Post on 13-Dec-2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MÉTODO DE DIFUSÃO RADIAL: VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO
PROCESSO DE EXTRAÇÃO PARA DOSEAMENTO DE TANINOS DE
ESPÉCIES MEDICINAIS DA CAATINGA
LUMA GOMES DOS SANTOS
RECIFE, 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MÉTODO DE DIFUSÃO RADIAL: VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO
DE EXTRAÇÃO PARA DOSEAMENTO DE TANINOS DE ESPÉCIES MEDICINAIS
DA CAATINGA
LUMA GOMES DOS SANTOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal de Pernambuco.
ORIENTADORA: Profa. Dra. ELBA LÚCIA CAVALCANTI DE AMORIM
RECIFE, 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Recife, 17 de maio de 2012.
Dissertação defendida em 17 de maio de 2012, banca Examinadora constituída pelos
seguintes profesores:
PRESIDENTE E EXAMINADOR INTERNO: Profª Drª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim
(Universidade Federal de Pernambuco).
Assinatura:___________________________________
EXAMINADOR INTERNO: Profº Dr. Pedro José Rolim Neto
(Universidade Federal de Pernambuco)
Assinatura:___________________________________
EXAMINADOR EXTERNO: Dr. Joabe Gomes de Melo
(Universidade Federal Rural de Pernambuco)
Assinatura:_________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Vice-Reitor
Sílvio Romero de Barros Marques
Pró-Reitor para assuntos de Pesquisas e Pós-Graduação
Francisco de Souza Ramos
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Nicodemos Teles de Pontes Filho
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Vânia Pinheiro Ramos
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Dalci José Brondani
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Antônio Rodolfo de Faria
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Nereide Stela Santos Magalhães
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Ana Cristina Lima Leite
Dedicatória
A meus avós, Geraldina Gomes dos Santos e
Juarez Carneiro dos Santos e a minha mãe,
Geraldina Maria Gomes dos Santos.
AGRADECIMENTOS
A todos aqui apresentados, agradeço a contribuição e força durante realização
deste trabalho.
INSTITUIÇÕES
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFPE
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.
AOS PROFESSORES
Profª Drª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
AOS COLEGAS DE LABORATÓRIO
Allan Chernichiarro Joabe Melo
Daniela Cabral Patrícia Neri
Daniel Carvalho Tadeu Peixoto
Elvis Alves Thiago Araújo
Irla França Valéria Borba
Jenifer Rodrigues Valérium Castro
AOS AMIGOS
Alan Lucena de Vasconcelos Karla Camila Barbosa Santana
Alex Lucena de Vasconcelos Laércio Brandão de Arruda
Anne Cecília Nascimento da Cruz Luciana Gomes Arrais
Diego Menelau de Almeida Marconi Coêlho Santos
Elaine Rafaelle da Silva Pâmela Tavares
Evanilson Alves Feitosa Rafaela Damasceno Sá
Flávia do Couto Grandelle Renato da Cruz Lino Salvador
Ingrid de Araújo Campos Salvana Priscylla Manso Costa
Jonatan Nunes Viana Vanessa Mendes Lira
Jouldes Matos Duarte Yvson Anderson Ferreira
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Profa. Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim, pela orientação, apoio,
paciência e compreensão em todos os momentos que necessitei.
A comunidade do sítio Carão, por sempre nos receber tão bem e por toda boa
vontade durante nossas coletas.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pelo financiamento do projeto.
Aos colegas de laboratório Thiago Araújo por ter se disponibilizado a fazer uma
viagem de 160 km para que eu pudesse fazer a coleta de plantas. E principalmente a
Daniela Cabral e Tadeu Peixoto Sobrinho, sem os quais eu NUNCA teria conseguido
concluir este trabalho, não há palavras que consigam descrever meu sentimento de
gratidão aos dois.
A Evanilson Alves Feitosa, companheiro de sala, de moradia, de trabalho e até
de autoescola, obrigada por suportar minha bagunça.
A Alan Lucena de Vasconcelos, por toda confiança e por sempre dar
importância a minha opinião.
A Diego Menelau de Almeida, companheiro de aventuras, obrigada por todos os
bons momentos de descontração, amizade e companheirismo.
A Luciana Gomes Arrais (a rainha da cromatografia), Ingrid de Araújo Campos
e Karla Camila Barbosa Santana que nem aqui poderiam estar separadas, obrigada por
toda amizade, companheirismo, confiança, risadas, conselhos, preocupações, fofocas,
confissões, puxões de orelha, por tudo que vocês têm representado pra mim durante
esses seis anos.
A Renato Lino e Jonatan Nunes os autores das piadas mais engraçadas do
planeta, obrigada por todas as risadas, sejam elas sinceras ou não.
A Salvana Costa com por toda boa vontade e ajuda com os experimentos de
validação, sem esquecer o Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto e a equipe do LTM pela
disponibilização do laboratório e equipamentos.
A toda minha família, primas, tias, tios pelo apoio e incentivo.
A minha MÃE, pelo amor, carinho e dedicação incondicionais.
“Seja a mudança que você quer ver no mundo”.
(Mahatma Gandhi)
RESUMO
As plantas sempre foram utilizadas por suas propriedades terapêuticas observadas
empiricamente através das gerações. Atualmente, sabe-se que essas propriedades são
devidas a presença de metabolitos secundários, e isso tem despertado o interesse de
pesquisadores que visam os vegetais como fonte promissora de novas moléculas úteis
ao homem para o tratamento de uma ampla gama de doenças. Há uma grande variedade
de metabólitos secundários, com diferentes estruturas químicas e diversas funções,
dentre estes estão os taninos. Diversos tipos de ensaio têm sido utilizados para a
quantificação de taninos. Os métodos mais apropriados para determinação de taninos
são os ensaios com precipitação de proteínas, porem outros métodos também são
utilizados, sendo os mais comuns os métodos de precipitação de metais e métodos
colorimétricos. Apesar de serem amplamente utilizados para análise quantitativa de
taninos de maneira geral, os métodos colorimétricos são específicos para algumas
classes de taninos. A metodologia de doseamento desenvolvida por Hagerman tem
como base a propriedade que os taninos possuem de se complexar com
macromoléculas, neste caso, as proteínas. É bastante simples, rápida e econômica, muito
útil em estudos que envolvem uma grande quantidade de amostras. Entretanto tem se
mostrado um método pouco sensível uma vez que se utiliza uma grande quantidade de
massa vegetal para extração. Este trabalho teve como objetivo realizar a otimização do
processo de extração para doseamento de taninos através da difusão radial e realizar o
estudo de validação do método. Para otimização da extração algumas variantes ao
método original foram testadas, são elas: massa vegetal, solventes, tipo e tempo de
extração. Observou-se que a redução da massa vegetal a metade pouco influenciou no
valor final do teor de taninos da espécie testada, uma melhora significativa dos
resultados quando da utilização de acetona 50% (v/v) em relação ao solvente original
metanol 50% (v/v). Resposta positiva foi também obervada com a utilização de
aparelho de ultrassom que aumentou consideravelmente o diâmetro do disco reduzindo
a metade o tempo necessário para uma extração eficiente. Para o ensaio de validação
todos os parâmetros obrigatórios foram avaliados. O método foi considerado linear e
com alta sensibilidade de quantificação (27,72 µg/poço). Mostrou-se também robusto e
com recuperação aceitável (85,96%). Os resultados obtidos para repetitividade (intra-
corrida) e precisão intermediária (inter-corridas), certificaram a precisão do método,
obtendo-se valores entre 1,89 e 7,03%. Para a exatidão valores entre 100,47 e 105,26%
foram obtidos, que se encontra dentro dos limites preconizados pela ANVISA. Sendo
assim o método foi considerado preciso, exato e reprodutível, além de ser de fácil
execução e baixo custo.
Palavras chave: taninos, difusão radial, caatinga, validação de método, otimização.
ABSTRACT
Plants always been used for its therapeutic properties empirically observed through the
generations. Currently, it is known that these properties are due to the presence of
secondary metabolites, and this has aroused the interest of researchers aimed the
vegetables as promising source of new molecules useful to man to treat a wide range of
diseases. A wide variety of secondary metabolites with different chemical structures and
several functions, among these are the tannin. Various types of assay have been used for
quantification of tannins. The most suitable methods for the determination of the tannins
are precipitated with protein assays, but other methods are also used, the most common
methods for precipitation of metals and colorimetric methods. Although widely used for
quantitative analysis of tannins in general, colorimetric methods are specific to certain
classes of tannins. The methodology developed by Hagerman assay is based on the
property that Tannins are complex with the macromolecules, in which case the proteins.
It's quite simple, fast and inexpensive, very useful in studies involving a large number
of samples. However has been a very sensitive method since it uses a large amount of
mass plant for extraction. This study aimed to perform the optimization of the extraction
process for assaying tannins by radial diffusion and perform the validation study of the
method. To optimize the extraction some variants to the original method were tested,
they are: plant mass, solvent type and extraction time. It was observed that the mass
reduction plant half little influence on the final amount of tannin content of the species
tested, significantly improved results when using 50% acetone (v / v) in relation to the
original 50% methanol solvent ( v / v). Positive response was also with the use of
ultrasonic apparatus which greatly increased the diameter of the disc reduces by half the
time required for efficient extraction. For assay validation all mandatory parameters
required by ANVISA were evaluated. The method was considered linear and with high
sensitivity quantitation (27.72 g / well). It was also shown robust and acceptable
recovery (85.96%). The results obtained for repeatability (within-run) and intermediate
precision (inter-run), certified the accuracy of the method, obtaining values between
1.89 and 7.03%. For the accuracy values between 100.47 and 105.26% were obtained,
which is within the limits recommended by ANVISA. Thus the method was considered
precise, accurate and reproducible, and is easy to perform and inexpensive.
Keywords: tannins, radial diffusion, caatinga, method validation, optimization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Divisão dos Taninos Hidrolisáveis..................................................... 23
Figura 2. Estrutura dos taninos gálico e elágico............................................. 23
Figura 3. Taninos condensados..................................................................... 24
Figura 4. Reação da Vanilina com o 3-flavanol monomérico............................. 31
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ANOVA – Análise de Variância
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BSA – Albumina Sérica Bovina
CLAE/ HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CMD – Concentração Média Determinada
CT – Concentração Teórica
CTE – Concentração Total de Taninos Extraídos
CTNE – Concentração de Taninos Não Extraídos
DP – Desvio Padrão
DPa – Desvio Padrão Relativo
DPR – Precisão
HHDF – Dihexa-hidroxifênico
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IC – Inclinação da Curva de Calibração
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
MS – Espectrometria de Massas
NADPH - Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato
PGL – Propilenoglicol
PH – Potencial Hidrogeniônico
RE – Resolução
SPE – Extração em Fase Sólida
U.V - Ultravioleta
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 15
OBJETIVOS 19
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20
1. Revisão Bibliográfica 21
1.1 Taninos 21
1.2 Classificação dos taninos 22
1.3 Biossíntese 25
1.4 Propriedades biológicas e farmacológicas 26
1.5 Métodos para quantificação de taninos 28
1.5.1 Métodos colorimétricos 28
1.5.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas 34
1.5.3 Métodos cromatográficos 35
1.5.4 Outras Metodologias 36
CAPÍTULO II - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO EXTRATIVO DE
TANINOS E QUANTIFICAÇÃO POR DIFUSÃO RADIAL DE
CEDRELA ODORATA L., UMA PLANTA MEDICINAL DA
CAATINGA.
38
1. Material e Método 39
1.1 Material Botânico 39
1.2 Doseamento de taninos através do método de Difusão Radial 39
1.3 Modificações realizadas no método 40
1.4 Análise estatística 41
2. Resultados e Discussão 41
3. Conclusão 46
CAPÍTULO III - VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA
PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS PELO MÉTODO DE
DIFUSÃO RADIAL
47
1. Material e Método 48
1.1 Reagentes e equipamentos 48
1.2 Preparação do gel 48
1.3 Procedimentos experimentais 48
1.4 Parâmetros da validação 49
2. Resultados e Discussão 50
3. Conclusão 53
CONCLUSÃO GERAL 54
PERSPECTIVAS 56
REFERÊNCIAS 58
APENDICE
15
Introdução
16
INTRODUÇÃO
As plantas sempre foram utilizadas por suas propriedades terapêuticas
observadas empiricamente através das gerações. Atualmente, sabe-se que essas
propriedades são devidas a presença de metabolitos secundários, e isso tem despertado o
interesse de pesquisadores que visam os vegetais como fonte promissora de novas
moléculas úteis ao homem para o tratamento de uma ampla gama de doenças (CRAGG
et al., 1999).
Porém o uso medicinal não é a única função destes metabólitos, visto que, na
planta, possuem diversos propósitos. Dentre eles estão: a proteção contra raios UV,
regulação do crescimento, interações intra e interespecíficas, defesa contra predadores e
infecções (VERPOORTE, 1998; WILLS; BONE; MORGAN, 2000; GOBBO-NETO;
LOPES, 2007).
Muitos desses produtos naturais apresentam interessantes atividades biológicas e
farmacológicas, sendo utilizados como agentes anti-inflamatórios, antimicrobianos e
quimioterápicos ou servindo como ponto de partida para o desenvolvimento de novos
medicamentos (VERPOORTE, 2000). Apesar de toda importância atribuída às plantas,
o seu potencial é ainda pouco explorado, sendo que apenas cerca de 20% das plantas
encontradas no mundo estão sendo submetidas a testes biológicos e/ou farmacológicos
(SUFFREDINI et al. 2004; BARROS, 2008)
Há uma grande variedade de metabólitos secundários, com diferentes estruturas
químicas e diversas funções, dentre estes estão os taninos (CLAESON, BOHLIN,
1997). O termo taninos é muito antigo, e foi introduzido por Seguin em 1796 para
descrever os constituintes químicos de tecidos vegetais responsáveis pela transformação
da pele animal em couros maleáveis e de grande durabilidade (curtimento; tanning em
inglês,) (RIBÉREAU-GAYON, 1972; QUEIROZ et al., 2002) . Taninos são metabólitos
secundários, polímeros fenólicos solúveis em água que possuem a habilidade de formar
complexos, insolúveis em água, com proteínas, gelatinas e alcaloides. Apresentam alto
peso molecular, compreendido entre 500 e 3000 Da (MELLO; SANTOS, 2001), contém
grupos hidroxilafenólicos em quantidade suficiente para permitir a formação de ligações
cruzadas com proteínas (DESPHANDE, CHERYAN, SALUNKHE, 1986).
Os taninos possuem ampla distribuição no reino vegetal, sendo encontrados em
muitas plantas usadas pelo homem para fins medicinais, na alimentação e na fabricação
de bebidas. O teor e o tipo de tanino variam, não só de um vegetal para outro como
17
também de uma parte para outra do mesmo vegetal. Nas plantas, os taninos podem ser
encontrados em raízes, flores, frutos, folhas, cascas de caule e na madeira. Eles
contribuem para o sabor adstringente em comidas e bebidas, como aquele sentido ao se
consumir vinhos tintos, chás e frutas verdes (SANTOS, 2000).
