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Coleta, Avaliação e Criopreservação
de Sêmen
4ª Aula:
Priscila Marques Moura de LeonDoutoranda PPGB, Médica Veterinária
Setembro, 2011
Universidade Federal de Pelotas
Graduação em Biotecnologias
Manipulação de Gametas e Embriões
Conceitos...
• Sêmen: suspenção celular contendo espermatozoides e
fluído secretado pelos órgãos acessórios do trato genital
masculino.
• Porção Celular: espermatozoides (formados no interior dos
túbulos seminíferos dos testículos)
• Porção fluída: plasma seminal (transportador e protetor dos
espermatozoides, fonte varia de acordo a espécie)
• Sêmen: suspenção celular contendo espermatozoides e
fluído secretado pelos órgãos acessórios do trato genital
masculino.
• Porção Celular: espermatozoides (formados no interior dos
túbulos seminíferos dos testículos)
• Porção fluída: plasma seminal (transportador e protetor dos
espermatozoides, fonte varia de acordo a espécie)
Célula Espermática
• Morfologia Espermática:
– Cabeça do Espermatozóide → núcleo achatado de forma oval contendo cromatina altamente condensada (DNA + protaminas);
– Acrossomo → cobertura com dupla camada de membrana que envolve o núcleo (Acrosina, hialuronidase, enzimas hidrolíticas)
– Cauda do Espermatozóide → colo, peças intermediária, principal e terminal. (*intermediária: numerosas mitocôndrias)
Principais componentes:
• Ácidos nucléicos
• Proteínas
• Lipídeos
* 1/3 do peso é constituído pelo núcleo
* Seleção prévia ao processamento e congelamento de sêmen para comercialização.
1. Zootécnicos:– teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores,
leva-se em consideração o desempenho obtido. Ex.: produção de carne, performanceesportiva.
– Teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valordo que o exame de sua genealogia. Ex.: produção de leite das vacas filhas.
2. Sanitários:– devem ser livres de doenças infectocontagiosas, devendo ser submetidos a exame
andrológico e a testes de diagnóstico. Ex.: Brucelose, Leptospirose, Tuberculose
3. Nutricional:– Deficiências nutricionais podem provocar infertilidade. Machos selecionados para
congelamento de sêmen devem receber alimentação de alta qualidade.
4. Reprodutivos:– Exame andrológico completo (teste de comportamento sexual, genitália externa e
interna, Espermograma,
5. Burocráticos:– medidas de credenciamento junto às associações de criadores para a exploração
comercial
* Seleção prévia ao processamento e congelamento de sêmen para comercialização.
1. Zootécnicos:– teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores,
leva-se em consideração o desempenho obtido. Ex.: produção de carne, performanceesportiva.
– Teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valordo que o exame de sua genealogia. Ex.: produção de leite das vacas filhas.
2. Sanitários:– devem ser livres de doenças infectocontagiosas, devendo ser submetidos a exame
andrológico e a testes de diagnóstico. Ex.: Brucelose, Leptospirose, Tuberculose
3. Nutricional:– Deficiências nutricionais podem provocar infertilidade. Machos selecionados para
congelamento de sêmen devem receber alimentação de alta qualidade.
4. Reprodutivos:– Exame andrológico completo (teste de comportamento sexual, genitália externa e
interna, Espermograma,
5. Burocráticos:– medidas de credenciamento junto às associações de criadores para a exploração
comercial
Seleção de Machos para Criopreservação de Sêmen
• Vagina Artificial
• Eletroejaculação
• Método de Excitação Mecânica
• Vagina Artificial
• Eletroejaculação
• Método de Excitação Mecânica
Métodos de Coleta de Sêmen
• Vagina Artificial:
– Corresponde à melhor técnica de coleta de sêmen, pois simula a cópula
natural.
– Método utilizado para: Bovinos, Equinos, Caprinos e Ovinos, coelhos.
– A vagina artificial é composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de
borracha, cone flexível e tubo coletor, recoberto por capa de térmica.
Através da válvula do tubo coloca-se a água a temperatura de 39-45°C e
regula-se a pressão.
– A temperatura interna deve estar entre 39 e 42°C.
