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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS
QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS
TRATAMENTO BIOLÓGICO DE SOLO IMPACTADO POR
RESÍDUOS OLEOSOS PROVENIENTES DO REFINO DE
PETRÓLEO
Teresa Cristina Ferreira do Nascimento
Fevereiro – 2013
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE
PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS
TRATAMENTO BIOLÓGICO DE SOLO IMPACTADO POR
RESÍDUOS OLEOSOS PROVENIENTES DO REFINO DE
PETRÓLEO
Teresa Cristina Ferreira do Nascimento
TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS
QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS PARA OBTENÇÃO DO
GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS (DSc.)
Orientadores: Francisca Pessoa de França, D.Sc.
Fernando Jorge Santos de Oliveira, D.Sc.
Fevereiro – 2013
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Ficha catalográfica
N244t Nascimento, Teresa Cristina Ferreira do.
Tratamento Biológico de Solo Impactado por Resíduos Oleosos
Provenientes do Refino de Petróleo/ Teresa Cristina Ferreira do
Nascimento. – 2013.
xix, 140 f.: il.
Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro,
2013.
Orientadores: Francisca Pessoa de França e Fernando Jorge Santos de Oliveira
1. Biorremediação. 2. Landfarming. 3. Resíduos Oleosos. 4. Hidrocarbonetos
Policíclicos Aromáticos 5. Cossubstratos- glicerol e óleo de soja – Teses. I. França,
Francisca Pessôa de. (Orient.). II. Oliveira, Fernando Jorge Santos de (Orient.).
III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química. IV. Título.
CDD: 628.5
v
“Manda a sabedoria desde o céu santo e a envia desde o teu trono glorioso, para
que ela me acompanhe e participe dos meus trabalhos, e me ensine o que é
agradável a ti”.
Livro da Sabedoria 9-10, Bíblia Sagrada
vi
Esta Tese é dedicada,
À Rita, minha mãe, pelo exemplo de vida, extremo amor e dedicação incondicional.
À José, meu pai (in memorian), pelo amor e pela calma.
À Maria do Socorro, minha querida tia, pelo amor e toda a ajuda possível e impossível.
À José Júnior, meu querido irmão, pelo amor que nos une.
vii
À Raquel e Rebecka
Fabiana, Camilla e Clara Eduarda (sobrinhas)
Por terem suprido o meu lado mãe, mesmo sem ter tido filhos
À Maria Eugênia (irmã- in memorian).
À Francisco Eduardo (primo- in memorian).
Elos importantes na minha jornada de vida.
viii
AGRADECIMENTOS
Como não se faz uma Tese sozinha, eu gostaria de agradecer a grande equipe que me
ajudou nessa conquista.
Primeiramente à Deus, que acredito ser a energia maior, sem a qual a minha vida não
teria o menor sentido.
Ao Divino Espírito Santo, pela iluminação nos momentos de completa escuridão.
À Jesus Cristo, pelo exemplo a seguir sempre, e pelo seu extremo sacrifício por nós,
na figura de um ser humano.
À mãe de Jesus Cristo e mãe de todos nós, que me houve e atende sempre. Obrigada,
minha Nossa Senhora de todas as horas.
À Nossa Senhora de Guadalupe, pelo milagre da aceitação do trabalho do México a
bom tempo, quando parecia não haver a menor possibilidade.
Aos meus orientadores; a Professora Doutora Francisca Pessôa de França e ao Dr.
Fernando Jorge Santos de Oliveira, pelo apoio e auxílio na execução e andamento deste
trabalho. Um agradecimento especial à Professora Francisca pelo convite, pela amizade,
sinceridade e liberdade a mim concedidas.
Aos meus amigos de fé e grandes incentivadores, em especial a amiga Ana Nilce
(Meméia), aos amigos Graça e Joselias (Bolota), Edson Leão (Didinho), Ubiratan Mynssem
(Bira), Carlos Alberto (Pinha) e demais amigos e amigas; pela amizade, pelos momentos de
relax e descontração, com muita música e boas gargalhadas.
Aos primos Cida Veloso, pelo carinho, e ao querido primo e parceiro de todas as
horas, Francisco Veloso, sempre cobrindo as minhas ausências.
Ao Carlinhos e Luizão da Geotecnia, pelas análises de solo, sempre sorrindo e de bom
grado, mesmo com suas agendas lotadas.
Ao Prof. Luiz Guilherme Marques, pela amostra de glicerol bruto.
Ao pessoal do CETEM, em especial a Dra. Andréa Rizzo, Eliane Carollo e Renata
Santos, pelo auxílio nas primeiras tentativas de ensaios de TPH.
Ao pessoal (equipe) do professor D’Ávila, em especial à Amanda Pereira e ao técnico
Estevan Padini, pelas análises de densidade e viscosidade, e também ao Rafael, pelas análises
de FTIR.
À Química Isabel Lopes, pelas sugestões e empenho nas análises de SARA, e aos
técnicos Santiago e Grazielli, pela execução e esclarecimentos.
ix
As professoras Cheila Mothé e Érica Chrisman, pelas sugestões e apoio em alguns
ensaios preliminares, e à professora e amiga Maria José, pelo incentivo no ingresso deste
curso.
Ao pessoal do IMA, à Dra. Bluma e à técnica Dalva, pela disponibilidade na
realização de alguns ensaios.
À professora Maria Cláudia da Geotecnia, pelo apoio e sugestões importantíssimas.
Ao professor Leon Rabinovitch, pela identificação de estirpes de bactérias, e à Jeane
Quintanilha Chaves, da equipe do professor Leon, do CCGB da FIOCRUZ.
À professora Maria Inês Sarquis, pela identificação de fungos e também por sua
atenção, dedicação e sugestões valiosas.
À professora doutora Lucy Seldim do Laboratório de Genética Microbiana, por
encaminhar para identificação de estirpes de bactérias, e à Renata Vollu, pela atenção,
trabalho com o preparo, envio e identificação das cepas.
À equipe de técnicos do laboratório das professoras Magali e Denise, em especial à
Verônica, pelo suporte nas análises preliminares de óleos e graxas.
À professora Eliana Flávia, pelo apoio logístico em seu laboratório e na confecção de
inúmeras análises. Obrigada pelo carinho, atenção e colaboração.
Ao professor Nei Pereira Jr., pelos bons conselhos e disponibilidade do seu laboratório
para a execução de algumas tarefas.
Aos amigos do Laboratório 107, pelos bons momentos de comemorações e trabalho de
equipe, entre eles: Cristiane D`Arco, José Vitor, Diego e Juliana, e Verônica, do Lab. 103,
pelas fotografias dos micro-organismos.
Aos amigos Paulo Santana e Iracema Marques da Silva, pelo suporte em momentos
difíceis. Ele viabilizando a execução de tarefas e ela com suas mãos mágicas no preparo de
culturas de fungos e bactérias para identificação.
Aos amigos do Laboratório 109 com quem eu tive a oportunidade de conviver ao
longo desses anos de forma divertida e prazerosa e que, direta ou indiretamente, me ajudaram
em momentos preciosos desse trabalho: Aike Costa, Diogo Simas, Denise, Jamille Lima,
Camilla Gonzales, Renata Calixto, Carlos Eduardo (Cadu), Leonardo Jordão, Kally Sousa,
Adilza (Dill), Milton, Rafael, Rafael Bittencourt, Virginia, Daniel Serwy, Daniel II, Igor, Eni,
Felisberto, Danadara. E quero agradecer especialmente aos amigos de jornada, companheiros
de todas as horas e de decisões acadêmicas importantes, Dr. Ulrich Vasconcelos, Dra.
Ivanilda Melo e Dra. Flávia Padilha.
x
Um agradecimento especial à amiga Moema Ungarelli Gonzaga que, amavelmente,
me presenteou com as correções de português.
Ao pessoal da Secretaria de Pós-Graduação, pela atenção e paciência no repasse de
todas as informações, em especial ao Júlio, Roselli, Marlene e Natália, o meu muito obrigado.
Ao amigo e químico Eric Tiago Neiva, pelo apoio nas minhas ausências no trabalho.
Ao Sr. José Antônio Roque Neto, da empresa INCOME Indústria e Comércio de
Metais Ltda., pela liberdade de trabalho.
À ESSENCIS Soluções Ambientais, pela destinação do resíduo sólido utilizado e
gerado neste estudo.
À CAPES e ao CNPQ.
xi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS xiv
LISTA DE TABELAS xvi
LISTA DE QUADROS xvi
LISTA DE ABREVIATURAS xvii
RESUMO xviii
ABSTRACT xix
CAPÍTULO 1 – Introdução 20
CAPÍTULO 2 – Objetivos 24
2.1. Objetivo Geral 24
2.2. Objetivos Específicos 24
CAPÍTULO 3 – Revisão Bibliográfica 25
3.1- Aspectos gerais sobre a complexidade da contaminação de solos por
petróleo, derivados e resíduos oleosos
25
3.2- Refino de óleo cru e a geração de resíduos 28
3.3- Sistemas de Tratamento de solos impactados com resíduos oleosos oriundos
de refinarias de petróleo
33
3.3.1- Processos térmicos 33
3.3.2- Processos químicos 36
3.3.3– Processos biológicos 39
3.3.3.1- Landfarming 40
3.3.3.2 – Biopilhas 43
3.3.3.3- Biorreatores 44
3.4- Biodegradação de hidrocarbonetos: microrganismos envolvidos e
metabolismo
45
3.4.1. Microrganismos 46
3.4.2- Metabolismo microbiano 48
3.5. Fatores que influenciam a biodegração de hidrocarbonetos 52
xii
3.5.1. pH e Nutrientes 52
3.5.2 Temperatura 54
3.5.3 Umidade e aeração 54
3.5.4. Tipo dos contaminantes e grau de intemperismo 55
3.5.5 Quantidade do contaminante 58
3.5.6. Tipo de solo 59
3.5.7. Presença de biosurfactantes 61
3.6. Uso de Cossubstratos na biorremediação de solos impactados 62
CAPÍTULO 4 - Materiais e Métodos 66
4.1 – Solo 66
4.1.1- Amostragem
66
4.2- Ensaios físicos e físico-químicos
67
4.2.1 – Umidade
67
4.2.2 - Capacidade de retenção de água
68
4.2.3 – Granulometria
68
4.2.4 – pH
69
4.2.5. Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH)
69
4.2.6. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)
70
4.2.7 – Nitrogênio total e fósforo total
70
4.2.8 – Determinação de SARA
70
4.3 – Quantificações microbianas
71
4.4 – Etapas Experimentais
72
4.4.1 – Influência da concentração inicial do contaminante na biorremediação
72
4.4.2 – Efeito do tipo e concentração inicial de cossubstratos na
biorremediação
73
4.4.3 – Efeito do uso de glicerol bruto na biorremediação
73
xiii
4.5 – Fitotoxicidade dos solos remediados
74
4.6 – Identificação de bactérias e fungos filamentosos
75
CAPÍTULO 5 – Resultados e Discussão 77
5.1 – Caracterização do solo
77
5.2 – Caracterização do contaminante
79
5.3 – Efeito da concentração inicial do resíduo na Biorremediação 83
5.4 – Emprego de cossubstratos renováveis como alternativa para aumentar a
biodegradação dos hidrocarbonetos
93
5.5 – Biorremediação de solo contaminado com TPH 60 g/kg, empregando
glicerol bruto como cossubstrato
100
5.6 – Fitotoxicidade do solo 106
5.7 – Micro-organismos isolados durante os 60 dias de processo em laboratório 108
CAPÍTULO 6 – Conclusões 114
Referências Bibliográficas 116
ANEXO A – Declaração de Destinação de Resíduos
ANEXO B– Produção Bibliográfica
ANEXO C – Trabalhos Publicados
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 Esquema Simplificado do processo de refino de petróleo e a
geração de resíduos
30
Figura 3.1 Fluxograma de processo de incineração de solos contaminados
com resíduos oleosos
35
Figura 3.3 Metabolismo bacteriano da ruptura orto ou meta do anel
aromático
50
Figura 3.4 Degradação de naftaleno por bactérias aeróbicas 51
Figura 3.5 Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos 52
Figura 4.1 Foto mostrando o landfarming, o local de origem das amostras
de solo
66
Figura 4.2 Os reatores usados em escala de bancada 72
Figura 5.1 Curva granulométrica de uma das amostras de solo 78
Figura 5.2 Cronograma de TPH de solo contaminado antes da
biorremediação, TPH=29,2 g/kg
81
Figura 5.3 Perfil cromatográfico do resíduo oleoso que contaminou os solos,
em coluna delgada, usando TLC-FID para análise SARA
83
Figura 5.4 Porcentagem de biodegradação de TPH, em 30 e 60 dias de
processo, nos ensaios de biorremediação com TPH inicial 15,3,
19,0 e 29,2 g/kg de solo
85
Figura 5.5 Evolucão do crescimento microbiano durante a biorremediacão
(a) BHT; (b) FT
91
Figura 5.6 Valores de pH dos reatores contendo glicerol, óleo de soja como
cossubstratos
94
Figura 5.7 Percentual de degradação com suplementação dos cossubstratos
glicerol e de óleo de soja após 60 dias
95
Figura 5.8 Perfil cromatográfico do extrato orgânico do solo de landfarming
com teor de HTP igual a 29,2g/kg de solo, suplementado com os
cossubstratos glicerol e de óleo de soja após 60 dias
96
Figura 5.9 Monitoramento microbiano solos suplementados com glicerol e
óleo de soja a 750 mg/kg e HTP de 29,2 g/kg (TPH/Cossubstrato,
igual a 40:1)
99
xv
Figura 5.10 Valores de pH e Umidade em solos suplementados com glicerol
comercial e glicerol bruto e THP inicial de 60 g/kg na relação
(TPH:Cossubstrato, igual a 40:1).
101
Figura 5.11 Percentual de degradação de solos com HTP de 60 g/kg,
suplementados com cossubstratos, glicerol comercial e glicerol
bruto na relação (TPH:Cossubstrato, igual a 40:1)
102
Figura 5.12 Monitoramento Microbiano em solos suplementados com
glicerol comercial e glicerol bruto na relação (TPH/Cossubstrato,
igual a 40:1) e TPH inicial de 60g/kg
105
Figura 5.13 Colônias de fungos e bactérias com distintos aspectos 109
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Características de borra oleosa 32
Tabela 3.2 Alguns gêneros microbianos hidrocarbonoclásticos 47
Tabela 3.3 Constantes físico-químicas dos 16 HPA listados pela USEPA 57
Tabela 5.1 Resultados da caracterização física e química do solo 77
Tabela 5.2 Capacidade de troca catiônica de solo de landfarming 79
Tabela 5.3 Caracterização por polaridade do resíduo oleoso contido no solo 82
Tabela 5.4 Comparações múltiplas das médias de biodegradação do TPH em
30 e em 60 dias de processo
86
Tabela 5.5 Lista CONAMA de valores orientadores para solos (Brasil,
2009)
88
Tabela 5.6 Biodegradação de criseno e de benzo[a]pireno em função da
concentração inicial de HPA no solo
89
Tabela 5.7 Características físico-químicas dos cossubstratos 93
Tabela 5.8 Monitoramento da umidade dos solos 94
Tabela 5.9 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno nas
concentrações de 350, 750 e 1500 mg/kg dos cossubstratos
glicerol e óleo de soja e HTP igual a 29,2 g/kg de solo
97
Tabela 5.10 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno – HTP igual a
60g/kg de solo e cossubstratos glicerol comercial e glicerol bruto
na relação HTP/Cossubstrato de (40/1).
103
Tabela 5.11 Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno reportados da
literatura
103
Tabela 5.12 Fitotoxidade do solo antes e depois do biotratamento 107
Tabela 5.13 Isolados bacterianos em solo contaminado com resíduos oleosos 109
Tabela 5.14 Fungos Filamentosos isolados de solo contaminado com resíduos
oleosos
110
LISTA DE QUADROS
Quadro 4.1 Representação da divisão do landfarming em células 67
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
BHT Bactérias Heterotróficas Totais
FT Fungos Totais
UFC/g Unidades Formadoras de Colônias por grama de solo
HPA Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
HTP Hidrocarbonetos Totais de Petróleo
TPH Hidrocarbonetos Totais de Petróleo
USEPA United States Environmental Protection Agency
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
CRA Capacidade de Retenção de Água
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Kow Constante de partição em octanol/água
CTC Capacidade de Troca Catiônica
pb Pares de base
TPH DRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Diesel
TPH ORO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Óleo Lubrificante
TPH GRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Gasolina
TPH KRO Hidrocarbonetos Totais de Petróleo- Faixa Querosene
xviii
RESUMO
NASCIMENTO, Teresa Cristina Ferreira. Tratamento biológico de solo impactado por
resíduos oleosos provenientes do refino de petróleo. Rio de Janeiro, 2013. Tese
(Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013
Os solos contaminados com hidrocarbonetos de petróleo constituem uma parcela significativa dos
resíduos gerados pelo setor de óleo e gás (O&G). Dada a toxicidade e a grande quantidade gerada,
trata-se de resíduos críticos. A viabilização do negócio do O&G pressupõe o adequado gerenciamento
dos resíduos gerados, que é uma tarefa ainda mais difícil quando se trabalha com materiais tóxicos, em
grandes quantidades e em áreas distantes dos grandes centros de disposição final e de tratamento de
resíduos. Neste contexto, avaliou-se a biodegradação de hidrocarbonetos em solo amazônico, oriundo
de um landfarming instalado em uma unidade do setor de O&G, em escala de biorreator de bancada.
A inovação deste trabalho de tese abrangeu: i) a avaliação da influência da concentração inicial de
hidrocarbonetos intemperizados de petróleo na biodegradação e, ii) o estudo da influência da
suplementação de fontes adicionais de carbono, óleo vegetal e glicerol sobre a biodegradação dos
hidrocarbonetos intemperizados. Os ensaios e os testes controles foram monitorados durante 60 dias,
promovendo-se sistemática aeração e umectação. Dos solos, foram isoladas linhagens de Aspergillus,
Cunninghamella, Serratia, Rhodococcus, Micrococcus e Bacillus, como micro-organismos
predominantes nos solos contendo altas concentrações de hidrocarbonetos. Verificou-se que o
aumento da concentração de hidrocarbonetos de 15,3 g/kg para 29,2 promoveu uma redução de 29%
na biodegradação. Também foi verificado que o aumento da concentração inicial do TPH do solo de
15,3 para 29,2 g/kg influenciou negativamente a biodegradação do criseno, que passou de 66% para
19%. Já para o caso do benzo(a)pireno, não foi verificado qualquer efeito do TPH inicial na
biodegradação. Visando a melhoria da biodegradação, foram feitos testes com uso de cossubstratos
renováveis e de baixo custo. Os testes foram conduzidos com solo contendo TPH inicial de 29,2 g/kg.
A suplementação com glicerol comercial ou com óleo de soja, na concentração de 750 mg/kg,
promoveu a manutenção da população dos micro-organismos presentes no solo e remoção de
hidrocarbonetos totais de petróleo, do criseno e também do benzo(a)pireno, que são compostos tóxicos
de alta massa molecular. Em seguida, visando a redução dos custos dos processos numa ampliação de
escala, testes foram conduzidos com emprego de glicerol residual da produção de biodiesel e glicerol
comercial, na proporção de (40:1) e um solo contendo TPH inicial de 60 g/kg. Não foi verificada
diferença significativa na biodegradação dos hidrocarbonetos totais de petróleo pela suplementação
com glicerol comercial ou bruto. Observou-se uma remoção de aproximadamente 80 % dos
hidrocarbonetos totais do solo, de aproximadamente 78% para o criseno e de 56% para
benzo(a)pireno. Em conclusão, contribuiu-se com o conhecimento de variáveis operacionais
importantes para a otimização da biodegradação de hidrocarbonetos recalcitrantes e intemperizados
em solo amazônico.
Palavras-chaves: Biorremediação, Landfarming, Resíduos Oleosos, Hidrocarbonetos
Policíclicos Aromáticos, Cossubstratos, Glicerol e Óleo de Soja.
xix
ABSTRACT
NASCIMENTO, Teresa Cristina Ferreira. Biological treatment of weathered oily-sludge
contaminated soil from oil refinery. Rio de Janeiro, 2013. Thesis (Post-Graduation in
Technology of Chemical and Biochemical Processes) – Escola de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, 2013
Petroleum hydrocarbons contaminated soil constitute a significant portion of the waste generated by
the oil and gas sector (O & G). It is critical residues due to toxicity and generated amount. The
feasibility of the O & G business requires proper management of generated waste, which is an even
more difficult task when working with toxic materials in large quantities and in areas far from main
centers of disposal and treatment of waste. In this context, we evaluated the biodegradation of
hydrocarbons in a soil from Amazon, by a landfarming installed on a facility of O & G sector, in
bench scale bioreactor. The innovation of this thesis included: i) the evaluation of the influence of
initial concentration of weathered hydrocarbons in oil biodegradation, and ii) the study of influence of
supplementation of additional carbon sources, vegetable oil and glycerol on the biodegradation of
weathered hydrocarbons . Assays and control tests were monitored for 60 days, promoting systematic
aeration and wetting. From the soil were isolated strains of Aspergillus, Cunninghamella, Serratia,
Rhodococcus, Micrococcus and Bacillus, such as micro-organisms predominant in soils containing
high concentrations of hydrocarbons. It was found that increasing the concentration of hydrocarbons
of 15.3 g/kg to 29.2 promoted a 29% reduction in biodegradation. It was also shown that increasing
the initial concentration of TPH of the soil from 15.3 to 29.2 g/kg negatively influenced
biodegradation of chrysene, which increased from 66% to 19%. For the case of benzo (a) pyrene it
was not observed any effect of the TPH initial biodegradation. Aiming biodegradation improvement,
tests were carried out using low cost and renewable co-substrates. Tests were conducted with initial
TPH soil containing 29.2 g/kg. Supplementation with glycerol or with commercial soybean oil at a
concentration of 750 mg/kg promoted maintenance of the population of micro-organisms present in
soil and total petroleum hydrocarbons removal, as also chrysene and benzo (a) pyrene removal, which
are high molecular weight and toxic compounds. Then, in order to reduce the costs of scale-up
processes, tests were conducted with use of residual glycerol from biodiesel production and
commercial glycerol in the proportion of (40:1) and an initial soil containing TPH of 60 g/kg. There
was no significant difference in the biodegradation of total petroleum hydrocarbons by
supplementation with residual or commercial glycerol. There was a removal of approximately 80% of
total hydrocarbons from the soil and approximately 78% for chrysene and 56% for benzo(a)pyrene. In
conclusion, we contributed with knowledge of important operational variables for the biodegradation
of recalcitrant and weathered hydrocarbons optimization in a soil from Amazon region.
Keywords: Bioremediation, Landfarming, Oily Waste, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,
Co-substrates - Glycerol and Soybean Oil.
