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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
MICHELLE DEL BIANCHI AMARANTE CRUZ
Moxidectina em tecidos de cordeiros: desenvolvimento e validação de método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção de resíduos
CAMPINAS 2017
MICHELLE DEL BIANCHI AMARANTE CRUZ
Moxidectina em tecidos de cordeiros: desenvolvimento e validação de método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção de resíduos
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes Coorientador: Dra. Patrícia Aparecida de Campos Braga Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Michelle Del Bianchi Amarante Cruz e orientada pelo Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes.
CAMPINAS 2017
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 141964/2012-0
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosClaudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Cruz, Michelle Del Bianchi Amarante, 1982- C889m CruMoxidectina em tecidos de cordeiros : desenvolvimento e validação de
método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção deresíduos / Michelle Del Bianchi Amarante Cruz. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
CruOrientador: Felix Guillermo Reyes Reyes. CruCoorientador: Patrícia Aparecida de Campos Braga. CruTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia de Alimentos.
Cru1. Cordeiros. 2. Moxidectina. 3. QuEChERS, Método de. 4. LC-MS/MS. 5.
Depleção. I. Reyes, Felix Guillermo Reyes. II. Braga, Patrícia Aparecida deCampos. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia deAlimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Moxidectin residues in lamb tissues : development and validationof analytical method by LC-MS/MS and application residue depletion studyPalavras-chave em inglês:LambsMoxidectinQuEChERS, MethodLC-MS/MSDepletionÁrea de concentração: Ciência de AlimentosTitulação: Doutora em Ciência de AlimentosBanca examinadora:Felix Guillermo Reyes Reyes [Orientador]Alda Lúcia Gomes MonteiroSônia Claudia do Nascimento QueirozCristiana Leslie CorreaNadia Regina RodriguesData de defesa: 23-08-2017Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________________ Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes
(Orientador) FEA/UNICAMP
_______________________________________________________________ Dra. Alda Lúcia Gomes Monteiro
(Membro Titular) Universidade Federal do Paraná -UFPR
_______________________________________________________________ Dra. Sônia Claudia do Nascimento Queiroz
(Membro Titular) EMBRAPA
_______________________________________________________________ Dra. Cristiana Leslie Correa
(Membro Titular) Planitox
______________________________________________________________ Dra. Nadia Regina Rodrigues
(Membro Titular) CPQBA/UNICAMP
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho,
- à minha família,
- aos meus pais Sérgio e Luzia,
- ao meu irmão Serginho,
- às minhas filhas Alice e Júlia
- e em especial ao meu marido Vitor.
AGRADECIMENTOS
A Deus e a Nossa Senhora Rosa Mística por ter realizado este trabalho.
Ao prof. Dr. Felix G. R. Reyes, pela orientação, confiança, dedicação, amizade e
aprendizado ao longo desse período.
A toda minha família, em especial ao meu pai Sérgio Del Bianchi que sempre me
incentivou aos estudos, a minha mãe Luzia Zan Del Bianchi e ao meu irmão Sérgio Del
Bianchi Júnior, pelo apoio e carinho.
Ao meu marido Vitor, pelo companheirismo durante todos esses anos e as minhas
princesas Alice e Júlia que de certa forma me acompanharam durante a realização deste
trabalho.
Aos meus amigos e colegas do laboratório de Toxicologia de Alimentos, em especial à
Silvia Helena, Maria José e Luciana Castello Branco que estiveram muito presentes em
minha vida.
Aos membros da banca examinadora desta tese pela disponibilidade e auxílio nas
correções.
A minha coorientadora Dra. Patrícia Ap. Campos Braga, pelas orientações, incentivo e
amizade.
A Dra. Juliana A. Teles pela amizade, ajuda e sugestões.
A prof. Dra. Alda Lúcia Gomes Monteiro pela colaboração, orientação e confiança e a
todos os alunos da LAPOC que fizeram parte do trabalho em especial à Dra. Maria
Ângela Fernandes pela ajuda, confiança e alegria que trazia para o nosso laboratório.
A todas as pessoas, que de certa forma, colaboraram para a realização deste trabalho.
Muito obrigada!
RESUMO
A ocorrência de resíduos de antiparasitários em matrizes biológicas, em concentrações
acima do Limite Máximo de Resíduos (LMR) estabelecidos pelo Codex Alimentarius,
pode ocorrer quando não se aplicam as Boas Práticas de Uso de Medicamentos
Veterinários. Em particular se deve levar em consideração as especificações de uso
como dose, período de tratamento e período de carência. Também, o conhecimento da
dimensão da exposição da população a esses compostos é de fundamental importância
para direcionar as ações de vigilância sanitária por parte dos órgãos governamentais
responsáveis pela proteção da saúde do consumidor. Para isto, é fundamental a
disponibilidade de métodos analíticos que apresentem seletividade e detectabilidade
adequadas. Dentre os diversos antiparasitários utilizados no tratamento de animais
produtores de alimentos destinados ao consumo humano, a moxidectina (MOX) recebe
destaque, pois é um fármaco de largo espectro de ação contra endo e ectoparasitas e tem
sido utilizado em todo país. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o
desenvolvimento e validação de um método analítico para determinação de resíduos de
MOX em tecidos de cordeiros (músculo, fígado, rim e gordura) através da técnica de
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). O método foi
validado levando em consideração os critérios de validação de métodos analíticos
utilizados em estudos de resíduos de fármacos veterinários, bem como em estudos de
depleção, que foram estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), União Europeia (UE) e da Cooperação Internacional para a
Harmonização dos Requisitos Técnicos para o Registo de Medicamentos Veterinários
(VICH). O preparo de amostra por QuEChERS garantiu seletividade adequada ao
método analítico e, de acordo com os guias de validação adotados, o método mostrou-se
adequado para o propósito pretendido. A quantificação do analito nas amostras foi
realizada a partir de curvas analíticas construídas pela fortificação das matrizes
biológicas isentas do analito, sendo possível estabelecer limite de quantificação (LOQ)
de 5 ng g-1
e limite de detecção (LOD) de 1,5 ng g-1
para todas as matrizes. O método
validado foi aplicado na quantificação de MOX em tecidos de cordeiros provenientes de
um ensaio de depleção de resíduos. Após o período de carência foi verificada nos
tecidos muscular, hepático e renal, a presença de MOX, porém em concentrações
inferiores ao LMR estabelecido de 50 ng g-1
, 100 ng g-1
e 50 ng g-1
, respectivamente.
Palavras-chave: moxidectina, cordeiro, QuEChERS, LC-MS/MS, depleção.
ABSTRACT
The occurrence of antiparasitic residues in biological matrices at levels above the
Maximum Residue Limit (MRL) established by the Codex Alimentarius can occur
when not applied the Good Veterinarian Practices for Use of Medicinal Products. In
particular, specifications of use such as dose, treatment period and withdrawal period
should be taken into account. Also, knowledge of the population exposure dimension to
these compounds is of fundamental importance to implement sanitary surveillance
actions by the governmental agencies responsible for the consumer health protection.
For this purpose, the availability of analytical methods which have appropriate
selectivity and detectability is required. Among several antiparasitic drugs used in the
treatment of animals intended for production of food for human consumption,
moxidectin (MOX) gets great importance because it is a drug of wide spectrum of
action against endo and ectoparasites, which has been widely used throughout the
country. Thus, this study aimed the development and validation of an analytical method
by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) for the
determination of MOX residues in lamb tissues (muscle, liver, kidney and fat). The
method was validated taking into consideration the criteria for the validation of
analytical methods used in veterinary drug residue studies, as well as in depletion
studies, that have been established by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock
and Food Supply (MAPA), the European Union (EU) and the International Cooperation
on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal
Products (VICH). The sample preparation by QuEChERS methodology ensured
adequate recovery of MOX, and according to the guidelines adopted the method was
reliable for the intended purpose. In order to quantify the analyte, matrix-matched
calibration curves were constructed by spiked blank tissues, being possible to reach a
limit of quantitation (LOQ) of 5 ng g-1
, and limit of detection (LOD) of 1.5 ng g-1
for all
matrices. The validated method was applied in the quantification of MOX in tissue
samples from a residue depletion study. After the withdrawal period, in the muscle,
liver and kidney tissues it was verified the presence of MOX residues, however in
concentrations lower than the established MRL of 50 ng g-1
, 100 ng g-1
and 50 ng g-1
,
respectively.
Key words: Moxidectin, lamb, QuEChERS, LC-MS/MS, depletion
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
CAPÍTULO I - Ovinocultura: Uso de anti-helmínticos, aspectos analíticos e
de legislação
Figura 1. Classes terapêuticas no uso de medicamentos veterinários. 25
Figura 2. Esquema do desenvolvimento das avermectinas e milbemicinas. 28
Figura 3. Estrutura das lactonas macrocíclicas. 30
CAPÍTULO II - Desenvolvimento e validação de método analítico para
quantificação de moxidectina em tecidos de cordeiro
Figura 1: Diferenças estruturais entre nemadectina e moxidectina. 41
Figura 2. Cromatograma da matriz branco de músculo e matriz branco
fortificada na concentração do LOQ 5 µg kg-1
. 50
Figura 3. Cromatograma da matriz branco de fígado, e matriz branco fortificada
na concentração do LOQ 5 µg kg-1
. 51
Figura 4. Cromatograma da matriz branco de rim e matriz branco fortificada na
concentração do LOQ 5 µg kg-1
. 51
Figura 5. Cromatograma da matriz branco de gordura e matriz branco fortificada
na concentração do LOQ 5 µg kg-1
. 52
Figura 6. Curvas analíticas obtidas para MOX: Curvas no Solvente, Curvas no
Extrato da Matriz e Curvas na Matriz músculo, todas preparadas em
triplicata. 53
Figura 7. Curvas analíticas obtidas para MOX: Curvas no Solvente, Curvas no
Extrato da Matriz e Curvas na Matriz fígado, todas preparadas em
triplicata. 53
Figura 8. Curvas analíticas obtidas para MOX: Curvas no Solvente, Curvas no
Extrato da Matriz e Curvas na Matriz rim, todas preparadas em
triplicata. 54
Figura 9. Curvas analíticas obtidas para MOX: Curvas no Solvente, Curvas no
Extrato da Matriz e Curvas na Matriz gordura, todas preparadas em
triplicata. 54
CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado e
rim de cordeiros
Figura 1. Concentração média de moxidectina no músculo de cordeiro, longe do
local de aplicação (lombo), após única administração subcutânea (0,2
mg/kg de peso corporal). 71
Figura 2. Concentração média de moxidectina no fígado de cordeiro, após única
administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal). 71
Figura 3. Concentração média de moxidectina no rim de cordeiro, após única
administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal). 72
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I - Ovinocultura: Uso de anti-helmínticos, aspectos analíticos e
de legislação
Tabela 1. Principais exportadores de ovinos e caprinos. 23
Tabela 2. Distribuição do consumo mundial per capita (kg) de carne de ovinos e
caprinos. 23
Tabela 3. Valor nutricional da carne de cordeiro em comparação aos outros tipos
de carne (conteúdo por 100g). 24
Tabela 4. Valores de LMR de MOX em diferentes espécie ovina 27
CAPÍTULO II - Desenvolvimento e validação de método analítico para
quantificação de moxidectina em tecidos de cordeiro
Tabela 1.Composição da fase móvel e gradiente utilizado. 44
Tabela 2. Parâmetros de fonte de ionização (ESI modo positivo) utilizados. 45
Tabela 3. Precisão e Exatidão nas matrizes músculo, fígado, rim e gordura de
cordeiro por LC-MS/MS. 55
Tabela 4. Valores de LOD, LOQ, CCα e CCβ nos tecidos músculo, fígado, rim e
gordura de cordeiro por LC-MS/MS. 56
Tabela 5. Efeito matriz observado no método de quantificação de MOX em
músculo, fígado, rim e gordura de cordeiro por LC-MS/MS (expresso
em %). 57
Tabela 6. Estabilidade de curta duração da moxidectina (média ± desvio
padrão). 58
Tabela 7. Estabilidade de ciclos de gelo e degelo (média ± desvio padrão). 58
Tabela 8. Variações realizadas no método no teste de robustez 59
CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado
e rim de cordeiros
Tabela 1. Dias após aplicação única do fármaco e número de repetições dos
animais que foram abatidos para coleta das matrizes. 69
Tabela 2. Concentração da moxidectina (µg kg-1
)em músculo, fígado e rim, após
administração única subcutânea de 0,2 mg/kg de peso corporal. 70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN: Acetonitrila
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCα: Limite de decisão
CCβ: Capacidade de detecção
CNA Confederação Nacional da Agricultura
DAD: Detecção por arranjo de diodos
EC: Comunidade Europeia (European Commission)
EMA Emamectina
EMEA: Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency)
ESI: Ionização por electrospray (eletrospray ionization)
FAO: Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (Food and
Agriculture Organization of the United Nations)
FDA: Administração de Drogas e Medicamentos (Food and Drug Administration)
FIDA: Fundo Internacional de Desenvolvimento Agrícola
FLU: Detecção por fluorescência
HPLC: Cromatografia líquida de alta performance (High Performance Liquid
Chromatography)
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDA: Ingestão diária aceitável
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
ISO: Organização Internacional de Padronização(International Organization for
Standardization)
JECFA: Comitê de Peritos em Aditivos Alimentares (Joint Expert Committee on Food
Additives)
LC: Cromatografia líquida (Liquid cromatography)
LOD: Limite de detecção
LOQ: Limite de quantificação
LMR: Limite máximo de resíduo
MAPA: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
MOX Moxidectina
MS: Espectrometria de massas (Mass spectrometry)
MS/MS: Espectrometria de massas sequencial (mass spectrometry in tandem)
MSPE: Microextração em fase sólida (Micro-Solid Phase Extraction)
OIE Organização Mundial da Saúde Animal
PAMVET: Programa Nacional de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários
PC Peso corporal
PI: Padrão interno
PNCR: Plano Nacional de Controle de Resíduos
PNCRC: Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes
PTFE: Politetrafluoretileno
PVDF: Fluoreto de polivinilideno
QuEChERS Rápido, Fácil, Econômico, Efetivo, Robusto e Seguro (Quick, Easy, Cheap,
Effective, Rugged and Safe)
QqQ: Triplo Quadrupolo
SEBRAE: Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas
SPE: Extração em fase sólida (Solid phase extraction)
UV: Radiação ultraviolet
WHO: Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL
16
OBJETIVOS 20
CAPÍTULO I - Ovinocultura: Uso de anti-helmínticos, aspectos analíticos e
de legislação
Revisão Bibliográfica 22
A ovinocultura no Brasil e no mundo. 22
Controle de resíduos de medicamentos veterinários e segurança alimentar 24
Lactonas Macrociclícas. 27
Moxidectina: natureza química e farmacológica. 29
Determinação de lactonas macrociclícas. 31
Considerações Finais 32
Referências 33
CAPÍTULO II - Desenvolvimento e validação de método analítico para
quantificação de moxidectina em tecidos de cordeiro
Resumo 39
Abstract 40
Introdução 41
Material e Métodos 43
Solventes e Reagentes 43
Preparo de Soluções 43
Equipamentos 43
Condições do Sistema LC-MS/MS 44
Preparo de amostras 45
Validação do método analítico 46
Resultados e Discussão 48
Otimização do método de extração 48
Validação analítica 49
Conclusão 59
Referências 65
CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado
e rim de cordeiros
Resumo 64
Abstract 65
Introdução 66
Material e Métodos 67
Administração Subcutânea MOX 67
Resultados e Discussão 69
Depleção de resíduo do músculo (longe do local de aplicação), fígado e rim 69
Conclusão 73
Referências 73
DISCUSSÃO GERAL 76
CONCLUSÃO GERAL 77
REFERÊNCIAS 78
ANEXO 1- Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais 88
ANEXO 2 - Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation
of Analytical Method by LC-MS/MS. 87
ANEXO 3- An updated residue depletion study of moxidectin in lamb tissues
conducted using an ultra-high performance liquid chromatography-
tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method. 110
16
INTRODUÇÃO GERAL
Os parasitas em animais da espécie ovina interferem na sua produtividade,
podendo ocasionar baixa produção e má qualidade da lã, baixo ganho de peso, baixa
eficiência alimentar e mortalidade nos rebanhos. Dentre os helmintos de maior
importância na ovinocultura brasileira destaca-se o Haemonchus contortus, endoparasita
de maior prevalência nos Estados de São Paulo (AMARANTE, 1995), Paraná (CUNHA
FILHO et al., 1998), Santa Catarina (PALOSCHI & RAMOS, 1991) e Rio Grande do
Sul (BORBA, 1996). Sendo assim, é necessário que se promovam medidas de controle
e profilaxia que minimizem estas infestações por nematódeos do trato gastrintestinal.
As lactonas macrocíclicas (LMs) são endectocidas de amplo espectro
(avermectinas e milbemicinas), largamente utilizadas em animais e em algumas
parasitoses de humanos (SHOOP et al., 1995). O seu mecanismo de ação no parasita se
baseia na atuação do ácido gama-aminobutírico (GABA), como agonista, aumentando a
permeabilidade dos íons cloro, resultando em paralisia muscular dos parasitas
(MELLIN et al., 1983).
A moxidectina, milbemicina obtida em 1990, apresenta amplo espectro
contra endo e ectoparasitos, sendo seu mecanismo de ação semelhante ao das demais
lactonas. É um antiparasitário com característica lipofílica, apresenta longo tempo de
permanência no organismo, assim como uma ampla distribuição em doses relativamente
baixas (PRICHARD et al., 2012). A resistência parasitária a esses fármacos encontra-se
disseminada ao redor do mundo nos rebanhos bovinos e também ovinos, reduzindo a
eficácia do tratamento e, por consequência, o retorno econômico dos tratamentos
antiparasitários (KAPLAN, 2004).
No Brasil, o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes
(PNCRC) nos Produtos de Origem Animal do Ministério da Agricultura e
Abastecimento (MAPA), constitui uma ferramenta de “Gerenciamento de Risco” com o
objetivo de promover a garantia de qualidade do sistema de produção de alimentos de
origem animal ao longo das cadeias produtivas, e prevê regulamentações para alguns
alimentos, como leite bovino, carne de frango, carne bovina, carne suína, pescado, ovos
e mel (BRASIL, 2012). A partir de 2013, por meio do Programa de Controle de
Resíduos e Contaminantes, estabelecido através da Instrução Normativa SDA nº17, de
31 de maio de 2013, as carnes de ovinos e caprinos passaram a fazer parte do PNCRC/
17
animal. No entanto, utilizam-se os parâmetros do Codex Alimentarius como referência
de LMR (BRASIL, 2015).
Os possíveis riscos à saúde humana, decorrentes do emprego de
medicamentos veterinários em animais de produção, podem estar associados aos seus
resíduos, nos produtos de origem animal destinados ao consumo, em concentrações
acima dos limites máximos recomendados (LMRs). Isto pode ocorrer quando o
emprego do produto não observa as Boas Práticas de Uso de Medicamentos
Veterinários, em especial quanto às especificações de uso. O conhecimento da dimensão
da exposição da população a esses compostos é de fundamental importância para
nortear as ações de controle, visando à proteção do consumidor (ANVISA, 2003). O uso
indiscriminado de anti-helmínticos, na tentativa de controlar as perdas no
desenvolvimento dos animais causadas pelas verminoses, leva ao desenvolvimento da
resistência aos fármacos de diferentes grupos químicos, utilizados no tratamento dos
animais.
Entre as técnicas utilizadas para determinação de resíduos de lactonas
macrocíclicas em matrizes biológicas, a cromatografia líquida de alta performance
acoplada ao detector de fluorescência (HPLC-FLD) é a mais comum. Porém, como a
evolução dos equipamentos é constante, a cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massa (LC-MS) se tornou uma ferramenta importante e muito
utilizada na determinação de resíduos de antiparasitários em diferentes matrizes, como
fígado (HOWELLS & SAUER, 2001; INOUE et al., 2009; KINSELLA et al., 2009;
NOPPE et al., 2009), músculo (INOUE et al., 2009; KAUFMANN et al., 2011), rim,
leite (TURNIPSEED et al., 2005; DURDEN, 2007; KINSELLA et al., 2009, WHELAN
et al., 2010; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (INOUE et al., 2009), dentre outras.