Devido as suas características, os taninos possuem diversas aplicações. Dentre
elas podemos citar: curtimento de pele animal, produção de resina, estabilização do solo
na horticultura e outras (CUNHA, 2009).
Diversos tipos de ensaio têm sido utilizados para a quantificação de taninos. Os
métodos mais apropriados para determinação de taninos são os ensaios com
precipitação de proteínas (HAGERMAN; BUTLER, 1989; HAGERMAN et al., 1997).
Porem outros métodos também são utilizados, sendo mais comuns os métodos de
precipitação de metais e métodos colorimétricos. Apesar de serem amplamente
utilizados para análise quantitativa de taninos de maneira geral, os métodos
colorimétricos são específicos para algumas classes de taninos. Apesar destas críticas,
alguns autores afirmam que não há método ideal e reforçam que os métodos
colorimétricos são os mais utilizados para a análise (HAGERMAN; BUTLER, 1989;
HAGERMAN et al., 1997; MONDAL et al., 2001; MUELLER-HARVEY et al., 2001).
As técnicas de doseamentos existentes nos permitem elucidar a quantidade de
taninos presente em uma determinada espécie e aí está fundamentada sua importância,
pois esses dados somados as já conhecidas propriedades dos taninos, permitem estudos
mais direcionados e menos empíricos. A metodologia de doseamento desenvolvida por
Hagerman (1987) tem como base a propriedade que os taninos possuem de se
complexar com macromoléculas, neste caso, as proteínas. É bastante simples, rápida e
econômica, muito útil em estudos que envolvem uma grande quantidade de amostras.
Entretanto tem se mostrado um método pouco sensível uma vez que se utiliza uma
grande quantidade de massa vegetal para extração (HAGERMAN, 1987)
Em conjunto com os doseamentos os trabalhos de validações de métodos
analíticos também são de suma importância, pois estes garantem a confiabilidade do
método. De acordo com a United States Pharmacopeia XXXIII (2010), “A validação de
métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes
mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método
realiza aquilo para o qual é indicado para fazer”. As características analíticas típicas
usadas na validação de métodos são: exatidão, precisão, especificidade, limite de
detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo de aceitação, robustez ou
18
resistência e conformidade do sistema (ESPIRES, 1998; PECORA, 2000; PINTO ET
AL., 2003).
A realização da validação deve ser executada: i) sempre que de forma direta ou
indireta o processo de fabricação tenha sido alterado; ii) quando a qualidade final do
produto for duvidosa; iii) em equipamentos novos e iv) em caso de implantação de um
processo ou método analítico novo (EMANUELLI, 2000; PASTEELNICK, 1993).
Apesar de a metodologia de doseamento de taninos através da difusão radial ser antiga e
amplamente utilizada, não há relatos na literatura de que esta tenha passado por um
processo de validação.
De acordo com a problemática apresentada, o objetivo deste trabalho foi realizar
a otimização do processo de extração empregada no método de difusão radial, bem
como a validação do mesmo.
19
OBJETIVOS
GERAL
Otimizar o processo de extração para aplicação na quantificação de taninos
através do método de Difusão Radial e realizar a validação do método.
ESPECÍFICOS
Verificar o efeito da utilização de diferentes solventes no processo de extração
dos taninos da Cedrela odorata L. (Cedro).
Reduzir a massa vegetal e o tempo necessários para um processo extrativo
eficiente aplicado a quantificação de taninos através do método de Difusão
Radial.
Comparar o efeito da utilização do ultrassom e da maceração na extração de
taninos da Cedrela odorata L.
Quantificar os taninos da Cedrela odorota L. através da Difusão Radial
Determinar os parâmetros de validação, linearidade, recuperação, precisão
exatidão e robustez, para o método de Difusão Radial.
20
Capítulo I
21
1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1-Taninos
Os Taninos pertencem a um grupo de compostos fenólicos provenientes do
metabolismo secundário de plantas (BUTLER et al. 1984). Inicialmente empregou-se o
termo “tanino” para substâncias de origem vegetal utilizadas pelas suas propriedades de
curtir as peles, isto é, capazes de transformar a pele fresca dos animais em material
imputrescível e pouco permeável (CUNHA, 2009).
Taninos são polifenóis de ocorrência natural em plantas, hidrossolúveis, com
peso molecular entre 500 e 3000 Da (MANGAN, 1988), contêm grupos hidroxila-
fenólico em quantidades suficientes para permitir a formação de ligações cruzadas
estáveis (DESHPANDE et al., 1986) sendo, desta maneira capazes de precipitar
macromoléculas como alcaloides e proteínas.
Na forma não oxidada, os taninos reagem com as proteínas através das pontes de
hidrogênio e/ ou ligações hidrofóbicas. Quando oxidados, os taninos se transformam em
quinonas, as quais formam ligações covalentes com alguns grupos funcionais das
proteínas (SGARBIERI, 1996). As interações hidrofóbicas e as ligações de hidrogênio
entre os grupos fenólicos dos taninos e algumas macromoléculas explicam a
adstringência característica dos taninos e a formação de complexos com as fibras de
colágeno da pele, conferindo-lhe resistência à água e ao calor. Porém a estabilidade dos
complexos formados só é assegurada após a formação das ligações covalentes que são
resultado da oxidação dos taninos em quinonas (BRUNETON, 1991). As massas
moleculares dos taninos também são determinantes na formação e estabilidade dos
complexos se este é demasiadamente elevado, a molécula de tanino não pode se
intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas ou macromoléculas; se é muito
baixo, a molécula fenólica se intercala, mas não forma um número suficiente de
ligações que assegure a estabilidade do complexo (CUNHA, 2009).
Os taninos são amplamente distribuídos dentro do reino vegetal, embora em
concentrações muito variáveis, são comuns tanto em espécies de Angiospermas como
Gimnospermas. Dentro das angiospermas os taninos são mais comuns nas
dicotiledôneas que nas monocotiledôneas (CANNAS, 1999), a riqueza relativa varia
cosoante a espécie, mas também com os órgãos, a idade e o estado de desenvolvimento
(predomina nos frutos verdes).
22
Considerando a proporção da ocorrência de taninos em famílias das
Angiospermas arranjadas de acordo ao sistema de classificação de Cronquist, em um
estudo realizado por Mole (1993), somente 4% de 228 espécies testadas foram positivas
para taninos. Nas ordens Polygonales e Plumbaginales apenas uma única família de
cada apresentou taninos, e em famílias de Caryophyllales tais compostos estavam
ausentes. Nas Moraceae, os taninos estão presentes em quantidade insuficiente para
precipitar proteínas (MOLE, 1993).
Nas plantas que biossintetizam quantidades apreciáveis destes metabólitos
secundários a sua localização encontra-se confinada a certos órgãos dissolvidos nos
vacúolos, normalmente combinados sob a forma de complexos solúveis (CUNHA,
2009). Neste local eles não interferem no metabolismo da planta, somente após lesão ou
morte eles agem e têm metabolismo eficiente (CANNAS, 1999).
Estes metabólitos são biossintetizados pelas plantas para diferentes propósitos,
que incluem regulação do crescimento, interações intra e interespecíficas, proteção
contra radiação U.V e infecções. A complexação dos taninos com as proteínas confere-
lhes também uma importante função no controle de bactérias, fungos e insetos
(VERPOORTE, 1998; WILLS; BONE; MORGAN, 2000; GOBBO-NETO; LOPES,
2007).
O uso de taninos na indústria de curtume se tornou muito restrito. No entanto, o
interesse por seu estudo foi aumentado, ao ter-se associado, através de estudos
epidemiológicos, a ingestão de alimentos que os contem, a prevenção de algumas
doenças, como a aterosclerose ou certos tipos de cancro (CUNHA, 2009).
1.2 – Classificação dos taninos
Nas plantas superiores têm-se distinguido, habitualmente, dois grupos de taninos
estruturais e biogeneticamente diferentes: Taninos hidrolisáveis (galotaninos e
elagitaninos) e taninos condensados. A partir de 1985, a elucidação estrutural
evidenciou a existência de elagitaninos modificados por flavanóis, que passaram a
designar-se por taninos complexos. Tendo em conta as características estruturais dos
taninos, conhecidas atualmente, é possível classificá-los como: Galotaninos,
elagitaninos, taninos complexos e taninos condensados (Figura 1) (MUELLER-
HARVEY, 2001; AGUILAR E GUITIÉRREZ-SÁNCHEZ 2001).
23
Figura 1: Divisão dos taninos hidrolisáveis
(Mueller-Harvey, 2001)
Os taninos hidrolisáveis são unidos por ligações éster-carboxila, sendo
prontamente hidrolisáveis, em condições ácidas ou básicas (HAGERMAN E BUTLER,
1981). A unidade básica estrutural desse tipo de tanino é um poliol, usualmente D-
glucose, com seus grupos hidroxilas esterificados pelo ácido gálico (galotaninos) e pelo
ácido hexadihidroxifênico (elagitaninos) (Figura 2) (LEWIS & YAMAMOTO, 1989).
Os taninos elágicos são muito mais frequentes que os gálicos e é provável que o sistema
bifenilico do ácido hexadihidroxifênico seja resultante da ligação oxidativa entre dois
ácidos gálicos (BRUNNETON, 1991).
Figura 2 - Estrutura dos taninos gálico e elágico.
24
Os taninos condensados ou proantocianidinas (Figura 3) são constituídos por
unidade flavanol: flavan-3-ols (catequina) ou flavan-3,4-diols (leucoantocianidinas). Os
taninos condensados podem conter de duas a cinquenta unidades flavonoides; possuem
estruturação complexas; são resistentes a hidrólise, mas podem ser solúveis em
solventes orgânicos e aquosos, dependendo de sua estrutura. As proantocianidinas,
assim denominadas provavelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados
da classe das antocianidinas, como cianidina e delfinidina, apresentam uma rica
diversidade estrutural, resultante de padrões de substituições entre unidades flavânicas,
diversidade de posições entre suas ligações e a estereoquímica de seus compostos
(MELO E SANTOS, 2001). Os taninos hidrolisáveis podem ligar-se ao C6 ou C8 de
uma unidade 3-flavonol, levando a formação de taninos complexos (CUNHA, 2009).
Figura 3: Taninos condensados.
(Mueller-Harvey, 2001).
Na mesma planta podem ocorrer, simultaneamente, taninos hidrolisáveis e
condensados predominando um destes tipos. Os taninos hidrolisáveis são característicos
das dicotiledôneas, herbáceas e lenhosas e tem uma distribuição taxonômica restrita a
algumas famílias. Os elagitaninos têm sido utilizados como marcadores taxonômicos,
particularmente para Hemamelidáceas, Dilenidáceas e Rosáceas. Quanto aos taninos
condensados, têm sido identificados em todos os grupos vegetais, inclusive nas
Gimnospermas e Pteridófitas (HEIL et al., 2002)
25
Com a intenção de localizar a origem intracelular da síntese de taninos
hidrolisáveis foram desenvolvidos, através de técnicas imunocitoquímicas, dois
anticorpos que reconhecem como antígenos os compostos pentagaloilglucose e a enzima
galoiltransferase, catalisadora de taninos hidrolisáveis (GRUNDHÖFER et al., 2001).
Esta técnica foi empregada por apresentar uma alta especificidade e um grande poder de
precisão, uma vez que os reagentes usualmente utilizados (como ex., Fe2+, Fe3+ ou
molibdato) não apresentam distinção entre outros compostos fenólicos vegetais.
Contrastando com a literatura vigente que prega a existência de “vacúolos tânicos”, não
foram encontrados tais compartimentos e sim regiões nos cloroplastos, nos
amiloplastos, na parede celular e em espaços intercelulares que apresentaram locais de
formação e deposição de taninos hidrolisáveis nas folhas de Quercus robus L. e Tellima
grandiflora (Pursh.) Dough.
1.3 – Biossíntese
Taninos hidrolisáveis
O ácido gálico está na gênese dos taninos hidrolisáveis. A esterificação deste
ácido fenólico pela uridina difosfoglucose (UDP-glucose) conduz a formação da β-1-O-
galoil-D-glucose (β-glucogalina) que constitui o primeiro intermediário na biossíntese
destes taninos. Ao atuar como receptor e como principal doador de grupos de ácido
gálico a β-glucogalina vai sendo sequencialmente esterificada e origina por fim o
1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose, que é considerado precursor da maioria dos
taninos hidrolisáveis (CUNHA, 2009).
São três as vias de biossíntese propostas para os taninos. A primeira via conduz à
formação de galotaninos típicos, que resultam da auto-esterificação entre moléculas de
ácido gálico unidas por ligações meta-depsídicas. Isto é: as unidades galoil são
esterificadas com um poliol, mas também ente si, em posição meta relativamente aos
seus grupos carboxílicos (HASLAM, 1989).
A segunda via conduz a formação de elagitaninos por acoplamento oxidativo C2-
C2 entre dois ou quatro grupos galoil vicinais, ligados a D-glucopiranose na sua
conformação mais estável. Em consequência deste processo, formam-se ésteres mono-
26
ou di-hexa-hiroxifênicos (HHDF), estes compostos podem se ligar a outros monômeros,
originando oligômeros (HASLAM, 1989)
A terceira via ocorre num grupo muito restrito de plantas, corresponde a uma
variante metabólica em que a D-glicopiranose tem uma conformação em cadeira pouco
estável, com substituintes em posição axial. Os grupos HHDF resultam do acoplamento
oxidativo de resíduos galoil adjacentes. Estes compostos podem condensar, por ligações
intermoleculares C-O-C, resultando os oligômeros (HASLAM, 1989)
Taninos condensados
São sintetizados pela via mista do chiquimato-acetato/malonato; a fenilalanina é
transformada em ácido trans-cinâmico, e este, posteriormente hidroxilado à ácido p-
cumárico. A subsequente condensação com três unidades de malonil-coenzima A
conduz à formação de uma chalcona, que, ao ciclizar, origina uma flavona. Por α ou β-
hidroxilação no C3 da flavona sintetizada formam-se os 2,3-di-hidro-3-flavonóis, que
por ação de uma enzima mediada pela NADPH são reduzidos a 3,4-flavonodiois.
Posteriormente estes compostos podem ser reduzidos a 3-flavonóis, através de uma
reação catalisada pela 3,4-flavonodiol redutase (SCHOFIELD, 2001).
A reatividade dos 3,4-flavonodióis promove a condensação entre si ou com os 3-
flavonóis. Este processo conduz a formação de oligômeros ou de polímeros designados
por proantocianidinas (SCHOFIELD, 2001).
1.4 - Propriedades biológicas e farmacológicas
As aplicações terapêuticas dos taninos estão relacionadas, principalmente, a três
propriedades destes metabolitos: complexação com íons metálicos, atividade
antioxidante e sequestradora de radicais livres e habilidade de se complexar com
macromoléculas como proteínas e polissacarídeos (SIMÕES et al, 2001).