– Vantagens: obtêm sêmen com maior densidade e concentração, menor risco
de contaminação ambiental.
– Desvantagem: necessidade de treino para os machos doadores.
• Vagina Artificial:
– Corresponde à melhor técnica de coleta de sêmen, pois simula a cópula
natural.
– Método utilizado para: Bovinos, Equinos, Caprinos e Ovinos, coelhos.
– A vagina artificial é composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de
borracha, cone flexível e tubo coletor, recoberto por capa de térmica.
Através da válvula do tubo coloca-se a água a temperatura de 39-45°C e
regula-se a pressão.
– A temperatura interna deve estar entre 39 e 42°C.
– Vantagens: obtêm sêmen com maior densidade e concentração, menor risco
de contaminação ambiental.
– Desvantagem: necessidade de treino para os machos doadores.
Métodos de Coleta de Sêmen – Vagina Artificial
Coleta de Sêmen por Vagina Artificial
Vagina Artificial de Ovinos e Caprinos
Vagina Artificial de Equinos
Vagina Artificial de Bovinos
• Eletroejaculação:
– Método consiste em induzir a passagem de uma corrente alternada pela
medula ao nível da 4a vértebra lombar, este estímulo produz a ejaculação.
– O eletroejaculador é inserido no reto, com eletrodos em forma de anéis ou
longitudinais irão promover a estimulação elétrica.
– A eletroejaculação é particularmente indicada para coleta de sêmen de touros
e carneiros.
– Desvantagens: correspondem ao estresse gerado e maior diluição seminal
quando comparado à coleta com vagina artificial (eletroejaculador exacerba a
secreção das glândulas sexuais acessórias) que pode ocasionar problemas de
congelabilidade desse sêmen.
• Eletroejaculação:
– Método consiste em induzir a passagem de uma corrente alternada pela
medula ao nível da 4a vértebra lombar, este estímulo produz a ejaculação.
– O eletroejaculador é inserido no reto, com eletrodos em forma de anéis ou
longitudinais irão promover a estimulação elétrica.
– A eletroejaculação é particularmente indicada para coleta de sêmen de touros
e carneiros.
– Desvantagens: correspondem ao estresse gerado e maior diluição seminal
quando comparado à coleta com vagina artificial (eletroejaculador exacerba a
secreção das glândulas sexuais acessórias) que pode ocasionar problemas de
congelabilidade desse sêmen.
Métodos de Coleta de Sêmen - Eletroejaculação
Coleta de Sêmen por Eletroejaculação
Sistema de Eletroejaculação
Coleta de Sêmen Bovino
Coleta de Sêmen de Animais Silvestres
• Método de Excitação Mecânica:
– utilizado por Spalanzani (1780) para a obtenção de sêmen de cão. Foi
o método utilizado para realizar a primeira inseminação artificial em
um animal de fecundação interna.
– A técnica consiste na excitação manual do corpo do pênis.
– Utilizado em Cães e Suínos.
– Suínos → Método da Mão Enluvada
– Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e
oferece um risco potencial de contaminação do sêmen por sujidades
ambientais.
• Método de Excitação Mecânica:
– utilizado por Spalanzani (1780) para a obtenção de sêmen de cão. Foi
o método utilizado para realizar a primeira inseminação artificial em
um animal de fecundação interna.
– A técnica consiste na excitação manual do corpo do pênis.
– Utilizado em Cães e Suínos.
– Suínos → Método da Mão Enluvada
– Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e
oferece um risco potencial de contaminação do sêmen por sujidades
ambientais.
Métodos de Coleta de Sêmen – Excitação Mecânica
O sêmen canino é composto de três frações distintas:• 1ª fração: é constituída por um líquido claro, aquoso, que representa o
produto de secreção das glândulas uretrais e seu volume pode variar de 0,25 a 5 ml;• 2ª fração: de cor branca e consistência viscosa, contém os espermatozoides,
o volume pode variar de 0,5 a 3 ml;• 3ª fração: clara, aquosa, pouco consistente, cujo volume varia de 3 a 30 ml,
representa a secreção prostática.* A concentração média da ejaculação completa seria de 12.500.000 por ml.