Referências
AMARANTE, A.F.T. Atualidades no controle das endoparasitoses ovinas. In: Simpósio
Paulista de Ovinocultura, 4, Campinas-SP, 1995. Anais. Campinas, CATI-ASPACO,
p 33-49, 1995.
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Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos Expostos ao
consumo- PAMVet. Brasilia, 2003. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/alimentos/pamvet/ pamvet.pdf. Acesso em: 06/03/2014.
18
BRASIL. 2013. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Plano Nacional
de Controle de Resíduos e Contaminantes em produtos de origem animal.
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BRASIL. 2015. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução
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20
OBJETIVOS
1. Objetivo Geral
Desenvolver e validar método analítico para quantificação de resíduos de
moxidectina (MOX) em tecidos de cordeiro: músculo, fígado, rim e gordura, e avaliar a
depleção dos resíduos nas matrizes, músculo, fígado e rim.
2. Objetivos Específicos
2.1. Desenvolver o método analítico para identificação e quantificação da MOX
através da técnica de LC-ESI-MS/MS;
2.2. Otimizar o preparo de amostra;
2.3. Validar o método analítico;
2.4. Analisar as amostras de músculo (local de aplicação do fármaco-corte pernil e
longe do local de aplicação- corte lombo), fígado, rim e gordura;
2.5. Caracterizar a depleção dos resíduos da MOX nos tecidos de cordeiros.
21
CAPÍTULO 1
OVINOCULTURA: USO DE ANTI-HELMÍNTICOS, ASPECTOS ANALÍTICOS
E DE LEGISLAÇÃO
Michelle Del Bianchi; Alda Lúcia Gomes Monteiro; Felix G. R. Reyes
Artigo em preparação para ser submetido à revista Ciência Rural
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Revisão Bibliográfica
A ovinocultura no agronegócio do Brasil e do mundo
Os ovinos foram uma das primeiras espécies de animais domesticadas pelo
homem. A sua criação destinou-se a ser mais uma fonte de alimento, principalmente de
carne e de leite, além da lã, fonte de fibra que servia como abrigo contra as intempéries
do ambiente. A ovinocultura está presente em praticamente todos os continentes. A
ampla difusão da espécie se deve principalmente ao seu poder de adaptação a diferentes
climas, relevos e vegetações. A criação de ovinos está destinada tanto à exploração
econômica como à subsistência das famílias de zonas rurais (VIANA, 2008).
A caprinocultura e a ovinocultura têm se destacado no agronegócio
brasileiro. A ovinocultura, em particular, tem representatividade nos Estados da Bahia,
Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Paraná e Mato
Grosso do Sul (MAPA, 2016). No ano de 2013, segundo dados da Confederação da
Agricultura e Pecuária no Brasil (CNA, 2014), a produção de ovinos foi comprometida
em função das estiagens na região Nordeste, onde estão 55,5% dos animais criados no
país. Para garantir o abastecimento interno, foi preciso recorrer às importações. As
regiões Sul e Centro-Oeste respondem por 30% e 6,4%, respectivamente, do rebanho; o
Sudeste, por 4,4%; e o Norte, por 3,6%. Ainda no mesmo ano, mesmo com perspectiva
de crescimento, a cadeia não se organizou, abrindo espaço para o mercado uruguaio.
O aumento do volume de importação da carne ovina do Uruguai aponta para
um mercado aquecido, oportunidade para os criadores brasileiros melhorarem as
condições de produção dos animais. Na Tabela 1, pode-se verificar os principais países
exportadores de ovinos e caprinos, com grande destaque aos países da América Latina,
como Uruguai, Chile e Argentina e do Continente Australiano, como Austrália e Nova
Zelândia.
Países como Austrália e Nova Zelândia são reconhecidos por
desenvolverem sistemas de produção de ovinos de alto rendimento. Suas criações,
altamente tecnificadas, visam à produção de carne e lã, o que os leva a controlar o
mercado internacional desses produtos, devido principalmente ao desenvolvimento de
técnicas produtivas e raças especializadas de animais que se difundiram pelo mundo,
dando impulso para exploração econômica mundial (VIANA, 2008).
23
Tabela 1. Principais exportadores de ovinos e caprinos
US$ Volume (toneladas)
Uruguai 25.780,80 5.418,80
Chile 1.397,00 182,7
Argentina 825,2 166,5
Nova Zelândia 256,7 24
Austrália 315,4 15,9
Total 28.575,2 5.808,00
Fonte: CNA (2014).
O Brasil possui condições climáticas favoráveis para criação de ovinos e
caprinos. As técnicas de produção, o abate informal, a desorganização no setor primário
e a falta de canais de comercialização impediram o maior crescimento no setor.
Na Tabela 2, observa-se a distribuição de consumo de carne de ovinos e
caprinos em vários países do mundo, no ano de 2009, verificando-se que o maior
consumo ocorre em países como Mongólia, Turcomenistão, Nova Zelândia e Islândia,
com média entre 19 e 49 kg/habitante/ano. Aspectos religiosos, tradição na atividade e
cultura da população são os principais fatores que determinam esse elevado consumo. O
consumo de carne ovina no Brasil nos últimos anos foi de 0,6 kg/habitante/ano (CNA,
2014), índice inferior quando comparado ao consumo da carne bovina que é 37 kg/ano
(SEBRAE/CE, 2013).
Tabela 2. Distribuição do consumo mundial (por habitante/ano) carne de ovinos e
caprinos
Ranking País 2009 (kg/Média per capta)
1º Mongólia 49,3
2º Turcomenistão 26,4
3º Nova Zelândia 23,2
4º Islândia 19,9
5º Kuwait 16,5
6º Grécia 13,1
7º Samoa 11,7
8º Austrália 11,5
9º Mauritânia 11,2
10º Emirados Árabes 10,8
11º República da Síria 9,9
12º Fiji 9,4
13º Kazaquistão 8,5
---- Brasil 0,6
Fonte: CNA (2014)
24
O cordeiro é a categoria de ovinos que oferece carne de excelente qualidade,
com maior eficiência produtiva devido à sua alta taxa de crescimento em idade jovem.
Na fase de crescimento, os cordeiros apresentam um rápido ganho de peso e,
consequentemente, as exigências nutricionais são maiores (RIBEIRO et al., 2006).
A carne ovina contribui na alimentação humana como fonte rica em
proteína, ferro, zinco, niacina e vitamina B, além de apresentar todos os aminoácidos
essenciais ao funcionamento orgânico. De maneira geral, pode-se dizer que 100 gramas
de qualquer corte de cordeiro (animal jovem) correspondem a menos de 200 calorias,
podendo se comparar à carne de caprinos (Tabela 3) (FRANCO, 2001).
Tabela 3. Valor nutricional da carne de cordeiro em comparação aos outros tipos de
carne (conteúdo por 100g).
Tipos de Carne Calorias (Kcal) Proteínas (%) Gorduras (%)
Cordeiro 163 19,3 9,5
Bovino 244 18,7 18,2
Suíno 216 15,5 16,6
Caprino 165 18,1 9,4
Frango 129 25 3,75
Fonte: FRANCO (2001).
Controle de resíduos de medicamentos veterinários e segurança dos alimentos
No Brasil, assim como em outros países do mundo, existe uma demanda
crescente por alimentos de melhor qualidade, em que os critérios de escolha entre um ou
outro alimento são as características que o produto apresenta, como sabor, cor,
suculência, padrão, garantia de origem e respeito ao meio ambiente, entre outras. O
consumo de carne ovina tende a aumentar. Todavia, enfatiza-se a importância de se
desenvolver produtos de acordo com os desejos dos consumidores e critérios de
qualidade.
A saúde animal, numa visão ampliada, envolve questões relacionadas a
enfermidades dos animais, saúde pública, controle dos riscos em toda a cadeia
alimentar, assegurando a oferta de alimentos seguros e bem estar animal. Para
assegurar a saúde animal, é necessária a existência de serviços veterinários bem
estruturados, capacitados e aptos para detecção e adoção precoce das medidas de
controle e erradicação das doenças.
25
Em sintonia com a Organização Mundial de Saúde Animal – OIE, que
reconhece os serviços veterinários como um bem público mundial, o serviço veterinário
brasileiro, responsável pela condução da política de saúde animal, compartilha com o
setor privado as responsabilidades para aplicação das medidas que objetivam a melhoria
da saúde animal (MAPA, 2016).
Segundo a União Europeia (EC, 1990), resíduos de medicamentos
veterinários são todas as substâncias farmacologicamente ativas, sejam elas princípios
ativos, excipientes ou produtos de decomposição e respectivos metabólitos, que
permanecem nos gêneros alimentícios provenientes de animais aos quais tenham sido
administrados os mesmos medicamentos.
O mercado brasileiro de medicamentos veterinários entre os anos de 2008 a
2016, vem aumentando o seu faturamento, respectivamente de R$ 2,5 a 5,5 bilhões de
reais, segundo o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para saúde Animal
(SINDAN, 2017). Dentre a classe desses medicamentos, o uso de antiparasitários é o
mais comercializado, conforme a Figura 1. Isso representa que esse setor é de grande
importância para a saúde animal e consequentemente para o consumidor do produto
final que é a carne.
Figura 1. Classes terapêuticas no uso de medicamentos veterinários
Fonte: SINDAN (2017)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
2008 2010 2012 2014 2016
34% 32% 27% 26% 21%
24% 26% 25% 27% 31%
18% 16% 16% 15% 14%
8% 8% 10% 14% 15%
4% 4% 5%
8% 8%
13% 14% 17% 11% 11%
ANOS
Classes dos medicamentos veterinários
BIOLÓG. ANTIPARASIT. ANTIMICROB. TERAPÊUT. SUPLEM. OUTROS
26
Os possíveis riscos à saúde humana decorrentes do emprego de
medicamentos veterinários em animais produtores de alimentos podem estar associados
aos resíduos dos mesmos em níveis acima dos limites máximos de resíduos (LMR). Isto
pode ocorrer quando o emprego do produto não observa as Boas Práticas de Uso de
Medicamentos Veterinários, em especial, quanto às especificações de uso. O
conhecimento da dimensão da exposição da população a esses compostos é de
fundamental importância para nortear as ações de controle visando à proteção do
consumidor (ANVISA, 2003a).
Na União Europeia, os órgãos regulatórios exigem o monitoramento de
resíduos de fármacos veterinários em tecidos comestíveis de animais produtores de
alimentos para estabelecer o grau de conformidade com os regulamentos do LMR,
assegurando assim a segurança da cadeia alimentar (HOLWELLS & SAUER, 2001).
O LMR é definido como a concentração máxima de resíduo tolerável no
alimento. O mesmo está fundamentado no tipo e quantidade de resíduo que pode ser
ingerido diariamente, durante toda a vida, sem que provoque danos à saúde, ou seja,
baseia-se na Ingestão Diária Aceitável (IDA) do composto, expressa em mg/kg de peso
corporal. A determinação da IDA é dada nas informações toxicológicas disponíveis do
composto analisado na época da avaliação (PASCHOAL et al., 2008).
Os procedimentos executados no âmbito do PNCRC/Animal são compostos
pela amostragem homogênea e aleatória das diversas matrizes e espécies animais
monitoradas, bem como de análises laboratoriais realizadas nos laboratórios da Rede
Nacional de Laboratórios Agropecuários, composta pelos Laboratórios Nacionais
Agropecuários – LANAGROs e laboratórios privados ou públicos credenciados pelo
MAPA. As diretrizes, programas, planos de trabalho e ações correspondentes constam
no Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem
Animal (PNCRC/Animal), instituído pela Instrução Normativa SDA N.º 11, de 22 de
maio de 2012, na qual prevê a regulamentações para alguns alimentos: leite bovino,
carne de frango, carne bovina, carne suína, pescado, ovos e mel (BRASIL, 2012).
Em 2013, através da Instrução Normativa de nº 17 de 31 de Maio, as carnes
de ovinos e caprinos foram incluídas para serem monitoradas pelo PNCRC/ animal.
Então, utilizam-se os parâmetros do Codex Alimentarius (2015) como referência de
LMR para a MOX.
O Codex Alimentarius é um programa conjunto da Organização das Nações
Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) e da Organização Mundial de Saúde
(OMS), que trata de um fórum internacional de normalização sobre alimentos
27
(PASCHOAL et al., 2008). Ele age como um gestor de risco e é responsável pelas
decisões finais no estabelecimento de LMR de medicamentos veterinários,
contaminantes e aditivos.
Na Tabela 4, observa-se o Limite Máximo de Resíduo (LMR) em tecidos,
estabelecidos pelo Codex Alimentarius para a MOX em ovinos.
Tabela 4. Valores de LMR de moxidectina em diferentes matrizes para a espécie ovina.
Medicamento Tecido Limite Máximo de
Resíduo (LMR)
Moxidectina
Fígado 100 µg/kg
Músculo 50 µg/kg
Tecido adiposo (gordura) 500 µg/kg
Rim 50 µg/kg
Fonte: Codex alimentarius (2015)
Lactonas Macrociclícas
Os derivados macrocíclicos da lactona, as avermectinas e milbemicinas,
utilizados como anti-helmínticos para o controle de parasitas, foram descobertos na
década de 1970 e comercializados no Brasil a partir de 1981. Pertencem a uma grande
família de compostos amplamente utilizados na criação de animais contra nematódeos e
artrópodes (HOLWELLS & SAUER, 2001; BORGES, 2003; PRICHARD et al., 2012).
As avermectinas são produzidas a partir do fungo Streptomyces avermitilis,
selecionado com base na atividade anti-helmíntica e inseticida. Ivermectinas (IVM) e
abamectinas (ABM) foram as primeiras lactonas macrocíclicas para uso em animais, o
que revolucionou o controle de parasitas na produção animal e na prevenção de
doenças. Posteriormente, foram descobertas a doramectina (DRM), eprinomectina
(EPM) e selamectina (SLM). A outra família das lactonas macrocíclicas corresponde às
milbemicinas, produzidas a partir do fungo Streptomyces hygroscopicus em 1967
(Figura 2). Em 1983, a MOX foi obtida a partir da modificação química da
nemadectina, substância natural produzida a partir da fermentação do Streptomyces
cyaneogriseus e subsequentemente comercializado (SPINOSA, 2006; PRICHARD et
al., 2012).
As avermectinas e as milbemicinas, que compreendem o grupo das lactonas,
são potenciais endectocidas, que mesmo em doses extremamente baixas, possuem o
28
mesmo mecanismo de ação e baseiam-se na interferência da transmissão dos impulsos
nervosos, causando paralisia no parasito (TORRANO, 2003; SPINOSA, 2006;
PRICHARD et al., 2012).
Figura 2. Esquema do desenvolvimento das avermectinas e milbemicinas.
Fonte: PRICHARDet al. (2012).
Haemonchus contortus é o nematódeo de maior patogenicidade que infesta
os ovinos. Os adultos desta espécie, além de se alimentarem de sangue, inoculam
substâncias anticoagulantes que provocam hemorragias, gastrites e erosão na mucosa do
abomaso, com consequente anemia. Este parasita ingere 0,08 mL de sangue por dia.
Animais com elevada carga parasitaria podem apresentar anemia, edema
submandibular, caquexia, prostração, podendo culminar em óbito (BUZULINI, 2006).
A Ivermectina (IVM) e abamectina (ABM) foram as primeiras lactonas
macrocíclicas desenvolvidas no início dos anos 1980 para utilização em animais. A
ivermectina, em particular, revolucionou o controle de parasitas em animais de
produção (PRICHARD et al., 2012).
Ivermectina (IVM), doramectina (DOR), eprinomectina (EPR), e
moxidectina (MOX), são compostos anti-helmínticos que podem ser administrados em
bovinos no combate a infestações parasitárias, como ascarídeos e ácaros. A aplicação
destes compostos pode ser por via oral ou injetável em bovinos, mas é comum o uso
tópico (PRICHARD et al., 2012).
AVERMECTINAS MILBEMICINAS
Abamectina
Ivermectina
Doramectina
Eprinomectina
Selamectina
Streptomyces
S. cyanogriseus
Nemadectina
Moxidectina
S. higroscopicus
Milbemicina 5-Oxima
Streptomyces
cyaneogriseus/higroscopicus
29
O tratamento com anti-parasitários de amplo espectro tem sido muito
importante para o controle de parasitas internos em pequenos ruminantes nas últimas
décadas. No entanto, a dependência de anti-helmínticos tem impulsionado o
desenvolvimento rápido de resistência do parasita, após a introdução de novas classes
deste tipo de medicamento no mercado. Para cada nova classe, a resistência
desenvolveu-se em pelo menos uma das espécies de nematódeos importantes de ovelhas
e cabras, dentro de poucos anos (LITTLE et al., 2011). Seu uso intensivo, subdoses,
diagnósticos incorretos e a rotatividade de bases farmacológicas sem critérios, têm
provocado um sério problema sanitário, que é a resistência de nematoides aos fármacos.
Este fenômeno é definido como a capacidade hereditária de uma população parasitária
de reduzir a sua sensibilidade à ação de uma ou mais drogas (FIEL, 2003). O problema
da resistência anti-helmíntica chegou a um patamar que não pode mais ser ignorado
como questão importante no controle de parasitas em animais (KAPLANA &
VIDYASHANKARB, 2012).
Moxidectina: natureza química e farmacológica
A estrutura molecular das avermectinas e das milbemicinas é semelhante e
ambas pertencem ao grupo das lactonas macrocíclicas (LM). Elas apresentam uma
estrutura cíclica principal composta por 16 elementos, incluindo o grupamento éster, o
qual confere a classificação de lactona. Possuem também um grupamento espiroacetal
no carbono C17 e um anel benzofurânico. No caso das avermectinas, há ainda a
presença de um grupo dissacarídeo no carbono C13, o que as diferencia das
milbemicinas (Figura 3) (MCKELLAR & BENCHAOUI, 1996, LIFSCHITZ et al.,
2002).
As propriedades físico-químicas das lactonas macrocíclicas incluem uma
alta massa molecular e elevada lipofilicidade, o que confere características
farmacocinéticas de um grande volume de distribuição, com grande afinidade por
gorduras corpóreas e prolongada persistência de concentração no organismo
(McKELLER & BENCHAOUI, 1996).
A MOX é a milbemicina com maior uso no gado bovino para o tratamento
dos endo e ectoparasitas. É ativa em doses extremamente baixas, contra uma ampla
variedade de nematoidese artrópodes nos estágios maduros e imaturos (EGERTON et
al., 1979; RODRÍGUES-VIVAS et al., 2010). É também indicada e amplamente usada
em ovinos (McKELLAR & JACKSON, 2004). Esta substância, obtida sinteticamente a
30
partir da nemadectina, apresenta uma substituição do grupamento hidroxila no C23 por
um grupamento metiloxima (LIFSCHITZ et al., 1999).
A MOX é um fármaco que pode ser usado em doses terapêuticas de 0,2 a
1,0 mg/kg de peso corporal em ovinos, sem apresentar reações adversas (RODRÍGUES-
VIVAS et al, 2010).
21
23
O
CH3
R3
O
OO
CH3
O
CH3 CH3
OH
R2
O
CH3
R1
O
OCH3
O
OO
O
OH
CH3
CH3
CH3
1
2 3
4
5
6
78
10
12
14
16
17
19
AVERMECTINA
espiroacetal
dissacarídeo
anel benzofurânico
Figura 3. Estrutura das lactonas macrocíclicas.