Os taninos são usados no tratamento de diarreias, como diuréticos, em
problemas estomacais e também como anti-inflamatórios antissépticos e hemostáticos.
Visto terem a propriedade de precipitar alcaloides e metais pesados, podem ser
empregadas como antídotos no envenenamento com estes compostos (BRUNNETON,
1991).
27
Supõe-se que os taninos atuem segundo mecanismos relacionados, pelo menos
em parte, com as características comuns aos taninos hidrolisáveis e condensados:
atividade antioxidante e sequestradora de radicais livres e capacidade de complexar
macromoléculas de natureza proteica e íons metálicos. Ensaios in vitro sugerem que
estes compostos intervêm na modulação de processos envolvidos na divisão e
proliferação celular, na coagulação, inflamação e resposta imunológica (JEREZ et al.,
2007).
Por via externa, os taninos, através da complexação tanino-proteína,
impermeabilizam as camadas mais externas da pele e das mucosas. Desta forma limitam
a perda de fluídos e impedem as agressões externas, favorecendo a regeneração
tecidular e, consequentemente, a cura de feridas, queimaduras e inflamações. (CUNHA,
2009)
Várias doenças degenerativas como câncer, doença de Alzheimer e de
Parkinson, esclerose múltipla, arteriosclerose e o próprio processo de envelhecimento
estão associados a altas concentrações intercelulares de radicais livres. Estudos recentes
mostram que vários taninos atuam como captadores de radicais, os quais interceptam o
oxigênio ativo formando radicais estáveis (MELLO E SANTOS, 2001).
Ao precipitar proteínas, os taninos propiciam um efeito antimicrobiano e
antifúngico. Alem dessas atividades, os taninos também possuem ação antiviral e
moluscicida (BRUNNETON, 1991).
A atividade antimicrobiana dos taninos, já bem conhecida e documentada, tem
sido fundamentada em três hipóteses: modificação do metabolismo microbiano, por
ação dos taninos sob as membranas celulares de bactérias e fungos, inibição das
enzimas microbianas, complexação com íons essenciais ao metabolismo microbiano.
Uma série de bactérias são sensíveis aos taninos, dentre elas Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis e Shigella dysenteriae e, em
concentrações mínimas (0,5 g/L), o fungo Fomes annosus teve seu crescimento inibido
(CASTRO et al., 1999).
Provavelmente, devido à habilidade de ligar-se às proteínas e outras
macromoléculas, os taninos também apresentam atividades tóxicas. A rápida
mortalidade de insetos tratados com taninos condensados foi relatada, e parece ser
devido à atividade tóxica destes compostos e não pela inibição da digestibilidade
(AYRES et al., 1997)
28
Os taninos são considerados nutricionalmente indesejáveis porque precipitam
proteínas, inibem enzimas digestivas e afetam a utilização de vitaminas e minerais
podendo, ainda, em alta concentração, desenvolver câncer de bochecha e esôfago
(CHUNG E JOHNSON, 1998).
Moléculas de taninos estão sendo testadas, com a intenção de se descobrir uma
droga eficiente contra o HIV. Galotaninos demonstraram atividade inibitória somente
em concentrações tóxicas, elagitaninos e taninos condensados inibiram fracamente a
replicação viral e os taninos complexos mostraram potente atividade contra a replicação
do HIV. Concluiu-se que a atividade anti-HIV exibida por taninos é devida à inibição da
transcriptase reversa, dificultando assim a replicação viral (KILKUSKIE et al., 1992).
1.5 - Métodos para quantificação de taninos
O doseamento de taninos é um processo complexo, não só pela dificuldade na
extração completa desses compostos, como ainda pela falta de especificidade de alguns
métodos utilizados. Muitos autores indicam, como mais favoráveis, os métodos
baseados na propriedade dos taninos em precipitar proteína, mas são bastante utilizados
também métodos baseados na capacidade destes para complexação com metais, ou
ainda a combinação entre os dois tipos. Além destes, existem também os métodos
específicos para determinados tipos de taninos, tais como galotaninos, elagitaninos e
proantocianidinas (MONDAL et al., 2001)
1.5.1 – Métodos colorimétricos
Os métodos colorimétricos são os protocolos mais comuns sensíveis e baratos
utilizados para quantificação de taninos. Todo método tem sua limitação e a escolha
específica de uma metodologia muitas vezes é baseada nas facilidades estruturais
disponíveis e no número de amostras a serem avaliadas (FULEKI & FRANCIS 1968a e,
1968b).
Os métodos colorimétricos podem ser divididos em dois grupos básicos, aqueles
em que as reações ocorrem com grupos fenólicos gerais, envolvendo as reações de
oxidorredução ou formação de complexos com íons metálicos e aqueles em que as
reações ocorrem com um grupo funcional específico, devido a uma estrutura em
particular dos taninos (GIUSTI & WROSLTAD, 2000).
29
Folin-Ciocalteau e Azul da Prussia
Os métodos de Folin-Ciocalteau, Folin-Denis e Azul da Prussia quantificam
fenóis totais e se baseiam nas reações de oxirredução entre os compostos fenólicos e os
íons metálicos (SINGLETON et al., 1999)
Os métodos de doseamentos de polifenois baseados nas reações de oxirredução
tiveram início com a utilização do reagente fosfotungstico para quantificação de ácido
úrico na urina, sendo posteriormente modificado e denominado reagente de Folin-Denis
(FOLIN; DENIS, 1912).
O reagente de Folin-Ciocalteu, inicialmente denominado reagente de fenol
modificado, difere do reagente de Folin-Denis pela presença de sulfato de lítio,
adicionado para evitar a formação de precipitados (SCALBERT, 1992)
A quantificação dos compostos fenólicos totais pela metodologia que emprega o
reagente de Folin-Ciocalteu baseia-se na redução dos ácidos fosfotungstico
(H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), presentes no reagente de Folin-Ciocalteu,
pelo íon fenolato, formado por adição do carbonato de sódio, presentes na amostra a
óxido de tungstênio (W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23) em meio alcalino. Estes
óxidos formados apresentam coloração azulada, sendo possível a quantificação da
absorbância da solução na região do visível (760nm). Através de uma curva de
calibração construída utilizando-se padrão para taninos é possível correlacionar a
intensidade da cor à concentração de fenóis presentes na amostra, sendo o resultado
expresso em equivalente do padrão utilizado (FOLIN; DENIS, 1912).
H3PW12O40 + H3Mo12O40 + FENOL → W3O23 + Mo3O23
Reação de quantificação de fenólicos totais por reagente de Folin-Ciocalteu
Inicialmente faz-se a determinação de todos os compostos fenólicos presentes,
para depois, após remoção dos taninos do extrato através da precipitação destes por
proteínas, se avaliar, por diferença, o grau de redução correspondente apenas aos
taninos totais (COSTA,1994; BRUNNETON, 2001; SCALBERT, 1992)
Entretanto, o reagente de Folin-Ciocalteu não é específico para grupos fenólicos
sofrendo interferências de outras substâncias redutoras presentes na amostra, tais como
ácido ascórbico e açúcares redutores, superestimando os valores (APPEL et al., 2001).
30
Em função destes interferentes, foi proposta uma modificação na metodologia, onde se
insere uma etapa de extração em fase sólida (SPE) em coluna, capaz de reter os
compostos fenólicos. Por esta metodologia é possível quantificar os fenólicos totais e
eliminar outros interferentes (GEORGÉ et al., 2005)
O método chamado de azul da Prússia é recomendado para análise de fenóis em
uma grande variedade de substratos, pois é menos susceptível à interferência de
proteínas que o método de Folin-Ciocalteu. A base química da metodologia é a redução,
pelos grupos hidroxi-fenólicos, de íons Fe+3 a Fe+2, que formam complexos com
ferrocianeto, produzindo pigmentos de coloração azul que podem ser posteriormente
quantificados através de espectrofotometria. O padrão utilizado para o Azul da Prússia
é, geralmente, o ácido tânico. Essa metodologia apresenta uma série de vantagens em
relação ao método de Folin-Cicalteau, como, por exemplo: rapidez, simplicidade,
sensibilidade e preço baixo. Sua desvantagem, assim como o método de Folin-
Cicalteau, é a inespecificidade para taninos se utilizado isoladamente (GRAHAM,
1992).
Os métodos acima mencionados são baseados na oxidação dos polifenóis por
reações de oxidação-redução. As interferências verificadas pelo método de Folin-
Ciocalteu são superiores ao do método do Azul da Prússia, já que os compostos não
fenólicos, ascorbatos e sulfitos são substâncias potencialmente interferentes na
determinação pelo método de Folin-Ciocalteu (SINGLETON, ORTHOFER E
LAMUELA-RAVENTOS, 1999).
Método de Stevanato
A metodologia desenvolvida por Stevanato et al. (2004) para a determinação do
teor de polifenóis totais baseia-se novamente em reações de oxidação dos fenóis
catalisadas pela enzima peroxidase. Os radicais fenoxila formados reagem com
substratos aromáticos, sendo então quantificados em A500 pelos teores de quinona-
imina coloridas formadas. Quando comparado com o método de Folin-Ciocalteau,
verificou-se ser mais rápido e específico, já que não reage com interferentes comuns,
como sulfitos, ascorbatos e citratos.
No entanto, as reações redox envolvidas no método de Stevanato et al. (2004),
nem sempre são reações quantitativas, devido às reações serem reversíveis. Uma outra
desvantagem é que a reação ocorre com maior ou menor intensidade, consoante o grau
31
de substituições hidroxilas e a sua respectiva posição nos anéis dos flavan-3-ol.
Ressaltando também que os grupos hidroxilo na posição meta do anel A não estão
envolvidas nestas reações.
Apesar de o método referido, ter sido descrito apenas para doseamento de fenóis
totais, este pode vir a ser adaptado e associado a precipitação com caseína, e deste modo
aplicado a quantificação de taninos através da diferença entre fenóis totais e residuais,
assim como ocorre no método de Folin-Ciocalteau.
Método da Vanilina e do Butanol-HCl
O método da Vanilina e do Butanol-HCL detectam grupos funcionais
específicos dos taninos, os quais exploram as diferenças estruturais que ocorrem na
molécula (MONTEIRO et al., 2005).
O método da vanilina é específico para flavan-3-óis, dihidrochalconas e
proantocianidinas. Este método baseia-se na formação do radical vanilina em meio
ácido, que se liga ao anel meta substituído por grupos hidroxilo pelos carbonos 6 ou 8
do anel A, formando um cromóforo vermelho capaz de absorver luz a 500nm. Apesar de
não ser específico, o método da vanilina em metanol é mais sensível às
proantocianidinas do que aos flavan-3-óis e, portanto, muito utilizado para detecção e
quantificação dos taninos condensados. Utiliza-se para este método, a catequina como
padrão (NACZK & SHAHIDI, 2004).
Figura 4 - Reação da vanilina com 3-flavanol monomérico
.
32
O sucesso deste ensaio depende do tipo do solvente usado, da concentração e
natureza do ácido, do tempo da reação, temperatura e concentração da vanilina. O maior
problema para o método vanilina parece ser a reatividade de subunidades de polímeros
de taninos, o que caracteriza a falta de especificidade e superestimação do conteúdo
para taninos condensados. A raiz das dificuldades analíticas está na complexidade e
variabilidade das estruturas dos taninos condensados, além de ser um método laborioso
e de alto custo (SCHOFIELD, 2001).
O Butanol-HCl é específico para proantocianidina. Este é considerado o melhor
método para determinação de taninos condensados. Através dessa metodologia
subunidades do polímero tanino condensado são oxidadas para produzir antocianidinas
cromóforas(clivagem oxidativa) que assumem uma coloração vermelha com máximos
de absorção em torno de 550 nm (PORTER, HRSTICH E CHAN, 1986)
Utiliza-se como padrão o tanino purificado. A principal vantagem dessa
metodologia é que é específica para taninos condensados, enquanto que as desvantagens
são: método laborioso, custo e dificuldade em se obter o padrão, uma vez que o tanino
purificado não é comercializável, o laboratório terá que purificar seu próprio tanino para
utilizá-lo como padrão, Salienta-se que a purificação do tanino é um processo muito
difícil, uma vez que os extratos, além de conter taninos, possuem proteínas complexadas
com taninos e outros compostos (SCALBERT, 1992).
Além disso, a transformação da proantocianidinas em antocianidinas não é
completa, porque o rendimento de antocianidinas coloridas depende tanto da estrutura
como do grau de polimerização das mesmas. Outro problema é que, reações colaterais
são comuns durante a reação, o que leva à formação de polímeros vermelho-
acastanhado absorvendo a cerca de 450 nm, resultando em um erro de estimativa. E por
último, é influenciado por variações no teor de água e metal da amostra (SCALBERT,
1992).
Método do KIO3, Rodanina e NaNO2
O procedimento descrito por Bate- Smith (1977) para determinação de taninos
hidrolisáveis em plantas da espécie Aces, o qual produz uma cor rosa após a reação com
KIO3, foi posteriormente analisado por Hagerman et al. (1997), que notou que esta
análise não seria compatível com misturas complexas de taninos, já que estes tendem a
33
adquirir uma coloração marrom frente a cor rosa. Além disso, esta análise não é
considerada confiável, pois o desenvolvimento da cor é criticamente dependente da
temperatura e do tempo de reação. Tal metodologia de análise foi re-examinada por
Wilis e Alen (1998) que sugeriram um aperfeiçomento do protocolo para determinação
de galotanino e elagitanino, recomendaram a investigação de um tempo ótimo de
reação (dependendo de cada espécie estudada) não sendo necessário o resfriamento das
amostras para o teste, como se acreditava.
O método descrito por Inoue e Hagerman (1988) para determinação de
galotaninos, envolve a formação de um complexo entre rodanina e o ácido gálico,
liberado após uma etapa de hidrólise ácida do tanino. O complexo, que possui
absorbância máxima a 520 nm, resulta da reação da rodanina com os grupos hidroxil
vicinais do ácido gálico. As moléculas de rodanina que não reagiram, não apresentam
em solução básica absorbâncias em comprimentos de onda superiores a 450 nm. A
rodanina apresenta baixa ou nenhuma afinidade pelos grupos hidroxil de radicais galoil
presentes na estrutura dos taninos e também pode reagir, em soluções alcalinas, com
quinonas ou hidroquinonas, sendo que os produtos destas reações absorvem em
comprimentos de onda maiores (THIES E FISCHER, 1973). Desta forma, este método é
muito útil para análises rotineiras, pois apresenta alta especificidade (sem interferência
dos compostos vegetais fenólicos), sensibilidade e precisão.
A análise com o reagente NaNO2 que foi primeiramente descrido por Bate-Smith
para determinação de elagitaninos, foi posteriormente aperfeiçoada por Hagerman e
Wilson (1990), tornou-se seletiva somente para determinação do ácido elágico de forma
que o ácido gálico, galotaninos, elagitaninos, taninos condensados e flavonóides não
iram mais interferir na quantificação.