O sêmen canino é composto de três frações distintas:• 1ª fração: é constituída por um líquido claro, aquoso, que representa o
produto de secreção das glândulas uretrais e seu volume pode variar de 0,25 a 5 ml;• 2ª fração: de cor branca e consistência viscosa, contém os espermatozoides,
o volume pode variar de 0,5 a 3 ml;• 3ª fração: clara, aquosa, pouco consistente, cujo volume varia de 3 a 30 ml,
representa a secreção prostática.* A concentração média da ejaculação completa seria de 12.500.000 por ml.
Coleta de Sêmen Canino - Excitação Mecânica
.Sêmen é coletada em 3 frações:• Fração Pré-espermática: translúcida• Fração rica em espermatozoides: esbranquiçada e opaca• Fração Pós-espermática: translúcida
.Sêmen é coletada em 3 frações:• Fração Pré-espermática: translúcida• Fração rica em espermatozoides: esbranquiçada e opaca• Fração Pós-espermática: translúcida
Coleta de Sêmen Suíno – Mão Enluvada
Outros métodos de coleta de sêmen
• Coleta de Sêmen de Aves – Massagem Abdominal
• Coleta de Sêmen de Camundongos – Retirada do Epidídimo e
ducto deferente
• Coleta de Sêmen de Peixes – Massagem Abdominal
• Coleta de Sêmen de Aves – Massagem Abdominal
• Coleta de Sêmen de Camundongos – Retirada do Epidídimo e
ducto deferente
• Coleta de Sêmen de Peixes – Massagem Abdominal
* A avalição do sêmen deve ser realizada logo após a coleta;
* Nenhum teste isolado é capaz de predizer a fertilidade, é necessário um conjunto de testes;
• Análises:
– Análises Imediatas
– Análises Morfológicas
– Análises de Viabilidade
– Sondas Fluorescentes
– Sistemas Automatizados
* Importante: todo material deve ser sempre mantido 37°C
* A avalição do sêmen deve ser realizada logo após a coleta;
* Nenhum teste isolado é capaz de predizer a fertilidade, é necessário um conjunto de testes;
• Análises:
– Análises Imediatas
– Análises Morfológicas
– Análises de Viabilidade
– Sondas Fluorescentes
– Sistemas Automatizados
* Importante: todo material deve ser sempre mantido 37°C
Métodos de Avaliação de Sêmen
• Aparência e Volume:– Coloração uniforme e aparência opaca (indica alta concentração
espermática);– Volume é utilizado para cálculo da dose espermática (estimativa
do número total de células);
Volume médio ejaculado :
• Bovino: 5 – 8 mL
• Ovino: 0,8 – 1,2 mL
• Caprino: 0,8 – 1,2 mL
• Suíno: 150 – 200 mL
• Equino: 60 – 100 mL
• Galo: 0,2 – 0,5 mL
• Aparência e Volume:– Coloração uniforme e aparência opaca (indica alta concentração
espermática);– Volume é utilizado para cálculo da dose espermática (estimativa
do número total de células);
Volume médio ejaculado :
• Bovino: 5 – 8 mL
• Ovino: 0,8 – 1,2 mL
• Caprino: 0,8 – 1,2 mL
• Suíno: 150 – 200 mL
• Equino: 60 – 100 mL
• Galo: 0,2 – 0,5 mL
Métodos de Avaliação de Sêmen
Sêmen Bovino
• Motilidade e Vigor:– Estimativa subjetiva da viabilidade e qualidade espermática;– Análise realizada em Microscópio óptico;– Avaliação pode ser dificultada em altas concentrações
espermáticas;– 10 a 20µL de sêmen são colocados entre lâmina e lamínula;
– Motilidade: células móveis são contadas e estimado o percentual;
– Vigor: velocidade que as células atravessam o campo e formam ondas;
• Motilidade média do ejaculado é 70 a 90%;
• Vigor é estimado entre 0 a 5, média e ideal entre 3 e 4;
• Motilidade e Vigor:– Estimativa subjetiva da viabilidade e qualidade espermática;– Análise realizada em Microscópio óptico;– Avaliação pode ser dificultada em altas concentrações
espermáticas;– 10 a 20µL de sêmen são colocados entre lâmina e lamínula;
– Motilidade: células móveis são contadas e estimado o percentual;
– Vigor: velocidade que as células atravessam o campo e formam ondas;
• Motilidade média do ejaculado é 70 a 90%;
• Vigor é estimado entre 0 a 5, média e ideal entre 3 e 4;
Métodos de Avaliação de Sêmen
http://www.youtube.com/watch?v=H2ORu0fkY5Y&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=unmKOt6Ee0w
Vídeos Motilidade Espermática
Valores médios de Motilidade:
•Bovino: 40 – 75%
•Ovino: 60 – 80%
•Caprino: 60 – 80%
•Suíno: 50 – 80%
•Equino: 40 – 75%
•Galo: 60 – 80 %
• Sistemas de análises computadorizadas da motilidade espermática estão disponíveis;
• O Sistema de Análise Espermática Computadorizado - CASA
(Computer Assisted Sperm Analysis): – sistema automatizado (Hardware e Software) para visualizar e digitalizar