MOX é um composto que apresenta característica lipofílica maior que a
ivermectina e é principalmente armazenado no tecido adiposo (RODRIGUES-VIVAS et
al., 2010). Como consequência, possui efeito acumulativo e resulta em maior tempo
médio maior de permanência do fármaco no organismo, como tem sido demonstrado em
bovinos (ESCUREDO et al., 1999), ovinos (ALVINERIE et al., 1998) e caprinos
(ESCUREDO et al., 1999). A biotransformação ocorre no fígado e o composto, na
forma inalterada, é o principal resíduo encontrado na gordura e no leite em bovinos,
ovinos e equinos, sendo identificados apenas dois metabólitos (2%), o C-29
hidroximetil e o C-14 hidroximetil, na gordura e no leite (SPINOSA, 2006).
Os anti-helmínticos são absorvidos através do estômago e intestino
(preparações orais), do tecido subcutâneo e muscular (preparações injetáveis) e da pele
(pour-on), penetrando na circulação sistêmica. São transportados para diferentes tecidos
e órgãos, particularmente para o fígado, onde são biotransformados e posteriormente
31
excretados nas fezes e urina. A biotransformação e a excreção dos anti-helmínticos
varia entre as espécies animais e pode ser influenciada pela dose, via de administração e
propriedades físico-químicas (constantes de dissociação, solubilidade e peso molecular)
(SPINOSA, 2006).
O mecanismo de ação da MOX é de maneira semelhante a todas as lactonas.
Ela atua como agonista do GABA (ácido gama-aminobutírico), neurotransmissor das
células nervosas, estimulando a liberação pré-sináptica deste neurotransmissor, pelo
aumento de sua ligação aos receptores pós-sinápticos e também se liga aos canais de
cloro. Deste modo, o canal de cloro é aberto, aumentando a condução intracelular do
neurotransmissor, alterando a membrana do neurônio hiperpolarizando-a, resultando na
paralisia motora e eliminação do parasito (SPINOSA, 2006; AWASTHI et al., 2013).
Em relação à excreção, a MOX é excretada primeiramente nas fezes, com
um pico de excreção plasmática de aproximadamente 25 horas. Após a administração de
200 µg/kg, pelas vias oral e subcutânea, o pico plasmático foi de 6,5 ng/mL e 75 ng/mL,
respectivamente. O tempo de permanência da MOX nos tecidos foi também mais
prolongado quando aplicada por via subcutânea. A meia vida de eliminação no tecido
adiposo foi maior do que a ivermectina, entre 12 e 15 dias (MACKELLAR &
BENCHAOUI, 1996; SPINOSA, 2006).
Determinação das lactonas macrociclícas
O amplo uso de produtos antiparasitários em animais de produção e a
necessidade de assegurar a qualidade e inocuidade dos alimentos provenientes dos
mesmos levaram ao desenvolvimento de técnicas e metodologias mais sensíveis e
precisas para a determinação destes fármacos nos diferentes tecidos animais (SILVA,
2008).
Utilizando a técnica de ionização por electrospray (ESI), as avermectinas
são ionizadas preferencialmente no modo positivo, formando íons adutos de amônio
[M+NH4+] ou sódio [M+Na]
+. No modo negativo, formam principalmente íons
moleculares do tipo [M–H]-. Para essa fonte de ionização, o autor indica a aplicação do
modo negativo para substâncias que contém somente carbono, hidrogênio e oxigênio
nas suas estruturas, como ABA, a DORA e IVER. Para as demais substâncias que
apresentam nitrogênio nas suas estruturas, como EPR, MOX e EMA, o modo positivo
pode apresentar maior sensibilidade, sempre sendo considerados os diferentes aditivos
nas fases móveis (DURDEN, 2007).
32
A espectrometria de massa (EM) é uma ferramenta para o desenvolvimento
de métodos mais rápidos e sem a necessidade de derivatização dos analitos, os quais
tendem a ser instáveis e exigem processos laboriosos de preparo de amostra. A EM
permite trabalhar com um preparo de amostra mais simples, requerendo poucos passos
de purificação, além de possibilitar a análise quantitativa e confirmatória de analitos em
uma grande variedade de matrizes.
A cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massas triplo
quadrupolo (LC-MS/MS), através do monitoramento de ions em modo MRM
(monitoramento de reações múltiplas, do inglês multiple reaction monitoring), tem sido
a técnica mais difundida para a quantificação de resíduos de fármacos veterinários em
tecidos animais. Especialmente para a quantificação de resíduos de avermectinas e
milbemicinas, diversos trabalhos estão relatados na literatura, relacionados à
determinação desses fármacos em diversas matrizes como músculo (WANG et al.,
2001; SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009;NOPPE et al., 2009; KAUFFMAN et
al.,2011), Fígado (WANG et al., 2001; INOUE et al.,2009; NOPPE et al. ,2009;
KINSELLA et al., 2010;), rim, leite (WANG et al., 2001; WHELAN et al., 2010;
KAUFFMAN et al. ,2011; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (STOUT et al., 2000;
SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009).
Considerações Finais
O Brasil possui grandes potencialidades para se tornar grande produtor de
ovinos. Problemas relacionados à sanidade na ovinocultura podem ser amenizados com
a adoção das boas praticas de manejo na produção, tendo com isso benefícios
econômicos.
As verminoses gastrointestinais são consideradas o principal problema
enfrentado pelos criadores de ovinos. A utilização de métodos inadequados no combate
à verminose vem gerando a resistência dos parasitas aos vermífugos. Questões
relacionadas à existência de resíduos de medicamentos veterinários em carnes são cada
vez mais frequentes e o desenvolvimento de métodos analíticos adequados e sensíveis
para a determinação de resíduos de fármacos em tecidos é uma ferramenta essencial
para este tipo de estudo.
A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é uma técnica
que tem sido utilizada com grande frequência em determinação de resíduos de fármacos
veterinários em tecidos de cordeiros pelas vantagens que oferece, como confirmação da
presença da substância, seletividade, detectabilidade, dentre outras.
33
Referências
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34
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38
CAPÍTULO II
Desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação de
moxidectina em tecidos de cordeiro
Michelle Del Bianchi, Maria A. M. Fernandes, Patricia A. de C. Braga,
Alda L. G. Monteiro, Daniela Daniel, Felix G. R. Reyes
Artigo em preparação para ser submetido ao Journal of Chromatography B
39
RESUMO
Moxidectina (MOX) é um anti-helmíntico comumente utilizado na ovinocultura para o
tratamento de endo e ectoparasitoses. Haemonchus contortus é o nematódeo de maior
patogenicidade que acomete os ovinos e que pode provocar hemorragias, gastrites e
erosão na mucosa do abomaso, com consequente anemia no animal. O uso intensivo de
anti-helmínticos, subdoses e diagnósticos incorretos tem provocado um sério problema
sanitário, que é a resistência dos nematoides aos fármacos. Neste trabalho, foi
desenvolvido e validado um método para determinar os resíduos de MOX em tecidos de
cordeiro (músculo, fígado, rim e gordura) utilizando a cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massas (LC-MS/MS). No preparo de amostra foi empregado o
método QuEChERS com modificações. A técnica de LC-ESI-MS/MS foi extremamente
eficiente para a quantificação dos resíduos da MOX devido a sua alta seletividade e
sensibilidade. O método apresentou exatidão, precisão e linearidade adequadas com
base nas recomendações descritas nos guias de validação utilizados como referências.
Além disso, mostrou boa detectabilidade, tendo sido estabelecido um limite de
quantificação (LOQ) de 5,0 ng g-1
e limite de detecção (LOD) 1,5 ng g-1
, para todas as
matrizes. Os valores de recuperação do analito, frente às diferentes matrizes estudadas,
estiveram entre 71-120% e coeficientes de correlação (r) obtidos nas curvas analíticas
foram superiores a 0,99. O método de extração se mostrou eficiente, tendo sido
estabelecido o mesmo preparo de amostra para todas as matrizes. Além disso, foram
realizados teste de estabilidade do analito (solução e amostra) nos quais os resultados se
mostraram satisfatórios.
Palavras-chave: Moxidectina, tecidos de cordeiro, QuEChERS, LC-ESI-MS/MS.
40
ABSTRACT
Moxidectin (MOX) is an anthelmintic commonly used in the lamb farming for the
treatment of endo and ectoparasites. Haemonchus contortus is the most pathogenic
nematode that affects the animals and can cause bleeding, gastritis and erosion in the
lining of the abomasum, leading to the development of anemia in the animals. The
intensive use of anthelmintics, underdosing and misdiagnosis has caused a serious
health problem, which is the resistance of nematodes to the drugs. In this study, an
analytical method for quantitation of MOX residues in lab tissues (muscle, liver, kidney
and fat) was developed and validated using liquid chromatography-mass spectrometry
(LC-MS/MS). The sample preparation was carried out by the QuEChERS extraction
method with some modifications. The technique LC-ESI-MS/MS was extremely
efficient for the quantitation of MOX residues, due to its high selectivity and sensibility.
The method showed appropriate accuracy, precision and linearity, based on
recommendations described in the validation guides used as a reference. In addition, it
showed good detectability, having been established a limit of quantitation (LOQ) of 5.0
ng g-1
and limit of detection (LOD) of 1.5 ng g-1
, the recoveries achieved were between
71-120% and the correlation coefficients (r) achieved in the calibration curves were
higher than 0.99. Also, analyte stability tests (solution and sample) were performed in
which the results were satisfactory.
Key words: Moxidectin, lamb tissues, QuEChERS, LC-ESI-MS/MS
41
Introdução
As avermectinas e milbemicinas, derivadas de lactona macrocíclica
utilizadas como anti-helmínticos para o controle de parasitas (nematódeos e parasitas
artrópodes), pertencem a uma grande família de compostos amplamente utilizados na
criação de animais (HOWELLS & SAUER, 2001; BORGES, 2003; PRICHARD et al.,
2012).
As avermectinas são produzidas a partir do fungo Streptomyces avermitilis,
selecionado com base na atividade anti-helmíntica e inseticida. Ivermectina (IVM) e
abamectinas (ABM) foram as primeiras lactonas macrocíclicas descobertas no início
dos anos 80 para uso em animais, e que revolucionaram o controle de parasitas na
produção e prevenção de doenças animais. Posteriormente, foram descobertas a
doramectina (DRM), eprinomectina (EPM) e selamectina (SLM). A outra família das
lactonas macrocíclicas são chamadas de milbemicinas, produzidas a partir do fungo
Streptomyces hygroscopicus (PRICHARD et al., 2012).
Em 1983, a moxidectina (MOX) foi obtida a partir da modificação química
da nemadectina, substância natural produzida através da fermentação do Streptomyces
cyaneogriseus. A MOX, em relação à nemadectina, apresenta uma substituição do
grupamento hidroxila em C23 por um grupamento metiloxima (LIFSCHITZ et al.,
1999; SPINOSA, 2006; PRICHARD et al., 2012).
Figura 1: Diferenças estruturais entre nemadectina e moxidectina
Anastassiades e colaboradores (2003) desenvolveram uma técnica de
preparo de amostra para análise multirresíduo de agroquímicos em alimentos de origem
vegetal, denominado QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). O
21
2223
24
Moxidectina
O
CH3 CH3
CH3
O
OO
CH3
O
CH3 CH3
OH
N
H
OHH
CH3H
OCH3
H
O
CH3 CH3
CH3
O
OO
CH3
O
CH3 CH3
OH H
OHH
CH3H
OH
H
21
2223
24
Nemadectina
42
método apresenta como vantagens ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e
seguro, consistindo em um procedimento dinâmico que pode ser aplicado em qualquer
laboratório. O método consiste na extração com solventes orgânicos, seguida por
partição líquido-líquido com adição de sais para efeito salting-out, tamponamento
quando necessário, secagem e finalmente uma etapa de clean-up. Com objetivo de
atender a rigorosos LMRs, estabelecidos por legislações internacionais, este método de
preparo da amostra foi idealizado para gerar extratos que pudessem ser analisados por
cromatografia líquida e/ou cromatografia gasosa, acopladas a espectrometria de massas
(GC-MS/MS e LC-MS/MS) (ANASTASSIADES et al., 2003). Todavia, embora seja
um método oficial para resíduos de agroquímicos em alimentos pela Association of
Official Analytical Chemists (AOAC) e pelo European Committee for Standardization,
o método QuEChERS tem sido amplamente empregado na extração de outros tipos de
analitos como fármacos, acrilamida e micotoxinas, assim como na análise de matrizes
alimentícias de origem animal (PRESTES et al., 2009).
Trapero-Pimentel et al. (2016), determinaram lactonas macrocíclicas (ABA,
IVER, DORA e MOX) em tecido de fígado bovino, usando HPLC-FLD. Os analitos
foram extraídos utilizando o método QuEChERS. Embora no método utilizado tenha
sido necessária uma etapa de derivatização, a qual o torna mais demorado, os autores
consideraram o método de extração rápido e simples podendo ser utilizado em análise
de rotina. Outros autores também, utilizaram esse método através da técnica de LC-
MS/MS para determinação das lactonas em carnes (RUBIES, et al., 2015), produtos
lactéos (FURLANI, et al., 2015) e em fígado bovino (KINSELLA, et al., 2010).
Diversos trabalhos têm usado a espectrometria de massas para a
quantificação de resíduos de avermectinas e milbemicinas em músculo (WANG et al.,
2001; SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009; NOPPE et al., 2009; KAUFFMAN et al.,
2011), fígado (WANG et al., 2001; INOUE et al., 2009; KINSELLA et al., 2010;
NOPPE et al., 2009), rim, leite (WANG et al., 2001;WHELAN et al., 2010;
KAUFFMAN et al., 2011; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (STOUT et al., 2000;
SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009).
O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de
método analítico (LC-MS/MS), para a quantificação da MOX em músculo, fígado, rim
e gordura de cordeiros utilizando no preparo da amostra o método QuEChERS com
algumas modificações.
43
44
Materiais e Métodos
Solventes e Reagentes
Acetonitrila (ACN) marca J.T. Baker (Philipsburg, USA) foi utilizada no
preparo de fase móvel e também no procedimento de extração das amostras. Ácido
fórmico e solução de formiato de amônio 5 M, utilizados no preparo de fase móvel,
foram fornecidos pela Agilent Technology. Sulfato de magnésio (MgSO4) e cloreto de
sódio (NaCl) foram obtidos da Sigma (Sigma-Aldrich Co. - USA). Para o cleanup
foram utilizados kits fornecidos pela Agilent Technology (Part. Nº5982-5022CH),
contendo PSA (amina primária secundária) e MgSO4 (nas proporções 50:150 mg) e
outro kit (Part. Nº 5982-5122CH), contendo PSA, C18 (octadecilsilano) e MgSO4 (nas
proporções 50:50:150 mg). Água ultra-pura foi obtida pelo sistema Milli-Q Simplicity
(Millipore, Bedford, MA, USA). As membranas de filtração de politetrafluoretileno
(PTFE) de 0,22 µm de porosidade foram adquiridas da empresa Nova Analítica e
utilizadas na filtração dos extratos da amostra.
Os padrões analíticos utilizados no projeto foram emamectina (EMA),
utilizada como padrão interno e MOX (Sigma-Aldrich), com grau de pureza de 99,7% e
97,2%, respectivamente.
Preparo de Soluções
As soluções estoque foram preparadas em ACN na concentração de 55 g
mL-1
para MOX e 60 g mL-1
para EMA, armazenadas em frascos âmbar e mantidas em
freezer a temperatura de -20 ºC, por até 90 dias.
As soluções de trabalho foram preparadas pela diluição apropriada das
soluções estoque em acetonitrila, sendo para MOX preparadas soluções nas
concentrações de 1,0 g mL-1
e 2,0 µg mL-1
e para EMA (padrão interno) 50,0 ng mL-1
e 100,0 ng mL-1
. As soluções foram armazenadas a -20 ºC, por até 15 dias.
Equipamentos
Para pesagem das amostras e dos padrões analíticos foi utilizada balança
analítica, modelo BL 2105 (Sartorius, Alemanha). A trituração das amostras foi
realizada em processador de alimentos modelo RI2086, marca Philips Walita (Barueri,
São Paulo), e a homogeneização foi feita utilizando-se um agitador de tubos tipo vortex
45
modelo G560 (DAIGGER-USA). Centrífuga refrigerada marca Eppendorf, modelo
5810R (Hamburg, Alemanha) foi utilizada na obtenção dos extratos.
As análises foram realizadas em sistema LC da Agilent modelo 1290,
composto por bombas quaternárias, injetor automático, termostato para coluna e para
amostrador acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo modelo 6460
(Agilent Technology, CA, USA) usando ESI (Electrospray Ionization) como fonte de
ionização no modo positivo. O software de controle de aquisição e tratamento dos dados
foi o MassHunter (Agilent Technology, CA, USA), versão B.06.00.
Condições do sistema LC-ESI-MS/MS
A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna analítica
Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD (2,1 x 50 mm, 1,8 µm), Agilent Tecnhologies®,
mantida em forno com temperatura controlada de 30ºC. Utilizou como fase móvel um
gradiente de solução de formiato de amônio 5 mM + 0,1% de ácido fórmico (A) e
acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico (B), conforme Tabela 1. As condições de eluição
foram otimizadas com fluxo de 0,5 mL min-1
, volume de injeção de 5 µL e temperatura
do forno de 30 0C.
Tabela 1.Composição da fase móvel e gradiente utilizado.
Formiato de Amônio 5 mM
+ 0,1% Ácido Fórmico
Acetonitrila +
0,1% Ácido Fórmico
Tempo (min.) % A % B
0 45 55
1,50 45 55
1,51 5 95
4,50 5 95
4,51 45 55
6,00 45 55
A quantificação da MOX foi realizada em modo MRM (multiple reaction
monitoring), com utilização de emamectina como padrão interno. Foram monitoradas
duas transições para cada molécula, sendo uma transição relacionada ao íon
quantificador e outra relacionada ao íon qualificador, com objetivo de obter pelo menos
3 pontos de identificação, como preconizado pelo Guia da Comunidade Europeia
2002/657/CE (EC, 2002). Na Tabela 2 são apresentados os parâmetros da fonte de
46
ionização e energia de colisão que foram adotados para o método de determinação de
resíduos de MOX.
Tabela 2: Parâmetros de fonte de ionização (ESI modo positivo) utilizados
Parâmetro
Gas Temp. 200◦C
Gas Flow 10 Lmin-1
Nebulizer 15 psi
Sheat Gas Temp. 400◦C
Sheat Gas Flow 12 Lmin-1
Capillary 5000 v
Nozzle Voltage 2000 v
Fragmentor 120 v
Molécula Transição Energia de Colisão (v)
Emamectina 886,5 158,0 40
886,5 126,1 48
Moxidectina 640,4 528,0 4
640,4 498,0 8
Preparo da amostra
Neste trabalho o preparo da amostra foi realizado conforme o método
QuEChERS (Anastassiades et al., 2003), porém com modificações conforme descrito a
seguir:
Amostras dos tecidos (músculo, fígado, rim e gordura) foram trituradas
individualmente, ainda congeladas, em microprocessador. A seguir, foram pesadas 2,0 g
de amostra em tubos de polipropileno de 50 mL, e adicionados 20 µL da solução de
trabalho contendo o padrão interno (100 ng mL-1
). Em seguida foram adicionados 2 mL
de ACN e uma cerâmica de homogeneização (Part. Nº 5982-9313, Agilent
Technologies®), e os tubos foram submetidos a agitação em vórtex por 5 min. Em
seguida 0,8 g de MgSO4 e 0,2 g de NaCl foram adicionados, agitando-se o tubo em
vórtex por mais 5 min antes da centrifugação a 10.000 g, por 5 min, a 25 ºC. Uma
alíquota de 1,0 mL foi transferida para um microtubo contendo MgSO4 e PSA (150:50
mg) para realização do cleanup das amostras de músculo, fígado e rim. Agitou-se em
vórtex por 30 segundos e em seguida a amostra foi centrifugada a 10.000 g, por 1 min, a
25 ºC. O sobrenadante foi filtrado em membranas de PTFE diretamente no vial do LC, e
injetado no sistema LC-MS/MS. Para análise da gordura, o preparo de amostra foi
47
realizado seguindo o mesmo procedimento, porém na etapa de clean-up foi adicionado
C18 tendo-se, assim, utilizado PSA, C18 e MgSO4 na proporção de 50:50:150 mg,
respectivamente.