Nascimento, T.C.F. Introdução 20
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO
Petróleo é o termo utilizado para designar óleo e gás natural. É uma substância
viscosa, inflamável, menos densa que a água, com cheiro característico e cor variando entre o
negro e o castanho-escuro (THOMAS, 2001). Também pode ser definido como uma mistura
de várias substâncias orgânicas e inorgânicas com predominância de hidrocarbonetos mais
impurezas (SZKLO e ULLER, 2008). Mais especificamente, deve-se considerar que todo o
tipo de petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, compostos sulfurados,
compostos nitrogenados, compostos oxigenados, elementos químicos diversos (ex: Ni, V, Hg,
Na, Ba e S), água e outras substâncias.
O uso de petróleo remonta a tempos muito antigos, há cerca de 3000 anos na China,
decorrente de um vazamento de gás na superfície, o que possibilitava a sua coleta e transporte
através de tubulações de bambu. Desta forma, nota-se que, desde o princípio, o uso para fins
energéticos é a principal aplicação deste recurso natural e finito. Atualmente o Brasil é o
segundo maior produtor de petróleo da América do Sul, e passa por constante crescimento no
setor. Em 2009 alcançou a marca de dois milhões de barris diários (ANP, 2011), constituindo
um dos pilares da matriz energética do país e da economia local.
A indústria do petróleo e gás natural possui vários ramos de atuação: exploração,
produção, refino, transporte e comercialização. Algumas empresas desse setor produtivo
possuem ainda operações envolvendo a produção, o transporte e a comercialização de
biocombustíveis. Há ainda empresas que se dedicam ao mercado produtor de energia a partir
de combustíveis diversos, como gás natural, diesel e carvão. Todas essas atividades geram
resíduos sólidos perigosos e não perigosos. Desta forma, fica claro o largo espectro de
materiais que devem ser gerenciados como resíduos.
Refinarias de petróleo são sistemas complexos com múltiplas operações que
dependem das propriedades do insumo ou da mistura de insumos e também dos produtos que
se deseja produzir, por isso a composição da carga das refinarias pode variar
significativamente. Assim, não existem duas refinarias iguais no mundo, (SZKLO e ULLER,
2008). Dentre os processos de refino destacam-se: a separação, a conversão, o tratamento e
processos auxiliares. De todos os segmentos do setor de petróleo e gás, as operações de refino
e petroquímicas são reconhecidas como grandes geradoras de resíduos perigosos e de manejo
complexo (CUNHA, 2009).
Nascimento, T.C.F. Introdução 21
As refinarias em geral são planejadas e dimensionadas para recebimentos de misturas
de petróleos, com vistas à produção de frações ricas em hidrocarbonetos com características
específicas, como, por exemplo, gasolina, diesel, corrente de propeno, correntes de
aromáticos, etc. Ocorre que, com o passar do tempo, há uma natural modificação da
composição do óleo cru recebido. Essas modificações geram perturbações no processo
produtivo e incrementam os resíduos. Além disso, a diversidade de produtos requer o uso de
processos térmicos, catalíticos e de equilíbrio de fases, e, conseqüentemente, aumenta-se a
complexidade do processo de refino, o que também pode promover aumento na geração de
resíduos.
Dentre os resíduos perigosos gerados nas refinarias encontram-se os resíduos oleosos,
como as borras de fundo de tanque, as borras geradas nas unidades de processo e os líquidos
drenados em canaletas dos pátios. Assim, a adequada gestão desses resíduos e os custos
relacionados com essas operações são uma preocupação do setor industrial e acadêmico.
Devido à composição química e à elevada quantidade em todo o planeta, o petróleo,
combustíveis derivados do petróleo, os óleos lubrificantes e os resíduos oleosos são
reconhecidos como materiais com alto risco de contaminação ambiental e de danos à saúde do
ser humano (THAPA et al. 2012, STEMPVOORT e BIGGAR, 2008). Detendo-se no ponto
de vista ambiental, sabe-se que o solo é um dos compartimentos do planeta impactados pelo
petróleo, derivados e resíduos oleosos (SHERR et al. 2007). Vários acidentes ambientais
envolvendo vazamento de petróleo ou derivados em tanques, dutos e refinarias já ocorreram
nas últimas décadas. No entanto, a contaminação não acidental, também denominada
contaminação crônica, é uma das preocupações atuais, constituindo uma das principais rotas
de contaminação por hidrocarbonetos (MUTECA, 2012).
Uma das questões contemporâneas é a sustentabilidade ambiental dos processos
industriais. Hoje a sociedade valoriza a necessidade de produtos e processos sustentáveis, que
não comprometam a qualidade de vida no planeta para as próximas gerações.
Para atender aos anseios da sociedade civil, da legislação e visando a manutenção das
suas operações, as empresas do setor de petróleo e gás vêm investindo no desenvolvimento de
tecnologias limpas, bem como no correto manejo, tratamento e disposição final dos resíduos.
Atualmente existem várias alternativas para o tratamento de resíduos oleosos, dentre elas a
disposição destes resíduos no solo. Os métodos empregados para o tratamento de solos
contaminados por petróleo e derivados são os processos físicos, químicos e biológicos. A
tecnologia de tratamento biológico de solos, também conhecida como biorremediação, é um
Nascimento, T.C.F. Introdução 22
processo que envolve degradação de contaminantes do solo, água e sedimentos através de
micro-organismos autóctones ou exógenos (MAO et al. 2012). Em geral os custos de um
tratamento biológico são menores em relação aos tratamentos químicos ou físicos
(CUNNINGHAN et al. 2004; SARKAR et al. 2005; PALA et al. 2006; YANG et al. 2009).
A incorporação de resíduos oleosos em solos objetiva usar o potencial da microbiota
natural desses ambientes para degradar os contaminantes orgânicos presentes. Essa rota de
tratamento apresenta resultados satisfatórios na eliminação da fração orgânica dos resíduos
oleosos, quando são oferecidas condições físico-químicas adequadas para a biodegradação
pela população microbiana do solo (da SILVA et al. 2012, HUANG, et al. 2004). Os
tratamentos biotecnológicos em geral envolvem, além da alta eficácia, custos reduzidos e
aplicabilidade em faixas amplas de concentração e de tipos de contaminantes (OLIVEIRA e
de FRANÇA, 2005).
Além dos nutrientes aceptores finais de elétrons, a cinética de biorremediação é
influenciada pela concentração do contaminante e presença de substâncias tóxicas, como
metais pesados e recalcitrantes, parafinas de alta massa molecular e hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (MARÍN, et al. 2005).
A tecnologia de landfarming é uma das tecnologias de biorremediação que consiste na
aplicação do resíduo na superfície do solo, para promover a degradação microbiana dos
derivados do petróleo. O espalhamento do material oleoso contaminante sobre o solo e a
incorporação na camada arável, também denominada camada reativa (USEPA, 2000), pode
afetar diretamente e de modo diferenciado os micro-organismos responsáveis pela
biodegradação (FRANCO, 2004).
A literatura apresenta vários trabalhos sobre a remediação de solos contaminados com
hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, com uso da tecnologia de landfarming e outras
técnicas biológicas (da SILVA et al. 2012; STELIGA et al. 2009). No entanto, quando se trata
de solos oriundos da região amazônica do Brasil e impactados com hidrocarbonetos, os
estudos de biodegradação são escassos (LIMA, 2002), embora essa região do país seja
estratégica, relevante, de notória visibilidade internacional e englobe várias atividades do
setor de petróleo e gás.
Os solos intemperizados, como aqueles encontrados nas regiões tropicais, apresentam
frações de argila e silte, que afetam negativamente a biorremediação por questões de
Nascimento, T.C.F. Introdução 23
diminuição de bioacesso, incrementando a problemática do tratamento (CAHAÎNEAU et al.
2003; GONG et al. 2008).
Estudos recentes demonstram que a adição de óleo vegetal à matriz de um solo da
Malásia, promoveu a dessorção dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) da fase
sólida do solo e a sorção na fase óleo, capacitando a assimilação dos mesmos pelos micro-
organismos, devido à facilidade de dessorção da interface óleo/água ou da interface óleo/solo
(Yap et al. 2010).
Considerando todo o exposto, tem-se a hipótese de que a adição de cossubstratos
renováveis e de baixo custo pode ser uma possível rota para melhoria do desempenho do
biotratamento de solos tropicais contaminados com hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos e
policíclicos aromáticos.
Nascimento, T.C.F. Objetivos 24
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS
2.2- Objetivo Geral
Verificar a eficácia do biotratamento de solo natural da Região Amazônica Brasileira
impactado com resíduos oleosos e intemperizados provenientes do refino de petróleo, em
condições de altas concentrações iniciais dos contaminantes, avaliando a influência da
suplementação de cossubstratos renováveis.
2.3-Objetivos Específicos
Caracterizar o solo impactado e avaliar o potencial da microbiota indígena em
biodegradar hidrocarbonetos, em especial os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos,
HPA; em diferentes concentrações de resíduos oleosos.
Estudar o efeito do uso de glicerol comercial e de óleo de soja, cossubstratos
renováveis, na biodegradação de hidrocarbonetos em solos contaminados com diferentes
concentrações de resíduos oleosos.
Verificar o efeito da suplementação com glicerol bruto (resíduo da produção de
biodiesel) na biodegradação de hidrocarbonetos em solos contendo alta concentração de
resíduos oleosos.
Isolar microrganismos nativos da Amazônia e degradadores de hidrocarbonetos de
petróleo.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 25
CAPÍTULO 3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1- Aspectos gerais sobre a complexidade da contaminação de solos por petróleo,
derivados e resíduos oleosos.
O petróleo é constituído por uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outros
compostos orgânicos, incluindo alguns constituintes organometálicos notadamente complexos
de vanádio e níquel (VAN HAME; SINGH e WARD, 2003). Como o petróleo contém
compostos químicos tóxicos, tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno, HPA e outros, a
contaminação por petróleo ou seus derivados pode ser danosa à saúde humana e ao ambiente
(VASUDEVAN e RAJARAM 2001, SARKAR et al. 2005).
A contaminação ambiental por óleo e derivados ocorre, principalmente, durante as
operações de estocagem e transporte das matérias primas, produtos acabados, bem como dos
resíduos oleosos gerados nos diversos processos (OLLIVIER e MAGOT, 2005).
No caso dos derramamentos de óleos e resíduos oleosos em solos, a contaminação se
caracteriza por movimentos verticais, e não pela propagação horizontal com a mancha de
petróleo, como acontece em águas (JUHASZ e NAIDU, 2000). Sendo assim, a infiltração do
óleo no solo dificulta as perdas por evaporação dos hidrocarbonetos voláteis, que podem ser
tóxicos para os micro-organismos, dificultando o processo de recuperação do local impactado.
Além disso, os compostos semi-voláteis e as substâncias não-voláteis presentes nos óleos
crus, derivados e também nos resíduos oleosos, permeiam pelas camadas dos solos,
preenchem alguns espaços vazios da coluna de solo e podem alcançar os corpos hídricos do
local, incrementando o estado crítico dos eventos de contaminação ambiental em solos.
Nesse processo de movimentação, fica claro que as partículas do solo podem
contribuir para a sorção dos constituintes contaminantes e, portanto, devido à redução da
mobilidade, pode se diminuir a toxicidade efetiva dos contaminantes aos seres vivos. Tal
redução de mobilidade de contaminantes nos solos se dá por meio de fenômenos como a
absorção e adsorção. No entanto, é provável que a adsorção de hidrocarbonetos à matéria
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 26
húmica promova a formação de resíduos persistentes, contribuindo para a complexidade do
seu tratamento (JUHASZ e NAIDU, 2000).
A literatura reporta que há uma baixa mobilidade de hidrocarbonetos nos solos
argilosos, devido à alta área superficial das partículas de argila e silte dos solos, que contribui
para o fenômeno da sorção dos contaminantes, e também devido à viscosidade dos fluidos.
Salienta-se, no entanto, a permanência da fração mais viscosa dos resíduos oleosos e de óleos
crus na superfície dos solos, favorecendo o contato dérmico com animais e,
consequentemente, o risco ecológico (GONG et al. 2005, ZHANG et al. 2006, HAMDI et al.
2007).
Os solos arenosos, por sua vez, apresentam menores áreas superficiais e, caso não haja
a presença de elevados teores de material orgânico, os contaminantes percolam as camadas
dos solos com maiores velocidades de deslocamento, incrementando a problemática de
contaminação de lençóis freáticos (GABARDO, 2007).
No Brasil, a maioria dos solos são intemperizados, ou seja, são solos que sofreram
elevados graus de ação do clima e com formação antiga e, portanto, apresentam elevados
teores de materiais finos como a argila e o silte (GABARDO,2007). Em muitos casos, os
solos possuem uma fração orgânica que pode ter características diversas. A matéria húmica
compõe um dos principais componentes da matriz orgânica do solo, representando cerca de
2/3 do carbono orgânico, e é constituída de ácidos orgânicos, como por exemplo, os ácidos
húmico e fúlvico. Como atuam sobre as condições químicas e físicas do solo, um melhor
entendimento das propriedades funcionais e estruturais da matéria húmica do solo pode
auxiliar na compreensão de mecanismos responsáveis pela complexação, redução,
mobilização ou imobilização de compostos químicos tóxicos no solo, que podem influenciar
de forma significativa na biodegradação dos hidrocarbonetos (FERREIRA et al. 2004).
Dentre os hidrocarbonetos do petróleo, é reconhecido que benzeno, tolueno,
etilbenzeno e xileno (BTEX), representam alguns dos compostos que possuem maior
mobilidade em solos. Isso se deve à maior solubilidade dessas moléculas em água e pela
menor massa molecular, maior polaridade e menor coeficiente de partição (MILENA et al.
2007). Os BTEX são tóxicos, mesmo em baixas concentrações, e podem proporcionar vários
danos à flora, à fauna e aos seres humanos (PATUREAU et al. 2008, BERNARDO et al.
2009), porém, estudos demonstram a biodegradação satisfatória destes compostos, por micro-
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 27
organismos, em solos com diferentes texturas (PRENAFETA-BOLDU et al. 2004, ORTIZ et
al. 2006, GENOVESE et al. 2008).
Outra classe importante de compostos orgânicos presentes nos óleos crus, derivados e
resíduos oleosos, são os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, HPA, (MENICONI et al.
2002, HANDI et al. 2006a, HARMSEN, 2007). Os HPA são moléculas que contém dois ou
mais anéis benzênicos condensados ou ciclopentanos arranjados de forma linear, angular ou
em grupo (MUCKIAN et al. 2007). Eles são formados durante a decomposição térmica de
moléculas orgânicas e sua subsequente recombinação, na combustão incompleta a altas
temperaturas (500-800ºC), ou por subinjeção de material orgânico em temperaturas em torno
de 100-300ºC por longos períodos (HARITASH e KAUSHIK, 2009). Os HPA são
introduzidos no ambiente através de fontes naturais ou antropogênicas. Como exemplos de
fontes naturais, temos florestas, erupções vulcânicas, derrames de óleo e exudatos de árvores.
A queima de combustíveis fósseis, carvão, madeira, lixo, resíduo, o uso de óleos lubrificantes
e filtros de óleo, são exemplos de fontes antropogênicas de HPA (KAUSHIK e HARITASH,
2006).
Embora semi-voláteis, os HPA tendem a ser sorvidos pela matriz dos solos, sobretudo
nos solos intemperizados, dificultando sua biodegradação. Os HPA também são compostos
tóxicos de difícil biodegradação, e incrementam a dificuldade da biorremediação de solos
impactados com esses contaminantes (ENNEL et al. 2005, GONG et al. 2007).
O conteúdo de matéria orgânica é a característica que mais influencia a sorção dos
HPA no solo. Diversos autores demonstraram efeitos nas relações lineares positivas entre o
conteúdo de carbono orgânico do solo e a capacidade de sorção de HPA (JACKES et al.
2007).
Ressalta-se, no entanto, que a biodisponibilidade é inversamente proporcional ao
número de anéis condensados compreendidos na molécula do contaminante, e é diretamente
proporcional à sua solubilidade em água (JUHASZ e NAIDU, 2000, CONTE et al. 2001).
Um estudo realizado em 1996 pela Agência de Proteção Americana (USEPA) relatou
que existem vinte e nove tipos diferentes de resíduos oleosos, gerados por 180 refinarias
espalhadas pelo território americano (URURAHY, 1998). Dentre os diferentes tipos de
resíduos oleosos gerados no setor de petróleo e gás, destacam-se as borras oleosas que são
formadas em praticamente todas as operações envolvidas nesse setor produtivo. Borras
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 28
oleosas são sistemas multifásicos, compostos basicamente de emulsões água-óleo, sólidos
(orgânicos e inorgânicos) e tensoativos (naturais e adicionais), e são formados segundo
mecanismos de floculação. São constituídas de óleo, água e sólidos em concentrações
variando de 5 a 100% de óleo; de 10 a 90% de água e de 10 a 90% de sólidos (URURAHY,
1998). De uma maneira geral, pode-se dizer que as borras são frequentemente detectadas em
fundos de tanques de armazenamento de óleo e em separadores de água-óleo (SAO),
justamente nas regiões interfaciais entre o petróleo e a fase aquosa. A viscosidade elevada
desses resíduos favorece a sorção de seus constituintes na matriz dos solos e acúmulo na
superfície dos sistemas terrestres e, juntamente com sua complexidade química, desfavorece o
biotratamento de solos impactados com esses resíduos.
Assim, a complexidade desses resíduos, somada à diversidade de solos, incrementa a
problemática dos processos de recuperação de ambientes contaminados e compreendem,
dessa forma, um tema contemporâneo das pesquisas em diversas partes do globo terrestre
(COELHO, 2002, OLIVEIRA e DE FRANÇA, 2005, MARCHETTINI; RIDOLF e RUSTICI,
2007).
3. 2 - Refino de óleo cru e a geração de resíduos
Define-se por refinaria de petróleo um conjunto de unidades de processos físicos,
químicos e térmicos, que objetivam a separação de componentes do óleo cru em frações com
misturas de hidrocarbonetos.
Tavares (2005) descreve que há basicamente três tipos de refinarias de petróleo:
topping, hydroskimming e de craqueamento térmico. As refinarias do tipo topping são plantas
industriais que apresentam apenas unidades de destilação atmosférica e de tratamento de
produtos. Já as refinarias do tipo hydroskimming apresentam uma unidade de reforma
catalítica e de hidrotratamento, além das unidades de destilação atmosférica e a vácuo. As
refinarias de craqueamento térmico são consideradas mais complexas, e sua principal
finalidade é a produção de frações diesel.
Independente do grau de complexidade, para que as operações de refino possam ser
realizadas, são necessárias Unidades de Processo (UP) e Unidades de Serviços (US). Dentre
as UP destacam-se os reatores, as colunas de destilação e as colunas de absorção. Dentre as
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 29
US destacam-se as unidades para geração de vapor, para adução de água, para tratamento de
efluentes e os escritórios.
A disposição dos equipamentos, o número de UP e US, a configuração dessas
unidades, o objetivo e a eficiência de cada instalação do refino do óleo cru, fazem com que
cada refinaria seja única. No entanto, em todos os casos, independente da localização
geográfica e de fatores inerentes ao local em estudo, no refino sempre se parte do óleo cru, e
se objetiva obter produtos de maior valor agregado. A Figura 2.1 apresenta um esquema
simplificado do processo de refino de petróleo e a geração de resíduos.
A Figura 3.1 demonstra que, de forma geral, existem correntes de entrada de matéria-
prima e insumos, e de saída de produtos, subprodutos e de resíduos. No Brasil, os resíduos
gerados pelas indústrias devem ser classificados em dois grandes grupos, perigosos e não
perigosos. Essa classificação é feita em conformidade com o disposto na norma 10004 da
ABNT (2004).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 30
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Destilação
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Unidades de Processo
Unidades de Serviço
FCC- Craqueamento Fluido Catalítico; HDT- Hidrotratamento; UCR - Coqueamento Retardado; UGH – Geração de H2;
URE – Recuperação de Enxofre; UTE – Tratamento de Emissões; UTAA – Tratamento de Águas Ácidas; ETDI –
Tratamento de Efluentes; ETA – Tratamento de Água e, CTR – Central de Resíduos
Figura 3.1: Esquema simplificado do processo de refino de petróleo e a geração de resíduos.
Fonte: Adaptado de Szklo e Uller, 2008
Para classificar um resíduo como perigoso ou não perigoso, a legislação considera os
aspectos fonte de geração, inflamabilidade, toxicidade, corrosividade e reatividade com o ar e
com água, bem como as concentrações de várias substâncias e elementos químicos
transferidos para uma solução após contato estático e dinâmico com os resíduos. Estes testes
são denominados, respectivamente, de testes de solubilização e de lixiviação de resíduos e são
semelhantes aos descritos no “Título 40 do Code of Federal Regulations dos EUA” (USEPA,
2001).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 31
Convém salientar que, de acordo com a norma da ABNT- NBR 10004 (2004), os
resíduos sólidos compreendem, ainda, quaisquer líquidos ou rejeitos semissólidos que
resultem das atividades de origem industrial ou de serviços associados, e cujas
particularidades tornam inviável o seu descarte na rede de esgotos ou corpos de água, ou
exijam, para isso, soluções técnicas e economicamente inviáveis, em face às operações
convencionais de tratamento de efluentes disponíveis. Dessa forma, considerando o exposto
na legislação, e a quantidade de UP e US, o refino de petróleo gera grande quantidade e
diversidade de resíduos. Daí surge a necessidade de classificar adequadamente os resíduos,
identificando-os e obtendo informações para a eficiente destinação destes materiais
(MARCHETTINI et al. 2007).
Dentre os vários resíduos sólidos gerados no refino destacam-se: soluções ácidas ou
alcalinas exauridas, produtos químicos fora de especificação, sucatas metálicas, trapos e
estopas contaminados, EPI contaminados, solos contendo hidrocarbonetos, borras oleosas,
catalisadores gastos e sólidos contaminados.
Os catalisadores gastos são resíduos abundantes nas refinarias, e, atualmente, o
consumo mundial de catalisadores nas indústrias químicas, especialmente a petroquímica, é
cerca de 243.000 toneladas. Dos processos de refino, o de obtenção de gasolina, o
hidrotratamento, a hidrogenação e a desidrogenação, estão entre os exemplos mais
representativos no uso de catalisadores (MARAFI e STANISLAUS, 2003, AFONSO et al.
2006). Os catalisadores gastos são materiais ricos em Si e Al, com presença de vários outros
elementos químicos, a depender da sua aplicação como: Co, Ni, Mo e Pt. A presença de V, As
e Hg, se dá pela remoção desses elementos das correntes de hidrocarbonetos. Considerando a
grande quantidade gerada e a toxicidade desses resíduos, eles podem ser considerados críticos
para a indústria do petróleo (MAFARI e STANISLAU, 2008a, MAFARI e STANISLAU,
2008b).