imagens sucessivas dos espermatozoides;
– processando, analisando e fornecendo informações da cinética individual das células e valores estatísticos
• Têm sido propostos e aplicados na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional do sêmen,
• Incrementar o estudo da andrologia através da análise de diversos parâmetros de motilidade;
• Sistemas de análises computadorizadas da motilidade espermática estão disponíveis;
• O Sistema de Análise Espermática Computadorizado - CASA
(Computer Assisted Sperm Analysis): – sistema automatizado (Hardware e Software) para visualizar e digitalizar
imagens sucessivas dos espermatozoides;
– processando, analisando e fornecendo informações da cinética individual das células e valores estatísticos
• Têm sido propostos e aplicados na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional do sêmen,
• Incrementar o estudo da andrologia através da análise de diversos parâmetros de motilidade;
Análise Computadorizada de Motilidade
CASA - Computer
Assisted Sperm Analysis
• Motilidade Total (%),• Motilidade Progressiva (%)• Velocidade de Trajeto (VAP, μm/s)• Velocidade Progressiva (VSL, μm/s)• Velocidade Curvilinear (VCL, μm/s)
• Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH, μm)• Freqüência de Batimentos (BCF, Hz)• Retilinearidade (STR, %)(VSL/VAP)• Linearidade (LIN, %) (VSL/VCL)• Velocidade Rápida (%; Arruda, 2000).
• Concentração Espermática:– Pode ser determinada por: Hemocitômetro e Espectrofotômetro
– Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água para facilitar a contagem (10X - 100X);
– Rotineiramente é utilizada Câmara de Neubauer para contagem celular;
Concentração média espermática milhões/mL :
• Bovino: 800 – 2000 x 106 sptz/mL
• Ovino: 2000 – 6000 x 106 sptz/mL
• Caprino: 2500 – 5000 x 106 sptz/mL
• Suíno: 200 – 300 x 106 sptz/mL
• Equino: 150 – 300 x 106 sptz/mL
• Galo: 3000 – 7000 x 106 sptz/mL
• Concentração Espermática:– Pode ser determinada por: Hemocitômetro e Espectrofotômetro
– Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água para facilitar a contagem (10X - 100X);
– Rotineiramente é utilizada Câmara de Neubauer para contagem celular;
Concentração média espermática milhões/mL :
• Bovino: 800 – 2000 x 106 sptz/mL
• Ovino: 2000 – 6000 x 106 sptz/mL
• Caprino: 2500 – 5000 x 106 sptz/mL
• Suíno: 200 – 300 x 106 sptz/mL
• Equino: 150 – 300 x 106 sptz/mL
• Galo: 3000 – 7000 x 106 sptz/mL
Métodos de Avaliação de Sêmen
Câmara de Neubauer Contagem Espermática
• Contagem de 5 quadrantes;• Contar as Linhas em “L”;• Contar nos 2 compartimentos (diferença
deve ser menor de 10%);• Caso haja disparidade fazer nova amostra;
• Diluir amostra (formol salina ou água);
• Montar câmara;• Esperar 5 min para contagem;
• Morfologia:– Estimativa do percentual de células normais e das patológicas;– Amostra é diluída e conservada em formol salina;– Avaliação através de esfregaço e coloração (Hematoxilina-eosina ou
Giemsa, Rosa de Bengala)– 100 a 200 sptz devem ser avaliados;
• Morfologia espermática ideal para congelamento é de 90%;
Espermatozóides morfológicamente normais:
• Bovino: 65 – 95%
• Ovino: 80 – 95%
• Caprino: 80 – 95%
• Suíno: 70 – 90%
• Equino: 60 – 90%
• Galo: 85 – 90%
• Morfologia:– Estimativa do percentual de células normais e das patológicas;– Amostra é diluída e conservada em formol salina;– Avaliação através de esfregaço e coloração (Hematoxilina-eosina ou
Giemsa, Rosa de Bengala)– 100 a 200 sptz devem ser avaliados;
• Morfologia espermática ideal para congelamento é de 90%;
Espermatozóides morfológicamente normais:
• Bovino: 65 – 95%
• Ovino: 80 – 95%
• Caprino: 80 – 95%
• Suíno: 70 – 90%
• Equino: 60 – 90%
• Galo: 85 – 90%
Métodos de Avaliação de Sêmen
• Morfologia Espermática:
– Classificação das Anormalidades espermáticas:
• Primárias: associadas a cabeça e acrossomo;
• Secundárias: gotas citoplasmáticas;
• Terciárias: defeitos de cauda;
• Morfologia Espermática:
– Classificação das Anormalidades espermáticas:
• Primárias: associadas a cabeça e acrossomo;
• Secundárias: gotas citoplasmáticas;
• Terciárias: defeitos de cauda;
• Avaliação automatizada da morfometria espermática - ASMA
(Automated Sperm Morphometry Analyses): avaliações da morfometria espermática pelo sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x);