Validação do método analítico
Os procedimentos de validação adotados no Brasil baseiam-se em guias
disponibilizados por órgãos credenciados nacionais, como a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003), o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento- MAPA (BRASIL, 2011) e o Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2007). Outros órgãos internacionais,
como União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), Organização
Internacional para Padronização (ISO), Conferência Internacional de Harmonização
(ICH), Comunidade Europeia (EC), Organização das Nações Unidas para Alimentos e
Agricultura (FAO), a Agência Norte-Americana de Administração de Drogas e
Alimentos (FDA), também estabelecem procedimentos de validação como critério
fundamental no credenciamento de laboratórios (PASCHOAL et al., 2008). A validação
do método analítico deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
desenvolvido atenda as exigências das aplicações pretendidas, assegurando a
confiabilidade dos resultados (ANVISA, 2003).
O método desenvolvido para a quantificação de resíduos de MOX em
tecidos de cordeiro foi validado seguindo as recomendações do Guia de Validação de
Métodos Analíticos estabelecido pelo MAPA (BRASIL, 2011), pela Comunidade
Europeia (EC, 2002) e pelo VICH (2011), no estabelecimento de critérios de
desempenho para métodos analíticos, destinados à determinação de resíduos e
contaminantes em alimentos de origem animal. Para tanto foram estabelecidos os
seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão intra e interdias,
exatidão, limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ), limite de
quantificação (LOQ) e limite de detecção (LOD).
Para a validação do método analítico, a fortificação dos tecidos foi realizada
com soluções de trabalho nas concentrações de 1000 e 2000 ng mL-1
de MOX e 50 e
100 ng mL-1
de EMA. Dessa forma, para cada nível de fortificação diferentes alíquotas
da solução de trabalho foram tomadas para obter a concentração desejada. Sendo que a
solução mais concentrada do padrão interno foi para preparar a curva na matriz.
48
A seletividade do método foi avaliada por comparação do cromatograma
obtido na análise das amostras branco de músculo, fígado, rim e gordura (n = 10) e das
matrizes fortificadas no LOQ (5 ng g-1
), verificando-se a ausência de interferentes
coeluindo com os analitos (MOX e EMA), ou próximo ao tempo de retenção.
A linearidade e sensibilidade foram estabelecidas a partir de curvas
analíticas dos padrões de MOX e EMA, preparadas em solvente, no extrato da amostra
branco, e através da fortificação da matriz branca propriamente dita na faixa de
concentração de 5 a 200 ng mL-1
e ng g-1
para cada tecido. Os resultados de linearidade
e sensibilidade foram expressos através dos coeficientes de correlação linear (r) obtidos
e pela inclinação da curva analítica, dada pelos coeficientes angular (b),
respectivamente.
O efeito matriz foi avaliado pela realização dos testes F e t de Student e os
efeitos obtidos para cada um dos analitos foram expressos em porcentagem. Para o
cálculo, foram comparados os resultados obtidos para o extrato fortificado, nos níveis
de concentração correspondentes a 5; 50; 100 e 200 ng mL-1
de extrato, com os
resultados obtidos para os mesmos níveis de concentração dos analitos em solvente.
A precisão do método foi determinada em duas situações: (i) repetibilidade
(precisão intradia) e (ii) a reprodutibilidade (precisão interdia). A precisão foi avaliada
nos seguintes níveis de fortificação: 5; 50; 100 e 200 ng g-1
, em 6 replicatas para cada
nível. A repetibilidade foi expressa pelo coeficiente de variação (CV %) dos resultados
de cada nível de fortificação, analisados no mesmo dia e usando o mesmo instrumento.
A reprodutibilidade também foi expressa pelo CV % dos resultados das análises
realizadas em três dias diferentes (n = 18), pelo mesmo analista, usando o mesmo
instrumento.
A exatidão foi avaliada através do teste de recuperação da matriz fortificada,
em 4 níveis de fortificação 5; 50; 100 e 200 ng g-1
. Cada nível de fortificação foi
avaliado utilizando 6 replicatas. Os resultados foram expressos como a percentagem das
concentrações médias fortificadas na matriz em relação a concentração fortificada no
extrato na mesma concentração.
Os limites de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram
estabelecidos através da análise da matriz fortificada com solução padrão de MOX. O
LOD foi expresso como a menor concentração cujo sinal equivale a 3 vezes a relação
sinal/ruído, enquanto que o LOQ foi estabelecido como menor concentração capaz de
produzir um sinal equivalente no mínimo, 10 vezes a relação sinal/ruído, com CV%
49
menor do que 20 % e exatidão entre 80-120%, conforme preconizado no guia do MAPA
(2011) e da Comunidade Europeia (EC, 2002).
Os valores de CCα e CCβ foram calculados utilizando-se os resultados da
curva analítica matrizada. CCα foi calculado como a concentração correspondente ao
LMR mais 1,64 o desvio padrão da reprodutibilidade, adotando-se erro igual à 5%. O
CCβ foi calculado como a concentração equivalente a CCα mais 1,64 vezes o desvio
padrão da reprodutibilidade, adotando-se erro β igual à 5%.
Os estudos de estabilidade visam avaliar se o analito sofre ou não influência
das condições de análise e estocagem das amostras (ANVISA, 2012). Foram realizados
dois testes de estabilidade durante a validação e na avaliação da robustez de alguns
parâmetros:
Estabilidade de curta duração: que tem como objetivo avaliar se o analito em
estudo permanece estável na matriz biológica nas condições de temperatura,
luminosidade e umidade presentes no laboratório. Neste caso as amostras foram
fortificadas no LMR de cada matriz e deixadas sobre a bancada por 4 horas e após esse
período as mesmas foram submetidas ao processo de extração e análise.
Estabilidade de ciclos de gelo e degelo: que tem como objetivo, avaliar se o
analito permanece estável após 3 ciclos de congelamento e descongelamento na matriz..
As amostras foram fortificadas e congeladas por 24 horas e então descongeladadas
novamente por 12 horas e posteriormente congeladas. Este processo foi repetido durante
3 ciclos, 24, 48 e 72 horas.
A robustez de um método determina sua sensibilidade a pequenas variações.
Um método diz-se robusto quando se revelar praticamente insensível a pequenas
variações intrínsecas da própria análise que possam ocorrer quando o mesmo está sendo
executado (BRASIL, 2011). Foi realizado o teste de robustez em relação ao fluxo da
fase móvel e a temperatura da coluna.
Resultados e Discussão
Otimização do método
O preparo da amostra consiste na obtenção do extrato representativo da
mesma. Deve ser conduzido de modo a extrair o máximo do analito de interesse sem
perdas e alterações em sua estrutura química. A homogeneização é uma etapa
indispensável em qualquer análise, pois a alíquota analisada precisa representar todo
material amostral. A fim de se evitar qualquer degradação do analito decorrente do
50
calor, utiliza-se a amostra ainda congelada ou parcialmente congelada. Deve-se utilizar
a menor quantidade de amostra representativa, de modo a reduzir o volume de solventes
e reagentes necessários (KOWALSKI et al., 2005).
Neste trabalho, para a extração dos resíduos de MOX em tecidos de cordeiro
(músculo, fígado, rim e gordura), foi utilizado o método QuEChERS (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged, Safe) proposto por Anastassiades et al., (2003), porém com
modificações.
No método original QuEChERS, os resíduos de agroquímicos são extraídos
a partir de 10 g de amostra com 10 mL de ACN. A remoção da água do extrato e o
aumento da extração de analitos polares pelo efeito salting out são promovidos pela
adição de 1 g de cloreto de sódio e 4 g de sulfato de magnésio. Após esta extração, uma
alíquota de 1 mL do extrato é submetida a etapa de clean-up e redução de água residual
com 25 mg do sorvente amina primária-secundária (PSA) e 150 mg de sulfato de
magnésio.
A fim de obter um método de baixo custo e que utilize menor quantidade de
solvente, optou-se em utilizar 2 g de amostra para 2 mL de ACN, utilizando também os
sais na mesma proporção do método original. A ACN é um solvente muito utilizado
para a extração de resíduos de MOX em diversos tecidos (KINSELLA et al., 2009;
NOPPE et al., 2009; WANG et al., 2011), proporcionando uma menor quantidade de
coextrativos lipofílicos provenientes da amostra e é compatível com o sistema
cromatográfico utilizado.
Devido à alta complexidade das matrizes, (ricas em água, proteínas, gordura
e minerais), após a extração, foram realizados testes com e sem clean-up, utilizando
PSA e C18.
O PSA possui um elevando efeito quelante, devido à presença dos grupos
amino primário e secundário em sua estrutura, retendo, portanto, ácidos graxos livres,
açucares e compostos polares presentes na matriz. O sorvente C18 promove uma
limpeza mais efetiva em matrizes que contem elevado teor de gordura, tendo uma boa
eficiência na remoção de compostos apolares como lipídeos e ácidos graxos de cadeia
longa. Por essa razão, fez-se o uso destes dois sais juntamente com o sulfato de
magnésio no processo de limpeza do extrato (PRESTES et al, 2009).
Somente na matriz gordura foi necessário o uso de C18 no procedimento de
limpeza do extrato, já nas outras matrizes apenas o PSA foi utilizado obtendo-se bons
51
resultados de recuperação. O uso do sulfato de magnésio em todas as matrizes foi
fundamental devido a sua maior capacidade da remoção de água.
Validação analítica
Para validação do método optou-se por seguir os guias disponibilizados pela
Comunidade Europeia (EC, 2002), MAPA (2011) e VICH (2011) que versam, entre
outros assuntos, sobre a validação de métodos bioanalíticos.
As amostras brancas utilizadas para o desenvolvimento do método analítico
foram extraídas e seus extratos avaliados quanto à presença de interferentes que
pudessem comprometer o método. Nenhum interferente foi detectado, nos tempos de
retenção correspondentes a MOX e EMA, em nenhum dos tecidos analisados (músculo,
fígado, rim e gordura), garantindo a seletividade e especificidade do método
desenvolvido, assim como a viabilidade das amostras brancas serem utilizadas na
validação do método analítico (Figuras 2, 3, 4, 5). O tempo de retenção da MOX nos
diferentes tecidos foi de TR: 4,28 e o da EMA TR: 1,29 min.
52
Figura 2. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de músculo e branco
fortificada na concentração do LOQ (5 ng g
-1).
Figura 3. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de fígado e branco
fortificada na concentração do LOQ (5 ng g
-1).
53
Figura 4. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de rim e branco
fortificada na concentração do LOQ (5 ng g
-1).
Figura 5. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de gordura e branco
fortificada na concentração do LOQ (5 ng g-1
).
A faixa de linearidade utilizada para todas as matrizes foi de 5-200 ng g-1
.
Os níveis de concentração para a construção da curva analítica ao redor do LMR para a
matriz músculo foram: 5, 10, 25, 50, 75, 100 e 200 ng g-1
. Já para as matrizes fígado,
rim e gordura, os níveis foram: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150 e 200 ng g-1
. Os valores
obtidos de área dos sinais analíticos da MOX apresentaram forte correlação linear com
os valores de concentração, apresentando coeficientes de correlação (r) superiores a
0,99 para a MOX. Três tipos de curvas analíticas foram construídas para as quatro
matrizes analisadas: curvas do analito no solvente, curvas do analito no extrato da
matriz e curvas do analito na matriz propriamente dita, como pode ser observado nas
Figuras 6, 7, 8 e 9.
54
Figura 6. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, curvas no extrato da
matriz e curvas na matriz músculo, todas preparadas em triplicata.
Figura 7. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da matriz
e na matriz fígado, todas preparadas em triplicata.
y = 0,013x + 0,0174 R² = 0,9997
y = 0,0097x + 0,0307 R² = 0,9986
y = 0,0087x + 0,0108 R² = 0,9996
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 50 100 150 200 250
Áre
a M
ox/E
ma
Concentração (ng/g)
Matriz Músculo
Solvente
Extrato
Matriz
y = 0,1043x - 0,2091 R² = 0,9984
y = 0,0571x - 0,1628 R² = 0,9957
y = 0,0591x - 0,0069 R² = 0,9982
0,000000
5,000000
10,000000
15,000000
20,000000
25,000000
0 50 100 150 200 250
Áre
a M
ox/E
ma
Concentração (ng/g)
Matriz Fígado
Solvente
Matriz
Extrato
55
Figura 8. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da matriz
e na matriz rim, todas preparadas em triplicata.
Figura 9. Curvas de Calibração obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da
matriz e na matriz gordura, todas preparadas em triplicata.
Os resultados de exatidão e precisão do método (Tabela 3) estão de acordo
com os valores preconizados pelos Guias de Validação do MAPA (BRASIL, 2011), na
decisão da Comunidade Europeia 2002/657/EC (EC, 2002) e do VICH (2011). Assim,
y = 0,0135x - 0,0551 R² = 0,997
y = 0,0061x - 0,0351 R² = 0,9919
y = 0,0073x - 0,063 R² = 0,9858
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 50 100 150 200 250
Áre
a M
ox/E
ma
Concentração (ng/g)
Matriz Rim
Solvente
Matriz
Extrato
56
os valores médios de exatidão, obtidos mediante ensaios de recuperação, estão dentro do
intervalo de 70 a 120% preconizados pelos guias.
A precisão do método foi avaliada em função da repetibilidade e da precisão
intermediária de acordo com as recomendações dos guias já citados. Para o estudo da
repetibilidade, foi realizada a extração da amostra fortificada com solução de padrão em
quatro diferentes níveis de concentração: 5, 50, 100 e 200 ng g-1
, com seis replicatas
individuais por nível e, a partir das 24 determinações, foi calculado o CV(%). A
precisão intermediária foi avaliada, assim como a repetibilidade nos mesmos níveis de
concentração, porém em três diferentes dias. Os valores de CV% obtidos foram
adequados tanto para a precisão intradia como para a precisão interdia, conforme o guia
VICH (2011), os quais situaram-se entre 5,9-19,8% e 8,0-22,5%, respectivamente.
Tabela 3. Precisão e Exatidão nas matrizes músculo, fígado, rim e gordura de cordeiro
por LC-MS/MS
Parâmetros
analíticos Músculo Fígado Rim Gordura
Valores aceitáveis*
CV%
Precisão
Intradia (CV %)
5 ng g-1
(n=6) 5,89 13,11 10,81 19,18 25
50 ng g-1
(n=6) 6,64 11,82 10,12 15,05 15
100 ng g-1
(n=6) 6,63 7,03 13,03 14,45 15
200 ng g-1
(n=6) 8,51 6,01 7,62 16,08 15
Interdia (CV %)
5 ng g-1
(n=18) 20,6 21,81 17,66 22,5 32
50 ng g-1
(n=18) 8,68 11,9 8,7 15,1 23
100 ng g-1
(n=18) 8,47 8,5 14,57 13,7 15
200 ng g-1
(n=18) 8,02 9,51 8,85 9,8 16
Exatidão (%)
5 ng g-1
(n=6) 71,61 120 108,9 92,54 -40% a +20%
50 ng g-1
(n=6) 103,96 110,26 82,2 73,2 -30% a +10%
100 ng g-1
(n=6) 103,46 103,88 111,2 71,66 -30% a +10%
200 ng g-1
(n=6) 97,82 105,71 99,6 81,8 -20% a +10%
(CV %) Coeficiente de Variação.
*Valores preconizados no guia de validação da VICH (2015) e MAPA (2011).
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram
estabelecidos através da análise de amostras branco fortificadas com soluções do analito
em acetonitrila. O LOQ foi considerado como sendo o primeiro ponto da curva em
57
todos os tecidos, ou seja, 5 ng g-1
, levando em consideração a precisão e a exatidão
aceitáveis. E o LOD foi estabelecido igual a mínima concentração detectável do analito
presente na amostra fortificada, com razão sinal-ruído igual a 3. Para determinar o
desempenho do procedimento analítico, avaliou-se o limite de decisão (CCα) e a
capacidade de detecção (CCβ), através de equações 1 e 2, em que os resultados foram
superiores ao LMR, sendo portanto considerados satisfatórios. Porém, não foi calculado
este parâmetro para matriz gordura, pois a curva foi construída abaixo do LMR
estabelecido, garantindo a quantificação do analito com uma boa margem de segurança.
CCα =LMR + 1,64 x σ (1)
CCβ = CCα + 1,64 x σ (2)
Em que σ: desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial
Como a gordura tem um LMR de 500 ng g-1
e o trabalho tem como objetivo
análise de resíduos de MOX, optou-se por trabalhar com um range de concentração
abaixo do LMR permitido para a gordura a fim de se garantir a linearidade, mantendo o
LOQ de 5 ng g-1
e diluindo as amostras quando necessário.
Tabela 4. Valores de LOD, LOQ, CCα e CCβ nos tecidos músculo, fígado, rim e
gordura de cordeiro por LC-MS/MS.
Matriz
LMR
(ng g-1
)
LOD
(ng g-1
)
LOQ
(ng g-1
)
Ccα
(ng g-1
)
ccβ
(ng g-1
)
Músculo 50 1,5 5,0 60,89 71,8
Fígado 100 1,5 5,0 119,4 130,9
Rim 50 1,5 5,0 66,59 83,28
Gordura 500 1,5 5,0 ---- ----
(----) Não foi possível calcular, pois o range da curva analítica foi estabelecido abaixo do LMR
para este tecido.
O efeito matriz foi avaliado pela comparação estatística entre as
concentrações médias determinadas no extrato fortificado e as concentrações médias
dos analitos no solvente, utilizando teste F (Snedecor) para médias iguais e confirmação
através do teste t (para amostras diferentes), em amostras que apresentam efeito, no
nível de confiança de 95%. Não houve efeito matriz no ponto de 5,0 ng g-1
para as
matrizes músculo, rim e gordura, porém nos outros pontos em todas as matrizes
verificou-se a perda de sinal. Ou seja, houve efeito matriz o qual, calculado em
58
porcentagem, variou entre 17,7 a 88,4 % (Tabela 5). Dessa maneira, todas as amostras
foram quantificadas em curva matrizada.
Tabela 5. Efeito matriz observado no método de quantificação de MOX em músculo,
fígado, rim e gordura de cordeiro por LC-MS/MS (expresso em %).
Parâmetros Analíticos Músculo Fígado Rim Gordura
Efeito
Matriz
(%)
5 ng g-1
(n=6) * 38,70 * *
50 ng g-1
(n=6) 17,78 47,76 65,57 69,31
100 ng g-1
(n=6) 22,87 45,20 88,41 30,41
200 ng g-1
(n=6) 25,12 46,67 44,89 31,72
(*) Não houve efeito matriz
O estudo de estabilidade de curta duração teve como objetivo avaliar se o
analito em estudo permanece estável na matriz biológica nas condições de temperatura,
luminosidade e umidade presentes no laboratório. As amostras foram fortificadas (n=3)
na concentração do LMR de cada matriz e deixadas sobre a bancada por 4 horas , porém
com exceção da gordura, que foi fortificada no ponto central da curva 100 ng g-1
, pois
foi realizada a curva analítica com precisão e exatidão abaixo do LMR. Após esse
período foram submetidas ao processo de extração e análise. Os resultados obtidos
foram comparados com os resultados de amostras extraídas após a fortificação como
valor de CV% ≤ 15.
O estudo de estabilidade de ciclos de gelo e degelo teve como objetivo
avaliar se o analito permanece estável após 3 ciclos de congelamento e
descongelamento. As amostras foram fortificadas como no estudo anterior e congeladas
por 24 horas e então descongeladas, novamente congeladas por pelo menos 12 horas e
posteriormente descongeladas. Este processo foi repetido e as amostras foram
analisadas no tempo de 24, 48 e 96 horas neste ciclo de congelamento e
descongelamento. Após estes ciclos as amostras foram submetidas ao processo de
extração e análise. Os resultados obtidos foram comparados com os resultados de
amostras extraídas logo após a fortificação. Os critérios de aceitação utilizados foram os
mesmos para precisão e exatidão.