As borras oleosas são outro exemplo de resíduos críticos do refino de petróleo. Esses
resíduos são gerados em grandes quantidades nas operações de armazenagem de petróleo e
derivados, nos reatores e colunas do processo. Estima-se que a geração de borras oleosas no
refino é de, aproximadamente, 1% volume do óleo refinado (URURAHY et al. 1998). São
materiais muito complexos e apresentam em sua composição uma série de contaminantes,
com destaque para os HPA, asfaltenos, resinas, metais pesados, elementos químicos diversos
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 32
(URURAHY et al. 1998, AL-FUTAISI et al. 2007). A Tabela 3.1 apresenta dados da
composição típica de borras oleosas geradas no refino de petróleo.
Tabela 3.1: Características de borra oleosa
Análises F. Sólida F. aquosa F. Orgânica Borra oleosa
Concentração (%p/p) 7 24 69 100
Íons (mg/L)
Nitrato - 45 Nd 10,8
Fosfato - <0,03 Nd -
Amônio - 25,6 Nd 6,2
N total (%p/p) Nd 0,4 0,2 0,1
Água 0,00 100 0,05 24,0
SARA (%p/p)
Saturados --- Nd 28,0 9,3
Aromáticos --- Nd 44,0 30,4
Resinas --- Nd 21,0 14,5
Asfaltenos --- Nd 7,0 4,8
HPA total (%p/p) --- Nd 13,51 9,32
Densidade (g/cm3) 0,6635 1,0000 0,8746 0,9576
F. dest (ºC) --- --- --- 289 a 550
pH --- 6,2-6,3 Nd 5,0-6,0
Viscosidade (cP)
30ºC 3 rpm - Nd Nd 885,5
50ºC 12 rpm - Nd Nd 207,7
70ºC 30 rpm - Nd Nd 70,8
Fontes: Ururahy et al. (1998); Ferrari; Albornoz e Neirotti (1994).
Nd – Não detectado; F. - Fase.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 33
3.3- Sistemas de Tratamento de solos impactados com resíduos oleosos oriundos de
refinarias de petróleo
Considerando a grande quantidade de resíduos gerada e a toxicidade dos solos
impactados com resíduos oleosos oriundos das operações de refino de petróleo, a busca por
alternativas de minimização e para o correto tratamento desses materiais é uma das questões
contemporâneas do setor. Além disso, as alternativas de tratamento a serem implementadas
devem ter um custo acessível, o que incrementa a problemática do programa de
gerenciamento de resíduos da indústria do petróleo e gás (FERRARI et al. 1994, DANDO e
MARTIN, 2003, ELSHORBAGYA e ALKAMALI, 2005, MAFARI e STANISLAU, 2008b).
Os métodos mais empregados no tratamento de solos contaminados por petróleo e
derivados são os processos físicos, químicos, e biológicos. Dentre os processos químicos, os
processos térmicos são os mais aplicados. São exemplos de processos térmicos, a incineração
em fornos e o co-processamento em fornos de clinquerização. A oxidação química é uma rota
bastante estudada atualmente para o tratamento de solos contaminados com recalcitrantes
como, por exemplo, os HPA (RIVAS, 2006).
Dentre os processos físicos, destacam-se as operações para separação de fases, como a
centrifugação, a filtração sob pressão e a dessorção térmica. Dada a complexidade dos
resíduos oleosos, sistemas combinando alternativas físicas, químicas e/ou biológicas têm sido
estudados e também executados. Um exemplo é a incorporação em materiais cerâmicos e a
solidificação/estabilização como pré-tratamento, antes da disposição em aterros industriais
(OLIVEIRA, 2003, ROJAS; CONSOLI e HEINECK, 2007).
Os tratamentos biológicos, por sua vez, são reconhecidos como eficientes e de menor
custo. Os tratamentos biológicos envolvem a quebra de contaminantes, utilizando micro-
organismos (SARKAR, 2005).
Dentre os processos biológicos adotados para o tratamento de resíduos da indústria de
petróleo, destacam-se os landfarming, compostagem/biopilhas e reatores biológicos (BAIRD,
2002; SEABRA, 2006; ROJAS; CONSOLI e HEINECK, 2007).
A seguir, são delineados os principais processos de tratamento de solos impactados
com petróleo, derivados e resíduos oleosos.
3.3.1- Processos térmicos
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 34
A incineração compreende um dos processos térmicos mais amplamente utilizados.
Esse processo pode ser definido como uma combustão controlada de resíduos que são
combustíveis e de gases, em presença de oxigênio, resultando em cinzas (COELHO, 2002,
DA SILVA; ALVES e DE FRANÇA, 2012). Nos dias de hoje, considerando as exigências da
legislação ambiental, consciência ecológica dos consumidores, geradores e fornecedores e as
questões relacionadas com o aquecimento global, a incineração requer um controle rígido,
tendo que se tratar também as emissões e os materiais particulados que são liberados para a
atmosfera, apresentando, portanto, um custo energético muito elevado. Outro inconveniente
está no fato de poder ocorrer a geração de cinzas ricas em metais pesados, que devem ser
destinadas a aterros classe I (DEL’ARCO, 1999, ABNT, 2004, SILVA e LANGE, 2008).
Considerando a textura dos solos, o grau de contaminação e o tipo do contaminante, os
solos impactados necessitam ser preparados antes da entrada no processo térmico. Essa etapa
de preparação é denominada de blendagem e visa obter uma mistura de poder calorífico
homogêneo, evitando explosões no interior dos fornos. Essa etapa é essencial para o sucesso
de qualquer tratamento térmico de resíduos.
A Figura 3.2 apresenta um fluxograma do processo de incineração e considera o
exposto na Resolução n° 316/02 do CONAMA (BRASIL, 2002), que regulamenta o
funcionamento de unidades de tratamento térmico de resíduos. De acordo com essa
Resolução, na operação dos incineradores os resíduos a serem admitidos devem ser
preparados e analisados, o forno deve estar em temperatura superior a 800ºC e a câmara de
pós-combustão, em temperatura acima de 1200ºC. Essas temperaturas visam à completa
oxidação dos resíduos e gases emanados na combustão. Essa legislação preconiza, ainda, uma
série de limitações para o descarte de efluentes gasosos, entre outros importantes para o
controle ambiental.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 35
Figura 3.2: Fluxograma do processo de incineração de solos contaminados com resíduos
oleosos. Fonte: Adaptado de Abreu e Souza (2005)
O co-processamento em fornos de cimento é alternativa do processo térmico para o
tratamento de solos contaminados por hidrocarbonetos. Neste processo, enquanto os resíduos
estão sendo destruídos no interior do forno, está acontecendo a produção de clínquer, para a
fabricação do cimento; ou seja, o co-processamento ocorre nos fornos para a produção do
clínquer e, por isso, o processo é denominado co-processamento em fornos de clinquerização.
Nesse processo, os resíduos oleosos atuam como combustíveis alternativos, aproveitando-se o
poder calorífico desses materiais.
Os fornos das cimenteiras possuem, em média, 60 m de comprimento e 4 m de
diâmetro, e operam na temperatura de 1.400ºC na zona de clinquerização, com um tempo de
residência para os gases de até 10 segundos, assegurando a completa destruição dos resíduos.
A eficiência de destruição e remoção, em média, para os fornos de clínquer, é de 99,99%, o
que mostra uma eficiência bastante elevada (ABREU e SOUSA, 2005).
No Brasil, o processo de co-processamento de resíduos em fornos de clinquerização é
regulamentado pela Resolução n° 264/99 do CONAMA (BRASIL, 1999). De acordo com
essa Resolução, solos contaminados com hidrocarbonetos podem ser processados, assim
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 36
como outros resíduos oleosos, mas não podem ser admitidos em unidades de co-
processamentos, resíduos do serviço de saúde e materiais radioativos.
Outra opção de tratamento térmico é a chamada Dessorção Térmica, que tem mostrado
grande eficiência na redução de contaminantes da indústria de petróleo. Na Dessorção
Térmica, o solo contaminado é escavado, peneirado e aquecido para liberar os
hidrocarbonetos do petróleo de seus interstícios (USEPA, 1995b, HEYDENRYCH et al.
2002, VASCONCELOS et al. 2010). O método é baseado no fenômeno da volatilização dos
constituintes do contaminante, o que envolve o equilíbrio de fases, transporte e transferência
de massa, sendo a temperatura um dos principais fatores no processo, ficando claro que o tipo
dos contaminantes e do solo, a granulometria e o tempo de residência nos equipamentos,
também são fatores importantes ao sucesso da dessorção térmica (BUCALÁ et al. 1994,
GEORGE et al. 1995). As temperaturas de dessorção variam na faixa de 100 a 600ºC, para
que os compostos orgânicos sejam apenas volatilizados, pois o aquecimento não objetiva
destruir os compostos orgânicos, e sim transformá-los em compostos de mais fácil degradação
(PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).
3.3.2- Processos químicos
Muitos dos contaminantes orgânicos podem ser parcial ou completamente oxidados
através de processos químicos de tratamento. Dentre os métodos químicos mais comumente
empregados estão a neutralização, a precipitação, a oxidação, a aplicação de surfactantes, e a
extração por solventes (PINA et al. 2002, YERUSHALMI et al. 2003, SANTOS, 2007,
PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).
A extração química consiste em misturar o solo com um solvente num reator,
promovendo-se, assim, a dissolução dos contaminantes. A fase líquida é então transportada
para um separador, onde se dá a separação dos contaminantes e do solvente, que são,
posteriormente, tratados e reutilizados respectivamente. Essa tecnologia não destrói os
contaminantes, sendo seu objetivo reduzir a massa de resíduo a ser tratada.
Dentre os processos químicos, destacam-se os processos oxidativos avançados
(POAs). A oxidação com reativo de Fenton (mistura de peróxido de hidrogênio e sulfato
ferroso) e a oxidação por permanganato de potássio são as tecnologias de oxidação mais
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 37
comumente usadas. A reação de Fenton gera radicais hidroxilas, que reagem com HPA
sorvidos, gerando produtos oxidados. A oxidação com permanganato é altamente dependente
da reatividade química do composto alvo (BROWN; BARTON e THOMSON, 2003). O
contaminante é degradado através de uma série de reações químicas, tendo como produtos
finais dióxido de carbono, água e íons inorgânicos (MILLIOLI, 2009).
Os Processos Oxidativos Avançados (POAs), são uma excelente alternativa para a
remediação de solos, pois envolvem um oxidante forte capaz de destruir ou hidrolisar os
contaminantes, num curto período de tempo (MILLIOLI; FREIRE e CAMMAROTA, 2003).
Estudos em escala de laboratório demonstraram que a oxidação química de HPA pelo
permanganato, pode ocorrer com diferentes reatividades químicas para diferentes espécies de
HPA dependendo da estrutura molecular, embora haja certa dificuldade do permanganato em
atacar o anel benzênico (BROWN; BARTON e THOMSON, 2003).
Segundo GAN et al. (2009), o permanganato de potássio é largamente utilizado para
oxidação de águas e tem mostrado aplicabilidade também na redução de solos contaminados
com HPA. O ânion permanganato é um agente oxidante com potencial de oxidação E0= 1,7 V.
Ele é efetivo na remediação de muitos hidrocarbonetos de petróleo e tem sido largamente
aplicado em remediações in situ e ex situ nos últimos anos. Ambos, permanganato de potássio
e de sódio, podem ser usados em aplicações ambientais, com resultados similares
(FERRARESE; ANDREOTTOLA e OPREA, 2008).
De Souza e Silva et al. (2009) estudaram a oxidação de solos contaminados com
fenantreno e pireno utilizando permanganato de potássio, observando que o mesmo reduziu
significativamente a concentração de HPA, chegando-se a valores abaixo do limite
estabelecidos pela legislação holandesa. Em relação à seletividade entre fenantreno e pireno, o
permanganato de potássio exibiu maior dificuldade em degradar pireno, provavelmente
devido ao seu maior peso molecular.
Persulfato de sódio é o mais recente agente oxidante utilizado na forma de sal
(Na2S2O8) para remediação de solos. A baixa solubilidade do persulfato de potássio (K2S2O8)
limita a sua aplicação como agente de remediação (ITRC, 2005, EPA, 2006). Em água, ocorre
a dissociação do persulfato em ânions persulfato (S2O82-
), que é um potente agente oxidante
com potencial de oxidação E0=2,0 V, mas cineticamente lento em destruir compostos
orgânicos. Uma adição de íons metálicos como, por exemplo, o ferroso, como no caso do
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 38
reativo de Fenton modificado, poderia ativar o íon persulfato, pela liberação de um poderoso
agente oxidante o (SO42-
) (LIANG et al., 2007b).
Os radicais sulfato livres têm um potencial redox E0=2,6 V e têm capacidade de oxidar
um maior número de poluentes orgânicos (EPA, 2006, LIANG et al. 2004). Estudos de
laboratório realizados por Ferrarese et al. (2008) com sedimentos contaminados com HPA,
verificando a eficiência de remoção utilizando os três agentes oxidantes em várias
combinações, mostraram que a oxidação química é uma tecnologia de remediação eficaz
facilmente aplicável à remediação ex-situ em sedimentos, e que reagentes diferentes
apresentaram eficiências de remoção diferentes. Os melhores resultados de eficiência foram
obtidos com o reagente de Fenton modificado, peróxido de hidrogênio e permanganato de
potássio 100 mol do agente oxidante, por 30 g de amostra de sedimento. Esse estudo mostrou
que são necessárias condições de oxidação muito enérgicas para solos e sedimentos
contaminados com altos teores de matéria orgânica.
O reagente de Fenton destaca-se frente aos outros processos, pois é capaz de gerar o
radical HO- mesmo na ausência de luz, e isto é uma vantagem em relação aos outros
processos oxidativos que utilizam luz ultravioleta para catalisar a reação.
Alguns autores verificaram que uma relação 5:1 de H2O2: Fe2+
é condição ótima para o
processo de oxidação de matéria orgânica em solos (RIBEIRO, 2003, MILLIOLI et al. 2009).
Muitos contaminantes orgânicos podem ser parcial ou completamente oxidados
através de processos de oxidação avançados, os (POAs), para aumentar a possibilidade de
posterior biodegradação. A USEPA (2001) identifica a oxidação química in situ como uma
das tecnologias inovadoras de remediação de solos contaminados por resíduos da indústria do
petróleo. Muitas pesquisas têm sido conduzidas para avançar e melhorar a eficácia dos
processos de limpeza de sítios contaminados. Muitos trabalhos foram realizados enfocando o
reagente Fenton (GOZMEN et al. 2003, MALIK, 2004) e oxidação por permanganato (YAN
e SCHWARTZ, 2000, GATES et al. 2001, HUANG et al. 2001).
Uma das vantagens das tecnologias de oxidação química é a sua capacidade de
sobrepor as limitações impostas pela baixa solubilidade de HPA em solução aquosa, nas
baixas taxas de biodegradação e/ou dissolução; deste modo, os produtos de oxidação
poderiam ser mais polares do que os compostos de origem (BROWN; BARTON E
THOMSON, 2003, MILLIOLI; FREIRE e CAMMAROTA, 2003). Por outro lado, a
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 39
qualidade do solo tem sido investigada através da análise de metabólitos tóxicos (SIRGUEY;
DE SOUZA e SILVA, P. T. e SCHWARTZ, 2008).
Os tratamentos químicos também podem ser combinados a processos de tratamento
biológico, por possibilitarem uma oxidação prévia dos compostos xenobióticos, isto é, um
pré-tratamento, sendo este um tema pouco estudado (PALMROTH et al. 2006,
VALDERRAMA et al. 2009).
2.3.3– Processos biológicos
Processos biológicos de tratamento de resíduos são também conhecidos como
bioprocessos, e têm a vantagem de degradar contaminantes do solo, água e sedimentos através
de micro-organismos autóctones ou exógenos. Em geral, os custos dos bioprocessos são
menores do que os dos processos físicos e, por isso, são mais vantajosos em relação a muitos
outros processos de tratamento (NANO et al. 2003, SARKAR et al. 2005, PALA et al. 2006).
A biorremediação de solos impactados com resíduos oleosos, petróleo e derivados,
pode ser conduzida com uso de diversas estratégias, sendo a bioaumentação ou bioaumento, e
bioestimulação ou bioestímulo, as mais empregadas normalmente. A bioaumentação envolve
a adição de micro-organismos, geralmente isolados da própria área impactada e reinoculados
sob a forma de suspensão ou encapsulados, para que, com a população aumentada em
número, possam ser capaz de degradar os poluentes presentes (OLIVEIRA, 2001). Neste
caso, a utilização de consórcios microbianos permite a degradação por via co-metabólica, isto
é, o substrato de um grupo gera produtos que servirão como substratos para outros grupos de
microrganismos. Os consórcios microbianos podem ser exclusivamente bacterianos
(AYOTAMUNO et al. 2007, JACQUES et al. 2008), compostos apenas por fungos
(MEYSAMI e BAHERI, 2003) e também podem ser mistos, ou seja, consórcios constituídos
por fungos e bactérias (BOONCHAN et al. 2000).
O bioestimulo, por sua vez, pode ser definido como a adequação ou suplementação de
nutrientes ou aceptores finais de elétrons no meio, para a melhoria ou viabilização do
metabolismo dos contaminantes. Quando se enfoca o caso de resíduos do setor de petróleo e
gás, verificam-se, em geral, altas concentrações de carbono, em detrimento a baixas
concentrações de N e P, essenciais à vida. Assim, em muitos casos, faz-se necessário corrigir
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 40
os teores de nutrientes nos solos, para o adequado tratamento (OLIVEIRA e DE FRANÇA,
2005, VASCONCELOS et al. 2011, CHAGAS-SPINELLI et al. 2012). Neste sentido, muitos
trabalhos de pesquisas atuais tratam da influência do uso de fontes alternativas de macro e de
micro-nutrientes, objetivando, sobretudo, a otimização de custos dos bioprocessos
(MUTECA, 2012).
As tecnologias de biorremediação podem ser divididas em duas categorias, in situ e ex
situ. Os processos são classificados como in situ quando as operações são realizadas nos
locais contaminados, ou seja, sem que haja a remoção do material. Quando o tratamento
ocorre fora do local atingido, classifica-se o processo como ex situ (USEPA, 2009). As
técnicas in-situ apresentam baixo custo, e requerem o uso de poucos equipamentos e técnicos.
No entanto, apresentam a dificuldade de aplicação em solos argilosos, principalmente quando
estes têm elevado grau de compactação e elevado teor de umidade, o que dificulta a passagem
do ar, devido ao aumento da perda de carga (BOOPATHY, 2000).
Dentre os processos biológicos adotados para o tratamento de resíduos da indústria do
petróleo, destacam-se os landfarming, as biopilhas e os biorreatores (SEABRA et al. 2006).
3.3.3.1- Landfarming
O landfarming caracteriza-se como um sistema de tratamento de resíduos em que estes
são aplicados na camada superficial do solo onde se encontra a maioria dos micro-organismos
heterotróficos, também conhecida como camada reativa do solo. É nesta camada do solo que
ocorrem os processos de biodegradação (BOOPATHY, 2000).
No sistema de landfarming os compostos de petróleo são removidos por volatilização,
biodegradação e adsorção (MAILA e CLOET, 2004, STEMPVOOP e BIGGAR, 2008,
SILVA, 2009, Da SILVA; ALVES e De FRANÇA, 2012).
No Brasil, para a confecção de projeto e operação desta forma de tratamento, deve-se
observar o estabelecido na norma ABNT NBR 13.894. Esta técnica é apropriada para dispor
resíduos oleosos não passíveis de recuperação, como materiais absorventes impregnados
(palha, serragem e turfa), e as emulsões água em óleo (CETESB, 2009).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 41
A operação de um landfarming consiste em três etapas: i) aplicação e mistura do
resíduo no solo, através das operações com máquinas de preparo como tratores e arados; ii)
irrigação com água e adição de nutrientes; iii) revolvimentos periódicos para possibilitar a
aeração e a mistura das camadas superficiais do solo (SILVA, 2009).
Em sistemas de landfarming geralmente são tratados resíduos perigosos, e a área de
tratamento destes resíduos é normalmente utilizada apenas para esse fim (JAQUES et al.
2007). Esta rota tecnológica é amplamente adotada mundialmente, pois tem baixo custo e
promove a redução na concentração dos contaminantes pela ação dos micro-organismos na
camada superficial do solo. O processo de biorremediação por landfarming é considerado
eficaz quando conduzido através de operações adequadas de manejo e gerenciamento
(MAILA e CLOETE, 2004, PAULA et al. 2006, LORS et al. 2012).
A utilização do solo para o tratamento de resíduo teve início na Europa no final do
século XIX, com a técnica de irrigação de áreas cultivadas com águas residuárias sanitárias.
No início dos anos 50, o processo de tratamento no solo despertou interesse nas empresas de
refino de petróleo dos Estados Unidos, sendo as primeiras a desenvolver e praticar o
tratamento no solo para seus resíduos e, a este processo de tratamento específico, deram o
nome de landfarming (GENOUW et al. 1994). No período de 1960 até 1987, a Alemanha
utilizou uma área de 20.000 hectares para tratamento de resíduos em solo (LINE et al. 1996).
A Holanda, em 1989, iniciou o funcionamento do primeiro landfarming para tratar 500 m³ de
resíduo contaminado com HPA e óleo mineral. Nesse país, a legislação vigente prescreve as
medidas de prevenção contra a percolação de contaminantes para o subsolo, lençol freático e
águas superficiais (MARIJKE e VAN VLERKEN, 1998).
Jatar et al. (1993) avaliaram a aplicação de landfarming em condições de clima
tropical, na Venezuela. Trabalharam em uma área de um hectare e usaram técnicas de
umidificação, homogeneização, bioaumentação e fertilização. O teor de hidrocarbonetos totais
de petróleo (HTP) reduziu em 80%, após um período de nove meses de tratamento.
Segundo Al-Awadhi et al. (1996), durante a crise do Golfo, o Kuwait sofreu ataques
bélicos, resultando em perdas de seus poços de petróleo, o que levou à formação de 300 lagos
de óleo em uma área de 49 km², com penetração no subsolo até a profundidade de 2,5 m. Foi
estimado um derrame de 9x106 m³ de óleo, equivalente a 25x10
6 m³ de solo contaminado. A
recuperação via biorremediação da área contaminada com óleo iniciou-se em novembro de
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 42
1992, com a implantação de 16 unidades de landfarming. Após 15 meses de operação, a
redução da carga poluente atingiu 80%.
No Brasil, o landfarming foi introduzido pela PETROBRAS quando, no ano de 1982,
colocou em funcionamento uma unidade na Refinaria Henrique Lage, na cidade de São José
dos Campos, Estado de São Paulo. Desde então, a PETROBRAS iniciou a implantação de
landfarming em outras refinarias (CASTRO et al. 2005).