• As imagens destinadas à avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software;
• Concentração de 200 x 106 sptz/mL
• Padrões morfométricos médios para equino:– cabeças espermáticas com 5,85 μm de comprimento, 2,97 μm de largura,
13,15 μm2 de área, 14,85 μm de perímetro e 0,51 μm para o coeficiente largura/comprimento.
* Espermatozoides são mais delgados quando subférteis
• Avaliação automatizada da morfometria espermática - ASMA
(Automated Sperm Morphometry Analyses): avaliações da morfometria espermática pelo sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x);
• As imagens destinadas à avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software;
• Concentração de 200 x 106 sptz/mL
• Padrões morfométricos médios para equino:– cabeças espermáticas com 5,85 μm de comprimento, 2,97 μm de largura,
13,15 μm2 de área, 14,85 μm de perímetro e 0,51 μm para o coeficiente largura/comprimento.
* Espermatozoides são mais delgados quando subférteis
Avaliação automatizada da morfometria espermática
• Testes de Viabilidade de membrana:
– Teste Hiposmótico:
• em uma solução hiposmótica (150 mOsm) a água entra no espermatozoide na tentativa de se alcançar o equilíbrio osmótico;
• capacidade do flagelo de se dobrar na presença de uma solução hiposmótica indica que a membrana está íntegra e funcional;
• O Teste Hiposmótico é um teste simples, prático e confiável;
Métodos de Avaliação de Sêmen
• Testes de Viabilidade de membrana:
– Live/Dead (Invitrogen):
• SYBR® 14 e Iodeto de Propídio;
• PI cora células com danos de membrana;
• O Live/Dead é um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento;
• Testes de Viabilidade de membrana:
– Live/Dead (Invitrogen):
• SYBR® 14 e Iodeto de Propídio;
• PI cora células com danos de membrana;
• O Live/Dead é um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento;
Métodos de Avaliação de Sêmen
Sêmen Bovino Sêmen Equino
– FITC-PSA:
• para avaliar a integridade do acrossomo de células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas
• Teste utilizado para avaliar crioinjúrias após Congelamento/Descongelamento;
* Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisum sativum agglutinin
– FITC-PSA:
• para avaliar a integridade do acrossomo de células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas
• Teste utilizado para avaliar crioinjúrias após Congelamento/Descongelamento;
* Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisum sativum agglutinin
Métodos de Avaliação de Sêmen
Sêmen Caprino Sêmen EquinoSêmen
Camundongo
• A criopreservação do sêmen busca a suspensão do
metabolismo espermático e a manutenção de suas
características por um período de tempo prolongado;
Criopreservação de Sêmen
• O sucesso da criopreservação do sêmen depende damanutenção do potencial fertilizante dos espermatozóides(integridade e funcionalidade):
– Flagelo (para garantir produção de ATP e motilidade);
– Núcleo (para manter estável o armazenamento do DNA);
– Acrossomo (para manter a fecundação);
– Segmento Equatorial (para que ocorra a ativação do oócito);
• Uso do Sêmen Congelado:
– Comercialização nacional e internacional;
– Biobancos (armazenamento de material genético);
– Inseminação Artificial;
– Produção in vitro de embriões (FIV e ICSI);
– Transferência de Gametas (GIFT);
– Programa de Transferência de embriões;
– Pesquisa Científica;
Criopreservação de Sêmen
• A preservação das estruturas espermáticas aocongelamento/descongelamento é obtida através douso de:
� Diluidores e Crioprotetores;
• Curvas de Resfriamento buscam minimizar osdanos causados pelo choque térmico, formação decristais de gelo e desidratação celular;
• A preservação das estruturas espermáticas aocongelamento/descongelamento é obtida através douso de:
� Diluidores e Crioprotetores;
• Curvas de Resfriamento buscam minimizar osdanos causados pelo choque térmico, formação decristais de gelo e desidratação celular;
Criopreservação de Sêmen
Resfriamento: altera as propriedades físicas da membrana celular.
Crioprotetores: alteram o volume celular, com desidratação e penetrando na célula
Armazenamento: estado de dormência celular.
Descongelamento: reidratação celular, com a recuperação e expansão da membrana
Verificação dos danos celulares