59
Na tabela 6 e 7, são apresentados os resultados (concentração da média ±
desvio padrão) de estabilidade de curta duração e de ciclos de gelo e degelo que
demonstraram que não houve diferença significativa entre as amostras, quando
analisado pela ANOVA (nível de confiança 95%), através do teste F e teste t. Portanto,
não houve degradação da MOX nas matrizes biológicas, garantindo a estabilidade da
molécula nas matrizes analisadas.
Tabela 6. Estabilidade de curta duração da moxidectina (média ± desvio padrão).
Matriz Concentração após 4 horas
Músculo (50 µg kg-1
) 50,25± 1,04
Fígado (100 µg kg-1
) 102,55±1,50
Rim (50 µg kg-1
) 51,40± 1,30
Gordura (100 µg kg-1
) 103,30±1,80
Tabela 7. Estabilidade de ciclos de gelo e degelo (média ± desvio padrão).
Matriz 24 horas 48 horas 96 horas
Músculo (50 µg kg-1
) 53,14 ± 1,04 50,20± 1,25 49,86±1,40
Fígado (100 µg kg-1
) 102,80 ± 1,50 102,95 ± 1,10 104,40 ± 1,90
Rim (50 µg kg-1
) 52,40 ± 1,95 54,60 ± 1,80 53,20 ± 1,70
Gordura (100 µg kg-1
) 101,35 ± 1,60 102,40 ± 1,50 105,40 ± 1,20
Amostras n=3
Em relação à robustez, foram avaliados dois parâmetros relacionados a
variações intrínsecas do sistema de cromatografia líquida: fluxo da fase móvel e a
temperatura da coluna.
O fluxo da fase móvel utilizada no método foi 0,50 mL min-1
, e as
alterações realizadas foram de fluxo de 0,55 e 0,45 mLmin-1
. Em relação à temperatura
da coluna, a utilizada no método foi de 30ºC e as alterações realizadas foram de 35ºC e
25ºC. Através da análise da ANOVA, pelo teste F e teste t, verificou-se que não houve
diferença na resposta do analito frente a estas variações no método analítico, mostrando
precisão e exatidão dentro do preconizado nos guias de validação.
60
Na Tabela 8, são apresentados os dados adquiridos para avaliação da
robustez do método, na concentração de cada matriz no ponto especificado com o
desvio padrão e as variações realizadas no método analítico.
61
Tabela 8. Variações realizadas no método no teste de robustez.
Fluxo da fase móvel
(ml min-1
)
Temperatura da coluna
Concentração
Referência 0,55 0,45 35 ºC 25 ºC
Músculo (50 ng g-1
) 52,93± 1,04 54,65±1,50 50,13±0,30 50,00±0,40 53,88±2,20
Fígado (100 ng g-1
) 101,25±1,30 102,40±1,3 100,90±1,60 104,50± 1,20 102,60± 1,80
Rim (50 ng g-1
) 51,70±1,60 54,50± 1,25 53,70±2,02 54,60±1,80 52,70± 1,50
Gordura(100 ng g-1
) 102,90±1,32 101,40 ± 1,80 103,50±1,40 101,30 ±1.40 102,50±1,60
Conclusão
O método desenvolvido para quantificação de resíduos de MOX em tecidos de
cordeiro (músculo, rim, fígado e gordura) demonstrou atender aos requisitos dos guias
de validação adotados no estudo (EC, 2002/657, MAPA, 2011 e VICH, 2011) para os
parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de
quantificação (LOQ), limite de detecção (LOD), limite de decisão (CCα), capacidade de
detecção (CCβ) e robustez.
Com base nos estudos realizados, este método analítico, apresentou-se como
uma alternativa promissora para a extração de resíduos de MOX em matrizes de
cordeiro, sendo realizadas modificações em relação ao método QuEChERS original.
Além disso, foi aplicado às diferentes matrizes (músculo, fígado, rim e gordura). No que
diz respeito à recuperação do analito das matrizes, os resultados foram considerados
satisfatórios, assim como o limite de quantificação estabelecido, de 5 ng g-1
. Desta
forma, pode-se concluir que o método analítico validado é aplicável para a finalidade
proposta no range de 5-200 ng g-1
, uma vez que se mostrou reprodutível e linear na
faixa de trabalho estabelecida.
62
Referências
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66
CAPÍTULO III
Depleção de resíduos de moxidectina em músculo (lombo), fígado e rim
de cordeiros
Michelle Del Bianchi; Maria Ângela M. Fernandes; Alda Lúcia G. Monteiro; Juliana A.
Teles; Arturo Anadón, Felix G. R. Reyes.
Artigo em preparação para ser submetido ao Food and Chemical Toxicology
67
RESUMO
A verminose é a principal responsável por grandes perdas observadas na ovinocultura,
reduzindo o potencial produtivo dos animais, causando prejuízos aos criadores. A
prática indevida do uso de anti-helmínticos em ovinos e não cumprimento do período de
carência para a espécie, eleva o risco ao consumo de níveis de resíduos farmacológicos
não permitidos em produtos cárneos. No entanto, foi realizado o estudo de depleção em
músculo, fígado e rim de cordeiros Vinte e dois cordeiros foram utilizados para o
estudo, após aplicação subcutânea de uma única dose de 0,2 mg/kg de peso corporal de
moxidectina (MOX). Os tecidos (músculo, fígado e rim) foram coletados após o abate
nos tempos 2, 4, 7, 14, 28 e 42 dias após aplicação do fármaco. Todos os resultados da
quantificação de resíduos de MOX foram menores do que o limite máximo de resíduo
(LMR) permitido para cada tecido. As concentrações da MOX no músculo variaram
entre 9,0 a 25,9 µg kg-1
, no fígado entre 11,6 a 44,2 µg kg-1
e no rim entre 9,4 a 46, 9 µg
kg-1
indicando uma baixa absorção de MOX nos tecidos analisados, não representando,
portanto, risco à saúde do consumidor.
Palavras-chave: moxidectina, sistema LC-ESI-MS/MS, depleção de resíduos.
68
ABSTRACT
The verminose is the main responsible for great losses observed in the sheep, reducing
the productive potential of the animals, causing damage to the breeders. The improper
practice of the use of anthelmintics in sheep and failure to comply with the grace period
for the species raises the risk of consumption of pharmacological residues not allowed
in meat products. However, the study of muscle, liver and kidney depletion of lambs.
Twenty-two lambs were used for the study, after subcutaneous administration of a
single dose of 0.2 mg / kg body weight, 1% moxidectin in injectable concentration.
Tissues were collected after slaughter at times: 2, 4, 7, 14, 28, 42 days after drug
application. The results even in the first days of slaughter were lower than the maximum
residue limit allowed for each tissue. The MOX concentrations in muscle, this was
between 25.90 to 9.0 µg/kg, This indicates a low absorption of MOX in the analyzed
tissues, not representing therefore risk to consumer health.
Key words: moxidectin, LC-ESI-MS/MS, depletion residue
69
70
Introdução
A ovinocultura possui um sistema de produção caracterizada por pastagens
com altas lotações de animais e, consequentemente, grande contaminação de larvas. As
infecções por nematódeos gastrintestinais é um entrave à expansão da produção de
ovinos de corte, destacando-se como o principal parasita, o Haemonchus contortus.
Esse parasito se localiza no abomaso e se alimenta de sangue. Devido ao seu hábito
hematófago, os animais com altos índices parasitários desenvolvem um quadro de
anemia grave, se desenvolvem de maneira lenta e incompleta levando até a morte
(VIEIRA, 2003).
A medida de controle dos nematódeos gastrointestinais é a utilização de
anti-helmínticos. A moxidectina (MOX), uma milbemicina pertencente à classe das
lactonas macrocíclicas, é o antiparasitário que se destaca na ovinocultura, devido ao seu
amplo espectro de ação a endo e ectoparasitas.
As lactonas macrocíclícas (LM) (avermectinas e milbemicinas) possui baixa
hidrossolubilidade e elevada lipossolubilidade o que favorece a sua deposição no local
de aplicação por via subcutânea, o que prolonga o tempo de residência do medicamento
no organismo (SPINOSA et al., 2006). Por ser um composto lipofílico, possui grande
afinidade por gorduras corpóreas e prolongada persistência de concentração no
organismo.
A MOX é ativa, mesmo em doses baixas, contra uma ampla variedade de
nematoides e artrópodes (McKELLER & BENCHAOUI, 1996). Ela é altamente solúvel
em lipídeos e sua biotransformação ocorre no fígado. O composto, na forma inalterada,
é o principal resíduo encontrado na gordura e no leite, em bovinos, ovinos e equinos
(SPINOSA et al., 2006; PRICHARD et al., 2012).
A MOX pode ser administrada por via oral ou formulação injetável no
tecido subcutâneo ou intramuscular. A biodisponibilidade dos endectocidas, por
administração oral, resulta em baixa eficácia devido à inativação parcial da droga no
rumem dos ovinos (ALVINERIE et al., 1998; LLOBERAS et al., 2013; McKELLER &
BENCHAOUI, 1996). No entando, a forma mais usual de aplicação deste tipo de
fármaco é por via subcutânea, na qual ele é rapidamente absorvido e amplamente
distribuído aos tecidos, particularmente naqueles contendo alto teor de gordura
(LIFSCHITZ et al., 1999).
71
A MOX armazena-se principalmente no tecido gorduroso, sendo o principal
reservatório a gordura abdominal e subcutânea, mas também está presente no intestino e
na pele do animal. O depósito da MOX no tecido adiposo atua como um reservatório da
droga, liberando-a para a corrente sanguínea gradualmente. Este fato contribui para a
persistência da atividade da molécula nos tecidos alvos e para a meia vida longa
(LLOBERAS et al., 2013). Inversamente, uma baixa concentração da droga é
encontrada no tecidosmagros, como o músculo, apresentando um baixo tempo de
residência. O tempo de residência prolongado da MOX proporciona um impacto
positivo na eficácia, como demonstrada pelomaior intervalo para o reaparecimento de
parasitas após o tratamento, quando comparado com outros compostos, minimizando a
oportunidade para o desenvolvimentoderesistência (LIFSCHITZ et al., 1999). Os
animais jovens, por apresentarem menor teor de gordura no corpo, quando comparados
com o animal adulto, tendem a armazenar menor quantidade do composto
(ALVINERIEet al., 1998).
No Brasil, a MOX não está autorizada para uso em ovinos. Apenas para
bovinos, equinos e animais de companhia (CPVS, 2016). No entanto, há evidências na
prática do seu uso extra-label por ovinocultores brasileiros. A prática tem se tornado
preocupante devido ao aumento dos riscos de resistência parasitária e ao mesmo tempo,
o desconhecimento ou o não cumprimento do período de carência para essa espécie,
eleva o risco associado ao consumo de níveis de resíduos farmacológicos não
permitidos no produto cárneo.
Diante do exposto o objetivo do presente estudo foi caracterizar a depleção
de resíduos de MOX em músculo (longe do local de aplicação- corte lombo), fígado e
rim de cordeiros, após única administração subcutânea de MOX em cordeiros na
concentração de 0,2 mg/kg peso corporal.
Material e Métodos
O método analítico utilizado está descrito no Capítulo II.
Neste trabalho é apresentada a caracterização da depleção nos tecidos
músculo, analisado longe do local de aplicação do fármaco, considerado o corte lombo
do animal, fígado e rim. Os outros tecidos, como o músculo (corte pernil) analisado no
local de aplicação do fármaco e a gordura, foram apresentados por FERNANDES
(2015) em sua tese de doutorado, utilizando o mesmo método analítico.
72
Administração subcutânea MOX
O estudo com os animais foi desenvolvido no Laboratório de Produção e
Pesquisa em Ovinos e Caprinos (LAPOC), da Fazenda Experimental do Canguiri, da
Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizada na região metropolitana de Curitiba
(Pinhais), Paraná, Brasil, entre novembro e janeiro de 2012. O processo de criação, do
nascimento até ao abate foi descrito abaixo por FERNANDES (2015).
Com o propósito de analisar as concentrações de MOX em tecidos de
cordeiro, para posterior caracterização da depleção de MOX 1% (Cydectin® NF, Fort
Dodge Saúde Animal) injetável na dose de 0,2 mg para cada quilo de peso corporal
(pc), por um período de até 42 dias após o tratamento, foram selecionados 22 cordeiros
da raça Suffolk, em bom estado nutricional, clinicamente saudáveis, com peso médio
semelhante (36,1 ± 3,2 kg) e que nunca receberam tratamento com anti-helmíntico. Dois
cordeiros foram abatidos antes do início das avaliações para serem utilizados como
“branco” (tecido isento do principio ativo) no desenvolvimento e validação da
metodologia analítica para posterior quantificação da MOX nos tecidos de cordeiro.
Do nascimento até o desmame, os cordeiros e as ovelhas foram mantidos em
aprisco suspenso ripado. A partir da 1ª semana de vida, os cordeiros receberam dieta
composta de concentrado farelado (20% de Proteína Bruta) e silagem de milho, por
meio de suplementação em creep feeding. Os cordeiros foram desmamados e em
seguida foram confinados em baias individuais, em aprisco suspenso com piso ripado.
A dieta era composta por 40% de feno de azevém (volumoso) e 60% de concentrado
farelado (20% de PB), formulada para atender às exigências de cordeiros com potencial
de crescimento rápido (NRC, 2007). Os animais foram tatuados na face interna da perna
esquerda para padronização do local de aplicação do anti-helmíntico e coleta do
material no momento da necropsia.
Todos os cordeiros receberam uma única aplicação subcutânea de MOX
1%, na dose de 0,2 mg/ kg de peso corporal, aplicada no local previamente demarcado
na face interna da perna esquerda. No dia anterior à aplicação do anti-helmíntico, os
animais foram pesados após jejum sólido de 12h e a dose foi calculada individualmente
com base no peso obtido. A dose de cada cordeiro foi aplicada com auxílio de seringa
plástica graduada em escala de 0,1. A quantidade total de MOX administrada, em mg,
foi calculada por regra de três simples, sabendo que a sua concentração nominal na
fórmula farmacêutica utilizada é de 1%.
73
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e os animais
testes foram distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos (tempos de abate após a
aplicação da MOX) conforme a Tabela 1. Em cada uma dessas seis datas observacionais
foi abatido um animal do grupo controle (não dosificado com anti-helmíntico). Após
abate, os tecidos foram separados e congelados até análise.
Tabela 1. Dias de abate após aplicação única do fármaco e número de repetições dos
animais que foram abatidos para coleta das matrizes.
Dias de abate após aplicação
do anti-helmíntico
Número de repetições dos
animais
2 4
4 4
7 3
14 3
28 4
42 4
Total de cordeiro 22
Fonte: FERNANDES (2015)
Os abates foram realizados nas datas pré-determinadas, após jejum sólido de
12 h. A insensibilização foi realizada por eletronarcose com descarga elétrica de 220 V
por oito segundos e a sangria, pela secção das veias jugulares e artérias carótidas.
Todas as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos incolores
devidamente identificados (tecido/órgão, dias pós-tratamento, data da amostragem,
número do animal e grupo) e congeladas a -20ºC para posterior análise no Laboratório
de Toxicologia de Alimentos, Departamento de Ciência de Alimentos da UNICAMP.
Todas as avaliações e manejos envolvendo os animais foram realizados de
acordo com as normas aprovadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Setor
de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná (Protocolo No. 055/2011).
74
Resultados e discussão
Depleção de resíduos em tecidos de músculo (lombo), fígado e rim
As concentrações médias de MOX nos tecidos de músculo (corte-lombo),
fígado e rim nos diferentes dias após aplicação única do fármaco e as respectivas
estimativas dos desvios padrão relativos estão apresentadas na Tabela 2. Os valores
mostram que as concentrações máximas de resíduo de MOX foram 25,93 µg kg-1
no
músculo, 44,20 µg kg-1
no fígado e 46,95 µg kg-1
no rim, já nos primeiros dias de abate
após aplicação única do fármaco.
De acordo com o Codex Alimentarius (2005), os limites máximos de
resíduos (LMR) permitidos em tecidos ovinos para MOX são 50 µg kg-1
no músculo e
rim, 100 µg kg-1
no fígado e 500 µg kg-1
na gordura. No presente experimento, os
valores detectados foram inferiores a estes limites máximos.
Para melhor visualização dos resultados, nas Figuras 1, 2 e 3 estão
representadas as curvas de os depleção da MOX em músculo (lombo), fígado e rim,
respectivamente. Fernandes (2015), em mesmo estudo, após única dose de 0,2 mg/kg pc
de MOX administrada por via subcutânea em cordeiros, resultou em concentração
abaixo do LMR no músculo (local de aplicação - perna), 5 dias após a aplicação. Outro
tecido analisado foi a gordura, na qual encontrou concentração abaixo do LMR 17 dias
após aplicação do fármaco. Porém, mesmo após 28 dias, que é considerado o período
de carência para MOX, foi encontrada na gordura, concentração de 319,1 μg kg-1
, sendo
que o LMR para este tecido é de 500 µg kg-1
.
Tabela 2. Concentração da moxidectina (µg kg-1
) no músculo (lombo), fígado e rim,
após administração única subcutânea de 0,2 mg/kg de peso corporal.
DAA Músculo (lombo) Fígado Rim
Concentração
da MOX
(Média ± DP)
2 25,93 ± 6,90 34,85 ± 9,25 33,96 ± 8,35
4 22,46 ± 3,65 44,20 ± 7,00 42,30 ± 11,70
7 20,65 ± 4,45 43,95 ± 6,30 46,95 ± 7,00
14 14,51 ± 1,74 17,90 ± 3,85 19,00 ± 7,90
28 11,57 ± 2,27 16,80 ± 3,30 16,52 ± 4,82
42 9,04 ± 0,50 11,65 ± 2,20 9,41 ± 0,78
DAA: Dias após aplicação do fármaco
75
Em estudo realizado por Lifschitz et al. (2000), após administração
subcutânea de 0,2 mg kg-1
MOX em ovelhas, observaram que as concentrações no
músculo e fígado estiveram abaixo do LMR. Os autores analisaram a gordura também,
na qual obteve uma concentração maior em relação aos outros tecidos em 21 dias após
tratamento, mas ainda abaixo do LMR. A MOX tem como característica ser um
composto lipofílico, o que explica sua afinidade maior pelo tecido adiposo.
Com relação ao consumo da carne, o cordeiro é a categoria de maior
preferência, por ter uma carne mais macia. Dessa maneira, o consumidor está
privilegiado, considerando que não há concentração alta desse tipo de fármaco mesmo
antes do período de carência de 28 dias para MOX, trazendo segurança ao consumo.
76
Figura 1. Concentração média de moxidectina no músculo de cordeiro, longe do local
de aplicação (lombo), após única administração subcutânea (0,2 mg/kg de
peso corporal).
Figura 2. Concentração média de moxidectina no fígado de cordeiro, após única
administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal).
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10 20 30 40 50
Co
nce
ntr
açã
o µ
g k
g-1
Dias após administração
Músculo longe do local de aplicação
0
20
40
60
0 10 20 30 40 50
Con
cen
traçã
o µ
g k
g-1
Dias após administração
Fígado
77
Figura 3. Concentração média de moxidectina no rim de cordeiro, após única
administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal).
Neste trabalho, houve concentração maior da MOX no fígado e rim, em sete
dias após o tratamento e também um perfil semelhante na depleção do fármaco.
Palma et al., (2006) pesquisaram resíduos de abamectina em tecidos de
bovinos tratados via oral, onde observaram as maiores concentrações em tecidos de
fígado, aos sete dias pós-tratamento, seguido dos tecidos de gordura, rim e, por último,
nas amostras de musculatura. Embora seja outra molécula e em outra espécie de animal,
a abamectina é uma lactona macrocíclica, assim também como a MOX.
A metabolização da MOX é feita em baixa proporção no fígado, secretada
pela bile, reabsorvida pelo intestino e eliminada na sua forma ativa através das fezes,
sendo esta a principal via de excreção (LIFSCHITZet al., 1999).