Uma das limitações dos métodos colorimétricos é a obtenção de substâncias
adequadas para serem utilizadas como padrão. Se a capacidade da substancia utilizada
como padrão não é precisamente a mesma do extrato analisado, a concentração
calculada a partir da curva padrão não refletirá, obviamente, o teor de fenóis da amostra,
ou seja, os padrões normalmente não fornecem o mesmo espectro de absorção dos
taninos purificados (APPEL, et al., 2001). Além disso, os métodos colorimétricos são
geralmente demorados, empregam produtos químicos que exigem condições especiais
de manipulação e, sobretudo, falta de especificidade, portanto eles só são apropriados
para análise de amostras purificadas (HERDERICH E SMITH, 2005).
34
1.5.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas
O início dos estudos sobre complexação de polifenóis com proteínas é bastante
antigo, sendo um dos primeiros relatos realizado por Day em 1803 (HASLAM et al.,
1989). Os complexos formados entre taninos e proteínas podem ser reversíveis ou
irreversíveis. Quando são estabelecidos por ligações de hidrogênio ou interações
hidrofóbicas, formam um coplexo reversível, enquanto que os irreversíveis implicam
em reações de oxidação, via formação de ligações covalentes (LUCK et al., 1994).
Os processos de complexação e precipitação de taninos e proteínas são tidos
como específicos e estão relacionados com a estrutura de ambos. Algumas
características, tanto dos taninos quanto das proteínas, são importantes para a formação
do complexo.
A estrutura molecular das proteínas se apresenta como um dos fatores mais
relevantes na formação do complexo. Estruturas mais abertas e flexíveis têm maior
afinidade pelos taninos, por outro lado, proteínas globulares, possuem menor afinidade
pelos compostos fenólicos (HAGERMAN; BUTLER, 1981). A afinidade das proteínas
por taninos é maior no ponto isoelétrico da proteína e quando estas são ricas em
prolina, este ultimo se explica pelo fato de que os peptídeos que contém prolina
apresentam o nitrogênio adjacente a carbonila substituído porum grupamento alquila,
favorecendo a ligação tanino-proteína (HASLAM et al., 1989). Outro fator importante
para a formação do complexo é o grau de glicosilação da proteína, as não-glicosiladas
apresentam menor afinidade por taninos que as com alto grau de glicosilação (FICKEL
et al., 1999).
Em contrapartida, a estrutura e propriedades dos taninos também são
determinantes na formação de complexos e na precipitação desses. Nesse sentido o
tamanho da molécula, a flexibilidade conformacional, a solubilidade em água e a
posição dos grupos periféricos na estrutura dos taninos devem ser considerados
(FREITAS; MATEUS, 2001; KAWAMOTO et al., 1996; HASLAM et al., 1989).
Moléculas de taninos maiores, porém não tão grandes que não possam se
intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas, são mais eficazes na formação
de complexos (FREITAS; MATEUS, 2001). Quando existe um impedimento
conformacional no polifenol, a capacidade de complexação é drasticamente reduzida
(HASLAM et al., 1989).
35
Com relação a solubilidade em água do polifenol, esta está em relação inversa
com o grau de complexação. Normalmente, baixas solubilidades favorecem uma
complexação mais forte (LUCK et al., 1994).
A combinação dessas peculiaridades, referentes tanto ás proteínas quanto aos
taninos, explica a falta de especificidade no comportamento de taninos diferentes, ou de
diferentes extratos vegetais, frente a um mesmo substrato proteico (FREITAS;
MATEUS, 2001).
Método da Difusão Radial
O método da difusão radial desenvoldido por Hagerman (1987) tem como
fundamento a propriedade que os taninos possuem de se complexar com as proteínas.
Nesta metodologia a Albumina Sérica Bovina é incorporada a um gel de Ágar no qual
são perfurados poços onde são colocadas as amostras contendo taninos. Imediatamente
após a introdução, a amostra começa a difundir-se pelo gel incorporado de proteína, esta
em contato com o tanino precipita, formando um disco claramente visível. O diâmetro
do disco formado é diretamente proporcional à quantidade de tanino colocada no poço
(HAGERMAN, 1987)
A metodologia se mostra bastante simples e rápida, muito útil para análises em
que uma grande quantidade de amostras é testada. Contudo deve ser utilizada com
cautela, pois apresenta diferentes sensibilidades aos diferentes tipos de taninos, sendo
desta maneira, melhor recomendada para estudos que visam medir o potencial biológico
da amostra em teste e não o valor absoluto de taninos na amostra (HAGERMAN;
BUTLER, 1989).
1.5.3 Métodos Cromatográficos
As separações cromatográficas em gel, papel e camada delgada, têm sido
bastante utilizadas (SHAHIDI & NAZCK, 1995), porém, atualmente, a cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) é a técnica mais utilizada para a identificação e
quantificação de compostos fenólicos.
A cromatografia líquida de alta eficiência trouxe avanços significativos na
análise de produtos naturais. A utilização de colunas com superfície apolar (fase
36
reversa) permitiu a identificação e quantificação de substâncias polares, pouco voláteis e
termolábeis (SADECK, 2000).
As técnicas analíticas por CLAE encontram emprego na identificação e
quantificação de estruturas monoméricas dos taninos, como ácido gálico, ácidoelágico,
catequina e pirogalol; ou estruturas com até 7-8 unidades flavônicas dos taninos
condensados (HARVEY, 2001). HPLC em fase reversa permite separar somente
proantocianidinas de baixo peso molecular, enquanto olígomeros e polímeros são co-
eluídos como um largo pico sem resolução (RIGAUD et al., 1993).
Esta técnica tem sido modificada quer seja na etapa de preparo da amostra ou
extração dos compostos, quer seja na fase móvel e ou estacionária, para uma melhor
separação dos compostos. A identificação propriamente dita é dificultada devido à
grande variabilidade de compostos fenólicos possíveis na natureza, sendo realizada com
segurança porespectrometria de massas acoplada à cromatografia líquida (CLAE-MS)
(NACZK & SHAHIDI, 2004).
1.5.4 Outras Metodologias
O índice de gelatina proposto por Glories, (1984) onde os taninos são
classificados pela sua tendência para precipitarem com gelatina, apresenta falta de
reprodutibilidade, devido a variabilidade na composição e pureza da gelatina.
A metodologia de Adams-Harbertson para a quantificação de taninos - método
BSA - é uma modificação do método de Hagerman e Butler, (1978). O precipitado
tanino-proteína formando pela adição de albumina de soro bovino (BSA), volta a ser
solubilizado e quantificado indiretamente, pela adição de FeCl3 e medição da
absorvância a 510 nm.
A medição da inibição da enzima fosfatasse alcalina pela sua interação com
taninos é outro método indireto. Apresenta como desvantagens detectar somente taninos
com mais de três subunidades flavan-3-ol e as características físico-químicas do
precipitado formado não serem bem conhecidas (ITTAH, 1991; ADAMS E
HARBERTSON, 1999).
Com o objetivo de contornar as desvantagens dos métodos que utilizam
proteinas, Sarneckis et al. (2006), desenvolveram um método de precipitação por
polímeros não proteicos, baseado no método de Montedoro e Fantozzi, (1974).
37
O método baseia-se na precipitação de taninos por metil-celulose (método MCP)
e a sua determinação é feita pela subtracção da absorvância a 280 nm dos compostos
fenólicos antes e após a precipitação dos taninos. Apresenta como vantagem não sofrer
interferência de outros compostos fenólicos que absorvem a 280 nm, como as
antocianinas e catequinas.
A carência de métodos analíticos práticos, rápidos e seguros para a quantificação
de taninos e ainda metodologias que sejam capazes de discriminá-los torna necessária a
busca por técnicas ou instrumentos de medidas e alternativas mais eficientes.
38
Capítulo II
39
Otimização do processo extrativo de taninos e quantificação por difusão radial de
Cedrela odorara L., uma planta medicinal da Caatinga
1 - MATERIAL E MÉTODO
1.1 Material Botânico
Para realização do estudo de otimização foi escolhida as cascas do caule da
planta Cedrela odorata L.(Cedro).
O material vegetal foi coletado, em novembro de 2011, em uma área de
vegetação nativa. Cada amostra foi coletada de pelo menos 5 indivíduos diferentes.
Todo o material foi pulverizado em moinho de facas e padronizado com auxílio de um
tamiz de 20 Mesh.
As amostras de cascas do caule de Cedrela odorata L. foram coletadas na região
do Carão, zona rural do município de Altinho, situado no Agreste Pernambucano a 161,
8 km da cidade de Recife, com área de aproximadamente 454,5 Km2. O clima é
Tropical Chuvoso com verão seco, com temperatura anual média de 24.5°C e vegetação
classificada como Caatinga Subcaducifólia e Caducifólia (CONDEPE/FIDEM, 2008).
1.2 Doseamento de taninos através do método de difusão radial
Utilizou-se como base o método de difusão radial segundo Hagerman (1987).
Uma solução de 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico foi preparada,
sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio (CABRAL et al. 2010),
pois este é o pH ótimo para o tipo de interação tanino-proteína (LÓPEZ et al., 2004).
O gel foi preparado utilizando agarose (tipo I) (Sigma-Aldrich) 1% na solução
descrita previamente. A mistura foi aquecida sob homogeinização até entrar em
ebulição para a completa dissolução da agarose, sendo adicionada posteriormente
albumina sérica bovina (BSA) fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich) na
concentração de 0,1%, após o resfriamento da dispersão até a temperatura de 45°C.
Alíquotas de 10,0 mL desta dispersão foram distribuídas em placas de Petri com
9.,0 cm de diâmetro e deixadas em bancada que foi nivelada com auxílio de um
nivelador digital (Insize), para se obter camadas uniformes de gel até solidificação total.
40
Utilizando um perfurador de 5 mm de diâmetro foram feitos poços, distando 2,0 cm um
do outro e das bordas das placas, com capacidade para aproximadamente 32 μL. Com o
auxílio de micropipeta, uma alíquota de 24 μL de cada extrato foi aplicada aos poços.
Todas as amostras foram processadas em triplicatas autênticas. Para a obtenção
da curva padrão preparou-se uma solução aquosa de ácido tânico com concentração de
25 mg/mL. Alíquotas de 2, 4, 8, 12, 16 e 20 μL foram colocadas nos poços em
triplicata. O ensaio descrito se baseia na propriedade que os taninos possuem de
formarem complexos estáveis e insolúveis com proteínas, formando um anel claramente
visível cuja área é linearmente proporcional a quantidade de tanino que foi colocada no
poço.
As placas foram escaneadas e utilizou-se o programa Corel Draw© X3 Versão
13 para mensurar os diâmetros dos anéis. Ao redor de cada anel foi desenhado um
círculo, utilizando o modelo do programa, sendo registrados dois diâmetros
perpendiculares, obtendo-se uma média do diâmetro de cada anel. De acordo com
Hagerman (1987) para facilitar os cálculos utiliza-se, ao invés das áreas, os quadrados
das médias dos diâmetros obtidos. As leituras dos anéis da curva padrão foram plotadas
num gráfico de dispersão para obtenção da equação da reta por meio de regressão linear
com o auxílio do software Excel versão 2003 (CABRAL et al. 2010).
1.3 Modificações realizadas no método de difusão radial para otimização
Na metodologia original desenvolvida por Hagerman (1987), o material vegetal
deve ser extraído durante uma hora a temperatura ambiente utilizando metanol:água
50% (v/v), numa razão planta:solvente de 200mg por ml. As modificações propostas
para otimização da extração foram feitas de acordo com:
Tipo de extração: Além da maceração durante uma hora realizada no método
original, foram também realizadas maceração durante 2h e extração durante 30
minutos em aparelho de ultrassom com aquecimento a 60ºC.
Solvente: além do Metanol na proporção 50% (v/v), foram também utilizados
Metanol 80% (v/v), Etanol 50% (v/v), Etanol 80% (v/v), Acetona 50% (v/v) e
Acetona 70% (v/v).
41
Massa vegetal: foram utilizadas massas de 200mg como descrito na metodologia
original e de 100mg com a mesma proporção de solvente.
1.4 Análise estatística
Foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov para avaliar a normalidade dos dados.
Os dados foram expressos como médias ± desvio-padrão. Foram realizadas análises de
variância ANOVA: one way seguido de comparações múltiplas pelo teste de Tukey. As
diferenças foram consideradas significativas ao nível de p<0,05. O programa BioEstat
5.0 foi utilizado para realização das análises estatísticas (PIMENTEL, BARROS NETO,
2002).
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A planta Cedrela odorata L. foi escolhida por ter apresentado um baixo teor de
taninos em estudos anteriores (SIQUEIRA, 2011), sendo qualquer melhora mais
facilmente detectada e representativa. As cascas do caule foram utilizadas para o estudo,
pois a disponibilidade desta parte do vegetal é independente de fatores climáticos. Nas
condições testadas os teores de taninos para Cedrela odorata L. variaram de 0,63% a
3,58% sendo considerada uma variação significativa. Com relação aos solventes
testados a análise dos dados (Tabela 1) evidenciou que a acetona 50% obteve resultado,
em teores absolutos, superior aos outros solventes utilizados, em todas as condições
testadas. Para confirmação, os dados foram analisados estatísticamente, obtendo-se que
a acetona 50% é superior e estatisticamente diferente (p<0.05) quando comparada com
etanol 50 e 80 % e metanol 50% e 80%, exceto quando estes solventes são utilizados em
conjunto com o aparelho de ultrassom. Foram obtidos também resultados com diferença
não estatística, em algumas condições testadas, quando comparado com acetona 70%.
42
TABELA 1 - Análise de variância para comparação do potencial de extração dos solventes
utilizados
Solvente 100mg (1h) 100mg (2h) 200mg (1h) 200mg (2h) 100mg (UTS 30’) 200mg (UTS 30’)
Acetona 50% 2,00 a 2,16 a 2,99 a 2,94 a 3,58 a 3,39 a
Acetona 70% 1,53 b 1,76 b 2,50 a 2,86 a 2,93 ab 3,27 a
Etanol 50% 1,39 c 1,36 c 1,48 b 1,59 b 2,20 bc 2,79 ab
Etanol 80% 0,63 d 0,81 d 0,92 b 1,05 c 1,43 c 1,88 c
Metanol 50% 1,23 e 1,52 bc 1,49 b 1,55 b 2,54 b 2,03 b
Metanol 80% 0,91 f 1,21 c 1,40 b 1,50 b 2,10 bc 2,50 ab
a,b,c,d,d,e,f: Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si
(p<0,05);
Acredita-se que, a aproximação dos valores de teores de taninos encontrada
quando da utilização de metanol 80% e etanol 50% aos da acetona 50%, quando estes
são utilizados em conjunto com aparelho de ultrassom e 200mg de massa vegetal, deve-
se a saturação do solvente, devido ao método de extração por ultrassom se mostrar mais
eficiente que a maceração. Analisando-se apenas a extração com metanol 50%,
verificou-se que com a massa de 100 mg de vegetal, o método de extração por ultrassom
a 60ºC é mais eficiente que maceração à temperatura ambiente, tanto para o tempo 1
hora quanto 2 horas. A análise de variância confirma esta afirmação apresentando um
p< 0,05. Para comparação entre os métodos de extração, o mesmo resultado foi
demonstrado para acetona 50% que, como descrito previamente, apresentou os maiores
teores. Convém salientar que a diferença estatística quando da comparação entre
métodos de extração tanto para a acetona 50% quanto para o metanol 50% foi
encontrada apenas com a utilização de 100mg. Quando da utilização de 200 mg esta
diferença não foi estatística, fato este atribuído a saturação mais rápida do solvente por
ser utilizada uma maior quantidade de massa vegetal, conseguindo a maceração, com
um maior tempo de extração equivaler a extração por ultrassom.