Criopreservação de Sêmen
• Passos da criopreservação do sêmen:
1. Diluição
2. Resfriamento
3. Congelamento
4. Armazenamento
5. Descongelamento
• Passos da criopreservação do sêmen:
1. Diluição
2. Resfriamento
3. Congelamento
4. Armazenamento
5. Descongelamento
1. Diluição:
� Diluentes
– Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, pH (6,5 a 6,9) e osmolaridade
adequados (300mOsm) , e atividade antibacteriana;
– O sêmen logo após a coleta deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte);
– Diluição na Proporção 1:1 (sêmen:diluente)
1. Diluição:
� Diluentes
– Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, pH (6,5 a 6,9) e osmolaridade
adequados (300mOsm) , e atividade antibacteriana;
– O sêmen logo após a coleta deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte);
– Diluição na Proporção 1:1 (sêmen:diluente)
Criopreservação de Sêmen - Diluição
1. Diluição:
� Crioprotetores
– Classificados como Externos e Internos de acordo a capacidade de penetração da membrana plasmática ;
– Devem provocar a desidratação celular, proteger e
estabilizar a membrana plasmática e evitar
formação de cristais de gelo;
1. Diluição:
� Crioprotetores
– Classificados como Externos e Internos de acordo a capacidade de penetração da membrana plasmática ;
– Devem provocar a desidratação celular, proteger e
estabilizar a membrana plasmática e evitar
formação de cristais de gelo;
Criopreservação de Sêmen - Diluição
� Crioprotetores
– Crioprotetores Internos:
• São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática;
• glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida;
� atuam nos meios intra e extracelulares;
� possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água;
� aumentam a osmolaridade do meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial);
� evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular;
� Crioprotetores
– Crioprotetores Internos:
• São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática;
• glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida;
� atuam nos meios intra e extracelulares;
� possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água;
� aumentam a osmolaridade do meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial);
� evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular;
Criopreservação de Sêmen - Diluição
� Crioprotetores
– Crioprotetores Externos:
• são moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática;
• Proteínas (da gema do ovo - LDL - e do leite desnatado),
• Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose)
• Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose)
• agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula
� Crioprotetores
– Crioprotetores Externos:
• são moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática;
• Proteínas (da gema do ovo - LDL - e do leite desnatado),
• Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose)
• Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose)
• agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula
Criopreservação de Sêmen - Diluição
• Toxicidade dos Crioprotetores:
• Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos;
• Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetoresdesestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos;
• Enquanto que em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação;
* Bovinos: Tris-gema e Glicerol melhores resultados
* Equino: Dimetilformamida é mais usada
* Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol
1949: Christopher Polge criopreserva sêmen bovino com sucesso
• Toxicidade dos Crioprotetores:
• Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos;
• Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetoresdesestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos;
• Enquanto que em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação;
* Bovinos: Tris-gema e Glicerol melhores resultados
* Equino: Dimetilformamida é mais usada
* Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol
1949: Christopher Polge criopreserva sêmen bovino com sucesso
Criopreservação de Sêmen - Diluição
2. Resfriamento:
– O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa;
– O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular.
