmetro, ramificado, septado, hialino, apressório hifal com formato mamilar, 2 – 8
µm, solitários ou pares opostos; conidióforos 62 – 140 µm x 5 – 12 µm, decorrentes de hifas
superficiais de base reta, não ramificados; células-pé 35 – 70 x 5 – 10 µm, ligeiramente curva
na base, seguida por 1 a 2 células mais curtas anteriores ao conídio, surgimento de cadeia
curta de conídios em maturação; conídios 20 – 30 x 7,5 – 12,5 µm, hialinos, lisos, formato
subcilíndrico em cadeia simples, tubos germinativos subcilíndricos, posição angular quase
terminais.
Material examinado: Brasil, estado de Minas Gerais, Viçosa, campus da Universidade
Federal de Viçosa, em folhas de Catharanthus roseus, 30 de outubro de 2016, DOA (VIC ).
4. DISCUSSÃO
Botrytis cinerea é o agente etiológico do mofo cinzento, doença que ataca mais de 230
espécies vegetais distintas (Horst, 1998). Apesar de ocorrer em ambientes diversos, a
sobrevivência, disseminação e infecção do patógeno é favorecido sob alta umidade e
temperaturas amenas (Williamson et al., 2007). Os conídios são disseminados pelo vento,
água da chuva e pela irrigação. O fungo causa lesões no tecido hospedeiro que se expandem
rapidamente, produzindo esporos e consequentemente, aumentando inóculo para novos ciclos
do patógeno (Ferreira, 1989).
Botrytis cinerea já foi relatado em Catharanthus roseus na Itália (Garibaldi et al.,
2009), Estados Unidos (Daughtrey et al., 1995), China (Zhang, 2006) e Taiwan (Ou-Yang,
13
1998). Os resultados aqui apresentados, ampliam ainda mais a grande significância de
Botrytis cinerea como problema para a planta C. roseus no Brasil. Seu manejo é
reconhecidamente difícil por conta de características como sua ocorrência mundial,
capacidade de sobrevivência como saprófita, produção de escleródios e ampla gama de
hospedeiros (Jarvis, 1977).
Microidium sp. é um fungo, agente etiológico da doença oídio, cujos sintomas são
caracterizados por manchas pulverulentas que correspondem à esporulação do fungo e
posterior amarelecimento e necrose das áreas infectadas, causando desfolha precoce e
consequente redução da área foliar (Sobrinho et al., 2005; Santana et al., 2012). O oídio é a
doença mais importante nos cultivos em estufas ou sob proteção de plástico, onde geralmente
a temperatura é mais elevada e a irrigação é por gotejamento, não havendo lavagem das
folhas, mas também pode ser encontrado em culturas a céu aberto (Lopes et al., 2005).
A observação do tubo germinativo dos conídios permite inferir que este, produz um
tipo único de germinação, o tipo micróide (To-anun et al., 2002), no qual os conídios
produzem tubos germinativos no ombro (parte angular) ou no final dos conídios, o tubo
germinativo é curto, aproximadamente 0,8 - 1,2 vezes o comprimento dos conídios,
terminando com inchaço em forma de mamilo, ou um apressório ligeiramente lobulado, com
ou sem dois ou três tubos germinativos menores no final de conidios. Segundo Hirata (1955) e
Braun (1987) este tipo de germinação não é idêntico ao de quaisquer outros mildios
pulverulentos relatados, desta forma, este grupo de fungos foi proposto como um novo
subgénero de Oidium (To-anun et al., 2005). O isolado aqui descrito encaixa-se nas
características anteriormente citadas, embora, não tenha sido constatada a formação de
apressório no tubo germinativo. Estudos moleculares estão em andamento para elucidar com
mais acuidade a identidade do fungo.
Três espécies de Microidium foram relatadas até o momento, são elas: Microidium
bauhinnicola (É.E. Foëx) em Bauhinia sp. no Brasil (Braun & Cook, 2012); Microidium
agatides (É.E. Foëx) U. Braun em Sesbania grandiflora na India, Sri Lanka e Vietnam (Braun
& Cook, 2012) e Microidium phyllanthi (J.M. Yen) To-anun & S. Takam. em Phyllanthus
urinaria, em Taiwan (Braun & Cook, 2012) e Vietnan (Tam et al., 2015). Este é o primeiro
relato de Microidium sp.em Catharanthus roseus no Brasil.
Fungos patogênicos reportados para Catharanthus roseus foram relatados
principalmente em países da América do Norte e Ásia, da mesma forma, esses patógenos são
14
amplamente distribuídos em outros hospedeiros (Sharma et al., 2013; Tomioka et al., 2013;
Blake & Williamson, 2015). Outros fungos foram relatados recentemente por nossa equipe
como sendo patogênicos à C. roseus no Brasil, são eles: Cercospora sp. (mancha foliar),
Colletotrichum siamensi (necrose nas hastes), Colletotrichum truncatum (mancha foliar),
Corynespora cassiicola (mancha alvo) e Lasiodiplodia theobromicola (podridão de colo e
dieback) (dados não publicados).
5. CONCLUSÃO
Este estudo descreveu a micobiótica fitopatogênica de Catharanthus roseus no Brasil,
e representa portanto, apenas uma pequena parte da diversidade existente de patógenos
fúngicos neste hospedeiro. Sendo assim, este é o primeiro relato no Brasil de Botrytis cinerea
causando mofo cinzento e Microidium sp. em C. roseus.
15
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21
7. ANEXOS
FIGURA 3: A (sintomas de Botrytis cinerea); B (sinais de Botrytis cinerea); C (folhas
doentes contaminando folhas sadias); D (conidióforos); E (células conidiogênicas); F
(escleródios)
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FIGURA 4: A (Sinais de Microidium sp. em folhas); B (Sinais de Microidium sp. em
frutos); C (conidióforo); D (conídios); E (conídio germinando); F (hifa com apressório)