No ano de 1984, a Central de Tratamento de Efluentes Líquidos (CETREL), em
Camaçari (BA), implantou duas unidades de landfarming em uma área de 20 hectares, para o
pós-tratamento do resíduo originado dos tratamentos químico e biológico dos efluentes
gerados no complexo industrial de Camaçari (ALVES et al. 1996).
Castro et al. (2005) estudaram a otimização do landfarming da RPBC (Refinaria
Presidente Bernardes): e a correção do pH do solo e fertilização da camada reativa resultaram
em aumento da população microbiana, e consequente maximização da biodegradação de
hidrocarbonetos.
Paudyn et al. (2007) estabeleceram quatro sistemáticas de operação em um
landfarming canadense, sob condição de baixa temperatura: atenuação natural; aeração em
intervalos de quatros dias; aeração diária e adição de fertilizante. O resultado do efeito
sinérgico de adição de fertilizante acrescida de aeração foi a redução de 90% de HTP em 700
dias. Ressaltam ainda que compostos orgânicos recalcitrantes, como pristano e fitano, foram
degradados.
Silva (2009) obteve reduções de HTP de 89,6% e 88,6% de HPA em uma área de
lanfarming de 1000 m2 refinaria de petróleo após 240 dias de processo; adotando medidas
sistemáticas de controle e monitoramento como aeração regular, adição de água, correção de
pH e adição de nutrientes.
A tecnologia de landfarming tem sido conduzida com sucesso tanto em países de
clima tropical como em países de clima frio, regiões semiáridas e desertas (JATAR et al.1993,
LINE; GALAND e CROWELWY, 1996, BALBA; AL-DAHER e AL-AWADHI, 1998;
MAILA e CLOETE, 2004, MARIN et al. 2005, JAQUES et al. 2005, PAULA et al. 2006,
SOARES e SIQUEIRA, 2007, MACIEL et al. 2007, CASTRO et al. 2007, PAUDYN et al.
2007, CERQUEIRA et al. 2011). Pesquisas têm revelado a presença de organismos adaptados
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 43
a condições de clima frio (MOHN e STEWART, 2000); microrganismos extremófilos são
candidatos ideais para tratamento biológico de poluentes no ártico (RIKE et al. 2003, MOHN
e STUART, 2000). Uma vasta variedade de micro-organismos tem sido detectada na camada
ativa em solo Ártico, norte do Canadá e Alasca (DEMING, 2000, PAUDYN et al. 2008).
3.3.3.2- Biopilhas
Tratamento de solos contaminados com hidrocarbonetos em biopilhas é um sistema
(FES) de fermentação sólida de substrato de tecnologia ex-situ ou off-site, baseada na
capacidade dos micro-organismos degradarem compostos de hidrocarbonetos
(ALEXANDER, 1999, BARUCH et al. 2007).
As biopilhas também são conhecidas pela denominação biocélulas e biomontes, e vêm
sendo utilizadas para reduzir a concentração de constituintes do petróleo em solos por meio de
biodegradação (USEPA, 2004).
De forma sucinta, a tecnologia de biopilhas envolve o amontoamento de solos em
pilhas, com estimulação da biodegradação por meio da aeração, umidificação e/ou adição de
nutrientes. Funcionam com o mesmo princípio da compostagem, sendo que, no caso das
biopilhas, a aeração é feita por injeção de ar ou por sucção do ar atmosférico, enquanto no
landfarming, a aeração é feita por meio da aragem dos solos. Pode-se dizer que o sistema de
biopilha é uma variação da técnica de compostagem de materiais orgânicos. Porém, na
compostagem, o resíduo orgânico é metabolizado e transformado em húmus e em
subprodutos inertes, tais como dióxido de carbono, água e sais minerais, tanto em condições
aeróbias como anaeróbias sob condições termofílicas (50 a 65°C). No entanto, essas
condições termófilas não ocorrem com os solos contaminados (SEABRA, 2005).
O sistema de biopilha é uma tecnologia já desenvolvida em escala industrial,
basicamente para solos arenosos. O solo escavado contaminado é colocado em pilhas ou
células, cujo teor do contaminante presente é reduzido por biodegradação. Umidade,
nutrientes, oxigênio, temperatura e pH podem ser controlados para estimular a atividade
degradativa dos micro-organismos presentes no solo (DOD, 1994, OFFICE OF
UNDERGROUND STORAGE TANKS, 1995) apud SEABRA 2005.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 44
As biopilhas são normalmente dispostas em locais impermeabilizados com mantas
para reduzir os riscos de migração do lixiviado para regiões de subsuperfície não
contaminados. No processo estático, o oxigênio é fornecido por meio de uma rede de tubos
perfurados instalada acima da base e conectada a um soprador ou bomba a vácuo.
Usualmente, as biopilhas são cobertas com mantas impermeáveis para minimizar o
escape de poluentes, principalmente voláteis, além de proteger o solo do vento e das chuvas
(VON FAHNESTOCK et al.1998). A altura típica de uma biopilha varia de 2 a 3 metros,
largura entre 5 e 10 metros e comprimento máximo de 30 m. A inclinação deve ter um ângulo
inferior a 35°, dependendo da textura do solo.
De uma forma geral, a biopilha é usada em tratamentos de curta duração, de 3 a 6
meses, em condições otimizadas. O sistema de biopilha é de projeto e construção
relativamente simples. Na sua construção, o solo pode ser misturado com: (a) esterco maduro
ou composto, para aumentar a população microbiana e ser um suprimento adicional de
nutrientes; (b) corretivo de solo (ex. sulfato de cálcio hidratado - gesso); (c) material
estruturante (serragem ou palha, por exemplo), para garantir que o meio tenha uma textura
mais permeável; e (d) substância química para ajuste do pH do solo, que deve estar dentro da
faixa de 6 a 8 (SEABRA, 2005).
Devido à presença de compostos voláteis no contaminante, estes tendem a se evaporar
durante a extração ou injeção de ar, necessitando-se de um sistema de captura e tratamento
dos vapores. Isto pode ser obtido com a colocação de uma cobertura na biopilha e com a
instalação de um sistema de coleta dos vapores (USEPA, 1994). As biopilhas podem ser
estáticas ou dinâmicas. O sistema de biopilhas não permite a frequência de mistura necessária
para suprir as limitações referentes à heterogeneidade e à disponibilização de nutrientes e
contaminantes (RIZZO, 2008, RIZZO et al. 2009).
3.3.3.3- Biorreatores
Os biorreatores são outra alternativa interessante para o tratamento de solos
impactados. Define-se biorreator como um ambiente controlado que permite o crescimento
adequado de células para obtenção do produto (WARD, 1981). Nesse sentido, várias
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 45
configurações de biorreatores têm sido estudadas para o tratamento de solos contaminados
com resíduos oleosos.
Trabalhos envolvendo o uso de biorreatores para o tratamento de solo contaminado
estão reportados na literatura (URURAHY, 1998, NANO et al. 2003, TROQUET et al. 2003,
WARD et al. 2003, PURWANINGSIHA et al. 2004, COLLINA et al. 2005, ARRAR et al.
2007). De uma maneira geral os biorreatores podem ser operados por batelada simples,
batelada alimentada, batelada sequencial, processos contínuos e em série; sendo que os modos
operacionais têm grande influencia na eficiência do processo (PEREIRA Jr; GOMES e
SORIANO, 2009).
Os tipos de biorreatores mais comuns para o tratamento de solos contaminados são os
reatores em fase sólida, os reatores de lama ou “slurry reactors”. Neste último tipo de
biorreator, o solo contaminado é misturado a uma fase aquosa (que pode conter
microrganismos e/ou nutrientes e/ou surfactantes). Esse sistema gera, como resultado do
tratamento, uma lama com 10 a 40% de sólidos, dependendo do tipo de solo. Essa lama do
tratamento normalmente é desidratada, ou pode ser submetida à biorremediação em fase
sólida, em que se trabalha com teores reduzidos de umidade de 10 a 20%.
Os reatores em fase sólida trabalham com um teor de umidade muito inferior aos
reatores de lama, e a água é usada para viabilizar o metabolismo microbiano. Em
conseqüência do menor teor de umidade requerido, esses biorreatores de fase sólida operam
com maior quantidade de solo (RIZZO, 2008).
3.4- Biodegradação de hidrocarbonetos: micro-organismos envolvidos e metabolismo
Considerando as particularidades das estruturas químicas, os hidrocarbonetos e os
demais constituintes orgânicos do petróleo, combustíveis e resíduos oleosos diferem quanto à
sua susceptibilidade ao ataque microbiano (SALANITRO, 2001). Estima-se que a
biodegradabilidade de diferentes tipos de óleo cru encontra-se na faixa de 70 a 97%. A fração
de baixa biodegradabilidade do óleo corresponde aos asfaltenos e às resinas, que são
considerados compostos biologicamente inertes (PRICE et al. 1999).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 46
3.4.1. Microrganismos
As bactérias constituem os microrganismos mais estudados, dentre os quais as
Pseudomonas foram as primeiras a serem postas em evidência em função da sua capacidade
de degradar (HPA). Mais tarde, outros gêneros (Alcaligenes, Mycobacterium, Rhodococcus)
foram também aplicados na degradação destes compostos (BOUCHEZ et al.1996).
Sabe-se que as bactérias são as grandes responsáveis pela biodegradação da maioria
dos hidrocarbonetos, mas algumas espécies de fungos filamentosos e leveduras têm
habilidade de degradar esses compostos (BOOPATHY, 2000).
Atualmente, sabe-se também que os fungos são capazes de degradar moléculas de
HPA de alta massa molecular (quatro ou mais anéis), enquanto que a maioria das bactérias
limita-se à degradação de HPA de baixa massa molecular (DRITSA et al. 2007, LEONARDI
et al. 2007).
A grande contribuição dos fungos reside no fato de que, sob condições adversas,
como, por exemplo, valores extremos de pH, limitação de nutrientes e baixos teores de
umidade, os fungos filamentosos demonstram maior habilidade para degradação de
hidrocarbonetos. Os fungos filamentosos têm a capacidade de excretar enzimas que atacam
diretamente os HPAs, enquanto as bactérias possuem um sistema enzimático intracelular.
April et al. (2000) isolaram 64 linhagens de fungos filamentosos de solos canadenses e os
cultivaram em óleo cru como única fonte de carbono. Os resultados mostraram que 32
linhagens pertencentes à classe dos Ascomicetos apresentaram capacidade para degradar
hidrocarbonetos de petróleo. No Brasil, também foram desenvolvidos trabalhos de isolamento
de fungos degradadores de hidrocarbonetos provenientes de óleo cru e resíduos oleosos.
Araújo e Lemos (2002) e Reiche e Lemos (2006) isolaram várias linhagens de fungos
filamentosos, e, dentre estas, se destacaram os gêneros Aspergillus, Penicillium, Percilomyces
e Fusarium, pelo número de relatos. A Tabela 3.2 apresenta alguns gêneros de micro-
organismos hábeis na degradação de hidrocarbonetos.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 47
Tabela 3.2: Alguns gêneros microbianos hidrocarbonoclásticos
Bactérias Fungos
Actinomicetos Leveduras Bolores
Achromobacter
Acinetobacter
Aeromonas
Agrobacterium
Alcaligenes
Arthrobacter
Bacillus
Burkholderia
Chromobacterium
Corynebacterium
Flavobacterium
Micrococcus
Mycobacterium
Proteus
Pseudomonas
Rhodococcus
Serratia
Xanthomonas
Actinomyces
Endomyces
Nocardia
Debaryomyces
Rhodotorula
Sporobolomyces
Yarrowia
Picchia
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Beauveria
Botrytis
Ceriporiopsis
Chrysosporium
Cladosporium
Cochliobolus
Colorospora
Coniothyrium
Coriolopsis
Cryphonectria
Cylindrocarpon
Dendosporium
Dendryphiella
Geotrichum
Gongronella
Drechslera
Fusarium
Graphium
Humicola
Lulwortria
Mortierella
Mucor
Paecilomyces
Penicillium
Phialophora
Rhizopus
Sprotrichum
Spicaria
Tolypocladium
Trametes
Trichoderma
Varicosporina
Verticilium
Fonte: Oliveira, (2001); Trindade, (2002); Silva, (2005); Pereira, (2008); Rizzo, (2008).
Em se tratando de leveduras, verifica-se nos estudos de Sá (2002) sobre a utilização de
hidrocarbonetos de petróleo por leveduras, que o gênero Candida apresenta preferência em
degradar hidrocarbonetos de cadeias lineares. Del’Arco (1999) demonstrou que leveduras
pertencentes ao gênero Sporolomyces e Rhodotorula são capazes de degradar hidrocarbonetos
alifáticos, cíclicos e aromáticos. Oliveira e de França (2001) isolaram linhagens de Pichia
gullermondii e de Yarrowia lipolytica de solo impactado com óleo cru, como degradadoras de
hexano.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 48
Cianobactérias e Algas também demonstraram capacidade em degradar
hidrocarbonetos. De acordo com CERNIGLIA et al. (1992), nove cianobactérias foram
capazes de degradar naftaleno em meio líquido. Leahy e Colwell (1990) relataram que a alga
Protolheca zopfii degradou 40% dos hidrocarbonetos contidos no óleo cru, quando este foi
utilizado como substrato.
O fato das bactérias serem reconhecidamente os principais micro-organismos
degradadores de hidrocarbonetos envolvidos no processo de biorremediação de solos, vem da
observação de que com o aumento da profundidade do solo, o número de bactérias não é
drasticamente afetado, enquanto o número de fungos ou actinomicetos diminui. Este aumento
da população bacteriana é atribuído à habilidade das bactérias de utilizarem outros aceptores
de elétrons, além do oxigênio (BOOPATHY, 2000).
3.4.2- Metabolismo microbiano
Para que um micro-organismo utilize HPA como fonte de carbono e energia para o seu
crescimento, é necessário que possua várias enzimas que transformam as complexas
moléculas dos HPA em intermediários comuns das suas rotas metabólicas. Várias vias de
degradação de HPA já foram identificadas em diferentes micro-organismos, porém as mais
estudadas são as do metabolismo aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos
e não-lignolíticos. No metabolismo bacteriano, a oxigenação inicial dos HPA é realizada por
uma enzima intracelular dioxigenase, que tem a função de reconhecer o HPA e adicionar dois
átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido à ressonância do anel aromático.
Após sucessivas oxidações, o último anel aromático é transformado em um dos
intermediários centrais da via de degradação dos HPA, que pode ser o catecol, o protocatecol
ou o gentisato. Até essa etapa, atuam as enzimas denominadas de periféricas, que têm a
função de conhecer as moléculas dos HPA e convertê-las nesses intermediários centrais. A
partir de então, atuam as enzimas de fissão, que converterão os intermediários centrais em
compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de geração de carbono e energia da
bactéria.
Segundo Bamforth e Singleton (2005) as enzimas de fissão podem ser divididas em
dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central:
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 49
As enzimas intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-
muconato, que por passos sucessivos, será convertido em succcinato e acetil-
coenzima.
As enzimas extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, o
semialdeído 2-hidroximucônico, que, por passos sucessivos, será transformado
em ácido pirúvico e acetaldeído.
As bactérias oxidam hidrocarbonetos aromáticos a cis-dihidrodióis por meio das
referidas dioxigenases, as quais constituem um sistema enzimático multicomponente e que
catalisa as reações iniciais. A oxidação dos compostos aromáticos envolve a incorporação
enzimática do oxigênio no substrato, de tal forma que, por meio da produção de dioxigenases
pelas bactérias, incorporam-se dois átomos de oxigênio no núcleo aromático para dar início à
oxidação. Ou seja, as enzimas catalisam a adição de oxigênio molecular ao anel, quebrando
uma das ligações carbono-carbono. Normalmente a oxidação do anel inicial é considerada o
passo limitante na taxa de biodegradação de compostos aromáticos (CERNIGLIA, 1992). Os
cis-dihidrodióis formados inicialmente são rearranjados por meio da enzima cis-diidrodiol
desidrogenase, gerando um derivado diidroxilado (CERNIGLIA, 1984). A oxidação posterior
do cis-dihidrodiol conduz à formação de catecol, o substrato da dioxigenase que é responsável
pela ruptura inicial do anel aromático.
O catecol, por sua vez, pode ser oxidado por duas vias: a via orto, que envolve a
ruptura da ligação entre os átomos de carbono provenientes dos dois grupos hidroxila, para
gerar o ácido cis-mucônico; e a via meta, que envolve a ruptura de uma ligação entre átomos
de carbono, um deles proveniente de um dos grupos hidroxila e o outro proveniente de um
grupo adjacente, conduzindo à formação de um semi aldeído-2-hidroximucônico, Figura 3.3.
A ruptura do anel leva à produção dos ácidos succínico, fumárico, pirúvico e acético, bem
como à de aldeídos, os quais são todos empregados pelo microrganismo na síntese dos
constituintes celulares, gerando, concomitantemente, energia, dióxido de carbono e água, que
são produtos dessas reações (JUHASZ e NAIDU, 2000).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 50
Figura 3.3: Metabolismo bacteriano da ruptura orto ou meta do anel aromático.
Fonte: Juhas e Naidu (2000)
A degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos HPA, em solo, é efetuada
por bactérias que pertencem a alguns grupos taxonômicos como, por exemplo, os gêneros
Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas e Mycobacterium, (ALBER et al. 2000,
BASTIAENS et al. 2003, JOHNSEN et al. 2005).
Banforth e Singleton (2005) estudaram a degradação de naftaleno por bactérias
aeróbicas. A via de degradação de naftaleno proposta por esses autores está ilustrada na
Figura 3.4. Nesse caso, também há a formação de catecol e outros compostos que seguem a
via metabólica aeróbica. Uma vez que o primeiro anel aromático do HPA é degradado (a
ácido pirúvico e dióxido de carbono), o segundo começa a ser atacado da mesma maneira, ou
seja, a degradação é sequencial.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 51
Figura 3.4: Degradação de Naftaleno por bactérias aeróbicas
Fonte: Banforth e Singleton (2005)
Os fungos oxidam os HPA a óxido de areno pela enzima Citocromo P-450
monoxigenase. Os óxidos podem sofrer isomerização, para dar origem a fenóis, ou submeter-
se a desidratação enzimática, para formar transdihidrodióis (JUHASZ; NAIDU, 2000). Tanto
o Citocromo P-450 como as epóxido hidrolases já foram detectados em extratos fúngicos,
mais especificamente de Cunninghamella elegans. As ligninas peroxidases ionizam os
compostos aromáticos a radicais arila, que oxidam posteriormente para formar quinonas.
Também é possível supor que a hidroxilação inicial pode conduzir à formação de compostos
como glicuronídios, sulfatos e glicosídios. O isolamento desses metabólitos e a detecção da
atividade da aril-sulfo transferase, glutation S-transferase, UDP-glicuronosil transferase, e
UDP-glicosiltransferase são um indicativo de vias metabólicas de degradação dos HPA
(CERNIGLIA, 1997).
Várias enzimas estão envolvidas na metabolização de HPA: citocromo P-450, as
enzimas extracelulares lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase, Figura 2.5. Os
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 52
fungos não mineralizam ou metabolizam os HPA tão rápido como as bactérias e a produção
de intermediários poliidroxilados pode ser o passo limitante na degradação de HPA por
fungos.
Figura 3.5: Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos
(Fonte: adaptado de Wilson e Jones, 1993)
Além da mineralização dos HPA, os fungos produzem compostos altamente solúveis
em água, aumentando a sua reatividade química, o que pode facilitar o ataque por parte de
bactérias autóctones. Isso revela a importância de ambientes biodiversos na biodegradação de
compostos persistentes do petróleo.
3.5- Fatores que influenciam a biodegração de hidrocarbonetos
Muitos fatores influenciam os bioprocessos. No entanto, a eficiência dos processos de
biorremediação é determinada pela presença de micro-organismos apropriados, a
disponibilidade de nutrientes e oxigênio, a temperatura, o tipo e a concentração de
cossubstrato, pH, umidade (SCHERR et al. 2007, MEGHARAJ et al. 2011). A correta
otimização desses fatores é fundamental para o sucesso da implementação de sistemas de
biorremediação (COLLINA et al. 2005 e JONES et al. 2004).
3.5.1. pH e Nutrientes
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 53
O pH do solo afeta diretamente a atividade dos micro-organismos através dos efeitos
dos íons H+ na permeabilidade celular e na atividade, assim como, indiretamente, pela
influência na disponibilidade de macro e micronutrientes, e na solubilidade do alumínio e
demais metais pesados, que podem ser tóxicos aos micro-organismos (JAQUES et al. 2007).
Para a maioria dos micro-organismos envolvidos no processo de biorremediação, a
faixa de pH mais favorável para o seu crescimento se situa entre 6,0 a 8,0, com um valor
ótimo em torno de 7,0, sendo que os fungos são mais tolerantes a condições ácidas
(URURAHY,1998, YEMASH et al. 2007, PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).
Segundo Alexander (1999), a biodegradação tende a ser mais efetiva nas faixas de pH em
torno da neutralidade.
A atividade microbiana é fortemente dependente do pH do meio, influenciando a
solubilidade dos contaminantes e a sorção destes no solo (RIZZO, 2008).
Os micro-organismos necessitam de nitrogênio e fósforo para o seu metabolismo de
síntese e para o seu crescimento, como, por exemplo, a síntese de fosfolipídeos e ácidos
nucléicos, mas sabe-se também que a administração de quantidades elevadas de nutrientes ao
local de contaminação pode causar inibição ao processo de biodegradação do contaminante
(DEL’ ARCO, 1999).
Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o crescimento microbiano
é o carbono, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes em quantidades que
normalmente excedem as demandas das comunidades microbianas (ALEXANDER, 1999). A
presença de elevadas concentrações de HPA no solo com potencial para serem utilizados
como substrato para o crescimento dos micro-organismos, pode fazer com que outros
nutrientes, que não o C, tornem-se limitantes (DEL’ ARCO, 1999).
A adição de nutrientes deve ser feita de modo que se obtenha uma relação carbono,
nitrogênio e fósforo adequada ao processo de biodegradação (HAMDI, et al. 2007). A relação
C:N:P de 100:10:1 no solo a ser biorremediado, tem sido normalmente recomendada
(JACKES et al. 2007).
Pesquisas que avaliaram os efeitos de N e P ao solo, demonstraram resultados muito
conflitantes, o que provavelmente se deve às especificidades de cada ambiente, no que se
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 54
refere a teores de nutrientes no solo, tipo de contaminante e população microbiana envolvida
(LEYS et al. 2005).
Outros nutrientes que poderiam influenciar na degradação de HPA no solo são o ferro
e o enxofre, porque desempenham funções celulares que estão intimamente relacionadas ao
metabolismo dos HPA, como a participação na estrutura das enzimas que realizam a
degradação destes compostos nas células microbianas.