A acetona 50-70% também foi indicada como melhor solvente para extração de
taninos em estudo realizado por Agostini-Costa, Lima e Lima. (2003). Nele foram
comparadas extrações em pedúnculo de cajú por diversos solventes: metanol puro, HCl
1%, metanol 50%, etanol 50%, etanol 70%, água destilada, acetona 50% e acetona 70%
para emprego dos extratos em diferentes metodologias para quantificação de taninos. Os
43
resultados obtidos com acetona 50 e 70% se mostraram superiores em relação aos
demais solventes e semelhantes entre si.
Resultados semelhantes foram obtidos por Queiroz e colaboradores (2002), que
comparou a extração de taninos da Astronium urundeuva entre acetona 70% e metanol
80%, para doseamento por diferentes metodologias. Foi demonstrado que a Acetona
70% aumenta em 3,7% o rendimento da extração quando comparado ao metanol 80%.
Na tabela 1 pode-se também observar que, comparando-se o mesmo solvente
com diferentes teores de água os resultados tem uma relação diretamente proporcional
ao aumento do teor de água. O mesmo foi constatado em estudo realizado por Ardisson
e colaboradores (2002) onde foram comparados os teores de taninos em extratos
glicólicos que diferiam entre si apenas pelo teor de água. Foi observado que o extrato
PGL 70 se apresentou mais rico em taninos quando comparado com o PGL 80 e 90, tal
fato foi atribuído à acidez dos taninos, que justificaria sua afinidade por solventes com
maior proporção de água.
Os bons resultados provenientes da extração pela metodologia de ultrassom se
devem, provavelmente, as peculiaridades deste método, que utiliza a energia das ondas
sonoras geradas em frequência superior à capacidade auditiva do ser humano. Estas
ondas criam uma variação de pressão do líquido empregado no processo, gerando
cavitação. A utilização de ondas ultra-sônicas de alta frequência, causa mudanças físicas
e químicas permanentes por conduzirem cavitação e microfluxos nos líquidos,
aquecimento e ruptura nos sólidos (BERLAN et al., 1992)
A eficiência desta técnica de extração é citada como sendo igual ou melhor do
que a obtida com o extrator Soxhlet, apresentando as vantagens de alta
reprodutibilidade, possibilidade de utilização para uma ampla gama de tamanhos de
amostras, rapidez de processamento e baixo custo (SARGENTI et al., 2000)
O aumento do teor de taninos quando extraídos por esta metodologia pode ser
explicado por 3 fatores: O aumento da permeabilidade da parede celular vegetal,
permitindo deste modo uma maior liberação dos taninos, a produção de cavitação, o que
resulta no aumento da superfície de contato entre a amostra e o solvente extrator e o
aumento da tensão mecânica das células, que por sua vez ficam mais permeáveis ao
solvente (LIST E SCHMIDT, 1989).
Resultados semelhantes com a utilização de ultrassom em comparação com a
técnica de maceração foram obtidos por Melecchi e colaboradores (2005). No presente
estudo foram empregadas comparativamente técnicas extrativas: Soxhlet, maceração,
44
ultrassom, líquido supercrítico, entre outros. para caracterização química de extratos de
Hibiscus tiliaceus L. e foi observado um rendimento superior das amostras extraídas a
partir do método de ultrassom em relação à maceração.
A comparação estatística entre os estudos realizados com diferentes massas, 100
e 200 mg revelou que para o metanol 50% há diferença estatística apenas para o tempo
de 1h de extração (Tabela 2). Com a acetona 50% essa diferença é também detectada
com o tempo de 2h de extração (Tabela 3). Tal fato não é observado quando da
utilização do ultrassom em nenhum dos solventes.
TABELA 2. Comparação entre massas para valores fixos de tempo e mesmo tipo de extração utilizando metanol 50%
Condição Valor de p Valor de F
Cedro 100mg (1h) x Cedro
200mg (1h)
< 0,05
16.0891
Cedro 100mg (2h) x Cedro
200mg (2h)
> 0,05
0.0926
Cedro 100mg (ultrassom
30’) x Cedro 200mg
(ultrassom 30’)
> 0,05
1.5199
TABELA 3. Comparação entre massas para valores fixos de tempo e mesmo tipo de
extração utilizando acetona 50%
Condição Valor de p Valor de F
Cedro 100mg (1h) x Cedro
200mg (1h)
< 0,05
22.4233
Cedro 100mg (2h) x Cedro
200mg (2h)
< 0,05
32.9424
Cedro 100mg (ultrassom
30’) x Cedro 200mg
(ultrassom 30’)
> 0,05
0.3864
Estas diferenças podem ser explicadas pela saturação do solvente durante a
extração. Para o metanol 50%, utilizando-se uma maior quantidade de massa vegetal
(200 mg) haverá uma maior quantidade de taninos disponíveis, isto somado ao aumento
45
da superfície de contato entre o solvente e o material vegetal causa uma rápida saturação
do solvente. Com 1h de extração o extrato de 200 mg atinge o seu ponto de saturação,
contudo este tempo não é suficiente para o saturar o solvente com a massa de 100mg e é
observada uma diferença estatística entre eles (Tabela 2). Com 2h de extração o extrato
que utiliza 100mg de massa vegetal também atinge o ponto de saturação e ambos
passam a ser estatisticamente semelhantes.
Na utilização de acetona 50% com o tempo de duas horas de extração, esta
diferença continua a ser observada. Supõe-se que isto se deva ao maior poder extrativo
deste solvente, sendo necessária uma maior quantidade de compostos extraídos para que
haja saturação, isto é, o tempo de 2h de extração ainda não é suficiente para que o
sistema que utiliza 100mg de massa vegetal se iguale ao que utiliza 200mg, pois
supostamente, com uma menor massa vegetal, todos os compostos que haviam para ser
extraídos o foram, e esta quantidade não foi suficiente para saturação do solvente. Esta
diferença passa a não existir com a extração por ultrassom, pois o fenômeno da
cavitação torna a parede celular mais permeável e aumenta a quantidade de compostos
disponíveis para extração, com isso o extrato de 100mg consegue atingir o ponto de
saturação.
A afirmação acima pode ser confirmada pela comparação entre os tempos de
extração, tanto para acetona quanto para o metanol 50% só foi observada diferença
estatística entre 1 e 2h de extração quando a massa de 100mg foi utilizada (Tabelas 4 e
5).
TABELA 4. Comparação entre tempos para valores fixos de massa e mesmo tipo de extração com metanol 50%
Condição Valor de p Valor de F
Cedro 100mg (1h) x Cedro
100mg (2h)
< 0,05
13.5956
Cedro 200mg (1h) x Cedro
200mg (2h)
> 0,05
0.6403
46
TABELA 5. Comparação entre tempos para valores fixos de massa e mesmo tipo de
extração com acetona 50%
Reafirmando que, para o metanol 50%, com a utilização de 200mg o tempo para
se atingir a saturação do solvente é menor, 1h torna-se suficiente, para o extrato de
100mg não, e por isso o tempo de extração torna-se relevante. Já para acetona 50%,
devido ao seu maior poder extrativo, com 1h de extração utilizando-se 200mg,
consegue-se atingir o nível de saturação do solvente, já com a utilização de 100mg
ocorre o esgotamento dos compostos extraídos, não havendo saturação, mesmo com o
tempo de 2h de extração.
3.CONCLUSÃO
Os resultados apresentados nos permitem concluir que a utilização do aparelho
de ultrassom frente à maceração e a substituição do metanol 50%, originalmente
utilizado no método descrito por Hagerman (1987), pela acetona 50%, tornará os
resultados das quantificações de taninos feitas por Difusão Radial superiores, mais
precisos e confiáveis. O aparelho de ultrassom além de ser mais eficiente, reduz o
tempo e a massa vegetal necessária, e elimina as possíveis diferenças que podem vir a
ocorrer diante das variações das condições da extração por maceração (tempo de
extração, massa vegetal, etc.) somado isto ao fato de a acetona 50% ter se mostrado o
solvente com maior capacidade extrativa para taninos.
Condição Valor de p Valor de F
Cedro 100mg (1h) x Cedro
100mg (2h)
< 0,05
13.5956
Cedro 200mg (1h) x Cedro
200mg (2h)
> 0,05
0.5279
47
Capítulo III
48
Validação de metodologia analítica para determinação de taninos pelo método de
difusão radial
1. MATERIAL E MÉTODO
1.1 Reagentes e equipamentos
O solvente usado foi metanol (Vetec Química Fina, 99,8%). Os reagentes foram
ácido acético glacial (Merck, 99,8%), hidróxido de sódio (Vetec Química Fina, 99%),
ácido ascórbico 99,5% (Vetec Química Fina), agarose tipo I (Sigma-Aldrich) e
albumina sérica bovina fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich). Como padrão
para taninos foi utilizado ácido tânico 99,5% (Vetec Química Fina).
As pesagens foram realizadas em balança analítica Shimadzu AX200 e as
diluições com micropipetas monocanal de volume variável HTL Lab Solutions. A
bancada de vidro foi nivelada com inclinômetro Insize C7. As análises de pH foram
realizadas em pHmetro de bancada Tecnopon mPA210.
1.2 Preparação do gel
Foi preparada uma solução 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico,
sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio em pérolas pois este é o
pH ideal para a interação tanino-proteína (López et al., 2004). O gel foi preparado
utilizando agarose (1%, p/v) na solução descrita previamente. A mistura foi
homogeneizada sob aquecimento e, após o resfriamento a 45°C, foi adicionada
albumina sérica bovina (0,1%, p/v). Alíquotas de 10 mL do gel foram distribuídas em
placas de Petri (90 mm x 15 mm) nas quais foram feitos poços com o auxílio de um
perfurador de 5 mm de diâmetro. As amostras foram aplicadas nos poços com
micropipetas.
1.3 Procedimentos experimentais
Para avaliar a robustez e a recuperação do método, 100 mg da amostra seca e
pulverizada de cedro (Cedrela odorata L.), foram pesados e transferidos para tubos de
penicilina, sendo adicionado 1 mL de acetona 50% para extração durante 60 minutos.
49
Os extratos foram filtrados por aspirados. Deste filtrado, 24 µL foram aplicados nos
poços.
As placas contendo os halos com amostras vegetais e padrão ácido tânico foram
escaneadas e foi utilizado o programa Corel Draw© X3 Versão 13 para mensuração dos
diâmetros dos halos.
1.4 Parâmetros da validação
Para a linearidade foi usada a média de três intervalos com repetições autênticas,
que contemplavam seis concentrações da solução de ácido tânico 25 mg/mL (100 - 600
μg/poço) Após relação linear visual, os resultados foram analisados estatisticamente
para definir o coeficiente de determinação, a equação de regressão, o ajuste linear e o
desvio padrão relativo (Barros Neto et al., 2002; Brasil, 2003). Os limites de detecção e
quantificação foram estimados (em μg/poço) considerando o desvio padrão em razão ao
coeficiente angular (inclinação da reta) obtidos pela linearidade, nos quais foram
utilizadas as equações 1 e 2 para determinar o limite de detecção e quantificação,
respectivamente (Brasil, 2003).
LD = DPa × 3/IC (1)
LQ = DPa × 10/IC (2)
Onde o LD é o limite de detecção; LQ é o limite de quantificação; DPa é o desvio-
padrão relativo; IC é a inclinação de curva de calibração.
O parâmetro recuperação foi realizado com três amostras em triplicata e o
resultado foi obtido através da equação 3. Os fatores a serem considerados para analisar
a robustez foram: tempo de extração (60 e 120 minutos) e estabilidade de leitura (3 e 4
dias), o que está de acordo com o preconizado pela ANVISA (Brasil, 2003). Os
resultados foram avaliados mediante comparação através da análise de variância.
R(%) = CTE/CTNE × 100 (3)
50
Onde CTE compreende a concentração total de taninos extraídos (simulação do
processo extrativo) e CTNE é a concentração de taninos não extraídos. R (%) é a
recuperação obtida (Brasil, 2003).
Os ensaios de repetitividade e precisão intermediária foram determinados por
seis amostras de mesma concentração, executados no mesmo dia (intra-corrida), e em
dois dias consecutivos por analistas diferentes (inter-corrida) (Brasil, 2003). Os
resultados foram expressos como desvio padrão relativo (Equação 4). A exatidão foi
avaliada por três controles (em sextuplicata) de concentração baixa, média e alta. A
exatidão (Equação 5) foi calculada, individualmente para cada controle.
DPR(%) = DP/CMD × 100 (4)
E(%) = CME/CT × 100 (5)
Onde o DPR (%) é a precisão; DP é o desvio-padrão; CMD é a concentração média
determinada; E (%) é a exatidão; CME é a concentração média experimental; e CT é a
concentração teórica.
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método validado apresentou linearidade para as concentrações estudadas (100
a 600 µg/poço). A equação da regressão linear média obtida a partir de três curvas de
calibração foi y = 0,646x + 36,664, onde y é o diâmetro quadrado (mm2) e x a
concentração (µg/poço) em equivalentes de ácido tânico. Como mostrado na Figura 1,
o coeficiente de determinação obtido foi R² = 0,9965, comprovando a adequação do
método ao intervalo avaliado (Brasil, 2003). Os dados de precisão (DPR) e exatidão (E)
do intervalo do método são apresentados na Tabela 1.
51
FIGURA 1. Curva de calibração construída com padrão ácido tânico (100 a 600 µg/poço)
onde a equação linear média obtida foi y = 0,646x + 36,664 e R² = 0,9965.
TABELA 1. Resultados do teste de linearidade por difusão radial para taninos, utilizando-se
ácido tânico como padrão.
Concentração teórica
(µg/mL) C (n=3) DP DPR (%) E (%)
100 93,95 2,81 2,99% 93,95%
200 191,92 6,29 3,28% 95,96%
300 298,22 10,25 3,44% 99,41%
400 406,94 7,14 1,76% 101,74%
500 517,95 23,58 4,55% 103,59%
600 586,56 39,93 6,81% 97,76%
C = Concentração média (µg/poço) de três determinações; DP = Desvio-padrão; DPR
(%) = Desvio-Padrão Relativo (Precisão); E (%) = Exatidão.