Gilaverte (2014), avaliou a cinética de excreção da MOX por meio das fezes
de ovinos, após aplicação subcutânea de 0,2 mg/kg peso corporal, e verificou o pico de
excreção do fármaco em 36 horas com concentração de 22,73µg kg-1
, e a presença da
molécula até aos 42 dias após aplicação, mesmo em baixa concentração de
aproximadamente 6,5 µg kg-1
.
Baptista et al., (2017), realizaram a farmacocinética da MOX em soro de
cordeiros, procedente do mesmo estudo e verificaram concentração máxima 7,4 ng ml-
1, com permanência do fármaco no soro em nove dias. Após este período não foi
possível quantificar as amostras mostrando portanto, que houve lenta absorção do
fármaco no soro.
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50
Con
cen
traçã
o µ
g k
g-1
Dias após administração
Rim
78
Na literatura há poucos estudos de resíduos da MOX em especial em
tecidos de cordeiros. No geral, o presente estudo mostra que se medicamento for
aplicado na dose correta, respeitando o período de carência, os tecidos estarão
conformes e poderão ser destinados ao consumo humano.
Conclusão
O método analítico desenvolvido e validado através da técnica LC-ESI-
MS/MS foi aplicado para quantificação de MOX em amostras de músculo (longe do
local de aplicação-lombo), fígado e rim de cordeiros tratados com o medicamento,
visando caracterizar a depleção deste principio ativo nos tecidos mencionados. A análise
dos resultados obtidos na caracterização da depleção indicou a presença de resíduos de
MOX em valores inferiores ao do LMR do músculo, fígado e rim (50 µg kg-1
, 100 µg
kg-1
e 50 µg kg-1
, respectivamente). Os valores de concentração da MOX encontrados
no músculo foram menores que os encontrados no fígado e rim, resultado este
interessante do ponto de vista de risco para os consumidores, uma vez que o tecido
muscular transformado em carne no post-mortem, é o mais consumido.
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81
DISCUSSÃO GERAL
As verminoses gastrointestinais são consideradas o principal problema
enfrentado pelos criadores de ovinos. A utilização de métodos inadequados no combate
à verminose vem gerando a resistência dos parasitas aos vermífugos. Questões
relacionadas à existência de resíduos em medicamentos veterinários em carnes são cada
vez mais frequentes, buscando a segurança no consumo de alimentos.
Métodos analíticos mais sensíveis para determinar estes resíduos são muito
importantes. Novos vermífugos surgirão no mercado e, mesmo que alternativas a esse
controle químico também sejam disponibilizadas, seu uso inadequado fará com que em
pouco tempo perca-se a eficácia no controle parasitário. Portanto, é importante entender
que o sucesso do controle dependerá de um conjunto de ações dentro da propriedade e,
para que esse sucesso de fato ocorra, a informação é a melhor ferramenta de trabalho.
O emprego da técnica cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas apresenta vantagens como a seletividade e a possibilidade de confirmação da
identidade dos analitos, aumentando assim a confiabilidade dos resultados. O
procedimento de preparo de amostras anterior à quantificação é uma etapa fundamental
para garantir a detectabilidade e seletividade do método. O preparo de amostra, usando
método QuECHERS, apresentou um ótimo desempenho na remoção dos interferentes
para a determinação da moxidectina nos tecidos de cordeiro, além de ter sido simples e
rápido.
O trabalho realizado em parceria com a UFPR, de onde as amostras de
tecidos foram obtidas, foi de grande importância para a pesquisa e para o produtor, bem
como para o consumidor final.
Os limites de detecção e quantificação do método analítico foram 1,5 ng g-1
e 5,0 ng g-1
, respectivamente, para todas as matrizes. As recuperações nos 4 níveis de
concentração analisados mostraram resultados entre 71,61-103,96 % para músculo,
103,40-120,40 % para fígado, 82,2 - 111,20% para rim e 73,20-92,54% para gordura.
O método foi desenvolvido e validado para as matrizes músculo (local de
aplicação do fármaco, corte perna e longe do local de aplicação do fármaco, corte
lombo), fígado, rim e gordura.
O músculo analisado no local de aplicação do fármaco e gordura foram
apresentados por FERNANDES (2015), evidenciando que após única dose de
moxidectina administrada por via subcutânea, resultou na concentração abaixo do LMR
82
no músculo (local de aplicação: perna) e na gordura, antes do período de carência que é
de 28 dias. Nos tecidos estudados neste trabalho, músculo (longe do local de aplicação-
lombo), fígado e rim, as amostras estiveram também abaixo do LMR logo no segundo
dia após aplicação, mostrando, que os produtos seriam seguros para o consumo humano,
respeitando o prazo de carência, mesmo com uso frequente.
CONCLUSÃO GERAL
Em conformidade com os guias de validação da ANVISA (2012), do
MAPA (2011), VICH (2011) e da Comunidade Europeia (2002), o método
desenvolvido e validado para a quantificação da MOX em tecidos de cordeiro,
utilizando o sistema LC-ESI-MS/MS (Agilent Technologies), foi eficiente, seletivo e
preciso.
O preparo de amostra foi unificado para determinação da moxidectina em
quatro matrizes diferentes, mostrando-se robusto, além de ser um método de execução
rápido para análise de rotina.
Em relação à caracterização da depleção de resíduos em músculo (longe do
local de aplicação - lombo), fígado e rim, as concentrações da MOX foram inferiores
aos limites máximos de resíduos (LMR), dando, portanto, segurança ao consumo deste
tipo de produto.
Do ponto de vista de segurança, o método mostrou que a carne de cordeiro
obtida nesse manejo é segura para o consumo humano. Porém, vale salientar que se
ocorrer o uso indiscriminado de medicamentos veterinários e tal como aplicar dose
repetitiva do anti-helmíntico para o tratamento de parasitas, e o desrespeito ao período
de carência do fármaco, podem levar a diferentes resultados. Além disso, os abates,
muitas vezes, são realizados de forma clandestina no Brasil, o que dificulta o controle
de qualidade e desmotiva o produtor a investir na profissionalização do rebanho.
Neste sentido, os métodos desenvolvidos podem ser utilizados em programa de
monitoramento destes alimentos, a fim de garantir a segurança do seu consumo.
83
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91
ANEXO 1 – Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais
92
ANEXO 2
Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation of
Analytical Method by LC-MS/MS
Artigo submetido ao Journal of Chromatography B
93
Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation of Analytical
Method by UHPLC-MS/MS
Michelle Del Bianchi A. Cruza, Maria A. M. Fernandesb, Patricia A. de C. Bragaa,
Alda L. G. Monteirob, Daniela Danielc and Felix G. R. Reyes*a
aDepartment of Food Science, School of Food Engineering, University of Campinas – UNICAMP,
Rua Monteiro Lobato, 80, 13083-862 Campinas, SP, Brazil
bDepartment of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research Center (LAPOC),
Universidade Federal do Paraná, Rua dos Funcionários, 1540, CEP: 80035-050 Curitiba-PR,
Brazil
cAgilent Technologies Brasil, Alameda Araguaia 1142, (Alphaville Industrial), CEP 06455-000
Barueri, SP, Brazil.
Corresponding Author: Felix G. R. Reyes
Phone: +55 (19) 3521-2167
E-mail: reyesfgr@gmail.com
94
Highlights
1. Novel method for determination of moxidectin residues in lamb tissues by UHPLC-ESI-
MS/MS.
2. Single sample preparation step developed for moxidectin extraction from target
tissues.
3. Incurred samples from all target tissues used in the validation step.
4. Short chromatographic run (5.0 min) per sample.
5. Reliable high-throughput method for surveillance of moxidectin in animal tissue.
95
ABSTRACT
The development and validation of a throughput method for the quantitation of
moxidectin residues in lamb tissues (muscle, kidney, liver and fat) was
conducted by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS). To achieve higher recovery of the analyte from
the matrices, a modified QuEChERS method was used for sample preparation.
The chromatographic separation was carried out on a Zorbax Eclipse Plus C18
RRHD column using mobile phase comprising 5 mM ammonium formate
solution + 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear
gradient program. Method validation was performed per the Commission
Decision 2002/657/EC and VICH GL49. To quantify the analyte, matrix-matched
analytical curves were constructed with spiked blank tissues, with the limit of
quantitation of 5 ng g-1 and limit of detection of 1.5 ng g-1 for all matrices.
Linearity, decision limit, detection capability accuracy, inter- and intra-day
repeatability of the method are reported. The method was successfully applied
to incurred lamb tissue samples, suitable for monitoring moxidectin residues in
lamb tissues in health surveillance programs, as well as for pharmacokinetics
and residue depletion studies.
Keywords: UHPLC-MS/MS, moxidectin, lamb tissues, QuEChERS, residues
determination.
96
1.Introduction
Consumers frequently search for alternatives of animal protein sources.
In Brazil, as in other countries of the world, there is a growing demand for better
quality foods, considering characteristics of the products such as flavor, color,
juiciness, guarantee of origin, and environmental costs of production, among
others. In this context, sheep breeding is distributed worldwide, with an annual
growth rate of 1.5% in the last 5 years, and a forecast for continued growth.
This kind of agribusiness has also been prominent in Brazil since the country
has propitious climatic conditions for breeding this species, with the 18th largest
population of sheep worldwide [1]. The lamb, in particular, has good feed
conversion , and provides meat of excellent quality. Lamb consumption tends
to increase, either with natural population growth, or by better organization of
production sectors for expansion of the market. However, a main limiting factor
for the greater economic use of this protein source is lamb gastrointestinal
infections by nematodes, mainly by Haemonchus contortus, an endoparasite
that is highly pathogenic to lambs. Usually, animals affected by this parasite
may show anemia, submandibular edema, cachexia, prostration, and even
death of the animal. In cases of chronic infection, the animals present slow
growth and low yields of wool and meat [2].
One strategy used to minimize losses from infections caused by
gastrointestinal nematodes has been the use of anti-parasitic agents. However,
the intensive use of these drugs as well as the administration of sub-optimal
doses and drug misuse because of misdiagnoses has caused a serious
problem of nematode drug resistance, which appears to be a worldwide
phenomenon [3]. Macrocyclic lactones are among the anthelmintics the control
of endo and ectoparasites in sheep, which have high efficiency and wide
spectrum of action. Such a macrocyclic lactone is moxidectin (MOX) (Figure 1),
a milbemycin produced from nemadectin, which in turn is obtained by the
fermentation of the fungus Streptomyces cyaneogriseus [4]
“Insert Figure 1”
MOX is a lipophilic compound and is stored mainly in abdominal and
subcutaneous adipose tissue [5]. Because MOX is slowly metabolized in these
tissues, it results in a mean residence time of the drug in the organism, greater
than that reported for other more hydrophilic antiparasitics, e.g. ivermectin,
according to studies reported in the literature for goats [6] and sheep [7].
Residues of veterinary drugs present in animal tissues in concentrations above
the maximum residue limits (MRLs) allowed by regulatory bodies, in meat
intended for human consumption, may endanger human health [8]
97
In general, the methods reported for the determination of MOX in food
matrices of animal origin such as bovine liver [9], bovine muscle [10], bovine
muscle and liver [11], milk [12, 13, 14], muscle, eggs and milk [15] and sheep
tissues (muscle, liver and fat) [16] make use of liquid chromatography with
fluorescence detection (LC-FLD). This detection technique is selective and
sensitive. However, a disadvantage is the requirement of a derivatization step to
produce a fluorescent derivative [17]. Also, the use of solid phase extraction
(SPE) cartridges during the sample preparation step is usually necessary [16,
18]. Those requirements make the LC-FDL methods time consuming, requiring
large amounts of organic solvents. On the other hand, liquid chromatography
with mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS) as a detection technique can
use simpler procedures for the sample preparation, LC-MS/MS confers
specificity, detectability, accuracy, and allows the identity confirmation of the
analytes, required for the determination of trace residues (ng/g) of different
analytes in different matrices [19]. However, only a few studies have been
reported on the use of this technique for the determination of MOX residues in
edible tissues derived from animals [20, 21]. A comprehensive review related to
analytical and biological aspects of macrocyclic lactones was published by
Danaher et al. [17]. Nevertheless, to our knowledge, there is no reported study
regarding the determination of MOX residues in lamb tissues by UHPLC-
MS/MS.
The development of reliable analytical methods for monitoring veterinary
drug residues to meet strict MRLs established by national regulatory bodies and
international agencies is desirable. Thus, the aim of this study was to develop
and validate an analytical method using UHPLC-MS/MS for the determinations
of MOX residues in lamb tissues (muscle, liver, kidney and fat), applying
QuEChERS with modifications at the sample preparation step.
2. Materials and Methods
2.1. Solvents and reagents
Acetonitrile (ACN) HPLC grade was purchased from J.T. Baker
(Mallinckrodt Baker, USA) and was used for both in the preparation of mobile
phase and in the extraction of the samples. Formic acid and 5 M ammonium
formate solution used both as additive in the mobile phase preparation were
provided by Agilent Technology (Agilent Technology, CA, USA, p/n G1946-
85021). Magnesium sulphate (MgSO4) and sodium chloride (NaCl) were
obtained from Sigma (Sigma-Aldrich Co., USA) and used in the sample
extraction process. In the cleanup step, a kit supplied by Agilent Technology
98
containing PSA (primary secondary amine) and MgSO4 (in the proportions
50:150 mg/mg, p/n 5382-5022CH) and another kit containing PSA, C18
(octadecylsilane) and MgSO4 (in the proportions 50:50:150 mg/mg/mg, p/n
5982-5122CH) were used. Ultra-pure water was obtained by the Milli-Q
Simplicity system (Millipore, Bedford, MA, USA). The 0.22 μm porosity
polytetrafluoroethylene (PTFE) filtration membranes were purchased from Nova
Analítica (São Paulo, Brazil) and used for the filtration of sample extracts. The
analytical standards were emamectin (EMA), used as internal standard and
moxidectin (MOX) (Sigma-Aldrich, Co., USA), with a purity of 99.7% and 97.2%,
respectively.
2.2. Solutions preparation
The stock solutions were prepared in ACN at a concentration of 55 µg
mL-1 for MOX and 60 µg mL-1 for EMA, stored in amber bottles and kept at -20 0C for up to 90 days. The working solutions were prepared by appropriate
dilution of the stock solutions in ACN;MOX at the concentrations of 1.0 µg mL-1
and 2.0 µg mL-1 . and for EMA (internal standard) at 50 ng mL-1 and 100 ng mL-
1. The working solutions were stored at -20 0C, for up to 15 days.
2.3 Lamb samples
The blank samples of lamb used to develop the analytical method and to
accomplish the validation of the method were of known origin, with a guarantee
of freedom from the presence of MOX and EMA (internal standard) that were
the analytical focus of this work. The samples were provided by the Department
of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research Center (LAPOC),
Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil. Nevertheless, to ensure the
viability of using these as blank samples, they were analyzed and the
chromatograms were inspected for the presence of any interference that could
compromise the development of the analytical method. No interference was
detected in the retention times corresponding to MOX and EMA.
In addition to the blank samples, incurred samples (samples
contaminated with MOX from an experiment conducted at LAPOC) were used.
In that study, the lambs were treated with a single dose of MOX (0.2 mg/kg
BW), by subcutaneous administration. Samples of target tissues were collected
from lambs slaughtered on the day 14 after the dose administration. All samples
were stored at -20 0C until analysis.
99
2.4. UHPLC-ESI-MS/MS conditions
The analyses were carried out in an UHPLC 1290 system coupled with
an Agilent 6460 triple quadrupole tandem mass spectrometer, with Electrospray
Ionization (ESI) source in the positive mode (Agilent Technology, CA, USA).
The source operation conditions were as follows: gas temperature, 200 0C; gas
flow, 10 L min-1; nebulizer, 15 psi; sheath gas flow, 12 L min-1; sheath gas
temperature, 400 0C; capillary voltage, 5.0 kV and nozzle voltage, 2.0 kV.
Sample analyses were performed in MRM scan mode (multiple reaction
monitoring, using a dwell time of 50 ms per channel), using MassHunter
software workstation, version B.06.00. Two transitions were monitored for MOX,
aiming to obtain at least 3 identification points, as recommended by the
European Community Guide 2002/657/EC [22]. Thus, the optimized mass
spectrometric parameters were established: fragment, 120 V and collision
energy 4 V for transitions m/z 640.0→528.0 (qualifier transition) and 8 V for
transitions m/z 640.4→498.0 (quantifier transition). Product ion spectrum was
obtained and high intensity fragments were chosen for quantification (Figure 2).
The chromatographic separation was carried out on a Zorbax Eclipse Plus C18
RRHD column (1.8 µm, 2.1 mm x 50 mm) (Agilent Technology, CA, USA, p/n
699775-902) using mobile phase comprising 5 mM ammonium formate solution
+ 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear
gradient program as follows: 0 min until 1.50 min, 45% A and 55% B; 1.51 min
until 4.50 min, 5% A and 95% B; 4.51 min until 6.00 min, returned to the initial
proportion. The elution conditions were: a flow rate of 0.5 mL min-1, the
injection volume was 5 µL and the column oven temperature was 30 0C.
“Insert figure 2”
2.5. Sample preparation
Sample preparation was performed based on the original QuEChERS
method, described by Anastassiades et al. [23], but modifications were made to
improve the extraction efficiency, considering the comments of Prestes et al.
[24, 25] that discussed the original QuEChERS method and successful
modifications. In the first step the tissue samples (muscle, kidney, liver or fat)
were individually ground, still frozen, using a waring blender. Then, 2.0 g of
tissue was weighed into a 50 mL polypropylene tube, and 20 μL of 100 ng mL-1
100
EMA was added together with 2 mL of ACN and a ceramic homogenizer
(Agilent Technologies, p/n 5982-9313) and the tubes were vortexed for 5 min.
Then 0.8 g of MgSO4 and 0.2 g of NaCl were added, and the tube was shaken
for a further 5 min prior to centrifugation at 10,000 g, for 5 min, at 25 0C. For
cleanup of the muscle, liver and kidney samples an aliquot of 1.0 mL of the
supernatant was transferred to a microtube containing MgSO4 and PSA (150:50
mg/mg). vortexed for 30 s and then centrifuged for 1 min at 10,000 g, at 25 0C.
The supernatant was filtered on PTFE membranes (0.22 m) directly into the
sample vial, capped and injected into the UHPLC-MS/MS system. For fat
analysis, sample preparation was performed following the same procedure, but
the cleanup step was performed using MgSO4, PSA and C18 in the proportion
150:50:50, mg/mg/mg, respectively.
2.6. Validation of the analytical method
The analytical method developed for the analysis of MOX residues in
lamb tissues was validated following the recommendations of the Guide for
Validation of Analytical Methods established by European Community [22] and
the Veterinary International Conference on Harmonization [26]. The parameters
evaluated were linearity, sensitivity, selectivity, matrix effect, intra and inter-day
precision, accuracy, decision limit (CCα) and detection capability (CCβ). Limit of
quantitation (LOQ) and limit of detection (LOD) were also established.
3. Results and discussion
3.1. Optimization of the sample preparation procedure
Sample preparation procedure (extraction of the analyte and cleanup of
the extract) for MOX residues determination in the target tissues (muscle, liver,
kidney and fat) was conducted on a modified QuEChERS method, taking into
consideration modifications reported by Rúbies and et al. [27] for determination
of ivermectin, abamectin, emamectin, eprinomectin, doramectin and moxidectin
in meat, and by Furlani et al. [28] for quantitation of ivermectin, abamectin,
doramectin, and moxidectin in dairy products. The purpose for introducing
modifications in the QuEChERS method was to increase the extraction
efficiency for MOX residue determination in the lamb target tissues, as well as
to develop a green and low cost method by minimizing the use of solvents and
reagents. Thus, in the original QuEChERS method [23], the analyte residues
are extracted from 10 g of sample with 10 mL of ACN, however in our method
101
only 2.0 g of sample of each target tissue were extracted with 2 mL of ACN.