Segundo Del’Arco, 1999, as fontes de nitrogênio e fósforo mais empregadas são os
sais de fosfato e o nitrato de amônio.
A adição de nutrientes deve ser feita somente após criteriosa avaliação, de forma a
evitarem-se adições desnecessárias, que resultariam em aumentos dos custos e em prejuízos
ao processo de biorremediação (JAQUES et al. 2005a).
3.5.2 Temperatura
A temperatura afeta a atividade metabólica, o consumo de substrato pelos micro-
organismos e, por consequência, a biodegradação dos HPA. Apesar de a biodegradação
ocorrer numa ampla faixa de temperatura, as maiores taxas de remoção ocorrem entre 25 e
35ºC, (OLLIVIER e MAGOT, 2005). Temperaturas acima ou abaixo desses valores, afetam
negativamente o processo de biorremediação (HAIDER, 1999).
3.5.3 Umidade e aeração
A umidade do solo é considerada por vários autores como o fator ambiental mais
crítico na biodegradação, pois uma alta atividade microbiana somente ocorrerá se houver
adequada disponibilidade de água aos micro-organismos (HAIDER, 1999).
Sabe-se que o teor de água no solo tem relação inversa com a disponibilidade de
oxigênio e, consequentemente, com as atividades dos micro-organismos aeróbios, que são os
principais responsáveis pela degradação dos HPA (PROVIDENT et al. 1993).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 55
Um teor de umidade na faixa de 50 a 80% da capacidade de campo, é sugerido como
ideal para a obtenção de taxas ótimas de biodegradação (DEUEL e HOLLIDAY, 1997 apud
RIZZO, 2008). Outros autores restringem um pouco mais essa faixa, considerando valores
ótimos na faixa de 70 a 80% da capacidade de retenção de água (DEL’ARCO, 1999,
OLIVEIRA, 2001). Segundo Malina et al. (2002), uma faixa aceitável para os processos de
biodegradação estaria em torno de 30 a 80% da capacidade de campo.
A aeração proporciona o suprimento de oxigênio ao ambiente, favorecendo o
crescimento de micro-organismos aeróbios que utilizam este elemento como aceptor final de
elétrons, viabilizando a biodegradação do poluente (TRINDADE et al. 2005).
Muitos micro-organismos incluindo bactérias, fungos e leveduras predominantemente
aeróbios, são os maiores responsáveis pela degradação de hidrocarbonetos em solo
(MORELLI et al. 2005, THANGARAJ et al. 2007). Como esses microrganismos são
encontrados na camada superficial, também chamada de camada reativa do solo, a presença
do oxigênio é fundamental e também um fator limitante nos processos de biorremediação. O
oxigênio age como aceptor final de elétrons na mineralização de compostos recalcitrantes,
como hidrocarbonetos de petróleo, onde a matéria orgânica é oxidada até CO2 e H2O
(MODIGAN et al. 2000, STREVETT et al. 2002). O oxigênio é utilizado pelos micro-
organismos também como substrato, pois as reações biodegradativas são catalisadas pelas
enzimas oxigenases (RIZZO, 2008).
Sob condições aeróbicas, a biorremediação ocorre mais facilmente (PEREIRA Jr.;
GOMES; SORIANO, 2009). Em solo, condições de aerobiose são obtidas pelo revolvimento
periódico do mesmo, o que possibilita a rápida disponibilidade de oxigênio para o processo de
biodegradação.
3.5.4. Tipo dos contaminantes e intemperismo
A estrutura química dos contaminantes no caso específico dos hidrocarbonetos de
petróleo; influenciam diretamente na eficiência do processo de biorremediação em solos
(TRINDADE et al. 2005).
O benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX), são os hidrocarbonetos aromáticos
mais abundantes nas frações leves do petróleo, como a gasolina e o óleo diesel. Esses
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 56
compostos são solúveis em água e podem ser transportados a pontos distantes do local onde
houver um derramamento. Além disso, por causa do pequeno tamanho molecular e baixo
ponto de ebulição, esses compostos aromáticos podem ser volatilizados à temperatura
ambiente, se constituindo também numa fonte de contaminação do ar (ESPIRITO SANTO,
2002).
Dentre os hidrocarbonetos do petróleo, os HPA aromáticos são os de mais difícil
degradação e isso se deve à presença de mais de um anel benzênico em suas estruturas e, por
isso, exibem a particularidade de maior persistência no ambiente, atrelada às características
físicas e químicas dos mesmos (ALEXANDER, 1999, LIEBEG, e CUTRIGH, 1999).
Com relação à biodegradabilidade dos HPA pela população microbiana, foi
evidenciado o seu decréscimo com o aumento do peso molecular e o coeficiente de partição
octanol/água (Kow) (Tabela 3.3) (JACQUES et al. 2007).
A partir dos dados mostrados na Tabela 3.3, pode-se observar algumas características
gerais dos HPA: são sólidos à temperatura ambiente, têm altos pontos de ebulição e fusão,
baixa solubilidade em água, são solúveis em solventes orgânicos e altamente lipofílicos; suas
afinidades por fases orgânicas lipofílicas expressas pelo coeficiente de partição octanol-água,
são elevadas (entre 3,4 a 7,1). De fato, devido ao seu caráter lipofílico, os HPA e seus
derivados podem ser absorvidos pela pele, além de serem absorvidos por ingestão ou por
inalação, sendo rapidamente distribuídos pelo organismo (NETTO et al. 2000). Observa-se
que a solubilidade em água diminui com o aumento do tamanho da molécula e, com exceção
do naftaleno, que é relativamente solúvel (32mg/L). Os coeficientes de partição entre carbono
orgânico e água são também elevados e, como resultado, em sistemas aquosos os HPA
tendem a concentrar-se em sedimentos ou ficam associados à matéria orgânica em suspensão
(COSTA, 2001).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 57
Tabela 3.3 - Constantes físico-químicas dos 16 HPA listados pela USEPA
HPA
Massa
molecular
(g)
Ponto de fusão (°C) Ponto de
ebulição (°C)
Naftaleno 128,17 81 217,9
Acenaftileno 152,20 92-93 -
Acenafteno 154,21 95 279
Fluoreno 166,22 115-116 295
Antraceno 178,23 216,4 342
Fenantreno 178,23 100,5 340
Fluoranteno 202,26 108,8 375
Pireno 202,26 150,4 393
Benzo(a)antraceno 228,29 160,7 400
Criseno 228,29 253,8 448
Benzo(b)fluoranteno 252,32 168,3 481
Benzo(k)fluoranteno 252,32 215,7 480
Benzo(a)pireno 252,32 178,1 496
Benzo(g,h,i)perileno 276,34 278,3 545
Indeno(1,2,3-c,d) pireno 276,34 163,6 536
Dibenzo(a,h) antraceno 278,35 266,6 524
HPA Pressão de
Vapor a 25° C
Coeficiente de partição
octanol/água
Solubilidade em
água a 25° C
(µg/L)
Naftaleno 10,4 3,4 3,17 . 104
Acenaftileno 8,9 . 10-1 4,07 -
Acenafteno 2,9 . 10-1 3,92 3,93 . 103
Fluoreno 8,0 . 10-2 4,18 1,98 . 103
Antraceno 8,0 . 10-4 4,5 73
Fenantreno 1,6 . 10-2 4,6 1,29 . 103
Fluoranteno 1,2 . 10-3 5,22 260
Pireno 6,0 . 10-4 5,18 135
Benzo(a)antraceno 2,8 . 10-5 5,61 14
Criseno 8,4 . 10-5 5,91 2,0
Benzo(b)fluoranteno 6,7 . 10-5 6,12 1,2 (20º C)
Benzo(k)fluoranteno 1,3 . 10-7 6,84 0,76
Benzo(a)pireno 7,3 . 10-7 6,50 3,8
Benzo(g,h,i)perileno 1,4 . 10-8 7,10 0,26
Indeno(1,2,3-c,d) pireno 1,3 . 10-8 6,58 62
Dibenzo(a,h) antraceno 1,3 .10-8 6,50 0,5 (27º C)
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 58
A pressão de vapor também diminui com o aumento do peso molecular. Como reflexo
destes fatos, no ar, HPA de dois ou três anéis tendem a concentrar-se na fase gasosa do ar,
HPA com quatro anéis distribuem-se entre as fases do ar e HPA com cinco anéis ou mais se
concentram principalmente no material particulado atmosférico (COSTA, 2001).
Trindade et al. (2005) define intemperismo como o resultado de processos biológicos,
químicos e físicos que podem afetar o tipo de hidrocarbonetos que permanecem no solo. Estes
processos incrementam a absorção de contaminantes orgânicos hidrofóbicos na matriz do
solo, diminuindo a taxa e a extensão da biodegradação. Esses autores compararam a
biodegradação de hidrocarbonetos em solo recém contaminado com óleo e um solo
contaminado há quatro anos, usando bioaumento e técnicas de bioestimulação. Ambos os
solos apresentavam 5,4% de hidrocarbonetos totais de petróleo, e uma maior eficiência de
biodegradação foi alcançado para o solo contendo óleo intemperizado, devido à adaptação da
microbiota nativa ao contaminante.
A biodegradação de hidrocarbonetos em solos com contaminação antiga também foi
estudada por Chaillan et al. (2006). Os autores verificaram que o intemperismo do óleo cru
dificultou sua biodegradação, pois os compostos mais recalcitrantes ficam remanescentes e
sorvidos à matriz do solo.
3.5.5 Quantidade do contaminante
A concentração dos HPA no solo tem grande influência na sua degradação por estar
ligada à taxa de transferência de massa para os micro-organismos. Del’ Arco e de França
(2001) verificaram a influência da concentração de hidrocarbonetos no processo de
biodegradação, em sedimento arenoso, utilizando cultura mista de microrganismos associados
a microrganismos autóctones. O contaminante usado foi o óleo Árabe leve e as concentrações
foram 14 g/kg, 21g/kg e 28 g/kg. Após 28 dias de processo, observaram degradação da fração
pesada do óleo de 33,7%, 32,8% e 28,9%, respectivamente. Para o caso de hidrocarbonetos
lineares entre C14 a C26, a biodegradação foi de, respectivamente, 100%, 61,3% e 24,9%.
Assim, concluíram o efeito negativo da concentração dos contaminantes sobre a taxa de
biodegradação, sendo esse parâmetro muito importante para a condução de processos in-situ
ou ex-situ, visto que o tempo implica, necessariamente, em aumento de custos. Cabe destacar
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 59
que, de forma geral, o perfil de concentração de bactérias e de fungos não variou em função
da concentração inicial do contaminante.
Em um estudo publicado por Li Hui et al. (2007), os autores verificaram que a
concentração de contaminantes influencia reduzindo a diversidade da comunidade microbiana
em ambientes impactados com petróleo. Os autores observaram que altas concentrações de
compostos recalcitrantes promovem uma pressão seletiva na comunidade, corroborando as
observações de Del’Arco e De França (2001). Sendo assim, os processos de recuperação de
ambientes degradados por petróleo, derivados e resíduos oleosos, requerem estudos
específicos.
3.5.6. Tipo de solo
A maioria dos solos é composta principalmente por partículas pequenas, provenientes
das rochas expostas ao intemperismo, que são os silicatos minerais. Com o tempo, o
intemperismo dos silicatos minerais leva a reações químicas, e essas reações formam
substâncias importantes na composição do solo, que são os minerais e a argila. A matéria
orgânica, por sua vez, é o agente inicial da maioria das reações do intemperismo, e é esse
material que acarreta, na maioria dos casos, a cor escura aos solos. A matéria orgânica do solo
é constituída principalmente por um material chamado húmus, que deriva principalmente das
plantas (BAIRD, 2002).
Os sedimentos são camadas de partículas minerais e orgânicas. Em países de clima
tropical, com frequência são finamente granuladas e podem, também, estar em contato com a
parte inferior dos corpos hídricos, como lagos, rios e oceanos. Os sedimentos são de grande
importância ambiental, porque são o local onde se depositam muitos poluentes, especialmente
HPA, objetos do presente estudo. A transferência de poluentes orgânicos hidrofóbicos para os
organismos pode ocorrer por meio de transferência intermediária para água intersticial, que é
a água presente nos poros microscópicos existentes dentro do material que forma o sedimento
(JAQUES et al. 2007).
A natureza físico-química do solo e o tamanho das partículas têm grande influência na
percolação, sorção e consequentemente, na degradação dos poluentes. Frações de argila e silte
são mais suscetíveis à formação de complexos com HPA, que as frações de areia. Esse
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 60
fenômeno se deve à granulometria e também à presença de filossilicatos, que são capazes de
formar complexos com substâncias cíclicas de baixa massa molecular (PEREIRA Jr.;
GOMES e SORIANO, 2009).
O teor de matéria orgânica e o grau de saturação são fatores importantes para o
processo de migração e de biodegradação de petróleo e seus derivados no solo, pois parte dos
contaminantes se particiona, ou seja, os produtos orgânicos estão em uma situação de
equilíbrio entre a sorção pelas partículas sólidas do solo e a dissolução pela água intersticial
(BAIRD, 2002, PEREIRA Jr; GOMES e SORIANO, 2009).
A Figura 3.6 apresenta esquematicamente os principais horizontes do perfil de um
solo.
Figura 3.6 – Perfil de um solo mostrando os principais horizontes.
Fonte: http://images.google.com.br/images
De forma bastante sucinta e simplificada, considera-se que o solo é constituído por
horizontes (camadas de partes do solo). No horizonte O predominam restos orgânicos. O
horizonte A é o horizonte de acúmulo de matéria orgânica. O horizonte E é o horizonte onde
as argilas e outras partículas finas foram lixiviadas pelas águas das chuvas. Já o horizonte B é
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 61
o horizonte de acúmulo de materiais provenientes dos horizontes superiores, e são, em geral,
ricos em argilas. O horizonte C é o constituído por material não consolidado e R é o horizonte
da rocha consolidada (IBGE, 2007). Os horizontes,variam dependendo da classificação dos
solos, (EMBRAPA, 2011).
3.5.7. Presença de biossurfactantes
Biossurfactantes são moléculas anfipáticas produzidas por micro-organismos. Eles têm
uma vasta diversidade estrutural, e podem ser: glicolipídeos, e lipoproteínas, lipoproteínas
para ácidos graxos lipídeos neutros fosfolipídeos, biossurfactantes particulados e poliméricos.
Os biossurfactantes apresentam uma melhor compatibilidade ambiental pelo fato de terem
uma grande propriedade emulsificante, alta seletividade e biodegradabilidade em comparação
aos surfactantes químicos (DAS e MUKHERJEE, 2006).
Diversas pesquisas utilizam biossurfactantes para favorecer a biodisponibilidade de
compostos hidrofóbicos. Esses estudos investigam o uso de biossurfactantes e de surfactantes
sintéticos para melhorar a remoção dos hidrocarbonetos de difícil degradação, como os HPA
(ALEXANDER, 1999, BARDI et al. 2000, NITSCHKE e PASTORE, 2002, RAHMAN et al.
2003, MILLIOLI et al.2005; LEONARDI et al. 2007). Estudos recentes mostraram a
metabolização de certos HPA pelos micro-organismos ligada a uma posterior produção de
biossurfactantes (DAS; MUKHERJEE e SEM, 2008).
Existe na natureza uma variedade de micro-organismos capazes de produzir
biossurfactantes, tais como espécies do gênero Bacillus, (DAS; MUKHERJEE e SEM, 2008,
NIKIFOROVA; POSDUYAKOVA e TURKOVSKAYA, 2009, CALVO et al. 2009, BANAT
et al., 2010, CERQUEIRA et al. 2012).
Os biossurfactantes facilitam o processo de emulsificação de hidrocarbonetos na fase
aquosa pela formação de micelas, deste modo acentuando a disponibilidade para os
microrganismos e favorecendo o processo de biodegradação (MAHANTY; PAKSHIRAJAN
e DASU, 2006, CALVO et al. 2009).
Considerando a importância do estabelecimento de condições ótimas para a
degradação de HPA, Nikiforova; Posduyakova e Turkovskaya (2009) estudaram a
possibilidade da produção de agentes emulsificantes durante a degradação de HPA de três e
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 62
quatro anéis pelo fungo Pleurotus ostreatus D1, e observaram uma dependência da atividade
emulsificante com a solubilidade do HPA.
Todos os estudos mostram que os surfactantes estão intimamente relacionados à
biodisponibilidade dos contaminantes em solos e isso tem uma importância particular, porque
contribui para o desenvolvimento de tecnologias de biorremediação de sítios contaminados
por substâncias xenobióticas.
Morita et al. (2007) estudaram a conversão microbiana do glicerol em biossurfactantes
glicolipídicos por leveduras do gênero Pseudozyma. O biossurfactante estudado foi o
Manosiletrol lipídio (MEL), que pode ser um agente facilitador da biodegradação de
hidrocarbonetos.
3.6- Uso de Cossubstratos na biorremediação de solos impactados
A adição de cossubstratos na biorremediação de solos impactados com óleo, seus
derivados e resíduos oleosos, é uma estratégia que vem sendo estudada ao longo das últimas
décadas (ARP; YEAGER e HYMAN, 2001, MORONO; UNO e HORI, 2006). Por definição,
cossubstratos são moléculas que são metabolizadas pelos microrganismos na presença de
outro substrato. Em outras palavras, os cossubstratos são fontes de carbono não essenciais ao
microrganismo, mas são utilizadas como fonte de carbono, enquanto o substrato preferencial é
consumido.
Considerando suas estruturas químicas, as moléculas de HPA não figuram como
fontes preferenciais de carbono. Associado a isso, destaca-se o fato de que esta classe de
compostos apresenta baixa solubilidade em água, favorecendo a sorção nas partículas dos
solos, com conseqüente formação de agregados (GONG et al. 2007, JACKES et al. 2008).
Assim, dada à característica e complexidade dos HPA, o processo de biodegradação ocorre
através de co-metabolismo, isto é HPA de baixa massa molecular servem de cossubstratos
para HPA de alta massa molecular (JOHNSEN; WICK e HARMS, 2005, GONG et al. 2006,
ZHANG et al. 2006), ou quando se utiliza moléculas menos complexas como, por exemplo, o
glicerol, óleos vegetais e o biodiesel (B100) (MUDGE e PEREIRA, 1999, PANNU; SINNGH
e WARD, 2004, GONG, et al. 2006).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 63
Os cossubstratos, de forma geral, favorecem processo de biodegradação pela sua
morfologia estrutural. Outro fenômeno a ser considerado é que a adição de cossubstratos
atuaria, também, na síntese de agentes emulsificantes e biossurfactantes, o que possibilita uma
maior biodisponibilidade dos HPA à célula (YUSTE et al. 2000, DAS e MUKHERJEE,
2007). A biodisponibilidade, por sua vez, é determinada pela taxa de transferência de massa
do substrato na célula microbiana relativa ao seu catabolismo intrínseco e excreção
(JOHNSEN; WICK E HARMS, 2005).
Segundo Taylor e Jones (2001), os cossubstratos podem também aumentar a superfície
de contato entre o microrganismo e composto recalcitrante, atuando sobre a viscosidade de
compostos pouco solúveis em água. Outra vantagem do uso de cossubstratos, é que a maioria
desses compostos é renovável e, portanto, ambientalmente aceitos.
A conversão de recursos renováveis em compostos utilizáveis, principalmente bio-
materiais, tem sido vista com muita atenção do ponto de vista ambiental. Esses recursos
disponíveis são óleos, amido, açúcar, celulose e lignocelulose de plantas, além de uma
variedade de rejeitos orgânicos da agricultura e indústria (MORITA et al. 2007).
Entre esses recursos renováveis destaca-se o glicerol, que tem sido obtido, em grande
quantidade, na produção de biodiesel (HUANG; CHENG e GEORGE, 2002).
ZHANG et al. (2005) estudaram a biodegradação de óleo cru Chinês, em meio líquido
por linhagem de Pseudomonas aeruginosa. Glicerol foi usado como cossubstrato ao processo
de biodegradação do óleo. Os testes foram executados em escala de bancada e demonstraram
que a presença do cossubstrato promoveu aumento da biodegradação do óleo de,
aproximadamente, 20 para 80%. Esse incremento expressivo da biodegradação foi explicado
pelos autores pela produção de raminolipídios, facilitando a transferência de massa e,
consequentemente, biodegradação. De fato, os gráficos apresentados no referido estudo
apresentam incremento da produção de tensoativos nos testes realizados na presença do
glicerol, e a literatura demonstra que linhagens de Pseudomonas aeruginosa produzem
biossurfactantes a partir de glicerol (SANT’ANNA et al. 2002, RAJINI et al. 2009).
Evidências experimentais mostram que surfactantes e glicerol diminuem a constante
dielétrica do meio, o que acentua a as interações eletrostáticas em solução e, em
consequência, estimulam a biodegradação de óleo cru (ZHANG et al. 2005, D’ERRICO;
CICCARELLI e ORTONA, 2005).
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 64
Biodiesel é outro cossubstrato que vem sendo estudado para biorremediação de
ambientes impactados por petróleo e derivados. O biodiesel é um combustível limpo com
muitas vantagens ambientais. Algumas das vantagens mais importantes são a sua
degradabilidade e a capacidade de dissolver ou emulsificar óleo cru e seus derivados
(MUDGE e PEREIRA, 1999).
Taylor e Jones (2001) realizaram experimentos de biorremediação adicionando
biodiesel a um solo contaminado com piche, em experimentos de laboratório e de campo.
Nesses experimentos, os autores observaram um aumento na degradação de óleo no solo, que
passou de 52% para 85%. O êxito do processo foi relacionado com o poder emulsificante do
biodiesel e sua ação como cossubstrato.
Pasqualino, Montané e Salvadó (2006) observaram que existiu um efeito sinérgico que
aumentou a biodegradabilidade de combustíveis fósseis na presença de biodiesel, pelo efeito
do co-metabolismo.
Fernándes-Álvarez et al. (2007) avaliaram a eficiência do biodiesel como agente de
biorremediação para tratamento on shore após derrame de óleo pesado. Verificaram que a
adição de biodiesel em 50g/kg de solo melhorou a aparência do solo, reduzindo a tonalidade
escura, e acelerou a degradação das frações alifáticas e aromáticas do óleo residual. Os
autores observaram a eficiência de remoção de HPA da ordem de 80 a 85% em um período de
60 dias.
Óleos vegetais também vêm sendo estudados como cossubstratos na biorremediação
de solos contaminados por petróleo e derivados. Pannu, Singh e Ward (2004) estudaram a
aplicação de óleo de amendoim entre 2,5 a 20% na extração de HPA em solo, obtendo
eficiências de remoção maiores que 90% na remoção de antraceno do solo.