Os valores dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) estimados pelas
equações 1 e 2, foram 8,32 e 27,72 µg/poço, respectivamente. Com esses resultados,
verificamos que o método possui alta sensibilidade para detectar e quantificar o padrão,
sem sofrer alteração de fatores intrínsecos do método.
52
A análise de variância ANOVA confirmou que o método proposto foi
considerado linear e indica que não há falta de ajuste (p<0,05) (Pimentel, Barros Neto,
2002), como pode ser visto na Tabela 2.
TABELA 2. Resultados da Análise de Variância (ANOVA) e teste de ajuste linear (p<0,05) do
parâmetro linearidade da validação.
ANOVA
Fonte SQ gL MQ F FCrítico
Modelo 540053,86 1 540053,86 1317,33 4,49
Residual 6559,38 16 409,96 Curva Linear
Falta de ajuste 1851,31 4 462,83 1,18 3,26
Erro puro 4708,07 12 392,34 Não há falta de ajuste
Total 546613,24 17 32153,72
SQ: soma de quadrados; gL:graus de liberdade; MQ: quadrado
médio; F: distribuição de Fisher-snedecor.
A recuperação que mede a eficiência do procedimento de extração do método
proposto foi 85,96% (Brasil, 2003). A análise de variância ANOVA confirmou que o
método proposto foi considerado robusto (p=0,095) (Pimentel, Barros Neto, 2002).
Os dados da repetitividade, precisão intermediária (intradia e interdia) e exatidão
do método encontram-se na Tabela 3.
TABELA 3. Resultados da repetitividade, precisão intermediária e exatidão do método de
quantificação de taninos por difusão radial.
Ensaio Concentração
teórica (µg/poço) C DP DPR (%) E (%)
Repetitividade 200,0 203,37 8,41 4,14 101,68
Precisão
intermediária
Analista 1 200,0 203,39 8,39 4,13 101,70
200,0 200,94 14,12 7,03 100,47
Analista 2 200,0 203,33 13,89 6,83 101,67
200,0 210,53 6,79 3,23 105,26
Exatidão
100,0 103,56 2,37 2,28 103,56
200,0 206,24 3,90 1,89 103,12
300,0 309,85 9,80 3,16 103,28
53
C = Concentração média (µg/poço) das n determinações; DP = Desvio-Padrão; DPR
(%) = Desvio-Padrão Relativo; E (%) = Exatidão.
Os ensaios de repetitividade (intradia) e precisão intermediária (interdia) estão
dentro dos parâmetros exigidos, com valores compreendidos entre 1,89 e 7,03%. Para o
ensaio de exatidão foram encontrados resultados entre 100,47 e 105,26%. A ANVISA
regulamenta que os resultados da exatidão não devem ser inferiores a 95% (Brasil,
2003). Estes dados confirmam que o método proposto encontra-se em conformidade
com a legislação vigente e apresenta confiabilidade dos resultados. O teste t de Student
apontou que não há diferenças estatísticas entre as concentrações determinadas e as
concentrações teóricas (µg/poço).
Esta metodologia vem sendo amplamente utilizada em laboratórios de estudos
de fitoterápicos, pois representa uma maneira simples e rápida de determinação do teor
de taninos de uma determinada espécie ou gênero (Melo et al., 2010)., em comparação
com outras metodologias já existentes, que geralmente são laboriosas, demoradas,
empregam produtos químicos que exigem condições especiais de manipulação e,
sobretudo, são inespecíficas.
A maior aplicabilidade do método de difusão radial encontra-se quando da
necessidade de análise de um grande número de amostras, requisitada principalmente
em estudos de triagem para seleção de plantas com potenciais atividades terapêuticas, e
os que visam comparação de determinadas condições a que a espécie vegetal está
submetida e como estas condições são refletidas no metabolismo secundário da planta
(Cabral et al., 2010; Siqueira et al., 2011).
3. CONCLUSÃO
O método proposto apresenta linearidade. A recuperação mostra que
aproximadamente 85% dos taninos presentes na amostra podem ser quantificados por
este método. Os resultados de precisão e exatidão obtidos atestam confiabilidade
necessária para o uso desta metodologia em laboratórios de controle de qualidade. O
método de quantificação por difusão radial mostrou-se preciso, exato e reprodutível,
aliado a acessibilidade e facilidade de execução.
54
Conclusão Geral
55
CONCLUSÃO
A quantificação de taninos através da metodologia de Difusão Radial se mostrou
bastante rápida, segura, econômica e muito útil em estudos onde uma grande quantidade
de amostras precisa ser analisada. Fato este devido a sua simplicidade quando
comparada as outras metodologias que na maioria das vezes são métodos laboriosos e
empregam reagentes específicos. Entretanto o método deve ser usado com cautela, não
sendo recomendada para determinação do valor do teor total de taninos e sim como uma
medida do potencial biológico destas moléculas.
Foi demonstrado neste trabalho que algumas alterações no processo de extração
da metodologia original, ocasionam a otimização deste método, uma vez que aumentam
sua sensibilidade, reduzindo o tempo e a quantidade de material vegetal empregado na
análise.
A substituição do metanol 50%, utilizado na metodologia original, pela acetona
50% acarretou em aumento do diâmetro dos discos em todas as condições testadas,
propondo um maior poder extrativo deste solvente nas condições testadas. A
combinação do emprego da acetona 50% com a utilização do ultrassom reduziu a
metade o tempo necessário para extração e quantidade de massa vegetal, eliminando as
divergências de resultados devido a não saturação dos solventes observadas com a
maceração.
Através do estudo de validação, o método foi considerado linear, preciso,
robusto e exato, uma vez que os valores encontrados para estes parâmetros estão dentro
do intervalo aceitável. O estabelecimento dos limites de detecção e quantificação
revelou um método bastante sensível.
Com os resultados obtidos no estudo de validação pode-se confirmar que o
método é ideal para o doseamento de taninos, podendo ser utilizado com segurança para
as aplicações analíticas. A validação do método, por sua vez, aumenta a credibilidade
nos resultados dos ensaios de quantificação por ele já realizados.
56
Perspectivas
57
PERSPECTIVAS
O doseamento de taninos através da difusão radial tem se mostrado um método
promissor, pois é simples rápido e eficiente. Contudo há a necessidade de
aprimoramento da técnica para obtenção de resultados padronizados e consequente
aumento da credibilidade destes.
A otimização do processo de extração e a validação do método foram um passo
importante para o alcance desse objetivo, uma vez que a utilização do ultrassom aliado à
pesquisa por um solvente com maior capacidade extratora para taninos minimiza as
disparidades nos resultados decorrentes de um processo extrativo ineficiente.
Por sua vez a validação do método é a prova documentada de que este satisfaz os
requisitos para as aplicações analíticas praticadas, essencial a qualquer metodologia.
Muito ainda pode ser feito, existem ainda várias etapas do método que podem
ser estudadas e melhoradas a fim de tornar a difusão radial uma ferramenta eficiente e
confiável para os laboratórios de análises.
58
Referências
59
REFERÊNCIAS
ADAMS, D. O., E HARBERTSON, J. F. Use of alkaline phosphatase for the analysis of
tannins in grapes and red wines. American Journal of Enology and Viticulture, v.50,
p.247–252, 1999.
AGOSTINI-COSTA, T.S.; LIMA A.; LIMA M. V. Determinação de tanino em
pedúnculo de caju: método da vanilina versus método do butanol ácido. Química Nova,
v.26, n.5, p. 763-765, 2003.
AGUILAR, C.N. GUITIÉRREZ-SÁNCHEZ, G. Review: sources, properties,
applications and potential uses of tannin acly hydrolase. Food Science and Technology
International, v.5, p.373-382, 2001.
APPEL, H.M.; GOVERNOR, H.L.; D’ASCENZO, M. SISKA, E.; SCHULTZ, J.C.
Limitations of folin assays of foliar phenolics in ecological studies. Journal of
Chemical Ecology, v.27, p.761-778, 2001.
ARDISSON, L.; GODOY, J. S., FERREIRA, L. A. M., STEHMANN, J. R.,
BRANDÃO, M. G. L. Preparação e caracterização de extratos glicólicos enriquecidos
em taninos a partir das cascas de Stryphnodendron adstringens (mart.) Coville
(Barbatimão). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.12, n.1, p. 27-34, 2002.
AYRES, M. P.; CLAUSEN, T. P.; MACLEAN, S. F.; REDMAN, A. M.;
REICHARDT, P.B. Diversity of structure and antiherbivore activity in condensed
tannins. Ecology, v.78, p.1696-1712, 1997.
BARROS C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, São Paulo, v.64, n.2,
p.175-177, jul./dez., 2002.
60
BARROS, F. M. C. Variabilidade sazonal, atividade amtimicrobiana,
fracionamento bio-guiado, isolamento e elucidação estrutural dos principais
constituintes do óleo essencial de Lippia Alba (MILL.) N. E. Brown. Santa Maria:
UFSM, 2008. 162p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2008.
BARROS NETO, B.; PIMENTEL, M. F.; ARAÚJO, M. C. U. Recomendações para
calibração em química analítica- Parte I. Fundamentos e calibração com um
componente (calibração univariada). Quim. Nova, v.25, n.5, p.856- 865, 2002.
BATE-SMITH, E.C. Astringent tannins of Acer species. Phytochemistry, v.16, p.
1421- 1426, 1977.
BERLAN, J.; TIMOTHY, J. M. Sonochemistry: form research laboratories to industrial
plants. Ultrasonic. v.30, n.4, p.203-212. 1992.
BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). R. E, nº 899 de 29 de
maio de 2003 – Guia para validação de métodos qualitativos e bioanalíticos.
BRUNETON, J. Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia. Ed. Acribia, SA:
Espanha, 1991.
BUTLER, L.G.; RIEDL, D.J.; LEBRYK, D.G.; BLYTT, H.J. Interaction of proteins
with sorghum tannin: mechanism, specificity and significance. Journal of American
Oil Chemistry Society, v.61, n.5, p.916-920, 1984.
CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM, E.L.C.;
ALBUQUERQUE, U.P. Relationship of biometric parameters on the concentration of
tannins in two medicinal plants – a case study. Boletín Latinoamericano y del Caribe
de Plantas Medicinales y Aromáticas, v.9, n.5, p.368-376, 2010.
61
CANNAS, A. Tannins: fascinating but sometimes dangerous molecules. Itaka, 1999.
Disponivel em: PESSINI, G. L. et al. Neolignanas e análise do oleo essencial das folhas
de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var pallescens (C. DC.) Yunck. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 15, n. 3, p. 199-204, jul/set 2005.
CASTRO, H. G.; CASALI, V. W. D.; BARBOSA, L. C. A.; CECON, P. R.
Rendimento de tanino em dois acessos de carqueja (Baccharis myriocephala ), em
diferentes épocas de colheita em viçosa-MG. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais, v.1, n.29, p. 1-6 1999.
CHUNG, K.; WEI, C.; JOHNSON, M.G. Are tannins a double-edged sword in biology
and healt. Trends in Food Science and Technology, v.9, n.4, p.168-175, 1998.
CLAESON, P.; BOHLIN, L. Some aspects of bioassay methods in natural-product
research aimed at drug lead discovery. Trends in Biotechnology. v. 15, n. 7, p. 245-
248, 1997.
CONDEPE/FIDEM - Agência Estadual de Planejamento e Pesquisas de Pernambuco,
2008. Disponível em:
<http://www.condepefidem.pe.gov.br/perfil_municipal/municipios.asp?cod=2>. Acesso
em: 26 de janeiro de 2012.
COSTA, A. F. Farmacognosia. 5. Ed. Lisboa: Calouste Gulbenkian, 1994, v. I.
CRAGG, G. M.; BOYD, M. R.; KHANNA, R.; KNELLER, R.; MAYS, T. D.;
MAZAN, K. D.; NEWMAN D. J.; SAUSVILLE E. A. International collaboration in
drug discovery and development: the NCL experience. Pure and Applied Chemistry,
v. 71, p. 1619-1633, 1999.
62
CUNHA, A. P. Farmacognosia e Fitoquímica. Ed. Fundação Calouste Gulbenkian:
Lisboa, 2009.
DESPHANDE, S.S. CHERYAN, M.SALUNKHE, D.K. Tannin analysis of foods
products. CRC Critical Reviews in Food Science & Nutrition, v.24, p. 401-449, 1986.
DESHPANDE, S.S., SALUNKHE, D.K. Interactions of tannic acid and catechin with
legume starches. Journal of Food Science, v.47, n.6, p.2080-2083, 1982.
EMANUELLI T, SCANDIUZZI M. Validação de processos na indústria farmacêutica.
In: Congresso de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos. 2000; Rio Grande do Sul:
Universidade do Rio Grande do Sul. Anais. 2000. p.57.
ESPIRES RC. Aspectos da metodologia analítica do metronidazol. São Paulo: USP,
1998. 136 p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998.
FICKEL, J.; PITRA, C.; JOEST, B. A.; HOFMANN, R. R. A novel method to evaluate
the relative tannin-binding capacities of salivary proteins. Comparative Biochemistry
and Physiology, v.122,p.225-229, 1999.
FOLIN, O.; DENIS, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color
reagents. The Journal of Biological Chemistry, v XII, p.239-243, 1912.
FREITAS, V. de. MATEUS, N. Structural features of procyanidin interactions with
salivary proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.738-743,
1981.
FULEKI, T. & FRANCIS, F.J. Quantitative methods for anthocyanins 1. Extraction and
determination of total anthocyanin in cranberries. Journal of Food Science, v.33, p. 72-
77, 1968.
63
FULEKI, T. & FRANCIS, F.J. Quantitative methods for anthocyanins 2.
Determination of total anthocyanin and degradation index for cranberry juice,
Journal of Food Science, v.33, p. 78-83, 1968.
GEORGÉ, S.; BRAT, P.; ALTER, P.; AMIOT, M.J. Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v.53, p.1370-1373, 2005.
GIUSTI, M. M. & WROLSTAD, R. E. Characterization and mesasurement of
anthocyanins by UV-visible spectroscopy. In WROLSTAD, R.E. (Ed.). Current
Protocols in Food Analytical Chemistry. New York: Wiley, 2001.
GLORIES, Y. La couleur des vins rouges, 2eme partie. Mesure, origine et
interpretation. Connaissance de la Vigne et du Vin , v.18, p.253–271, 1984.
GOBBO-NETO, L., LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no
conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, p. 374-381, 2007.
GRAHAM, H. D. Stabilization of the Prussian Blue color in the determination of
polyphenols. Journal of Agricuture Food Chemistry, v. 40, n. 5, p. 801-805, 1992.
GRUNDHÖFER, P.; NIEMETZ, R.; SCHILLING, G.; GROSS, G. G. Biosynthesis and
subcellular distribution of hydrolyzable tannins. Phytochemistry, v.57, p.915- 927,
2001.
HAGERMAN, A.E.; BUTLER, L.G. Choosing appropriate methods and standards for
assaying tannin. Journal of Chemical Ecology, v.15, p.1795-1810, 1989.