ACN was used as the extraction solvent since it produces protein precipitation
and a lower amount of lipophilic coextractives, which is required for LC-MS
analyzes. Methods for extracting MOX residues using ACN are reported in the
literature for different matrices, such as bovine liver [29] and porcine liver, meat
and fish tissue [30], but not for the lamb target tissues reported in this study.
The salting out effect, aiming to increase the efficiency of MOX extraction was
promoted by use of 0.2 g of NaCl and 0.8 g of MgSO4.
After the extraction process, cleanup tests were performed by dispersive
solid-phase extraction (d-SPE), employing PSA and C18. The PSA has a strong
chelating effect, due to the presence of the primary and secondary amino
groups in its structure, thus retaining free fatty acids, sugars and polar
compounds present in the matrix. The sorbent C18 promotes a more effective
cleanup in matrices that contain high fat content, showing good efficiency in the
removal of apolar compounds. Thus, for muscle, kidney and liver matrices, the
cleanup process using PSA and MgSO4 provided a suitable extract for injection
in the UHPLC-MS/MS system. However, for the fat target tissue, C18 dispersive
was used together with PSA to promote a more effective cleanup. Thus, after
extraction step with 2 mL of ACN, an aliquot of 1 mL of the extracts from
muscle, kidney and liver tissues was submitted to a cleanup by adding 50 mg of
(PSA) and 150 mg of MgSO4, while for fat tissues 50 mg of PSA, 50 mg of C18
and 150 mg of MgSO4 were used.
3.2. Method validation
To evaluate the specificity and selectivity of the analytical method,
samples of all tissues free of MOX and EMA (blank samples), were extracted
and evaluated for the presence of possible interferents. No interferences were
observed in the retention times corresponding to MOX (4.28 min) and EMA
(1.29 min) in any analyzed target tissue (muscle, liver, kidney and fat) when the
transitions monitored in MRM for each molecule were extracted, This ensures
the selectivity and specificity of the analytical method, as well as the viability of
the blank samples to be used in the validation procedure.
“Insert Figure 3”
For matrix effect evaluation, analytical curves of MOX and EMA were
prepared in solvent and in the extract from the target tissues (muscle, kidney,
102
liver and fat). The matrix effect was evaluated by the statistical comparison
between the average concentrations obtained from the analysis in the solvent
and in the extract from the target tissues, using F test (Snedecor) for equal
means and confirmation by the t test (for different samples), at the 95%
confidence level. Thus, since matrix effect was observed, all samples were
quantified using a matrix-matched analytical curve in seven different
concentration levels for muscle (5, 10, 25, 50, 75, 100 e 200 g kg-1) and eight
different concentration levels for kidney, liver and fat (5, 10, 25, 50, 75, 100, 150
e 200 g kg-1). To evaluate linearity, three analytical curves with seven
concentration levels were prepared in triplicate. The calibration was performed
by linear regression of the peak-area ratios of MOX/EMA (internal standard)
versus standard concentration ratios. The linearity was expressed as the linear
correlation coefficient (r), presenting r values higher than 0.99 (Table 1),
showing strong correlation between the concentration levels and analytical
response.
“Insert Table 1”
The precision of the method was carried out in two steps: intra-day
precision and inter-day precision. For intra-day precision, the blank sample was
spiked with working solution for different concentration levels: 5, 50, 100 and
200 g kg-1, representing low, low middle, high middle and high concentration
levels. Each concentration level was prepared in six individual replicates and
the results were expressed as coefficient of variation (CV%). The inter-day
precision was performed as the intra-day precision, but on three different days,
by the same analyst using the same instrument. For both intra-day and inter-
day precision, the CV% values obtained were between 5.89-19.8% and 8.02-
22.5% respectively, as recommended in the guidelines [22, 26]. Accuracy was
assessed through the recovery test, by spiking blank samples with working
solution at 4 levels of fortification 5; 50; 100 and 200 ng g-1. Each level of
fortification was evaluated using 6 replicates. The results were expressed as the
percentage of concentrations in the fortified blank samples regarding the
concentration in the fortified extract blank sample at the same concentration.
The mean values of accuracy, obtained through recovery trials, were within the
range of 70 to 120%, as recommended by the guidelines adopted [22, 26].
Limits of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were established
by analyzing the fortified matrix with standard solution of MOX. LOD was
expressed as the lowest concentration whose signal is equal to 3 times the
signal-to-noise ratio, while LOQ was established as the lowest concentration
capable of producing a signal equivalent to 10 times the signal-to-noise ratio.
103
The LOQ was taken as the first level of the analytical curve for all tissues, that
is, 5 g kg-1. The LOD (1.5 g kg-1) was obtained by diluting the LOQ.
The decision limit (CCα) and detection capability (CCβ) were determined
as described in the European Community Guide 2002/657/EC [22], in
accordance with ISO 11843 [31], by matrix-matched analytical curves
procedure, taking into account that MOX has MRL‟s established [32]. CCα was
(α = 5%) equal to the MRL plus 1.64 times the standard deviation (CCα =LMR +
1,64 x σ) and CCβ corresponding to the decision limit (CCα) plus 1.64 times the
standard deviation of reproducibility, adopting a β error equal to 5%.
MOX stability tests both in solution and in the tissue samples were
performed under the validation of the analytical method. The short-term stability
study was carried out to evaluate if MOX remains stable in the biological matrix
under the conditions of temperature, luminosity and humidity present in the
laboratory. Thus, tissue samples were fortified (n=3) at the MRL level of each
tissue (except fat tissue, which was fortified at the central point of the analytical
curve, 100 ng g-1) and left on the bench for 4 hours and after that period were
submitted to the extraction and analysis process. The results obtained were
compared with the results of samples extracted after fortification as RSD value
≤ 15%.
In the study of stability of freeze/thaw cycles, the aim was to evaluate if
the analyte remains stable after 3 cycles of freezing and thawing. The samples
were fortified as in the previous study and frozen for 24 hours and then thawed,
again frozen for at least 12 hours and then thawed. This process was repeated
and the samples were analyzed at the time of 24, 48 and 96 hours in this
freeze-thaw cycle. After these cycles the samples were submitted to the
extraction and analysis process. The results obtained were compared with the
results of samples extracted shortly after fortification. The acceptance criteria
used were the same for precision and accuracy.
The results (mean ± standard deviation) of short-term stability and
freeze/ thaw cycles show that there was no significant difference between the
samples when analyzed by ANOVA (confidence level 95 %), through the F test
and the t test. Therefore, there was no degradation of the MOX in the biological
matrices, guaranteeing the stability of the MOX in the matrices analyzed.
Results of the analytical method validation parameters are described in Table 1.
Analysis of incurred samples is recommended to demonstrate the
precision of a method in samples genuinely contaminated, providing confidence
that the method can be deemed appropriate for the intended purpose and
provide confidence that the method could be used by regulatory agencies in
health surveillance programs, as well as in pharmacokinetics and depletion
studies [32, 33]. Thus, the analytical method developed and validated in this
study was applied to quantify MOX residues in incurred samples of lamb tissues
104
(muscle far from and near of the MOX application site, kidney, liver and fat).
Three animals treated with MOX were slaughtered to obtain the tissues
analyzed, and all final processed extracts were prepared in triplicate prior to
instrumental analysis by UHPLC-MS/MS. Data obtained (Table 2) demonstrated
that the method is suitable for the determination of MOX residues in all lamb
tissues since all, but one, CV% values for the triplicates of the all samples
analyzed were in the range of 1.25 to 14.70%. The only triplicate out of this
range was from a fat samples (CV 23%). Nevertheless, for the other two
samples of fat the CV value was lower than 8.90%. These results contribute to
demonstrate the applicability of the method in unknown samples.
Per the Codex Alimentarius [34] the MRLs allowed in sheep tissues for
MOX are: 50 μg kg-1 in muscle and kidney, 100 μg kg-1 in the liver and 500 μg
kg-1 in fat. The results found for all samples from muscle, kidney and liver
showed MOX residues at concentration levels lower than the MRLs established
for each tissue (Table 2). However, the MOX residues levels found in two
samples from the fat tissue were higher than the established MRL value, which
demonstrates a longer period of persistence of MOX in this tissue, related to the
high lipophilicity of the drug, as observed by Lifschitz et al. [35].
“ Insert Table 2”
4. Conclusions
The analytical method developed and validated in this study is adequate
for the quantitation of MOX residues in lamb tissues (muscle, kidney, liver and
fat). The same extraction procedure and dispersive solid phase extraction (d-
SPE) for the extract cleanup was applied to the different matrices studied, which
demonstrates the versatility of the method. In addition, the d-SPE extract
cleanup procedure used is made simple, cheaper and faster by avoiding the
use of SPE cartridges, which is important for methods to be used for routine
analysis. The method reported here enabled unequivocal quantitation and
confirmation of MOX due to the selectivity of the MS/MS system. Also, must be
mentioned that has high detectability and provide suitable results for the
quantitation of MOX residues in accordance to the MRL values established by
the European Union for lamb tissues, as well as well below the MLR values.
Data from incurred samples demonstrated the precision of the method in
samples genuinely contaminated, providing confidence that can be considered
appropriate for determining MOX residues in lamb tissues available at the retail
market (as part of health surveillance programs for the protection of consumer
health), as well as to be used in pharmacokinetic and depletion studies.
105
Acknowledgements
The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation-
Agilent Technologies for supplying the Agilent UHPLC 1290-MS/MS 6460
system employed in this study (FAPESP-Agilent Grant number 2013/50452-5);
and to the National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq Grant number 305390/2013-9; CNPq Grant number 141964/2012-0),
Brazil. We also thank Dr. Lenore Kelly, from Agilent Technologies, for her
assistance with the language correction of the manuscript.
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108
Figure captions
Figure 1: Moxidectin chemical structure.
Figure 2: Mass Spectrum of moxidectin.
Figure 3: Extracted MRM chromatograms for blank tissues and blank tissues spiked with
moxidectin at the method limit of quantitation concentration (5 ng g-1). (A) Muscle, (B) Kidney,
(C) Liver and (D) Fat.
109
Figure 1
21
2223
24
O
CH3 CH3
CH3
O
OO
CH3
O
CH3 CH3
OH
N
H
OHH
CH3H
OCH3
H
110
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figure 2 11
12
111
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Figure 3 23
24
112
Table 1: Analytical results of the method validation parameters
Parameters Specifications* Muscle Kidney Liver Fat
Specificity/
Selectivity
No interference OK OK OK OK
Linearity r ≥ 0.98 y = 0,0087x + 0,0108
r = 0.9998
y = 0,0073x - 0,063
r = 0.9929
y = 0,0591x - 0,0069
r = 0.9991
y = 0.0289x – 0.1534
r = 0.9969
Intra-day
precision
n=6
Analite
Concentration
%CV
Analite
concentration
%CV)
Analite
concentration
%CV)
Analite
concentration
%CV
Analite
concentration
%CV)
< 1 µg/kg 30 5 µg/kg 5.9 5 µg/kg 10.8 5 µg/kg 13.1 5 µg/kg 19.2
≥ 1µg/kg < 10 µg/kg 25 50 µg/kg 6.6 50 µg/kg 10.1 50 µg/kg 11.8 100 µg/kg 15.1
≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 15 100 µg/kg 6.6 100 µg/kg 13.0 100 µg/kg 7.0 500 µg/kg 14.5
≥ 100 µg/kg 10 200 µg/kg 8.5 200 µg/kg 7,6 200 µg/kg 6.0 1000 µg/kg 16.1
Inter-day
precision
Analite
Concentration
%CV
Analite
concentration
%CV
Analite
concentration
%CV
Analite
concentration
%CV
Analite
concentration
%CV)
< 1 µg/kg 45 5 µg/kg 20.6 5 µg/kg 17.7
5 µg/kg 21.8 5 µg/kg 22.5
≥ 1µg/kg < 10 µg/kg 32 50 µg/kg 8.7 50 µg/kg 8.7 50 µg/kg 11.9 100 µg/kg 15.1
≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 23 100 µg/kg 8.5 100 µg/kg 14.6 100 µg/kg 8.50 500 µg/kg 13.7
≥ 100 µg/kg 16 200 µg/kg 8.0 200 µg/kg 8.9 200 µg/kg 9.51 1000 µg/kg 9.8
Accuracy
Analite
Concentration
%
Accuracy
Analite
concentration
%
Accuracy
Analite
concentration
%
Accuracy
Analite
concentration
%
Accuracy
Analite
concentration
%
Accuracy
< 1 µg/kg -50% a +
20%
5 µg/kg 71.6 5 µg/kg 78.4 5 µg/kg 108.9 5 µg/kg 92.5
≥ 1µg/kg < 10 µg/kg -40% a
+20%
50 µg/kg 103.9 50 µg/kg 82.6 50 µg/kg 82.2 100 µg/kg 73.2
≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg -30% a
+10%
100 µg/kg 103.5 100 µg/kg 87.4 100 µg/kg 111.2 500 µg/kg 71.7
≥ 100 µg/kg -20% a
+10%
200 µg/kg 97.8 200 µg/kg 89.0 200 µg/kg 99.6 1000 µg/kg 81.8
LOD n = 10 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg
LOQ n = 10 5 µg/kg 5 µg/kg 5 µg/kg 5 µg/kg
Specification from the guidelines
113
Table 2: MOX residues in lamb tissues collected after single subcutaneous dose administration of 0.2 mg/kg body weight and after 28 days withdrawal
period.
Animal
Muscle - near of application site Average (ng g-1) CV %
Muscle - far from application site
Average (ng g-1)
CV%
Kidney Average (ng g-1)
CV%
Liver Average (ng g-1)
CV%
Fat Average (ng g-1)
CV%
(ng g-1) (ng g-1) (ng g-1) (ng g-1) (ng g-1)
1
22,45
20,23 10,90
12,91
12,83 3,50
18,60
18,00 6,25
14,64
13,60 9,90
328,90
332,52 1,25 18,04 13,22 16,70 12,07 336,90
20,21 12,34 18,63 14,00 331,17
2
19,50
19,66 4,35
13,78
14,40 5,90
19,50
18,05 14,45
23,00
21,80 9,70
633,20
625,75 23,00 20,60 15,37 19,63 19,34 476,76
18,92 14,04 15,04 22,80 767,27
3
21,66
21,54 1,78
16,95
16,30 3,75
19,85
20,95 14,70
19,50
18,40 7,90
848,00
768,95 8,90 21,85 16,23 24,45 16,75 731,50
21,11 15,74 18,59 18,95 727,35
114
ANEXO 3
Tissue residue depletion study of moxidectin conducted in lambs
using an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical method
Artigo em preparação para ser submetido ao Journal Food and Chemical
Toxicology
115
Tissue residue depletion study of moxidectin conducted in lambs
using an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical method
Michelle Del Bianchi a; Maria Ângela M. Fernandes b; Alda Lúcia G. Monteiro b;
Juliana A. Teles a; Arturo Anadón c, Felix G. R. Reyes a.
a School of Food Engineering, Department of Food Sciences, University of
Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.
b Department of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research
Center (LAPOC), Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil.
c Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Veterinary Medicine,
Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain.
Corresponding author.
Email addresses <reyesfgr@gmail.com> (F.G.R. Reyes)
Phone: +55-19-35212167
Manuscript to be submitted for publication at Food and Chemical Toxicology
116
University State of Campinas
Food Engineering College
Department of Food Sciences
Highlights
1. A tissue residue depletion study of Cydectin® NF, containing 1% of
moxidectin, in lambs is reported by the first time.
2. A reliable validated UHPLC-MS/MS method was used for quantitation of
moxidectin of tissue residues in lamb target tissues.
3. No residues of moxidectin in tissues were below the the method LOQ
meaning consistency on withdrawal time calculation.
4. A withdrawal time of 31 days could be established for Cydectin® NF
when is used in the lamb.
5. Depletion study valuable to regulatory agencies and national authorities‟
responsible for consumer health protection.
117
ABSTRACT
To date, a tissue depletion study of moxidectin (Cydectin® NF) in lambs is not
available. Thus, the aim of the present study was to conduct such study determining
the residue concentration of moxidectin (MOX) in the target tissues (i.e., muscle,
liver, kidney and fat) and subsequently calculate the withdrawal period for moxidectin
in the lamb. For this purpose, 22 healthy Suffolk lambs, weighing 36.1 ± 3.2 kg and
untreated with anthelmintics, were analyzed using a reliable ultra-high-performance
liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical
method. All individual samples from the different target tissues (i.e. muscle, liver,
kidney and fat) showed result above the method limit of quantitation (LOQ) (5.0 μg/kg
for all matrices) at the several sacrifice point times (days). The lambs were treated
with a single subcutaneous (s.c.), dose of 0.2. mg Cydectin® NF/kg BW. Samples of
target tissues were collected on 2, 4, 7, 14, 28 and 42 days after Cydectin® NF
administration. During the whole study, the highest drug residue level occurred in the
target tissue fat. From the other target tissues (i.e. muscle, liver, kidney), MOX
concentrations were below the maximum residue limit (MRL) recommended by the
European Union (EU), under Commission Regulation (EU) nº. 37/2010. Considering
the MRL value of 500 µg/kg for MOX residues in fat for ovine, our results allowed the
estimation of a MOX withdrawal period of 31 days. This indicates that the withdrawal
period established for MOX in sheep, do not apply for lamb (other category of
animal), must ensure human food safety and not to hinder international trade of this
food commodity. Thus a specific withdrawal period for the lamb is necessarily
established.
Keywords: moxidectin; lamb; tissue depletion study; UHPLC-MS/MS; withdrawal
period.
1. Introduction
118
Sheep farming for meat is an activity that has been expanding in several
regions of Brazil (Zen et al., 2014). In this species, lamb meat is the one with the
highest acceptability in the consumer market, with better carcass yields in a shorter
production cycle, but higher efficiency due to the high growth rate of the animals
(Warner et al., 2010). However, gastrointestinal nematode infections have been a
critical obstacle to the expansion of this animal activity, with Haemonchus contortus
infection (McManus et al., 2011; Hoste et al., 2016) of overwhelming importance.
Macrocycline lactones (i.e., avermectins and milbemycins) are potent
antiparasitic drugs widely used in the treatment of parasitic infections in animals and
human parasites for the prevention of river blindness, a parasitic disease caused by
Onchocerca volvulus. Macrocyclic lactones are considered as the last „traditional‟
class of anthelmintics introduced consisting of two closely related chemical groups:
avermectins, which include abamectin, doramectin, ivermectin, emamectin,
eprinomectin, and selamectin; and milbemycins (also called nemodectins), with
moxidectin being the most representative compound. They are broad-spectrum drugs
with endectocidal and ectocidal parasiticide activity, ectoparasiticides (Shoop et al.,
1995).
Moxidectin (MOX) (5 - O -demethyl - 28 - deoxy-25-(1,3-dimethyl-1-butenyl)-
6,28 - epoxy - 23 - (methoxyimino) - (6R,23E,25S(E)) -milbemycin B); with molecular
formula: C37H53NO8) and CAS Number: 113507-06-5 was introduced in 1997 and
isolated from Streptomyces cyanogrise and Streptomyces hygroscopicus. Moxidectin
has been worldwide regulated for use in several animal species intended to produce
food for human consumption (i.e. cattle, sheep and equidae) (Global MRL Data
Base; Romero-González et al., 2014). In sheep is used in respiratory and
119
gastrointestinal nematodes, diptera larvae and mange mite‟s infections; of particular
interest is its use in the gastrointestinal nematode infection Haemonchus contortus
resistant to benzimidazoles, ivermectin and doramectin.
The mode of action on parasites of the milbelmicin moxidectin is similar to
ivermectin and abamectin by binding to ligand-gated chloride channels, more
specifically the subtypes that are gamma-aminobutyric (GABAA) mediated and
glutamate-gated (Shoop et al., 1995). The consequence of moxidectin binding and
activation is an increased membrane permeability leading to death.
The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) evaluated
MOX at its 45th and recommended a health-based acceptable daily intake (ADI) of 0-
0.0015 mg/kg bw (JECFA, 1998). In this regard, JECFA also recommended MRL
(maximum residue limit) values for cattle, sheep and deer, referring to residues of the
pharmacological active substances in edible tissues form the food producing animals.