Gong et al. (2006) estudaram a remoção de HPA em diferentes concentrações, 4.721 e
724 mg/kg em uma refinaria, utilizando óleo de girassol, a experimentos em colunas em testes
de laboratório. Após a remoção, 4 a 5% do óleo permaneceu no solo, mas o conteúdo de
carbono orgânico retornou aos níveis originais após 180 dias de incubação. Esses resultados
indicaram para os autores que o óleo de girassol tem uma grande capacidade de remover HPA
de solos contaminados, e que a solubilização com o mesmo pode ser uma alternativa para a
remediação de solos contaminados com HPA.
Nascimento, T.C.F. Revisão Bibliográfica 65
Baseado em comprovações de que óleos vegetais podem ser usados como um extrator
efetivo na remoção de compostos orgânicos de solos contaminados com petróleo e derivados,
esses materiais podem ser potenciais para biorremediação de solos impactados (BRAGATO e
El SEOUD, 2003, PANNU; SINGH e WARD, 2004).
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 66
CAPÍTULO 4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 – Solo
4.1.1- Amostragem
O solo utilizado no estudo foi proveniente de uma área de landfarming de indústria de
petróleo e gás, localizada no norte do país.
A Figura 4.1 mostra o perfil do landfarming onde são depositados os resíduos de
processamento de refinaria de petróleo. O landfarming foi construído obedecendo aos
procedimentos descritos na norma ABNT NBR 13894 (1997) e opera em local coberto e
impermeabilizado, com dimensões externas de 50 x 100 m, com sistema de aspersão de água
para controle do teor de umidade.
Figura 4.1: Foto ilustrando o landfarming, local de origem das amostras de solo
As amostras de solo do landfarming foram recolhidas obedecendo aos
procedimentos descritos na norma ABNT NBR 10007 (2004). Em todos os casos foram
tomadas cinco sub-amostras de cada célula de dimensões 12,5 x 16,67 m. O solo foi
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 67
submetido a revolvimento manual com auxilio de enxada e a área superficial de cada célula
foi dividida em uma rede quadriculadas imaginárias e de cada quadrícula, retirou-se amostras
de maneira que as variações do perfil fossem representadas. As amostras foram coletadas a
uma profundidade de 15-20 cm, de três células do landfarming, totalizando 75 kg de amostra
de cada célula, que foram acondicionados em sacos plásticos e depositados em caixas de
isopor, sendo em seguida encaminhados para o laboratório, para a montagem do experimento.
No momento da coleta uma parte da amostragem do solo foi separada, e encaminha para a
realização das análises físico-químicas e bacteriológicas. As amostras para as análises
bacteriológicas foram acondicionadas e mantidas a 4°C em isopor com gelo e transportadas
ao laboratório. O desenho representativo das células do landfarming está apresentado no
Quadro 4.1.
Quadro – 4.1- Representação da divisão do landfarming em células
A B C D
E F G H
I J K L
M N O P
Q R S T
U X Y Z
4.2- Ensaios físicos e físico-químicos
4.2.1 – Umidade
Os ensaios de umidade foram realizados em duplicata. Amostras, de aproximadamente
2,0 gramas de solo, tomadas no decorrer dos experimentos, foram transferidas para placas de
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 68
Petri e levadas ao analisador de umidade por infravermelho IV-2000, GEHAKA, até massa
final constante (APHA, 1992).
4.2.2 - Capacidade de retenção de água (CRA)
Os ensaios de capacidade de retenção de água foram realizados em triplicata segundo
metodologia descrita por WATWOOD, et al. (1991), para tanto se transferiu uma quantidade
(aproximadamente 10 g) de solo para papel de filtro qualitativo tipo Watman, acoplado a um
funil de vidro de aproximadamente 5 cm de diâmetro e 5 cm de profundidade. Compactou-se
o solo sobre o papel e transferiu-se o conjunto para um becker com capacidade de 500 ml, ao
qual foi adicionada água, ao becker até um nível pouco acima do nível do papel de filtro.
Após o umedecimento da amostra, adicionou-se mais água ao becker, de forma que se
atingisse o nível próximo do topo do funil, pouco acima do nível do papel de filtro. Deixou-se
em repouso por 30 minutos. Após o período de repouso, retirou-se o funil do becker e
deixou-se escoar a água por mais meia hora. Transferiu-se o papel de filtro com solo a um
becker com 50 ml de capacidade, previamente tarado, e procedeu-se a pesagem em balança
analítica. Transferiu-se o conjunto para uma estufa a 105 ± 1ºC, por um período de vinte e
quatro horas. Em seguida, o material foi levado para um dessecador, contendo sílica gel
ativada, até alcançar a temperatura ambiente. Pesou-se o conjunto, e determinou-se o
conteúdo de umidade (capacidade de retenção de água pelo solo), pela relação da perda de
massa com a massa final da amostra, multiplicando-se por 100 para obter-se o resultado em
percentagem.
3
100)21(
m
mmCRA
Onde: CRA – Capacidade de Retenção de Água; m1 – massa inicial, em gramas; m2 –
massa final seca, em gramas e m3 – massa inicial úmida, em gramas. O ensaio foi conduzido
em triplicata e as pesagens realizadas em balança analítica (TDSFA2104N).
4.2.3 – Granulometria
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 69
A distribuição granulométrica do solo foi executada no Laboratório Prof. Jaques
Medina, Área de Geotecnia da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O ensaio foi
executado seguindo-se a ABNT NBR 7180 (1984), que corresponde à homogeneização da
amostra, secagem ao ar, passagem por uma série de peneiras e, por fim, sedimentação em
solução de orto-polifosfato de sódio.
4.2.4 - pH
Os valores de pH dos solos foram determinados em água de acordo com as
recomendações da Embrapa (1979). Acompanhou-se o pH durante o período de 60 dias, para
cada experimento. A um becker com capacidade para 50 ml, foram transferidos 10 g de solo
pesados em balança semi-analítica (ADA, 210/L). Com auxílio de uma proveta de capacidade
para 50 ml, transferiu-se 25 ml de água destilada ao becker. A mistura foi levada à placa de
agitação para homogeneização, com o auxílio de barra magnética revestida com Teflon, por
um período 30 minutos. Após esse tempo de agitação, a mistura foi deixada em repouso, para
separação das fases. O sobrenadante foi transferido para outro becker e levado ao
potenciômetro (Digimed, Mod. DM-20), para as medições de pH. Os ensaios foram realizados
em triplicata.
4.2.5. Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (HTP)
Os ensaios foram realizados empregando-se o método USEPA 8015, que determina
compostos orgânicos não halogenados, através de cromatografia gasosa acoplada a detector
de ionização de chama. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5990) e coluna DB-5 (30 m x
0,25 mm). A pré-concentração das amostras foi realizada em atmosfera de gás inerte, N2.
Os extratos orgânicos foram obtidos seguindo o método USEPA 3540C (Soxhlet
extraction) empregando o diclorometano seco com solvente e a preparação prévia à
cromatografia seguiu o método USEPA 3630C (Silica gel cleanup).
Os valores de HTP total consideram os resultados de HTP nas faixas de gasolina,
querozene, diesel e óleo combustível, assim como a fração não resolvida no cromatograma.
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 70
Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical Technology, na cidade de São
Paulo.
4.2.6. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)
Foram determinados os teores dos dezesseis HPA prioritários listados pela USEPA
(Environmental Protection Agency): benzo(a)pireno (BaP); benzo(b)fluoranteno (BbF);
benzo(k)fluoranteno (BkF); criseno (CHR); acenaftileno (ACL); fluoreno (Fl), antraceno (A);
benzo(g,h,i)perileno (BghiPRL); fenantreno (FEN); dibenzo(a,h)antraceno (DahA);
indeno(1,2,3,c-d)pireno (I123cdP); pireno (PYR); acenafteno (AC); fluoranteno (FLU);
naftaleno (N) e benzo(a)antraceno (BaA). A metodologia empregada foi USEPA 8270D, que
determina compostos orgânicos semi-voláteis por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5880), coluna DB-5 (30 m x
0,25 mm) e um espectrômetro de massa (EM 5987). Antes da injeção, os extratos foram obtidos
seguindo o método USEPA 3540C (Soxhlet extraction) empregando o diclorometano seco com
solvente. A pré-concentração das amostras foi realizada em atmosfera inerte, N2. A preparação
dos extratos (clean-up) anterior à cromatografia seguiu o método USEPA 3630C, com uso de
cartuchos descartáveis de sílica gel. Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical
Technology, na cidade de São Paulo.
4.2.7 – Carbono Orgânico Total, Nitrogênio total e fósforo total.
Nas quantificações de Carbono Orgânico Total foi utilizado o método USEPA 9060,
fundamentado na oxidação da matéria orgânica pelo dicromato de potássio, em meio ácido.
As quantificações de Fósforo Total foram executadas por espectrofotometria, de acordo com o
método USEPA 365.3, complexação com ácido ascórbico. As quantificações de Nitrogênio
Total também foram executadas por meio de técnica espectrofotométrica, de acordo com o
método USEPA 351.2, Kjeldahl. Os ensaios foram realizados no laboratório Analytical
Technology, cidade de São Paulo.
4.2.8 – SARA – Saturados, Aromáticos, Resinas e Asfaltenos.
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 71
A determinação de SARA foi realisada com base no descrito por Shama et. al. (1998).
O analisador TLC-FID da marca Iatroscan, modelo MK7, foi utilizado para a separação e
quantificação dos picos com as seguintes condições de análise: Fluxo de gases: 160 ml/min de
Hidrogênio, 2L/min de ar sintético. Para o preparo da amostra pesou-se: cerca 0,1g de
amostra, seguido da eluição de 10mL em clorofórmio UV-HPLC, injeção de 1µL. As frações
de hidrocarbonetos saturados, aromáticos (polares, e asfaltenos) foram separadas através do
procedimento padrão ASTM (Drews,1989) utilizando cromatografia em coluna e estas frações
foram utilizadas para identificação e quantificação por toda parte. Para a percolagem
(separação dos componentes para leitura) utilizou-se n-Hexano UV-HPLC (percolagem de
100cm); tolueno UV-HPLC (percolagem de 50cm) e uma solução 95% diclorometano UV-
HPLC e 5% metanol UV-HPLC, (percolagem de 20cm).
4.3– Quantificações microbianas
As quantificações de bactérias heterotróficas totais e fungos totais nas amostras de
solo, foram conduzidas utilizando a técnica “Pour Plate”, seguindo o exposto no método de
referência (GENHARTDT et al. 1994).
Para o caso de fungos filamentosos, 10 g das amostras de solo foram homogeneizadas
em 90 mL de solução salina (NaCl 0,9%). Homogeneizou-se em shaker por 15 minutos e,
com auxílio de pipeta graduada de 1 mL, tomou-se alíquota de 1 mL que foi submetida ao
procedimento de diluição sucessiva até a décima diluição. Alíquotas de 1mL foram
transferidas para placas de Petri e acrescidas de meio Agar Sabouraud 2% de glicose (Vetec,
Rio de Janeiro, Brasil), suplementado com ampicilina 50 mg/L (CIMED, Pouso Alegre,
Brasil). As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30 ± 1º C por 120 horas. Após
esse período, as colônias foram quantificadas e os resultados expressos em UFC por grama de
solo seco.
As bactérias heterotróficas totais foram quantificadas a partir de solos de
aproximadamente 10 g, ressuspendeu-se o solo em 90 mL de solução salina (NaCl 0,9%).
Homogeneizou-se e, com o auxílio de pipeta graduada de 1 mL, tomou-se alíquota de 1 mL,
que foi submetida ao procedimento de diluições sucessivas até a décima diluição. Alíquotas
de 1 mL foram transferidas para placas de Petri e acrescidas de meio Agar Nutriente (Merck,
Darmstadt, Alemanha) suplementado-se com nistatina, 50 mg/L (Teuto, Anápolis, Brasil). As
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 72
placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30 ± 1º C por 48 horas. Após esse período,
as colônias foram quantificadas e os resultados expressos em UFC por grama de solo seco.
4.4 – Etapas Experimentais
4.4.1 - Influência da concentração inicial do contaminante na biorremediação
Para estudar a biorremediação dos solos contaminados foram montados testes em
escala de laboratório, usando-se reatores de polietileno nas dimensões de 20 cm de
comprimento, 20 cm de largura e 10 cm de altura, conforme indicado na Figura 4.2.
Cada reator foi preenchido com 2 kg de solo contaminado, coletado de solo de
landfarming de acordo com a norma NBR-10.007 da ABNT. Procurou-se manter as mesmas
condições de umidade em todos os reatores, na faixa de 70-80% da capacidade de retenção de
água, o que correspondeu à manutenção de valores de umidade na faixa de 20% a 35%.
O pH inicial do solo de aproximadamente 7,0 ± 0,2 não foi corrigido no decorrer dos
experimentos, apenas monitorado. Todos os reatores foram tampados, para minimizar as
contaminações por poeira e a perda de umidade.
Figura 4.2: Os reatores usados em escala de bancada
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 73
O monitoramento e estabelecimento da cinética do bioprocesso foram realizados
contemplando medidas da concentração de bactérias heterotróficas totais, fungos totais, HPA
e HTP, teor de umidade e temperatura do ambiente.
As amostras de solo apresentaram valores de concentração inicial de HTP de 15,3,
19,0 e 29,2 g/kg. Em todos os experimentos foram realizadas medições do pH do solo em
água, da temperatura ambiente e da umidade ao longo dos 60 dias do processo.
Os valores das médias da biodegradação do HTP nos solos contaminados foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de comparação múltipla de médias de
Tukey, a 5% de significância. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do
programa Statistica 5.0 (Statsoft Inc).
4.4.2- Efeito do tipo e concentração inicial de cossubstratos na biorremediação
Primeiramente foram realizados testes com solos contaminados com resíduos oleosos,
cuja concentração de hidrocarbonetos inicial foi de 29,2 g/kg, quanto à presença de dois
cossubstratos: óleo de soja e o glicerol comercial.
O óleo de soja utilizado nos experimentos foi o óleo de soja comercial, da marca Liza.
O glicerol, por sua vez, da marca Vetec.
Para cada cossubstrato, foi estudada a suplementação dos solos, no tempo zero, em
concentrações de 375, 750 e 1500 mg/kg. Essas concentrações foram escolhidas baseado
inicialmente no trabalho de Zhang et al. (2005) que trabalharam em meio líquido, com
concentração de glicerol igual a 1g/L.
Foram implementadas a mesma cinética e estratégia de monitoramento apresentada no
item anterior, e mantidas as demais condições operacionais de umidade e pH iniciais do solo.
Os testes foram monitorados seguindo a mesma sistemática já apresentada.
4.4.3 - Efeito do uso de glicerol bruto na biorremediação
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 74
Em seguida, foram realizados testes com solos contaminados com resíduos oleosos,
cuja concentração de hidrocarbonetos inicial foi de 60 g/kg, quanto à presença de dois
cossubstratos: glicerol comercial e o glicerol bruto.
O glicerol bruto utilizado foi gentilmente cedido pela Unidade Experimental de
Produção de Biodiesel da UFRJ. Este material é um resíduo da produção de biodiesel a partir
de óleo de soja.
Para este cossubstrato, foi estuda a suplementação dos solos, no tempo zero, em
concentração de 750 mg/kg, porque nesta concentração de cossustrato obtiveram-se os
maiores percentuais de remoção de HTP.
Foi implementada a mesma cinética e estratégia de monitoramento apresentadas no
item anterior e mantidas as demais condições operacionais de umidade e pH inicial do solo.
Os testes foram monitorados seguindo a mesma sistemática já apresentada nos itens
4.2 e 4.3.
4.5 - Fitotoxicidade dos solos remediados
Para a realização dos ensaios de fitotoxicidade, foram escolhidas sementes de
Abelmoschus esculentus (quiabo), Cucumis sativus (pepino) e Rudbeckia hirta (margarida
amarela). As sementes foram lavadas com água destilada por três vezes, com o objetivo de
diminuir a interferência dos conservantes. Durante a lavagem, as sementes com morfologia
irregular foram descartadas. Em seguida as sementes de bom aspecto foram colocadas sobre
papel-filtro para secagem ao ar, por uma hora, à temperatura ambiente.
Dez gramas de solo foram transferidos para um frasco cônico com capacidade para
250 mL contendo 90 mL de água destilada. Após agitação de 250 rpm por 10 minutos (Tecnal
TE920), a suspensão foi filtrada.
As placas de Petri foram forradas com papel-filtro Whatman comum disposto dentro
da placa. O papel foi recortado e colocado no interior de cada placa de Petri. Em seguida, um
volume de 5 mL do filtrado de cada solo foi transferido para as placas de Petri. Dez sementes
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 75
de cada tipo em estudo foram distribuídas sobre a superfície do papel umedecido com o
filtrado em cada placa de Petri.
O controle foi realizado com água destilada, substituindo o extrato de solo. As placas
foram incubadas em estufa da marca e modelo Nova Ética, 411D, com temperatura controlada
a 22 ±1°C, em ausência de luz, por 5 dias e, após este período, as sementes germinadas foram
contadas e o tamanho das raízes medidos com o auxílio de uma régua.
Os resultados dos níveis de toxicidade foram obtidos a partir dos cálculos do Índice de
Germinação Relativa das Sementes (GRS), da Elongação Relativa da Raiz (ERR) e do índice
de germinação (IG), conforme descrito por Vasconcelos (2011).
4.6 - Identificação de bactérias e fungos filamentosos
A identificação biomolecular dos isolados bacterianos foi realizada de acordo com o
protocolo seguido pelo Laboratório de Fisiologia Bacteriana – LFB da FIOCRUZ (estirpe
TCB-3), e de Genética Microbiana do Instituto de Microbiologia da UFRJ (estirpes TCB-1 e
TCB-4). A identificação dos isolados fúngicos foi realizada de acordo com o protocolo
descrito pelo Laboratório de Taxonomia, Bioquímica e Bioprospecção de fungos –
IOC/Fiocruz. Após a identificação, as cepas foram depositadas na coleção de culturas de
fungos filamentosos do IOC/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil.
Identificação de bactérias: para as estirpes TCB-1, TCB-2 e TCB-4: as sequências de
parte do gene que codifica o 16S rRNA foram analisadas pelo NCBI BLAST-N (primeiro hit
ou a sequência mais próxima de uma bactéria cultivada). O gene de codificação de rRNA 16S
a partir da estirpe foi amplificado por PCR utilizando iniciadores universais a 518F
(CCAGCAGCCGCGGTAATACG) x1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) e
27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) x 800R (TACCAGGGTATCTAATCC) usando
MACROGEN instalações (Coreia). A sequência de rRNA 16S obtido foi comparada ao banco
de dados GenBank utilizando a possibilidade de BLAST-N (www.ncbi.nlm.nih.gov/
explosão). As sequências de estirpes foram comparadas estreitamente com a sequência obtida
neste estudo utilizando o software CLUSTAL-X (Thompson et al. 1997). A árvore
filogenética foi construída com base nas seqüências de rRNA 16S por método de vizinhos
(NJ) de acordo com o descrito em Saitou e Nei (1987), utilizando software 5 MEGA (Tamura
Nascimento, T.C.F Materiais e Métodos 76
et al., 2011). Para a estirpe TCB-3, a identificação foi conduzida de acordo com as
considerações citomorfológicas, bioquímicas e fisiológicas e a utilização do sistema API 50
CHB (BioMériex®). O isolado TCB nº3 foi analisado através do Multiplex-PCR.
Identificação dos fungos filamentosos: Os ensaios de isolamento das colônias foram
realizados em meio Ágar Sabouraud 2% de glicose, adicionado de 50mg/L de ampicilina
(CIMED, Pouso Alegre, Brasil), para inibir o crescimento bacteriano. Os tubos com as
colônias de fungos isolados foram enviados para o Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de
Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos, Coleção de Culturas de Fungos
Filamentosos, para a identificação taxonômica macroscópica e microscópica. A classificação
foi realizada de acordo com as técnicas clássicas micológicas, descritos na literatura
específica, para cada taxon. A identificação macroscópica das espécies fúngicas foi realizada
por análise das características macroscópicas relacionados com cada estirpe: textura da
colônia, a cor da frente e de lado reverso, a produção de pigmento, o tamanho da colônia, o
tempo de crescimento, a produção de exsudado ou não. Todas as características foram
registradas e avaliadas por serem potencialmente importantes para a classificação da linhagem
de fungos. Exame direto dos fragmentos miceliais foi observado em microscópio ótico, em
lâminas contendo o corante Lactofenol de Amann com Azul de Algodão. Após a observação
das características miceliais, cada colônia foi semeada em meios específicos. As colônias
foram incubadas à temperatura ambiente e observadas a cada 24 horas por um período de 5 a
7 dias. A identificação microscópica foi cuidadosamente examinada por preparação feita com
meios específicos, pela técnica de microcultivo segundo Rivalier e Seydel (1932). Após o
crescimento, os fungos foram identificados segundo literatura específica para cada gênero e
espécie (GOMES et al. 2010, RAPER e FENNEL, 1965, HAWKSWORTH et al. 1995).
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 77
CAPÍTULO 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1- Caracterização do solo
Os parâmetros físicos, químicos e biológicos do solo estão apresentados na Tabela 5.1.
Tabela 5.1: Resultados da caracterização física e química do solo
Parâmetro Resultado
pH (em H2O) 6,9 ± 0,2
Argila (%) 13 ± 1
Silte (%) 25 ± 2
Areia Fina (%) 18 ± 1
Areia Média (%) 28 ± 2
Areia Grossa (%) 12 ± 1
Capacidade de Retenção de Água - CRA (%) 32 ± 1
P Total (mg P/kg de solo) 16 ± 1
N Total (mg N/kg de solo) 680 ± 50
Carbono Orgânico Total - TOC (%) 6 ± 1
O perfil da curva granulométrica, Figura 5.1, mostra uma amostra de solo, constituída
predominantemente por materiais grossos (areias e cascalho), porém apresentando também
partículas de materiais finos (argila e silte), em valores de 38%. Considerando que as argilas e
siltes apresentam elevada área superficial, os fenômenos de sorção dos contaminantes nesses
materiais são bastante favorecidos. O fato das moléculas dos contaminantes poderem estar
sorvidas na matriz do solo dificulta o processo de solubilização dessas moléculas e, por
conseguinte, a biodegradação. Por outro lado, o solo apresenta um grande percentual de
materiais arenosos, 58%, devido à porosidade que pode favorecer a transferência de massa
entre o ar atmosférico e o solo, (MARÍN et al. 2005; TRINDADE et al. 2005).
O solo apresentou pH neutro em água, considerado adequado para a atividade de
degradacão de hidrocarbonetos por bactérias e fungos (Franco et al. 2004). Em geral, solos
tropicais apresentam pH na faixa levemente ácida a neutra, devido à presença de minerais
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 78
intemperizados 1:1, por exemplo, caulinita e outros filossilicatos além dos óxidos de ferro e
de alumínio.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0,001 0,01 0,1 1 10 100
Diâmetro dos Grãos (mm)
Pa
ss
a (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Reti
da (
%)
PEDREGULHOAREIAARGI LA SILTE
GROSSOMÉDIOFINO GROSSAMÉDIAFINAABNT
PENEIRAS: 200 100 60 40 2030 10 8 4 3/8 3/4 1 1 1/2
AMOSTRA 1
Figura 5.1: Curva granulométrica de uma das amostras de solo
A capacidade de retenção de água, CRA, de aproximadamente 30%, é compatível com
solos com presença de materiais finos, ou seja, argila e silte, capazes de reter água, devido à
alta superfície específica.