HAGERMAN, A., E BUTLER, L. Protein precipitation method for the quantitative
determination of tannins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.26, p.809–
812, 1978.
HAGERMAN, A. E.; BUTLER, L. G. The specificity of proanthocyanidin-protein
interaction. Journal of Biological Chemistry, v.256, p.4494-4497, 1981.
64
HAGERMAN, A.E. Radial difusion method for determining tannin in plant extrats.
Journal of Chemical Ecology, v.13, n.3, p.437-448, 1987
HAGERMAN, A.E.; ZHAO, Y.; JOHNSON, S. Methods for determination of
condensed and hydrolysable tannins. Antinutrients and phytochemicals in foods.
Washington, DC: F. Shahadi: American Chemical Society, v.12, p.12, 209, 1997.
HARVEY, I. M. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and
Technology, v.91, p.3-20, 2001.
HASLAM, E. Plant polyphenois-vegetable tannins revisited. Cambridge: Cambridge
University Press, 1989.
HEIL, M.; BAUMANN, B.; ANDARY, C.; LINSENMAIR, K.E.; MCKEY, D.
Extraction and quantification of “condensed tannins” as a measure of plant anti-
herbivore defence? Revisiting an old problem. Naturwissenschaften, v.89, p.519-524,
2002.
HERDERICH, M. J., E SMITH, P. A. Analysis of grape and wine tannins: Methods,
applications and challenges. Australian Journal of Grape and Wine Research , v.11,
p.205–214, 2005.
INOUE, K.H., HAGERMAN, A.E. Determination of gallotannin with rhodanine.
Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363-369; 1988.
ITTAH, Y. Titration of tannin via alkaline-phosphatase activity. Analytical
Biochemistry, v.192, p.277–280, 1991.
65
JEREZ, M., TOURINO, S., SINEIRO, J., TORRES, J. L., E NUNEZ, M. J.
Procyanidins from pine bark: Relationships between structure, composition and
antiradical activity. Food Chemistry, v.104, p. 518 –527, 2007.
KAWAMOTO, H.; NAKATSUBO, F.; MURAKAMI, K. Stoichiometric studies of
tannin co-precipitation. Phytochemistry, v.41, p.1427-1431, 1996.
KILKUSKIE, R. E.; KASHIWADA, Y.; NONAKA, G.; NISHIOKA, I.; BODNER, A.;
CHENG, Y.; LEE, K. HIV and reverse transcriptase inhibition by tannins. Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters, v.2, n.12, p.1529-1534, 1992.
LEWIS, N.G.; YAMAMOTO, E. Tannins: their place in plant metabolism. In:
HEMINGWAY, R.W.; KARCHESY, J.J (Ed) Chemistry and significance of condensed
tannins. New York: Plenum Press, 1989. P.23-46
LIST, P. H.; SCHMIDT, P. C. Phytopharmaceutical Technology. Boca Raton: CRC,
1989. 374 p.
LÓPEZ, J.; TEJADA, I.; VÁSQUEZ, C.; DE DIOS GARZA, J.; SHIMADA, A.
Condensed tannins in tropical fodder crops and their in vitro biological activity: Part 2.
Journal of the Science and Food Agriculture, v.84, p.295–299, 2004.
LUCK, G.; LIAO, H.; MURAY, N. J.; GRIMMER, H. R.; WARMINSKI, E. E.;
WILLIAMSON, M. P.; LILLEY, T. H.; HASLAM, E. Polyphenols, astringency and
proline-rich proteins. Phytochemistry, v.37, p.357-371, 1994.
66
MANGAN, J.L. Nutritional effects of tannins in animal feeds. Nutrition Research
Reviews, v.1, p.209-231, 1998.
MELECCHI, M.I.S. Caracterização química de extratos de Hibiscus tiliaceus L:
estudo comparativo de métodos de extração. Porto Alegre: UFRGS, 2005.197 p.
Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2005.
MELLO, J.P.C.; SANTOS, S.C. Taninos. In: Farmacognosia: da planta ao
medicamento ;Simões, C.M.O.; Schenckel, E.P. (Orgs.). Ed. UFSC: Porto Alegre; 3ª
ed., p. 527-554, 2001
MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALMEIDA E CASTRO, V.T.N.; CABRAL, D.L.V.;
RODRIGUES, M.D.; NASCIMENTO, S.C.; AMORIM, E.L.C.; ALBUQUERQUE,
U.P. Antiproliferative Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of
Semi-Arid Northeastern Brazil. Molecules, v.15, p.8534-8542, 2010.
MOLE, S.; ROGLER, J.C.; BUTLER, L. G. Growth reduction by dietary tannins:
different effects due to different tannins. Biochemical Systematics and Ecology, v.21,
p.667-677, 1993.
MONDAL, K.C.; BANERJEE, D.; JANA, M.; PATI, B.R. Colorimetric assay method
for determination of the tannin acyl hidrolase activity. Analytical Biochemistry, v.295,
p.168-171, 2001.
MONTEDORO, G., E FANTOZZI, P. Dosage des tannins dans les moûts et les vins à
l’aide de la methyl cellulose et evolution d’autres fractions phenoliques. Lebensmittel-
Wissenschaft und -Technologie , v.7, p.155–161, 1974.
67
MONTEIRO, J. M.; ALBUQUERQUE, U. P.; ARAÚJO, E. DE L.; AMORIM, E. L. C.
Taninos: uma abordagem da química à ecologia. Química Nova, v. 2, p. 892-896, 2005.
MUELLER-HARVEY, I. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and
Technology, v. 91, p. 3 - 20, 2001.
NBR ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de
Calibração e de Ensaios. 2001 ABNT. RJ. Brasil.
PASTEELNICK LA. Analytical methods validation. In: Berry IR, Nash RA.
Pharmaceutical process validation. New York: Marcel Dekker; 1993. p.411-28.
PECORA M. Validação de métodos analíticos. São Paulo: UNIFAR, 2000. 45p.
Apostila (Curso de Validação) – União Farmacêutica de São Paulo; 2000.
PINTO, T. J. A.; FERRARINI, M.; GATTI, R. M.; Proposta de roteiro prático para a
validação de métodos analíticos. Farmácia & Química, v.36, p. 26-36, 2003.
PORTER, L. J., HRSTICH, L. N., E CHAN, B. G. The conversion of
proanthocyanidins and prodelphenidins to cyanidins and delphenidins. Phytochemistry,
v.25, p.223-230, 1986.
QUEIROZ, C.R.A.A.; MORAIS, S.A.L.; NASCIMENTO, E.A. Caracterizaçao dos
taninos da aroeira-preta (myracrodruon urundeuva). Revista Árvore, v.26, n.4, 2002.
RIBÉREAU-GAYON, P., 1972. Plant Phenolics, Cap. 7, Oliver & Boyd, Edinburgh, p.
169-197.
RIGAUD, J.; ESCRIBANO-BAILON, M. T.; PRIEUR, C.; SOUQUET, J. M.;
CHEYNIER, V. (1993). Normal-phase high-performance liquid chromatographic
68
separation of procyanidins from cacao beans and grape seeds. Journal of
Chromatographic, v.654, p. 255-260, 1993.
SADECK, P. C. Troubleshooting HPLC Systems. New York: Willey, 2000.
SANTOS, M.A.T. Caracterização química das folhas de brócolis e couve- flor
(Brassica oleracea L.) para utilização na alimentação humana. 2000. Dissertação
(Mestrado), UFLA, Lavras, 2000.
SARGENTI, S. R.; VICHNEWSI, W. Sonication and Liquid Chromatography as a
rapid technique. For extraction and fraction of plant material. Phytochemical Analysis.
v.11, n.2, p.69-73. 2000.
SARNECKIS, C. J., DAMBERGS, R. G., JONES, P., MERCURIO, M., HERDERICH,
M. J., E SMITH, P. A. Quantification of condensed tannins by precipitation with
methyl cellulose: development and validation of an optimised tool for grape and wine
analysis. Australian Journal of Grape and Wine Research, v.12, p.39–49, 2006.
SCALBERT, A. Quantitative methods for the estimation of tannins in plant tissues. In
R. W. HEMINGWAY, e P. S. LAKS, Plant Polyphenols: Synthesis, Properties,
Significance. New York: Plenum Press, p.259-280, 1992.
SCHOFIELD, P.; PELL, A.N.; MBUGUA, D.M. Analysis of condensed tannins: a
review. Animal Feed Science and Technology, v. 91, p.21-40, 2001.
69
SGARBIERI, V.C. Proteínas em alimentos proteicos: propriedades – degradações –
modificações. São Paulo: Varela, 1996. Cap.5: Deterioração e modificações químicas,
físicas e enzimáticas de proteínas.
SHAHIDI, F. e NAZCK, M. Extration and analysis of phenolics in food Review.
Journal of Chromatography A, v. 1054, p. 95-111, 2004
SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ,
L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3ªed. rev. –
Porto Alegre/Florianópolis: Ed. Universidade/UFRGS/Ed. da UFSC, 2001.
SINGLETON, V.; ORTHOFER, R.; E LAMUELA-RAVENTOS, R. M. Analysis of
total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-
Ciocalteau reagent. Methods Enzymol , v. 299, p.152-178, 1999.
SIQUEIRA, C.F.Q.; CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM,
E.L.C.; MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALBUQUERQUE, U.P. Level of Tannins and
Flavonoids in Medicinal Plants: Evaluating Bioprospecting Strategies. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine, v.2012, n.2012, p.1-7, 2011.
STEVANATO, R.; FABRIS, S.; MOMO, F. Enzymatic method for the determination of
total phenolic content in tea and wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
v.52, p. 6287−6293, 2004.
SUFFREDINI, I.B.; SADER, H.S.; GONÇALVES, A.G.; REIS, A.O.; GALES, A.C.;
VARELLA, A.D.; YONES, R.N. Screening of antibacterial extracts from plants native
to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic Forest. Brazilian Journal of Medical
and Biological, v. 37, p.379-84, 2004.
70
SUN, B.; RICARDO-DA-SILVA, J. M.; SPRANGER, I. Critical Factors of Vanillin
Assay for Catechins and Proanthocyanidins. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.46, p. 4267-4274, 1998.
THIES, M.; FISCHER, R. Photometric bestimmug von gallassäuredurch farbreaktion
mitrhodanine. Mikrochimica Acta, v. 5, p.809-814, 1973.
UNITED STATES PHARMACOPEIA. 33.ed. Rockville U.S.:Pharmacopeial
Convention; 2010.
VERPOORTE, R. Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary
metabolites as leads in drug development. Drug Development Trends, v.3, p.232-238,
1998.
VERPOORTE, R. Pharmacognosy in the new millennium: leadfinding and
biotechnology. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 52, p. 253-262, 2000.
WILLIS, R. B.; ALLEN, P. R., Improved method for measuring hydrolysable tannins
using potassium iodate. Analyst, v. 123, p. 435-439, 1998.
WILLS, R. B. H.; BONE, K.; MORGAN, M. Herbal products: active constituents
modes of action and quality control. Nutrition Research Reviews, v. 13, p. 47-77,
2000.
WILSON, T.C., HAGERMAN, A.E. Quantitative determination of ellagic acid Journal
of Agricultural and Food Chemistry, v.38, p. 1678-1683, 1990.
APÊNDICE – Artigo enviado para Revista Brasileira de Plantas Medicinais
Validação de metodologia analítica para determinação de taninos pelo método de
difusão radial
Validation of analytical methodology for determination of tannins by radial
diffusion method
LGSantos1*; TJSPeixoto Sobrinho
1; DLVCabral
1; ELCAmorim
1
1Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas - Centro
de Ciências da Saúde Universidade Federal de Pernambuco - Av. Prof Arthur de Sá, s/n,
Cidade Universitária 54740-521 - Recife - PE, Brasil
* Corresponding author: lumagomes_68@hotmail.com
RESUMO
A metodologia para doseamento de taninos através de difusão radial desenvolvido por
Hagerman (1987) vem sendo utilizada em laboratórios de fitoterápicos devido
principalmente a sua simplicidade de execução, rapidez e baixo custo, contudo não há
relatos na literatura da submissão desta metodologia a um estudo de validação.
Baseando-se neste fato, o presente estudo visou validar a metodologia de Difusão
Radial para o doseamento de taninos. Todos os parâmetros obrigatórios exigidos pela
RE 899 de 2003 foram avaliados. O método foi considerado linear e com alta
sensibilidade de quantificação (27,72 µg/poço). Mostrou-se também robusto e com
recuperação aceitável (85,96%). Os resultados obtidos para repetitividade (intra-corrida)
e precisão intermediária (inter-corridas), certificaram a precisão do método, obtendo-se
valores entre 1,89 e 7,03%. Para a exatidão valores entre 100,47 e 105,26% foram
obtidos, que se encontra dentro dos limites preconizados pela ANVISA. Sendo assim o
método foi considerado preciso, exato e reprodutível, além de ser de fácil execução e
baixo custo.
Palavras-chave: difusão radial, doseamento de taninos, validação de método,
quantificação.
ABSTRACT
The methodology for determination of tannins by radial diffusion developed by
Hagerman (1987) has been explicitly used in herbal laboratories due mainly to its
simplicity of implementation, speed and low cost, yet there are no reports in the
literature of the submission of this methodology to a study validation. Based on this
fact, this study sought to validate the methodology of Radial Diffusion in the tannins
determination. All mandatory parameters required by ANVISA were evaluated. The
method was considered linear and with high sensitivity quantitation (27.72 g / well). It
was also shown robust and acceptable recovery (85.96%). The results obtained for
repeatability (within-run) and intermediate precision (inter-run), certified the accuracy
of the method, obtaining values between 1.89 and 7.03%. For the accuracy values
between 100.47 and 105.26% were obtained, which is within the limits
recommended by ANVISA. Thus the method was considered precise, accurate
and reproducible, and is easy to perform and inexpensive.
Key words: radial diffusion, tannins content, method validation, quantification.
INTRODUÇÃO
Milhões de medições analíticas são efetuadas a cada dia em laboratórios ao redor
do mundo e, verifica-se a necessidade progressiva de dados analíticos comparáveis e
consistentes, para a eliminação de barreiras técnicas entre os vários países. Para atingir
este processo de reconhecimento mútuo a nível internacional, em que uma vez efetuada
a medição, esta é aceita em qualquer país, requisitos legais, de certificação e de
credenciamento devem ser observados. As normas internacionais, nacionais e sistemas
da qualidade destacam a importância da validação de métodos analíticos e a
documentação do trabalho de validação, para a obtenção de resultados confiáveis e
adequados ao uso pretendido (Barros, 2002).