– A taxa de resfriamento ideal: resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos de cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento.
* A velocidade de descongelamento deve ser compatível a velocidade
utilizada de congelamento.
2. Resfriamento:
– O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa;
– O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular.
– A taxa de resfriamento ideal: resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos de cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento.
* A velocidade de descongelamento deve ser compatível a velocidade
utilizada de congelamento.
Criopreservação de Sêmen - Diluição
• Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min (0,25 °C/min);
• Curva de Congelamento até -80°C (-15°C/min);
• Curva de Congelamento até -120°C (-10°C/min);
• Imersão em Nitrogênio líquido (-196°C);
• Armazenagem
• Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min (0,25 °C/min);
• Curva de Congelamento até -80°C (-15°C/min);
• Curva de Congelamento até -120°C (-10°C/min);
• Imersão em Nitrogênio líquido (-196°C);
• Armazenagem
Curva de Resfriamento/Congelamento
Curva de Resfriamento/Congelaamento
Bio Cool:
• Sistema que resfria por curva padrão até – 80°C;• Utilizado para sêmen, embriões e outras células
4. Armazenamento:
– Em Botijões de Nitrogênio Líquido (-196°C);
– As palhetas são colocadas em raques identificadas;
– Nível do NL é verificado e mantido periodicamente (15 dias);
– Armazenamento por tempo ilimitado;
4. Armazenamento:
– Em Botijões de Nitrogênio Líquido (-196°C);
– As palhetas são colocadas em raques identificadas;
– Nível do NL é verificado e mantido periodicamente (15 dias);
– Armazenamento por tempo ilimitado;
Criopreservação de Sêmen - Diluição
5. Descongelamento:
– Retira do Nitrogênio líquido e coloca em Banho-Maria;
– Em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;
– Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen;
5. Descongelamento:
– Retira do Nitrogênio líquido e coloca em Banho-Maria;
– Em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;
– Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen;
Criopreservação de Sêmen - Diluição
Coleta de Sêmen
Avaliação Seminal
Congelamento/Descongelamento
Avaliação Seminal
Seleção do Macho Doador
� Sêmen é centrifugado (eliminado plasma seminal e diluente);
� Ressuspendido na concentração de 100 x 106 sptz/mL;
� Após a diluição, o sêmen é mantido a 37°C/10 min para estabilização;
� Homogeneização e Envase nas palhetas de 0,5mL ou 0,25mL;
� Identificação das palhetas;
� Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min;
� Curva de Congelamento até -80°C ;
� Curva de Congelamento até -120°C ;
� Palhetas são imersas em Nitrogênio líquido (-196°C);
� Palhetas são raqueadas e armazenadas em botijões de NL;
� Descongelamento: em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;
� Sêmen é centrifugado (eliminado plasma seminal e diluente);
� Ressuspendido na concentração de 100 x 106 sptz/mL;
� Após a diluição, o sêmen é mantido a 37°C/10 min para estabilização;
� Homogeneização e Envase nas palhetas de 0,5mL ou 0,25mL;
� Identificação das palhetas;
� Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min;
� Curva de Congelamento até -80°C ;
� Curva de Congelamento até -120°C ;
� Palhetas são imersas em Nitrogênio líquido (-196°C);
� Palhetas são raqueadas e armazenadas em botijões de NL;
� Descongelamento: em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;
Protocolo de Criopreservação de Sêmen