A salinidade do solo, ou seja, a determinação do teor de cloreto de sódio, não foi
investigada devido ao fato de ser um solo oriundo da região amazônica e não de região
marinha ou lacunar. No entanto, destaca-se que as concentrações de metais alcalinos e
alcalinos terrosos trocáveis analisados, Tabela 5.2, foram baixas, compatíveis com solos não
salinos e intemperizados e corroboram os resultados das análises granulométricas.
Minerais tipo 1:1 são comuns em solos tropicais devido ao intemperismo, e
caracterizam-se por possuir uma unidade cristalográfica contendo uma camada de tetraedros
de silício e oxigênio e uma camada de octaedros de alumínio (ou magnésio) e hidroxilas.
Como há pouca substituição do átomo central, tanto nos tetraedros quanto nos octaedros, há
pouco desbalanço de cargas, gerando poucas cargas negativas ou, tecnicamente, pequena
capacidade de troca catiônica (CTC), o que significa que os solos em que predominam os
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 79
minerais de argila do grupo das caulinitas têm pouca capacidade de reter elementos químicos,
daí a baixa fertilidade de solos tropicais muito intemperizados, como os latossolos do Cerrado
e da Amazônia Brasileira. Os óxidos de ferro e alumínio, à semelhança dos argilominerais
1:1, têm baixa CTC e contribuem pouquíssimo na retenção de nutrientes no solo, justificando,
assim, os resultados obtidos.
Tabela. 5.2: Capacidade de troca catiônica do solo de landfarming
Parâmetro Resultado
(cmolc/kg)
Ca2+
6,5
Mg2+
0,2
Na+ 11,7
K+ 0,97
Valor S 19,31
Al3+
0
H+ 6,3
Valor T 25,6
Pode-se inferir que a maior parte da matéria orgânica do solo está relacionada com a
presença de hidrocarbonetos de petróleo, uma vez que a etapa de clean up em sílica gel foi
executada previamente à determinação do TPH, que será apresentado na seção seguinte.
5.2- Caracterização do contaminante
Trata-se de resíduos oleosos do refino de petróleo, de consistência semi-sólida e
coloração negra, impregnado ao solo, conferindo cor e brilho.
Analisando o perfil cromatogratográfico do extrato de HTP de uma das amostras dos
solos estudados, Figura 5.2, observa-se que foram detectados compostos orgânicos como uma
mistura complexa não resolvida (MCNR) e nenhum hidrocarboneto linear, pristano e fitano
foram detectados. A MCNR apresentou-se com compostos orgânicos na faixa da gasolina
(TPH GRO) 5%, do diesel (TPH DRO) 5%, e do lubrificante (TPH ORO) 90%. A ausência de
pristano e de fitano, a concentração do TPH GRO e do TPH DRO e a elevação da linha de
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 80
base indicam o processo de intemperização dos resíduos oleosos, incrementando a
recalcitrância e, consequentemente, a dificuldade para o biotratamento.
O intemperismo se refere ao resultado de processos químicos, biológicos e físicos
sobre o resíduo, que podem afetar o tipo dos compostos que permanecem em solo. Somada
aos fatores descritos, destaca-se a elevada concentração de HTP, que dificulta ainda mais a
biorremediação (Del’Arco e De França, 2001).
A composição dos óleos e resíduos oleosos é um dos fatores que determinam a
eficácia de um processo de biotratamento. Óleos crus e resíduos oleosos podem ter suas
composições descritas de acordo com vários critérios e considerando vários métodos
analíticos. Dentre estes critérios, o mais usado é a polaridade.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 81
Figure 5.2: Cromatograma do extrato orgânico do solo contaminado antes da biorremediação
em laboratório, HTP = 29,2 g/kg
Análise de SARA, saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos, divide os componentes
do óleo cru e resíduos oleosos de acordo com a sua polaridade, usando técnicas analíticas,
como, por exemplo, com base na força da gravidade: cromatográfia em coluna e
cromatografia em camada fina (TLC); e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
2.5
5
.0
7.5
1
0.0
12
.5
15.0
17
.5
Min
ute
s
TP
H-G
RO
TP
H-K
RO
-
TP
H-D
RO
-
TP
H-O
RO
0
20
00
60
00
40
00
mV
olts
Tem
po
(m
in)
Corrente (mV)
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 82
Os resultados das análises de SARA estão apresentados na Tabela 5.3. Juntamente
com a Figura 5.3, fica demonstrado que se trata de um solo contaminado com resíduo oleoso
pesado, com significante presença de compostos recalcitrantes, como as resinas e os
asfaltenos.
Tabela. 5.3: Caracterização por polaridade do resíduo oleoso contido no solo
Fração (%)
S - Saturados 6 1
A - Aromáticos 22 3
R - Resinas 52 3
A - Asfaltenos 20 2
A análise dos resultados de SARA, sobretudo aqueles realizados via cromatografia em
camada delgada acoplada à detector de ionização de chama (TLC-FID), considera resultados
em porcentagens, pois os compostos saturados e aromáticos podem ser subestimados, por se
tratar de uma fração com materiais voláteis, sobretudo quando comparados às resinas e
asfaltenos, que podem ser perdidas na análise TLC. Destaca-se que, nos nossos testes, o
tempo de eluição foi minimizado ao máximo, objetivando evitar a volatilização de frações
leves da amostra. Considerando, ainda, se tratar de um solo de landfarming, exposto ao
processo de aeração continuada, infere-se que os resultados refletem a integridade da amostra,
demonstram a dificuldade de biodegradação, além de corroborar o perfil cromatográfico, onde
se verifica o intemperismo.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 83
0,1 0,2 0,3 0,4
Tempo (min)
0,6
0,5
0,4
0,3
Co
rren
te (
mV
)
Figura 5.3: Perfil cromatográfico do resíduo oleoso que contaminou os solos, em coluna
delgada, usando TLC-FID para análise SARA
É importante destacar que, a fração de compostos saturados consiste de material não
polar, incluindo hidrocarbonetos lineares, ramificados, e hidrocarbonetos cíclicos saturados. A
fração aromática inclui compostos aromáticos, constituídos de um ou mais anéis aromáticos e,
portanto, mais polar que a fração saturada. As duas frações restantes, resinas e asfaltenos, têm
substituintes polares, se distinguindo a miscibilidade em solventes orgânicos, os asfaltenos
são insolúveis em um excesso de heptano ou pentano, ao passo que as resinas são miscíveis
nestes hidrocarbonetos. Assim, comparando a Tabela 5.3 e Figura 5.2, pode-se verificar que a
maior parte dos hidrocarbonetos saturados restantes está na faixa do óleo lubrificante,
reiterando os desafios da biorremediação proposta.
Com alto teor de hidrocarbonetos, o solo apresenta, ainda, elevada quantidade
de carbono orgânico, cerca de 6%, o que indica a presença de outras classes de compostos
orgânicos no solo, que pode ser material húmico, material fúlvico, ou compostos oriundos da
biodegradação dos hidrocarbonetos (OLIVEIRA e de FRANÇA, 2005). O teor de HPA no
solo é muito menor que o de TPH, corroborando com as informações do local de origem, e
análises de SARA.
5.3 - Efeito da concentração inicial do resíduo na Biorremediação
A operação de landfarming e outras tecnologias de biotratamento de solos impactados
com resíduos oleosos, deve considerar a concentração inicial do contaminante, que é
S A
R
A
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 84
reconhecida como um dos fatores limitantes para bioprocessos (LIU et al. 2011,
BOOPATHY, 2000). Assim, para se estudar a influência da concentração inicial de
hidrocarbonetos na biorremediação do solo, foram realizados testes com amostras de solos
com valores iniciais de hidrocarbonetos totais de petróleo de 15,3, 19,0 e 29,2 g/kg de solo. É
importante enfatizar que, unidades de biotratamento de resíduos oleosos, almejam tratar as
maiores concentrações de resíduos, no menor tempo, para melhoria dos custos globais do
processo, justificando esta etapa da Tese.
Independente da concentração inicial do contaminante, em todos os ensaios de
biorremediação o pH inicial do solo foi de aproximadamente 6,9 ± 0,1, decaindo ligeiramente
ao longo dos 60 dias e atingindo valores de 6,0. O metabolismo de frações leves e pesadas de
petróleo produzem diversos tipos de ácidos orgânicos que podem reduzir o pH do solo, fato
que dá evidências de uma microbiota metabolicamente ativa (WATSON et al. 2002). A
manutenção do pH pode estar relacionada à neutralização dos intermediários ácidos pelas
espécies alcalinas do solo, detectadas nas análises químicas.
Destaca-se ainda que a umidade dos solos foi monitorada e corrigida para 70 a 80% da
capacidade de retenção de água; faixa considerada ideal para os processos de biodegradação,
de acordo com RAMÍREZ et al. (2009), objetivando a melhoria da dispersão de oxigênio,
oriundo do ar atmosférico, no solo. Esses valores foram monitorados e corrigidos durante
todo o processo.
A evolução da biodegradação dos HTP do solo diminuiu com o aumento dos
níveis de contaminante, conforme visualização da Figura 5.4 a e b. Em 30 dias de processo, a
degradação em todos os biorreatores contendo 15,3 ou 19,0 g/kg de solo, alcançou o mesmo
nível, aproximadamente 55%, indicando que já existiam no solo, micro-organismos
degradadores de hidrocarbonetos. Neste mesmo período, a biodegradação dos contaminantes
foi 10% menor, quando se operou com o nível de contaminação de 29 g/kg de solo, que
alcançou 55% de remoção somente foi alcançada em 60 dias de processo. Esta menor
atividade microbiana está provavelmente relacionada com a suscetibilidade de algumas
espécies ao contaminante.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 85
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
30 60
Tempo (dias)
Bio
de
gra
daçã
o (
%)
(%)
HTP inicial 15,3 g/kg
HTP inicial 19,0 g/kg
HTP inicial 29,2 g/kg
0
5000
10000
15000
20000
30 60
Tempo (dias)
HT
P (
mg
/kg
)
(mg
/kg
)
LI
(a)
(b)
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 86
Figura 5.4: Porcentagem de biodegradação de HTP (a) e Concentração de HTP (b), em 30 e
60 dias de processo, nos ensaios de biorremediação com HTP inicial 15,3, 19,0 e 29,2 g/kg de
solo.
LI = Limite de intervenção para áreas industriais, segundo a Lista Holandesa.
Na Tabela 5.4, encontram-se os resultados das comparações múltiplas das médias de
biodegradação do HTP em 30 e em 60 dias de processo.
Tabela. 5.4: Comparações múltiplas das médias de biodegradação do HTP em 30 e
em 60 dias de processo
HTP inicial (g/kg de solo)
MSB*
30 dias 60 dias
15,3 54,93 a** 83,83 c**
19,0 55,03 a** 71,97 d**
29,2 45,07 b** 55,28 e**
*MSB – Média significativa da biodegradação (p < 0,05)
** Letras minúsculas distintas, em cada coluna, indicam médias significativamente
diferentes, pelo Teste de Tukey.
Em 30 dias, a análise de variância indicou uma diferença mínima significativa para a
biodegradação foi de 5,34%, com um desvio padrão de 2,13. O Teste de Tukey comprovou,
com base nas comparações múltiplas das médias, para p<0,05, que a biodegradação é
diferente somente entre os dois níveis mais altos de concentração de HTP estudados.
A análise de variância, realizada com os dados de biodegradação em 60 dias, levou a
um valor de diferença mínima significativa para a biodegradação de 7,16%, com um desvio
padrão de 2,86%. Complementarmente, com o conjunto de dados obtidos com o Teste de
Tukey, foi possível verificar que, neste período de tempo, os percentuais de biodegradação
obtidos são estatisticamente diferentes, a um nível de significância de 5%. Desta maneira
confirma-se, que a concentração inicial do contaminante influenciou a biodegradação dos
hidrocarbonetos, tanto em 30 quanto em 60 dias de processo.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 87
Cabe destacar que, em 60 dias, somente os ensaios com solo contendo 15,3 e 19,0
g/kg, alcançaram HTP residual abaixo do limite de intervenção estipulado pela Legislação
Holandesa para solos em áreas industriais, que é de 5 g/kg de solo (HOLANDA, 1994). É
importante informar que os Estados da Região Norte do Brasil não possuem legislação
específica para valores orientadores de qualidade do solo e, em casos como estes, onde a
legislação local ambiental é omissa ou não existente, os estudos ambientais para remediação
de áreas contaminadas por petróleo, derivados e resíduos oleosos, costumam usar como base a
Legislação Nacional ou Legislações Internacionais de valores orientadores da qualidade do
solo. Neste contexto, a Legislação Holandesa, por sua vanguarda, é tomada como referência
em muitos Países e também em alguns Estados do Brasil, como é o caso do Estado de São
Paulo.
Detendo-nos aos aspectos de Legislação Nacional, o CONAMA, por meio da sua
Resolução Nº 420/09, que “dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo
quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento
ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de atividades
antrópicas”, não apresenta valores de HTP como referência de qualidade de solo, justificando,
assim, o uso do valor de HTP indicado na Legislação Holandesa como alvo da
biorremediação nesta Tese.
Os maiores valores de HTP residual, em 60 dias de processo, podem estar
relacionados com o aumento da concentração inicial de hidrocarbonetos nos solos,
corroborando alguns estudos encontrados na Literatura. ABIOYE et al. (2012) realizaram
experimentos de biorremediação de solo contaminado com óleo lubrificante automotivo
usado, e verificaram que a biodegradação dos hidrocarbonetos de petróleo é inversamente
proporcional à quantidade inicial de contaminantes no solo. Embora não tenham reportado
valores de HTP, estes autores relatam o uso de solos com 5 e 15% de contaminação com o
óleo lubrificante, e destacam que a biodegradação decresce em até duas ordens de grandeza
com o aumento da quantidade inicial do contaminante. Para esta conclusão, usaram um
modelo de decaimento exponencial (Eq 5.1):
y = - a.eC(t)
, Equação 5.1
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 88
onde y é a degradação, a uma constante, t é o tempo e C a concentração do
contaminante.
Del’ Arco e de França (2001) trabalharam na biorremediação de solo arenoso, recém-
contaminado com óleo árabe leve, em concentrações de HTP não superiores a 14 g/kg, devido
aos efeitos inibidores do contaminante. Estudando a biodegração nos testes com concentração
inicial de TPH de 29 g/kg, observou-se que ela não foi inibitória, mostrando a importância da
realização de estudos específicos para cada sistema e o potencial da microbiota autóctone dos
solos. Considerando que nesta pesquisa foi utilizado solo de uma área de landfarming de uma
refinaria de petróleo, considera-se que a microbiota já estava adaptada ao contaminante,
contribuindo para a remoção dos hidrocarbonatos.
Destacamos ainda que outro fator que pode ter contribuído para permanência de
hidrocarbonetos no solo foi o intemperismo. Trindade et al. (2005) estudaram a bidegradação
de petróleo cru e petróleo cru intemperizado em solo tropical, e verificaram que a facilidade
com que os hidrocarbonetos podem ser removidos dos solos varia inversamente com o
intemperismo do contaminante.
Para estudar a degradação dos HPA, usamos como alvo do tratamento, o atendimento
à Legislação Nacional, ou seja, a Resolução Nº 420/09 do CONAMA cujos valores de
concentração de HPA no solo são reportados individualmente, conforme Tabela 5.5.
Tabela 5.5: Lista CONAMA de valores orientadores para solos (Brasil, 2009)
HPA
Solo (mg/kg de solo)
Prevenção
Investigação
Agrícola Residencial Industrial
Antraceno 0,039 - - -
Benzo(a)antraceno 0,025 9 20 65
Benzo(k)fluoranteno 0,38 - - -
Benzo(g,h,i)perileno 0,57 - - -
Benzo(a)pireno 0,052 0,4 1,5 3,5
Criseno 8,1 - - -
Dibenzo(a,h)antraceno 0,08 0,15 0,6 1,3
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 89
Fenantreno 3,3 15 40 95
Indeno(1,2,3-c,d)pireno 0,031 2 25 130
Naftaleno 0,12 30 60 90
(-) não estabelecido
Os resultados obtidos das amostras com HTP de 29,2 g/kg, revelam concentrações de
Benzo(a)Pireno e Criseno, de 8,1 e 21,4 mg/kg, respectivamente, sendo os demais oito HPA
detectados, porém em concentrações abaixo do limite de quantificação, de 0,6 mg/kg, para
cada composto. Cabe destacar que, dos dois HPA quantificados, somente o Benzo(a)Pireno
possui valor de concentração para intervenção, que é 3,5 mg/kg de solo.
A biodegradação do criseno e benzo[a]pireno está apresentada na Tabela 5.6. A
análise da tabela permite verificar que o aumento da concentração inicial de hidrocarbonetos
no solo influenciou negativamente a biodegradação do criseno, não sendo observado o efeito
na degradação de benzo[a]pireno. Os HPA são compostos tóxicos e compõem moléculas de
interesse ambiental em solos impactados (JAQUES et al. 2007).
Tabela 5.6: Biodegradação de criseno e de benzo[a]pireno em função da concentração inicial
de HPA no solo
HTP inicial (g/kg do solo) Biodegradacão (%)
Criseno Benzo(a)Pireno
15,3 66 ± 5 37 ± 4
19,0 53 ± 4 29 ± 2
29,2 19 ± 2 35 ± 3
A biodegradação de HPA depende de muitos fatores, como biodisponibilidade e
intemperismo do contaminante (TRINDADE et al. 2005). O criseno possui quatro anéis
aromáticos enquanto o Benzo(a)Pireno possui cinco anéis condensados, e, portanto, maior
massa molecular. Vários estudos comprovam que os HPA de alta massa molar são menos
biodegradáveis quando comparados com os de menor massa molar (VASCONCELOS et al.
2011, ATAGANA et al. 2006), o que está relacionado com a biodisponibilidade destes
compostos.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 90
Outro fato a considerar é que o intemperismo do solo aumenta a adsorção dos
contaminantes orgânicos hidrofóbicos, como os HPA na matriz do solo, diminuindo a
velocidade e a extensão da biodegradação. Como consequência, depois de um período inicial
de tratamento, a concentração de alguns HPA pode tender a se estabilizar em um valor
residual, como observado para o caso do benzo(a)pireno. Uma das hipóteses mais aceitáveis
propõe que os fenômenos de transferência de contaminantes constitui a etapa limitante do
bioprocesso (NOCENTINI et al. 2000, RIZZO et al. 2008). Ou ainda que a taxa de
transferência de massa de hidrocarbonetos para a fase aquosa é considerada como sendo um
dos principais fatores que regem a taxa de biodegradação (HADBARATA e TACHIBANA,
2009). Em tais situações, a concentração residual do contaminante depende principalmente
das partículas finas do solo e do intemperismo do contaminante.
A análise da Tabela 5.5 permite, ainda, verificar que permanece a necessidade de
intervenção no solo com HTP inicial de 29,2 g/kg, pois o valor residual de Benzo(a)Pireno é
em torno de 5 mg/kg, superior ao indicado na Resolução CONAMA N° 420/09, justificando
estudos de melhoria da biorremediação do solo nesta condição, os quais serão apresentados na
seção seguinte.
O comportamento dos micro-organismos revela informações a respeito da presença ou
ausência das variáveis da biodegradação e auxilia na interpretação dos resultados (Pala et al.
2006). Os resultados do monitoramento das concentrações de Bactérias Heterotróficas Totais
e Fungos Totais estão apresentados na Figura 5.5 a-b.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 91
Figura 5.5: Evolução do crescimento microbiano durante a biorremediacão em função do teor
inicial do contaminante, (a) Bactérias Heterotróficas Totais -BHT; (b) Fungos Totais- FT
A concentração inicial de Bactérias Heterotróficas Totais e de Fungos Totais foi
similar em todos os ensaios (Fig. 5.5 a-b). Na maioria dos ensaios alcançou valores máximos
em sete dias de processo, diminuindo ao longo do tempo e alcançando menores concentrações
microbianas em 30 dias de processo, mas em valores compatíveis aos reportados na literatura
(a)
(b)
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 92
consultada para solos impactados com petróleo e seus derivados (OLIVEIRA e De FRANÇA
2005).
A análise das Figuras 5.5 a e b, conjuntamente com a Figura 5.4, permitiu concluir que
os teores dos macronutrientes (N e P) presentes no solo impactado, não foram inibitórias para
o processo, e que esses elementos foram importantes para a produção de biomassa e, portanto,
para a biodegradação. Em condições aeróbicas provocadas pelo revolvimento do solo nos
ensaios, verificou-se que a presença de maiores concentrações dos contaminantes provocou a
redução da concentração de FT e BHT ao longo do processo, entretanto o perfil das curvas se
manteve. Aqui se pode verificar o poder inibidor dos contaminantes.
Nos ensaios, com a concentração inicial de HTP de 29,2 g kg-1, foram obtidas as
mesmas concentrações de fungos totais a partir de 30 dias de processo, sem comprometer a
biodegradação dos contaminantes. Isto corrobora o relatado na literatura por Pérez-
Armendáriz et al. (2010) e por Tortella et al. (2005), que destaca os fungos filamentosos como
micro-organismos com elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente na degradação
de frações mais pesadas de petróleo, como aquelas predominantes nos resíduos oleosos. A
redução das concentrações dos grupos microbianos monitorados pode também ser atribuída ao
esgotamento dos nutrientes, requeridos para a assimilação de carbono (BALLAMINUT e
MATHEUS, 2007).
O conjunto dos resultados apresentados é suficiente para concluir que existe efeito
antagônico do aumento da concentração do resíduo na biodegradação dos hidrocarbonetos de
petróleo no solo estudado. Cabe novamente destacar que, ao final de 60 dias de bioprocesso,
os solos com as duas menores concentrações de HTP inicial testadas foram considerados
tratados, conforme a Legislação Holandesa (TPH < 5 g/kg) e a Resolução CONAMA 420/09,
justificando, desta forma, os estudos complementares com solos contendo TPH inicial de 29,2
g/kg, que foram executados e cujos resultados estão apresentados e discutidos na seção
subsequente.
Esta parte da Tese foi publicada na Revista Internacional de Contaminación
Ambiental, v. 29, n.1, p.21-28, Fevereiro de 2013. Cópia do artigo no Anexo C desta pesquisa.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 93
5.5- Emprego de cossubstratos renováveis como alternativa para aumentar a
biodegradação dos hidrocarbonetos
As características dos cossubstrados usados para aumentar a biodegradação dos
hidrocarbonetos, estão listadas na Tabela 5.7, e foram obtidas do fornecedor.