De acordo com a United States Pharmacopeia XXXIII (2010), “A validação de
métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes
mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método
realiza aquilo para o qual é indicado para fazer”, ou seja, é a confirmação por exame e
fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um
determinado uso pretendido são atendidos (NBR ISO/IEC 17025, 2001). As
características analíticas típicas usadas na validação de métodos são: exatidão, precisão,
especificidade, limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo de
aceitação, robustez ou resistência e conformidade do sistema (Brasil, 2003; Espires,
1998; Pecora, 2000; Pinto et al., 2003). Portanto, a validação de metodologias analíticas
necessita ser especifica, robusta, sensível, precisa e exata, constituindo fundamental
importância para o controle de qualidade dos produtos e sendo parte das normas de
Boas Práticas de Fabricação e Controle (Barros Neto et al., 2002).
A realização da validação deve ser executada: i) sempre que de forma direta ou
indireta quando o processo de fabricação tenha sido alterado; ii) quando a qualidade
final do produto for duvidosa; iii) em equipamentos novos e iv) em caso de implantação
de um processo ou método analítico novo (Emanuelli, 2000; Pasteelnick, 1993).
O método de difusão radial desenvolvido por Hagerman (1987) para o
doseamento de taninos se fundamenta na propriedade que estes metabólitos secundários
possuem de se complexar com as proteínas. No ensaio, o tanino difunde por um gel
contendo proteína e o precipitado desenvolve uma forma de disco visível à medida que
o tanino interage com a proteína. O método é simples, sensível e específico, e deve ser
especialmente aplicado para estudos nos quais um grande número de amostras será
analisado. Apesar de já bastante utilizado e difundido na comunidade acadêmica, não há
relatos de que a metodologia tenha passado por um processo de validação, estudo este
de extrema importância para se garantir a confiabilidade do método. Neste sentido, o
objetivo deste trabalho foi realizar a validação da metodologia analítica de quantificação
de taninos por difusão radial.
MATERIAL E MÉTODO
Reagentes e equipamentos
O solvente usado foi metanol (Vetec Química Fina, 99,8%). Os reagentes foram
ácido acético glacial (Merck, 99,8%), hidróxido de sódio (Vetec Química Fina, 99%),
ácido ascórbico 99,5% (Vetec Química Fina), agarose tipo I (Sigma-Aldrich) e
albumina sérica bovina fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich). Como padrão
para taninos foi utilizado ácido tânico 99,5% (Vetec Química Fina).
As pesagens foram realizadas em balança analítica Shimadzu AX200 e as
diluições com micropipetas monocanal de volume variável HTL Lab Solutions. A
bancada de vidro foi nivelada com inclinômetro Insize C7. As análises de pH foram
realizadas em pHmetro de bancada Tecnopon mPA210.
Preparação do gel
Foi preparada uma solução 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico,
sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio em pérolas pois este é o
pH ideal para a interação tanino-proteína (López et al., 2004). O gel foi preparado
utilizando agarose (1%, p/v) na solução descrita previamente. A mistura foi
homogeneizada sob aquecimento e, após o resfriamento a 45°C, foi adicionada
albumina sérica bovina (0,1%, p/v). Alíquotas de 10 mL do gel foram distribuídas em
placas de Petri (90 mm x 15 mm) nas quais foram feitos poços com o auxílio de um
perfurador de 5 mm de diâmetro. As amostras foram aplicadas nos poços com
micropipetas.
Procedimentos experimentais
Para avaliar a robustez e a recuperação do método, 100 mg da amostra seca e
pulverizada de cedro (Cedrela odorata L.), foram pesados e transferidos para tubos de
penicilina, sendo adicionado 1 mL de acetona 50% para extração durante 60 minutos.
Os extratos foram filtrados por aspirados. Deste filtrado, 24 µL foram aplicados nos
poços.
As placas contendo os halos com amostras vegetais e padrão ácido tânico foram
escaneadas e foi utilizado o programa Corel Draw© X3 Versão 13 para mensuração dos
diâmetros dos halos.
Parâmetros da validação
Para a linearidade foi usada a média de três intervalos com repetições autênticas,
que contemplavam seis concentrações da solução de ácido tânico 25 mg/mL (100 - 600
μg/poço) Após relação linear visual, os resultados foram analisados estatisticamente
para definir o coeficiente de determinação, a equação de regressão, o ajuste linear e o
desvio padrão relativo (Barros Neto et al., 2002; Brasil, 2003). Os limites de detecção e
quantificação foram estimados (em μg/poço) considerando o desvio padrão em razão ao
coeficiente angular (inclinação da reta) obtidos pela linearidade, nos quais foram
utilizadas as equações 1 e 2 para determinar o limite de detecção e quantificação,
respectivamente (Brasil, 2003).
LD = DPa × 3/IC (1)
LQ = DPa × 10/IC (2)
Onde o LD é o limite de detecção; LQ é o limite de quantificação; DPa é o desvio-
padrão relativo; IC é a inclinação de curva de calibração.
O parâmetro recuperação foi realizado com três amostras em triplicata e o
resultado foi obtido através da equação 3. Os fatores a serem considerados para analisar
a robustez foram: tempo de extração (60 e 120 minutos) e estabilidade de leitura (3 e 4
dias), o que está de acordo com o preconizado pela ANVISA (Brasil, 2003). Os
resultados foram avaliados mediante comparação através da análise de variância.
R(%) = CTE/CTNE × 100 (3)
Onde CTE compreende a concentração total de taninos extraídos (simulação do
processo extrativo) e CTNE é a concentração de taninos não extraídos. R (%) é a
recuperação obtida (Brasil, 2003).
Os ensaios de repetitividade e precisão intermediária foram determinados por
seis amostras de mesma concentração, executados no mesmo dia (intra-corrida), e em
dois dias consecutivos por analistas diferentes (inter-corrida) (Brasil, 2003). Os
resultados foram expressos como desvio padrão relativo (Equação 4). A exatidão foi
avaliada por três controles (em sextuplicata) de concentração baixa, média e alta. A
exatidão (Equação 5) foi calculada, individualmente para cada controle.
DPR(%) = DP/CMD × 100 (4)
E(%) = CME/CT × 100 (5)
Onde o DPR (%) é a precisão; DP é o desvio-padrão; CMD é a concentração média
determinada; E (%) é a exatidão; CME é a concentração média experimental; e CT é a
concentração teórica.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método validado apresentou linearidade para as concentrações estudadas (100
a 600 µg/poço). A equação da regressão linear média obtida a partir de três curvas de
calibração foi y = 0,646x + 36,664, onde y é o diâmetro quadrado (mm2) e x a
concentração (µg/poço) em equivalentes de ácido tânico. Como mostrado na Figura 1,
o coeficiente de determinação obtido foi R² = 0,9965, comprovando a adequação do
método ao intervalo avaliado (Brasil, 2003). Os dados de precisão (DPR) e exatidão (E)
do intervalo do método são apresentados na Tabela 1.
FIGURA 1. Curva de calibração construída com padrão ácido tânico (100 a 600 µg/poço)
onde a equação linear média obtida foi y = 0,646x + 36,664 e R² = 0,9965.
TABELA 1. Resultados do teste de linearidade por difusão radial para taninos, utilizando-se
ácido tânico como padrão.
Concentração teórica
(µg/mL) C (n=3) DP DPR (%) E (%)
100 93,95 2,81 2,99% 93,95%
200 191,92 6,29 3,28% 95,96%
300 298,22 10,25 3,44% 99,41%
400 406,94 7,14 1,76% 101,74%
500 517,95 23,58 4,55% 103,59%
600 586,56 39,93 6,81% 97,76%
C = Concentração média (µg/poço) de três determinações; DP = Desvio-padrão; DPR
(%) = Desvio-Padrão Relativo (Precisão); E (%) = Exatidão.
Os valores dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) estimados pelas
equações 1 e 2, foram 8,32 e 27,72 µg/poço, respectivamente. Com esses resultados,
verificamos que o método possui alta sensibilidade para detectar e quantificar o padrão,
sem sofrer alteração de fatores intrínsecos do método.
A análise de variância ANOVA confirmou que o método proposto foi
considerado linear e indica que não há falta de ajuste (p<0,05) (Pimentel, Barros Neto,
2002), como pode ser visto na Tabela 2.
TABELA 2. Resultados da Análise de Variância (ANOVA) e teste de ajuste linear (p<0,05) do
parâmetro linearidade da validação.
ANOVA
Fonte SQ gL MQ F FCrítico
Modelo 540053,86 1 540053,86 1317,33 4,49
Residual 6559,38 16 409,96 Curva Linear
Falta de ajuste 1851,31 4 462,83 1,18 3,26
Erro puro 4708,07 12 392,34 Não há falta de ajuste
Total 546613,24 17 32153,72
A recuperação que mede a eficiência do procedimento de extração do método
proposto foi 85,96% (Brasil, 2003). A análise de variância ANOVA confirmou que o
método proposto foi considerado robusto (p=0,095) (Pimentel, Barros Neto, 2002).
Os dados da repetitividade, precisão intermediária (intradia e interdia) e exatidão
do método encontram-se na Tabela 3.
TABELA 3. Resultados da repetitividade, precisão intermediária e exatidão do método de
quantificação de taninos por difusão radial.
Ensaio Concentração
teórica (µg/poço) C DP DPR (%) E (%)
Repetitividade 200,0 203,37 8,41 4,14 101,68
Precisão
intermediária
Analista 1 200,0 203,39 8,39 4,13 101,70
200,0 200,94 14,12 7,03 100,47
Analista 2 200,0 203,33 13,89 6,83 101,67
200,0 210,53 6,79 3,23 105,26
Exatidão
100,0 103,56 2,37 2,28 103,56
200,0 206,24 3,90 1,89 103,12
300,0 309,85 9,80 3,16 103,28
C = Concentração média (µg/poço) das n determinações; DP = Desvio-Padrão; DPR
(%) = Desvio-Padrão Relativo; E (%) = Exatidão.
Os ensaios de repetitividade (intradia) e precisão intermediária (interdia) estão
dentro dos parâmetros exigidos, com valores compreendidos entre 1,89 e 7,03%. Para o
ensaio de exatidão foram encontrados resultados entre 100,47 e 105,26%. A ANVISA
regulamenta que os resultados da exatidão não devem ser inferiores a 95% (Brasil,
2003). Estes dados confirmam que o método proposto encontra-se em conformidade
com a legislação vigente e apresenta confiabilidade dos resultados. O teste t de Student
apontou que não há diferenças estatísticas entre as concentrações determinadas e as
concentrações teóricas (µg/poço).
Esta metodologia vem sendo amplamente utilizada em laboratórios de estudos
de fitoterápicos, pois representa uma maneira simples e rápida de determinação do teor
de taninos de uma determinada espécie ou gênero (Melo et al., 2010)., em comparação
com outras metodologias já existentes, que geralmente são laboriosas, demoradas,
empregam produtos químicos que exigem condições especiais de manipulação e,
sobretudo, são inespecíficas.
A maior aplicabilidade do método de difusão radial encontra-se quando da
necessidade de análise de um grande número de amostras, requisitada principalmente
em estudos de triagem para seleção de plantas com potenciais atividades terapêuticas, e
os que visam comparação de determinadas condições a que a espécie vegetal está
submetida e como estas condições são refletidas no metabolismo secundário da planta
(Cabral et al., 2010; Siqueira et al., 2011).
CONCLUSÃO
O método proposto apresenta linearidade. A recuperação mostra que
aproximadamente 85% dos taninos presentes na amostra podem ser quantificados por
este método. Os resultados de precisão e exatidão obtidos atestam confiabilidade
necessária para o uso desta metodologia em laboratórios de controle de qualidade. O
método de quantificação por difusão radial mostrou-se preciso, exato e reprodutível,
aliado a acessibilidade e facilidade de execução.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado
de Pernambuco (FACEPE) pela bolsa de Doutorado concedida a D.L.V. Cabral e a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES) pela bolsa
de Pós-Doutorado concedida a T.J.S. Peixoto Sobrinho e de Mestrado concedida a L. G.
Santos, ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto e sua equipe do Laboratório de Tecnologia
dos Medicamentos (LTM-UFPE) pelo apoio dado durante todo o estudo.
REFERÊNCIAS
ATHAIDE A. Validação comprova e documenta qualidade dos produtos e
equipamentos. Controle de Contaminação. 2000; maio/jun.:16-22.
BARROS NETO, B.; PIMENTEL, M. F.; ARAÚJO, M. C. U. Recomendações para
calibração em química analítica- Parte I. Fundamentos e calibração com um
componente (calibração univariada). Quim. Nova, v.25, n.5, p.856- 865, 2002.
BARROS C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, São Paulo, v.64, n.2,
p.175-177, jul./dez., 2002
BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). R. E, nº 899 de 29 de
maio de 2003 – Guia para validação de métodos qualitativos e bioanalíticos.
CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM, E.L.C.;
ALBUQUERQUE, U.P. Relationship of biometric parameters on the concentration of
tannins in two medicinal plants – a case study. Boletín Latinoamericano y del Caribe de
Plantas Medicinales y Aromáticas, v.9, n.5, p.368-376, 2010.
EMANUELLI T, SCANDIUZZI M. Validação de processos na indústria farmacêutica.
In: Congresso de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos. 2000; Rio Grande do Sul:
Universidade do Rio Grande do Sul. Anais. 2000. p.57.
ESPIRES RC. Aspectos da metodologia analítica do metronidazol. São Paulo: USP,
1998. 136 p. [Dissertação – Mestrado em Ciências Farmacêuticas]. Universidade de São
Paulo; 1998.
HAGERMAN, A.E. Radial difusion method for determining tannin in plant extrats.
Journal of Chemical Ecology, 13(3): 437-448, 1987.
LÓPEZ, J.; TEJADA, I.; VÁSQUEZ, C.; DE DIOS GARZA, J.; SHIMADA, A.
Condensed tannins in tropical fodder crops and their in vitro biological activity: Part 2.
Journal of the Science and Food Agriculture, 84: 295-29, 2004.
MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALMEIDA E CASTRO, V.T.N.; CABRAL, D.L.V.;
RODRIGUES, M.D.; NASCIMENTO, S.C.; AMORIM, E.L.C.; ALBUQUERQUE,
U.P. Antiproliferative Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of
Semi-Arid Northeastern Brazil. Molecules, v.15, p.8534-8542, 2010.
NBR ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de
Calibração e de Ensaios. 2001 ABNT. RJ. Brasil.
PASTEELNICK LA. Analytical methods validation. In: Berry IR, Nash RA.
Pharmaceutical process validation. New York: Marcel Dekker; 1993. p.411-28.
PECORA M. Validação de métodos analíticos. São Paulo: UNIFAR, 2000. 45p.
Apostila (Curso de Validação) – União Farmacêutica de São Paulo; 2000.
PINTO TJA, FERRARINI M, GATTI RM. Proposta de roteiro prático para a validação
de métodos analíticos. Farmácia & Química. 2003;36:26-36.
SIQUEIRA, C.F.Q.; CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM,
E.L.C.; MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALBUQUERQUE, U.P. Level of Tannins and
Flavonoids in Medicinal Plants: Evaluating Bioprospecting Strategies. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine, v.2012, n.2012, 2011.
UNITED STATES PHARMACOPEIA. 33.ed. Rockville U.S.:Pharmacopeial
Convention; 2010.