In the case of sheep, the recommended values are 50; 100; 50 and 500 µg/kg for
muscle, liver, kidney and fat, respectively (JECFA, 1998). Those recommended
values for those target tissues have been adopted by Codex Alimentarius
Commission (Codex, 2015a), and the European Union (EU, 2010) and by the
legislative framework of several countries, such as Argentina, Chile and Colombia
among others. United State of America established MRLs values of 200, 50 and 900
µg/kg for liver, muscle and fat, respectively (Global MRL Data Base) but not for the
target tissue kidney as established by the Codex alimentarius and the European
Union.
To ensure that target tissues do not contain residues of the pharmacologically
active substance in excess of the MRL value a withdrawal period is established. That
is, the period of time between the last administration of a drug and the collection of
120
edible tissue or products from a treated animal that ensures the contents of residues
in food comply with the MRL for this veterinary drug (Codex 2015b). The withdrawal
period could be different for each veterinary medicinal product, animal
species/category and target tissue (Anadón et al., 2001, 2012).
Presently, MOX is not legally authorized for use in sheep in Brazil, only for
cattle and horses (CPVS, 2016). However, there is evidence in practice of its “extra-
label” use by sheep breeders in Brazil (Cezar et al., 2010; Cruz et al., 2010;
Veríssimo et. al., 2012). The practice has become worrisome due to the worldwide
increased reports of parasitic resistance (Kaplan and Vidyashankar, 2012; Martínez-
Valladares et al., 2013; Papadopoulos et al., 2012). At the same time, the lack of
knowledge or failure to comply with the withdrawal period for this species raises the
risk associated with the consumption of levels of pharmacological residues not
allowed in the meat product. Furthermore, to our knowledge no information is
available in the literature regarding tissue residue depletion studies of MOX in the
lamb meat.
Oral, injectable and pour-on formulations containing MOX are the veterinary
pharmaceutical presentations available on the world market for sheep treatment
against external and internal parasites (Prichard et al., 2012). Injectable moxidectin is
completely and rapidly absorbed through the subcutaneous (s.c.) pathway being
widely distributed to tissues, particularly those with high fat content (Lifschitz et al.,
1999).
It has been reported that the high lipophilicity of MOX favors its deposition at
the site of application, which allows it to be slowly released into the bloodstream,
providing longer intervals between treatments with lower dose and greater efficacy.
121
This may contribute to its persistence in target tissues and to a prolonged elimination
half-life (Alvinerie et al., 1998; Prichard et al., 2012; Rodriguez-Vivas et al., 2010).
In general, the methods reported for the determination of MOX in meat food
matrices of animal origin such as bovine muscle liver (Ali et al., 2000; Chou et al.,
2004; Xia et al., 2010), and sheep muscle, liver, and fat (Berendsen et al., 2007;
Lifschitz et al., 2000) make use of liquid chromatography with fluorescence detection
(LC-FLD). This detection technique is selective and sensitive. However, presents as
a disadvantage the requirement of a derivatization step to produce a fluorescent
derivative (Cerkvenik-Flajs et al., 2010) and usually the use of solid phase extraction
(SPE) cartridges during the sample preparation step. On the other hand, liquid
chromatography with mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS) requires simpler
procedures in the sample preparation step and provides structural identity of the
individual components with high molecular specificity and detection capability (Pitt,
2009), being recommended by Bandeira et al. (2017) for determination of
avermectins residues in ovine muscle samples. However, few studies have been
reported in the literature on the use of this technique for the determination of MOX
residues in edible tissues derived from animals (Pan, 2011; Robert et al., 2013). In
addition, to our knowledge, there is no reported study regarding the depletion of MOX
residues in lambs in which target tissues have been analyzed by ultra-high
performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)
method for the calculation of the withdrawal period. To date, the only report related to
a LC-MS/MS method for the determination of MOX is the one published by Baptista
et al. (2017) in serum from Suffolk lambs.
Therefore, the aim of this study was to conduct a MOX tissue depletion study
in lambs by determining MOX residues in four different target tissues (muscle, liver,
122
kidney and fat), after s.c. administration of a single recommended dose of 0.2 mg
Cydectin® NF /kg BW with a view to calculate the withdrawal period of MOX in lambs.
In order to monitor the presence of MOX residues in the lamb target tissues, an
analytical method by UHPLC-MS/MS was developed and fully validated. Based on
the results data obtained, the MOX withdrawal period was calculated following the
recommendations of the European Medicines Agency (EMEA, 1996).
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and reagents
Cydectin® NF was supplied by Zoetis-Fort Dodge Animal Health, Brazil.
Analytical standards of MOX and emamectin (EMA) (internal standard) were obtained
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), 99.7% purity and 97.2% purity,
respectively. Magnesium sulphate (MgSO4) and sodium chloride (NaCl) were
supplied by Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). At the sample preparation step, for
the extract cleanup, a kit containing PSA (primary secondary amine) and MgSO4 (in
proportions 50:150 mg) (Part No. 5,982-5022CH) and another kit containing PSA,
C18 (octadecylsilane) and MgSO4 (in the proportions 50:50:150 mg) (Part No. 5982-
5122CH) were supplied by Agilent Technology (Santa Clara, CA, USA). Acetonitrile
(ACN) was from J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA). Formic acid and ammonium
formate solution (5M) were supplied by Agilent Technology (Santa Clara, CA, USA).
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filtration membranes (0.22 μm) were from Nova
Analítica Importação e Exportação Ltda (São Paulo, SP, Brazil). Water was purified
by distillation and passage through a Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA).
123
2.2 Standards
Analytical standards - moxidectin (MOX) and emamectin (EMA) - {internal
standard (PI)} were obtained from Sigma-Aldrich, 99.7% pure and 97.2% pure,
respectively. The stock solutions were prepared in ACN at the concentration of 55
μg/mL for moxidectin and 60 μg/mL for emamectin, stored in amber bottles at -20 °
C. The working solutions were prepared by appropriate dilution of stock solutions and
stored at -20 °C for up to 15 days.
2.3 Animals and handling
The experiment was conducted at the Sheep and Goat Production and
Research Center (LAPOC), Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil
(25º25'S, 49º8'W, 930 m altitude). All animal evaluations and handling were carried
out according to the standards approved by the Ethics Committee on Animal Use of
the Agricultural Science Sector of the Federal University of Paraná (Protocol No.
055/2011).
Twenty-two male and female Suffolk lambs, clinically healthy and never
treated with antiparasitc medicines, were selected. From birth to weaning, these
lambs and their mothers (ewes) were kept in suspended sheep shed. During this
period, lambs received a diet composed of pelleted concentrate (Golden Sheep
Cordeiros e Borregos®; Agraria Ovinos; 20 g/kg Crude Protein) and corn silage,
through creep feeding supplementation, with free access to water. The ewes had
been no treated with MOX (Cydectin® NF) for more than 6 months before. The lambs
124
were vaccinated against clostridial diseases (Sintoxan Polivalent®, Merial, Brazil)
and weaned at 74 ± 10 days of age and 27.0 ± 2.1 kg body weight (BW). After
weaning, lambs were kept in individual suspended pens including the evaluation
period and they received 40% ryegrass hay and 60% concentrate (Golden Sheep
Cordeiros e Borregos®; Agraria Ovinos; 20 g/kg Crude Protein) ad libitum, twice a
day, with a surplus daily of approximately 10% not to limit feed intake. The diet was
formulated to meet the requirements of weaned lambs with fast growth potential
(NRC, 2007). In only two moments, the lambs underwent solid fasting: (i) 12 hours
prior to weighing to calculate the drug dosage and (ii) 16 hours prior to slaughter.
2.3.1 Experimental design
The evaluation started when the lambs presented 113 ± 1 days of age and
36.1 ± 3.2 kg. All the animals received a single dose (0.2 mg/kg BW) of Cydectin® NF
- contain 1% moxidectin by subcutaneous application (Zoetis-Fort Dodge Animal
Health, Brazil) at the inner surface of the left thigh. The dose was calculated based
on individual body weight, considering the 1% concentration of the veterinary
medicine used.
The experimental design was completely randomized and the twenty-two
animals were randomly sacrificed at different times after drug application (2, 4, 7, 14,
28 and 42 days after application). The animals at each time point consisted of two
males and two females, with the exception of days 7 and 14 in which only 2 females
and 1 male were sacrificed. In addition, 2 males were used as control (without
treatment with MOX) to obtain the blank target tissue samples for validation of the
analytical method.
125
The lambs were slaughtered in the experimental farm abattoir (Federal
University of Paraná) after solid fasting of 16 h. The stunning was performed using
electric discharge of 220 V for eight seconds and bleeding by sectioning the jugular
veins and carotid arteries. During the evisceration of the carcasses, the perirenal fat
samples were collected. Carcasses were cooled in a cold chamber at 5 °C for 24 h
and then divided longitudinally into two half-carcasses and seven commercial cuts.
The subcutaneous fat of the loin was taken and combined with the perirenal fat to
determine the concentrations of MOX residues in the adipose tissue. In addition to
fat, liver, kidney and muscle samples (loin) were also collected and conditioned in
appropriately identified plastic bags (tissue, days post-treatment, date of sampling,
animal number and group) and frozen at -20 0C until analysis.
2.4. Analytical method and validation
The MOX residues in the target tissues were determined by liquid
chromatography (UHPLC) coupled to a triple quadrupole mass spectrometer
(MS/MS) using electrospray ionization in the positive mode as ionization source. The
developed analytical method was validated taking into consideration the International
Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of
Veterinary Medicinal Products requirements (VICH, 2015).
2.4.1. Samples preparation
126
In this work, modifications were made to the original QuEChERS (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged, Safe) method, proposed by Anastassiades et al. (2003).
Thus, in a 50mL polypropylene tube containing 2.0 g of sample (previously crushed
and still frozen), were added 20 μL of the working solution containing the internal
standard (100 ng mL-1), 2 mL ACN and a homogenization ceramic (Part. No. 5982-
9313, Agilent Technologies®). Then the tubes were vortexed for 5 minutes and
subsequently 0.8 g of MgSO4 and 0.2 g of NaCl were added. Again, the tubes were
vortexed for 5 minutes and centrifuged at 10,000 g (5 minutes / 25 ° C). For cleanup,
1.0 mL aliquot of the organic phase was transferred to a microtube containing MgSO4
and PSA (150: 50 mg), shaken for 30 seconds and centrifuged at 10,000 g (1 minute
/ 25 ° C). The cleanup of the fat sample was performed using the ratio of 150: 50: 50
mg of MgSO4, PSA and C18, respectively. The supernatant was then filtered into
PTFE membranes with porosity 0.22 μm in diameter, directly into the vial, and
injected into the LC-MS / MS system.
2.4.2. LC-MS/MS analysis
All analyzes were performed on the Agilent UHPLC 1290 system consisting of
quaternary pumps, automatic injector, thermostat for column and sampler coupled to
a 6460 triple quadrupole mass spectrometer (Agilent Technology, CA, USA). The
data acquisition and treatment control software was MassHunter (Agilent
Technology, CA, USA) version B.06.00. The samples were analyzed using Zorbax
Eclipse Plus C18 RRHD column ( 1.8 µm, 2,1 mm x 50mm) (Agilent Tecnologies,
CA, USA, p/n 699775-902). and mobile phase gradient solution of 5 mM ammonium
formate + 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear
gradient program as follows: 0 min until 1.50 min, 45% A and 55% B; 1.51 min until
127
4.50 min, 5% A and 95% B; 4.51 min until 6.00 min, returned to the initial proportion.
The elution conditions were optimized with flow rate of 0.5 mL/min, injection volume
was 5 μL and oven temperature was 30 °C. The following ionization source
parameters were adopted for the MOX method: gas temperature – 200ºC; gas flow –
10L/min; nebulizer – 15 psi; sheath gas temperature – 400 ºC; sheath gas flow –
12L/min; capillary – 5000 V and nozzle voltage – 2000 V.
MOX quantitation was performed in MRM (multiple reaction monitoring) mode
using EMA as an internal standard. For the two analytes, two transitions were
monitored, being a transition related to the quantifying ion and another related to the
qualifying ion, aiming to obtain at least 3 identification points, as recommended by
the European Community Guide 2002/657 / EC (EC, 2002).
2.4.3. Validation of the analytical method
The developed analytical method was fully validated according the
International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for
Registration of Veterinary Medicinal Products requirements (VICH, 2015)
requirements - linearity, accuracy, precision, method quantitation limit (LOQ), method
detection limit (LOD) and specificity.
2.5. Data analysis
Data obtained was calculated with the withdrawal period calculation program
WT 1.4 that was recommended by the Committee for Veterinary Medicinal Products
EMEA/CVMP/036/95 (EMEA, 1996). This guide recommends consider the linear
128
regression technique of log-transformation; it was determined as the time when the
one-sided 95% upper tolerance limit of the regression line was below the MRL with
95% confidence.
3. Results and Discussion
3.1. Analytical method
As previously mentioned, the method developed for the analysis of moxidectin
in lamb tissues was validated following the recommendations of the VICH (2015).
Analytical curves for the determination of MOX residues in the target tissues were
prepared by fortifying blank tissues with MOX to produce a linear concentration in the
range of 5 - 200 μg/kg, and showed a correlation coefficient exceeding 0.99. The
method limit of quantitation (LOQ) was 5.0 μg/kg for all matrices. The overall
accuracy for the determination of MOX in target tissues was between 70 - 120%,
obtained from recovery tests. The average interday and intraday precisions were
evaluated from the relative standard deviations and were lower than 5.5% for MOX in
all matrices.
3.2. Tissue residue depletion
In this study, the injectable veterinary medicinal product Cydectin® NF
containing MOX was well tolerated by lambs after subcutaneous application of the
recommended dose (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW), and no adverse reactions were
observed at the injection site of administration (i.e. left thigh).
129
Mean MOX residue concentration in muscle tissue (i.e. loin, liver, kidney and
fat – perirenal plus subcutaneous) on days 2, 4, 7, 14, 28 and 42 after subcutaneous
application and respective estimates of relative standard deviations are show in
Table 1, and MOX residue depletion in the target tissues is shown in Figure 1. The
curves were constructed from the MOX residue concentration averages obtained at
each point of collection. Data indicates that there is a slow elimination of MOX in all
tissues, with a higher permanence in the adipose target tissue (perirenal and
subcutaneous). It is clearly observed in both liver and kidney residue depletion
curves a great similarity from the 2nd to the 28th day after moxidectin subcutaneous
application.
Table 1. Residue concentrations of moxidectin (MOX) in lamb target tissues after
single dose (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW) subcutaneous injection.
Days
Post -administration
Tissue residue concentration (mean ± SD) of MOX (µg/kg)
Muscle Liver Kidney Fat
2 25.93 ± 6.90 34.85 ± 9.25 33.96 ± 8,35 750.12 ± 202.84
4 22.46 ± 3.65 44.20 ± 7.00 42.30 ± 11.70 729.18 ± 239.3
7 20.65 ± 4.45 43.95 ± 6.30 46.95 ± 7.00 675.57 ± 240.06
14 14.51 ± 1.74 17.90 ± 3.85 19.00 ± 7.90 575.73 ± 208.76
28 11.57 ± 2.27 16.80 ± 3.30 16.52 ± 4.82 297.8 ± 84.41
42 9.04 ± 0.50 11.65 ± 2.20 9.41 ± 0.78 123.29 ± 35.57
130
Figure 1. Residue depletion curves of MOX from lamb fat, liver, kidney and muscle
after single dose subcutaneous injection (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW).
As shown in Table 1, from the first to the last day of collection all samples for
the 4 target tissues were quantifiable. Thus, all values were above the LOQ (5
μg/kg). The maximum residue concentrations of MOX found in muscle (25.93 ± 6.90
μg/kg, 2 hours after), liver (44.20 ± 7.00 μg/kg, 4 hours after), kidney (46.95 ± 7.00
μg/kg, 7 days after) and fat (750.12 ± 202.84 μg/kg, 2 hours after), corroborate that
fat should be considered the main target tissue of MOX in lambs, due to the fact that
in this target tissue it was verify the highest residue level of MOX. MOX is very
lipophilic, which causes it to have a high volume of distribution and concentrates in
the animal‟s adipose tissue from where is released (Zulalian et al., 1994).
On the second day after MOX application the residue levels in muscle, liver
and kidney were all below the recommended MRL values for each target tissue.
1
10
100
1000
0 10 20 30 40
log.
con
c. (
µg/
kg)
Days post-administration
liver
kidney
muscle
fat
131
Lifschitz et al. (2000) in a similar study conducted in adult sheep (i.e. other category
of animal species) also reported MOX residue levels in muscle, liver and fat tissues
below the respective MRL value at all collection times. Nevertheless, those authors
collected the samples for analysis from day 21 until day 49 post-treatment.
In addition, comparing our results to those obtained by Lifschitz et al. (2000) it
can be verified that MOX decays in adipose tissue in sheep (abdominal) is faster
than in lambs (perirenal plus subcutaneous). Furthermore, on the 42nd day post-
treatment the MOX residue level found in the adipose tissue was 23.04 ± 21.84 μg/kg
and 123.29 ± 35.57 μg/kg for adult sheep and lambs, respectively. This demonstrates
longer MOX mean residence time in lambs than in sheep; what probably justifies this
difference is the age of the animals, since according to Owens et al (1993) and
Santos et al. (2001) the proportional amount of fat in adult sheep (17% total fat; 70 to
80 kg BW) is greater than in lambs (2-4% total fat; 35 to 40 kg BW).
3.3. Withdrawal period estimation
Statistics methodology applied on data analysis of this study follows the
recommendation of the Committee for Veterinary Medicinal Products (EMEA), using
the linear regression analysis of the logarithmic transformation data techniques
(EMEA, 1996). Using this concept, the withdrawal period was determined as the time
when the one-sided 95% upper tolerance limit of the regression line with 95%
confidence level was below the MRL values and analysis of homogeneity of
variances.
Withdrawal period are determined to ensure that residues in tissues are
reduced to the permissible safe intake levels. It assures the producer and the
132
consumer that the concentration of residues will be below the permitted MRLs (EMA,
1996; Vranic et al., 2003). Based on this information, is possible to estimate the
withdrawal period from the MRL (500 μg/kg) for fat. The value found was 31days
(Figure 2).
Figure 2. Plot of withdrawal time calculation for lamb fat at the time when the one-
sided 95% upper tolerance limit was below the MRL (500 µg/kg).
The withdrawal time must be established in relation to each target animal
species (i.e. sheep) and category (i.e. lamb) due to differences in physiological (in
this case, ruminants and pre-ruminant) and biochemical characteristics (Anadón el
at., 2016). For instance, data available in the public literature database indicates
there is a shortage of this type of study in lambs.
WT = 30.94
MRL
133
Conclusions
The reliable and sensitive UHPLC-MS/MS method used in this study for
quantitation of MOX residue levels in lambs target tissues (muscle, liver, kidney and
fat) was suitable for the tissue depletion study conducted. At the first point time of
sample collection (2 days after treatment) MOX residue levels in liver, kidney and
muscle were below the established MRL for these matrices in sheep. Furthermore,
results from the residue depletion study corroborates that the adipose tissue should
be considered as the main target tissue for MOX in lambs after single subcutaneous
administration, as well as allowed the calculation of an estimated withdrawal period
of 31 days. Thus, to ensure human food safety and not to hinder international trade
of this food commodity, a specific withdrawal period for MOX residues in lamb edible
tissues must be established.
Conflict of Interest
The authors declare that there are no conflicts of interest.
Acknowledgments
The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation-Agilent
Technologies for supplying the Agilent UHPLC 1290-MS/MS 6460 system employed
in this study (FAPESP-Agilent Grant number 2013/50452-5), and the funding support
from the Coordination for the Improvement of Higher Level Education Personnel
(Process PROEX/CAPES number 3300301702P1) and the National Council for
Scientific and Technological Development (Process CNPq number 305390/2013-9).
134
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