Tabela 5.7 – Características físico-químicas dos cossubstratos
Parâmetro Óleo de Soja Glicerol Comercial
Densidade (20°C) 0,916 1,262
pH 4,7 6,0
Tensão superficial (20°C) 34,4mN/m 63,4 mN/m
Umidade < 0,1% 1 %
Ca, Mg, Na, K, Fe <0,1 < 0,2 mg Elemento/g
Semelhante aos testes anteriores, a temperatura dos solos não foi controlada para
reduzir custos de processo. Nos 60 dias de experimento, a temperatura dos solos esteve em 30
2ºC. Reitera-se que a Literatura reporta que, em temperaturas entre 25 a 30ºC, desenvolve-
se uma grande variedade de espécies de micro-organismos capazes de oxidar hidrocarbonetos
(OLLIVIER e MAGOT, 2005). Muitos experimentos de laboratório têm demonstrado que a
degradação de hidrocarbonetos por micro-organismos tem sido melhor conduzida em
temperaturas na faixa de 20 a 35ºC.
O perfil de comportamento do pH dos solos, nos reatores suplementados com cada um
dos cossubstratos testados, está exibido na Figura 5.6. Nota-se que em todos os experimentos,
o comportamento do pH foi semelhante e houve um leve decaimento ao longo do processo,
tendendo a valores de pH levemente ácido, e, portanto, não inibindo o desenvolvimento dos
micro-organismos (OLLIVIER e MAGOT, 2005). Nossos resultados corroboram com aqueles
apresentados por Kim et al. (2005), quando reportaram que, os valores de pH levemente
ácidos encontrados em solos contaminados, estão relacionados à captação de HPA da matriz
sólida pelos micro-organismos e consequente a degradação destes compostos com formação
de intermediários ácidos. Em estudo mais recente, Janbadhu e Fulekar (2011) também
relacionaram a mudança do pH do meio para valores levemente ácidos, com a biodegradação
de HPA. As alegações destes autores foram embasadas em testes conduzidos em escala de
laboratório, usando como reatores frascos tipo Erlenmeyer, com capacidade para 250 mL, em
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 94
meio mineral. Os achados de Janbadhu e Fulekar (2011) foram justificados pelo aumento da
produção de intermediários ácidos, que estão diretamente relacionados à atividade metabólica
e ao progresso da biodegradação de hidrocarbonetos por consórcio misto composto por
linhagens bacterianas, de fungos filamentosos e actinomicetos, todos isolados de solo
impactado com hidrocarbonetos.
Figura 5.6: Valores de pH dos reatores contendo glicerol e óleo de soja como cossubstratos
Durante os ensaios, a umidade dos solos foi monitorada e corrigida para 70 a 80% da
capacidade de retenção de água; faixa considerada ideal para os processos de biodegradação
de acordo com Ramírez et al. (2009). Estes valores de capacidade de retenção de água
representavam umidades de, aproximadamente, 20-25%, conforme Tabela 5.8.
Tabela 5.8: Monitoramento da umidade dos solos
Tempo (dias) Óleo de Soja Glicerol Comercial
0 22 3 24 2
15 25 3 27 2
30 20 2 22 3
45 16 3 17 3
60 22 2 21 1
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 95
Alguns autores relatam uma faixa ideal de umidade de solos para a biodegradação de
hidrocarbonetos, que situa-se entre 15 e 20% (KOTER; WHITE e KELSEY, 2001). Outros
autores, como ATANAGA et al. (2006), relatam um teor de umidade na faixa de 23 a 26%.
Assim consideramos que nos testes realizados, a umidade foi mantida dentro da faixa ótima.
As perdas abióticas de HTP foram menores que 10% e, nas condições estabelecidas
nesta investigação, possivelmente resultaram da volatilização e foto-oxidação, como descreve
a literatura (Imfeld et al. 2009). Verificou-se que, independente do tipo de cossubstrato usado,
ocorreu aumento da biodegradação nos solos, em 60 dias de processo (Figura 5.7).
Figure 5.7: Percentual de degradação com suplementação dos cossubstratos glicerol e óleo de
soja e HTP de 29,2 g/kg de solo, após 60 dias
Pode-se observar que o glicerol foi o cossubstrato que promoveu uma maior redução
na concentração de HTP residual no solo. Nesse período, as amostras suplementadas com
glicerol promoveram respostas satisfatórias nas concentrações de 375 e 750 mg/kg, quando o
parâmetro HTP esteve abaixo do limite de intervenção estipulado pela Legislação Holandesa
para solos em áreas industriais, que é de 5000 mg/kg de solo (BRASIL, 2009). Quando se
50
60
70
80
90
Controle 375 750 1500
Concentração do cossubstrato (mg/kg)
Glicerol Comercial
Óleo de Soja
Bio
de
gra
daçã
o (
%)
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 96
suplementou o solo com um teor mais alto de cossubstrato testado, 1500 mg/kg, a
biodegradação foi um pouco menor que a encontrada na condição anterior, provavelmente
devido ao fato de que, nessa concentração, o cossubstrato foi preferencialmente degradado
aos contaminantes (SILVA et al. 2010).
A análise do perfil cromatográfico (Figura 4.8) dos extratos dos solos suplementados
com os cossubstratos permite verificar que, nas três condições estudadas, os compostos na
faixa de TPH GRO foram totalmente biodegradados, observado pelo perfil próximo a linha de
base, e que a degradação do TPH ORO também ocorreu, embora em menor proporção,
indicando a adaptação da microbiota nativa.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 97
Figure 5.8. Perfil cromatográfico do extrato orgânico do solo de landfarming com teor de
HTP igual a 29,2g/kg de solo, suplementado os cossubstratos glicerol e de óleo de soja
após 60 dias
A potencialidade dos cossubstratos na biorremediação também foi analisada com
relação à biodegradação do Criseno e do Benzo(a)pireno (Tabela 5.9), ambos considerados
HPA de alta massa molecular (VASCONCELOS et al. 2011), e, portanto, de mais difícil
biodegradação, em comparação aos HPA de menor massa molecular.
Tabela 5.9: Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno
Tipo Cossubstrato Biodegradação (%)
Concentração (mg/kg de solo) Criseno Benzo(a)Pireno
Gli
cero
l
Com
erci
al 375 38 ± 2 30 ± 1
750 55 ± 2 53 ± 2
1500 19 ± 1 35 ± 2
Óle
o d
e S
oja
375 38 ± 2 31 ± 2
750 41 ± 2 36 ± 3
1500 22 ± 2 17 ± 2
Bra
nco
0 (zero) 18 ± 3 22 ± 2
A análise da tabela permite verificar que tanto o óleo de soja quanto o glicerol
comercial incrementam a biodegradação dos HPA monitorados, corroborando os resultados
de redução de TPH. A melhor condição encontrada foi 750 mg/kg relação 40:1 TPH: glicerol
(concentração de 750 mg/kg)
Comparando a Tabela 5.9 e 5.6, verifica-se que, para o solo com HTP inicial de 29,2
mg/kg, o uso do glicerol comercial permitiu o aumento da biodegradação do Criseno de 19
para 55%, quando se empregou a relação 40:1 HTP: glicerol (concentração de 750 mg/kg).
Ainda analisando estas tabelas, pode-se verificar que a biodegradação do Benzo(a)pireno
aumentou de 35 para 53%, também com o uso do glicerol na concentração de 750 mg/kg.
Embora, com efeito menos pronunciado que o observado nos testes que
empregaram glicerol, o uso do óleo de soja, na concentração de 750 mg/kg (40:1 HTP: óleo
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 98
de soja), também aumentou a biodegradação dos dois HPA monitorados. Em suma, os
resultados encontrados, mostram que o uso de um dos dois cossubstratos estudados aumenta a
remoção do Criseno e do Benzo(a)pireno, na concentração de cossubstrato de 750 mg/kg.
O efeito sinérgico do uso do cossubstrato no solo sobre a biodegradação dos dois HPA
estudados, pode estar relacionado com fenômenos de transporte. O glicerol é uma fonte de
carbono solúvel em água, mais acessível como nutriente para diferentes tipos de micro-
organismos e pelo fato deste composto poder estimular a produção de biossurfacctantes, o que
pode ter favorecido o processo de biorremediação (CALVO et al. 2003, SILVA et al. 2010).
O óleo vegetal também pode ter sido usado na produção de biotensoativos, justificando o
aumento da remoção dos hidrocarbonetos (LIMA et al. 2009). Outra hipótese considerada
para explicar a melhoria da biodegradação é que os cossubstratos podam ter auxiliado na
transferência de massa dos HPA, através de processos físico-químicos de interface,
viabilizando a dessorção dos contaminantes da fase sólida e a assimilação microbiana (YAP et
al. 2010). Assim fica claro o efeito positivo do uso dos cossubstratos testados no
biotratamento dos solos contaminados com resíduos oleosos.
Os resultados obtidos no monitoramento microbiano nos reatores que operaram na
biorremediação do solo suplementado com 750 mg/HTP estão apresentados na Figura 5.9.
Nota-se que a concentração inicial de BHT e FT totais foi semelhante em todos os testes, (Fig.
5.9.a e 5.9.b), dado que o perfil das curvas foi semelhante, independente da quantidade do
cossubstrato usado. Tanto as concentrações de BHT quanto as de FT alcançaram valores
máximos em sete dias de processo, decrescendo ao longo do tempo e alcançando as menores
concentrações microbianas em 60 dias de processo, porém em valores compatíveis aos
reportados na literatura para solos impactados com petróleo e derivados (OLIVEIRA e De
FRANÇA, 2005).
A análise das Figuras (5.9.a e 5.9.b) permite ainda concluir que: 1) o solo impactado
possuía concentração não inibitória de macronutrientes (N e P), que são elementos
importantes para produção de biomassa; 2) a suplementação com os cossubstratos favoreceu o
crescimento de bactérias e não influenciou a concentração de fungos, que apresentaram um
perfil semelhante para os testes com e sem suplementação com glicerol ou com o óleo
vegetal.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 99
O tempo para o re-estabelecimento, em média, da população dos fungos, determinado
no reator controle, foi metade do tempo pelas BHT, provavelmente devido ao esgotamento
dos nutrientes ou aumento não significativo da concentração de metabólitos tóxicos.
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E+09
1,0E+10
BH
T (
UF
C/g
de s
olo
)
Controle Biótico
Glicerol Comercial
Óleo de Soja
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
0 7 15 30 60
Tempo (dias)
FT
(U
FC
/g d
e s
olo
)
Figura 5.9: Monitoramento microbiano de solos suplementados com glicerol e óleo de soja a
750 mg/kg e HTP de 29,2g/kg, (HTP/Cossubstrato, igual a 40:1)
Os resultados de alta concentração de fungos apresentados neste trabalho, confirmam
as alegações encontradas de Atagana et al. (2006), Tortella et al. (2005) e de Pérez-
Armendáriz et al. (2010), que reportaram fungos filamentosos como micro-organismos com
(a)
(b)
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 100
elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente na degradação de frações mais
pesadas do petróleo, como aquelas predominantes nos resíduos oleosos.
O conjunto dos resultados demonstra que o uso de glicerol, numa concentração de 750
mg/kg, que leva a uma relação HTP: Glicerol de 40:1, foi eficiente para biotratamento do
solo, considerando os maiores valores de remoção de Benzo(a)pireno e Criseno.
Considerando que se deseja otimizar a quantidade de resíduo que ingressa em qualquer planta
de tratamento de resíduos, fica justificado um estudo para a verificação da eficácia da relação
de HTP: glicerol de 40:1, no biotratamento de solo com maior quantidade de hidrocarbonetos.
Esta parte da pesquisa foi publicada, na Revista: Brazilian Journal of Petroleum and
Gas, v.6, n.2, p.43-51, 2012. Cópia do artigo no Anexo C desta pesquisa.
5.6- Biorremediação de solo contaminado em laboratório com TPH 60 g/kg, empregando
glicerol bruto como cossubstrato
Em tratamentos em escala industrial, busca-se aumentar a eficiência econômica das
unidades pelo aumento da capacidade de processamento das cargas, num dado intervalo de
tempo. Em alguns casos essa estratégia pode funcionar, porém, em processos biotecnológicos
de tratamento, esta prática pode não ter êxito, pois a concentração inicial dos contaminantes
pode exercer efeito inibitório à microbiota (ALEXANDER, 1999, Del’ARCO e De
FRANCA, 1999).
Assim, buscando a melhoria da economicidade do tratamento, e com a finalidade de
verificar a eficácia de emprego de cossubstratos em solo contendo alta concentração de HTP
inicial, 60 g/kg, na relação 40:1 (HTP inicial e glicerol), testou-se o glicerol comercial e o
glicerol bruto, excedente da produção de biodiesel. Os resultados de pH e umidade ao longo
do tempo estão apresentados na Figura 5.10.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 101
Figura 5.10: Valores de pH e umidade em solos suplementados com glicerol comercial e
glicerol bruto e HTP inicial de 60 g/kg de solo na relação (HTP: Cossubstrato, igual a 40:1)
Pode-se verificar pelo perfil das curvas de pH, que houve um leve decaimento nos
valores, o que é indicativo de atividade metabólica. Esse decaimento inicial foi mais
acentuado nos reatores com glicerol comercial. Já pelo uso de glicerol bruto foi observado
decaimento menos acentuado inicialmente, talvez devido à presença de contaminantes como
metanol e sabão, fósforo, potássio, cálcio, silício, sódio e zinco (ABAD e TURON, 2012).
Esses contaminantes podem causar alguma inibição na atividade de certas enzimas. A faixa de
pH do solo entre 6,0 e 7,0 é considerada ótima para a degradação de hidrocarbonetos (Vidal,
2001, apud Coulon et al. 2010, JAQUES et al. 2007).
Das nossas observações em laboratório destacamos que a alta concentração de óleo
(HTP) dificultou a incorporação da água no solo, requerendo maior revolvimento para a
incorporação da água. Assim, obtiveram-se valores de umidade na faixa de 18 a 22%, dentro
da faixa de 50 a 80% da capacidade de retenção de água do solo, que são considerados
favoráveis a degradação pelos micro-organismos (RAMÍREZ et al. 2009).
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 102
Os resultados dos percentuais de biodegradação do HTP estão apresentados na Figura
5.11.
20
30
40
50
60
70
80
90
100
30 60
Tempo (dias)
Bio
degra
dação (
%)
Glicerol Comercial
Glicerol Bruto
Controle Biótico
Figura 5.11: Percentual de degradação de solos com HTP de 60 g/kg, suplementados com
cossubstratos, glicerol comercial e glicerol bruto na relação (HTP: Cossubstrato, de 40:1)
A análise dos resultados permite verificar que ambos os cossubstratos empregados
influenciaram positivamente a biodegradação de HTP, aumentando de 50 para
aproximadamente 80% a biodegradação em 60 dias de processo. Assim, fica claro que a
adição dos cossubstratos testados no solo com alto teor inicial de hidrocarbonetos, pode ser
eficaz na biodisponibilidade desses contaminantes para os micro-organismos.
Observando a degradação do Benzo(a)pireno na Tabela 5.10 abaixo, verifica-se que o
percentual de degradação desse contaminante; na presença de glicerol comercial foi de 35 ±
7% e de 56 ± 10%, e na presença de glicerol bruto, ao final de 60 dias de processo. O uso do
glicerol bruto, resultou em leve aumento no percentual de biodegradação deste HPA. Os
resultados de biodegradação de Criseno foram semelhantes entre si, ou seja, aproximadamente
75% de remoção, independente do cossubstrato usado. Estes resultados indicam que os
contaminantes do glicerol bruto não influenciaram negativamente na biodegradação dos HPA
analisados e, assim, a potencialidade do uso deste subproduto na remediação de solos
impactados com hidrocarbonetos.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 103
Tabela 5.10. Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno
Cossubstrato Biodegradação (%)
Criseno Benzo(a)pireno
Glicerol Comercial 72 ± 12 35 ± 7
Glicerol Bruto 78 ± 15 56 ± 10
A literatura reporta trabalhos da degradação de criseno e Benzo(a)pireno em diferentes
ambientes, conforme Tabela 5.11.
Tabela 5.11. Biodegradação de Criseno e de Benzo(a)pireno reportados da literatura
Autor(es)
Criseno
Conci. Biod. Amb.
Hadibarata e Tachibana (2009) - 90% solo
Doth et al., 2010 50 mg/L 80% Meio Mineral
Hyayat et al., 2012 1mM 48% Meio Mineral
Willison J.C (2004) 0,5 g/L 97,5% Meio Bifásico
Valentin et al., 2007 50 mg/Kg 34,6% solo
Mohan et al., 2009 84 mg/Kg 40,95% solo
Sayara et al., 2011 1000 mg/kg 29,5% solo
Lors et al., 2012 809 mg/Kg 76% solo
Autor(es)
Benzo(a)pireno
Conci. Biod. Amb.
Rentz et al. (2008) 1630µ/ml 100 % Meio mineral
Lily et al. (2009) 50µ/ml 84,7 % Meio mineral
Kot-Wasik et al. (2004) 1 mg/L 80% Água de rio
Romero et al. (2010) 40 mg/L 75 % Meio mineral
Nabatilan (2006) 30µg/g 63 % Sedimento
Wang et al. (2008) 100 mg/kg 29 a 37 % Solo
Heitkamp e Cerniglia (1989) - 36% Sedimento
Kot-Wasik et al. (2004) 1 mg/L 20% Água de mar
Nota: Conci. = concentração; Biod. = biodegradação e Amb. = ambiente
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 104
Comparado as Tabelas 5.10 e 5.11, podemos verificar que os resultados de
biodegradação encontrados no nosso Estudo são promissores. Considerando os micro-
organismos encontrados em uma área de landfarming, supomos que estão adaptados aos HPA
de maior número de anéis, sendo o solo da região Amazônica de características
predominantemente argilosas. Outro fator que pode ser destacado é que a adição de fontes
adicionais de carbono, mais facilmente assimiláveis, pode estar agindo como um estimulante
à degradação de compostos recalcitrantes ou facilitando a biodisponibilidade dos
hidrocarbonetos.
Ressaltamos que, após a remediação, os valores de concentração residual de Criseno e
Benzo(a)pireno foram, respectivamente, de 113 mg/kg e de 12 mg/kg. Logo, o
Benzo(a)pireno está presente no solo em concentração acima do limite de intervenção
estabelecido pela Resolução CONAMA 420/09 para áreas industriais, que é de 3,5 mg/kg,
sendo a redução da concentração deste HPA no solo, um novo desafio a ser vencido em
experimentos futuros.
A atividade microbiana com cada cossubstrato foi monitorada pela medida da
concentração de bactérias heterotróficas totais e fungos totais, no período de 60 dias (Figura
5.12).
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 105
Figura 5.12- Monitoramento microbiano em solos suplementados com glicerol comercial e
glicerol bruto na relação (HTP/Cossubstrato, igual a 40:1) e HTP inicial de 60g/kg
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 106
Observa-se que a concentração inicial de cada grupo microbiano investigado, foi
semelhante, independente do emprego do cossubstrato. Na Figura 5.12a observa-se que no
decorrer do processo houve um leve decaimento na população de bactérias, chegando a
valores na ordem de 106 UFC/g, em 60 dias de processo. Isso se deu, provavelmente, devido
ao nível elevado de contaminação e pela recalcitrância do contaminante.
Na presença de glicerol bruto, Figura 5.12b, a população de fungos decaiu nos
primeiros 10 dias e tendeu a estabilidade até o final do processo. Já nos testes com o uso do
glicerol comercial observou-se um aumento da concentração de fungos até 30 dias de
processo, decaindo ao longo dos trinta dias seguintes.
O perfil da população de fungos pode ser indicativo de adaptação ao contaminante ou
o uso do cossubstrato como fontes de carbono de fácil biodegradação. O comportamento
diferenciado da concentração de fungos nos solos não influenciou o resultados da
biodegradação do HTP e dos HPA monitorados, comprovando as alegações de Trindade et al.
(2005) e de Del’Arco (1999) que reportam que a diversidade de tipos de micro-organismos
(não necessariamente a concentração) é fator importante na biodegradação.
5.7- Fitotoxicidade do solo
O mecanismo de ação dos HPA nas plantas foi descrito como a redução da habilidade
da raiz em absorver água e nutrientes (DEBIANE et al. 2008). O teste de fitotoxicidade é uma
das mais simples formas de diagnóstico da fertilidade de solos biorremediados (DAZY;
FÉRARD e MASFARAUD, 2009 apud Vasconcelos 2011). A inibição da germinação e a
diminuição do crescimento vegetal, bem como a morte das plantas, são indicadores da
toxicidade dos hidrocarbonetos (RIVERA-CRUZ e TRUJILLO-NARCÍA, 2004).
Assim, para verificar a eficiência de processos de biorremediação de solos
contaminados por hidrocarbonetos do petróleo e minimizar riscos associados à disposição
desse resíduo no solo, verificou-se a fitotoxicidade do solo contaminado com 60g/kg de solo
no inicio e após 60 dias de bioprocesso.
Nas amostras de solo impactado por hidrocarbonetos de petróleo e no solo tratado com
os cossubstratos na concentração de 750 mg/kg de solo, o efeito fitotóxico foi investigado
utilizando-se sementes dos vegetais Abelmoschus esculentus ( quiabo), Cucumis sativus
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 107
(pepino) e Rudbeckia hirta (margarida amarela). As três sementes são dicotiledôneas, sendo
duas de vegetais e uma de flor. A escolha destas sementes também foi embasada no diâmetro.
Cucumis sativus tem o maior diâmetro de semente de 0,9 cm, seguido pela Rudbeckia hirta
0,8 cm e o Abelmoschus esculentus, 0,5 cm.
Os resultados dos ensaios de Fitotoxicidade para as três sementes estudadas estão
listados na Tabela 5.12.
Tabela 5.12. Fitotoxidade do solo antes e depois do biotratamento
Vegetal 0 dias 60 dias
Abelmoschus esculentus ALTO NÃO FITOTÓXICO
Cucumis sativus MODERADO NÃO FITOTÓXICO
Rudbeckia hirta ALTO ALTO
Os resultados demonstram que a toxicidade dos contaminantes estudados não teve
relação com o diâmetro das sementes, pois apenas a semente de tamanho intermediário sofreu
efeitos tóxicos, após o tratamento. As sementes de Cucumis sativus e de Abelmoschus esculentus
(de maior e menor diâmetro), se mostraram mais tolerantes aos efeitos tóxicos do contaminante. A
literatura reporta que sementes maiores são menos influenciadas pelo efeito tóxico dos
contaminantes do que sementes de menor tamanho (SMITH et al. 2006, HAMDI et al. 2007,
REYNOSSO-CUERVAS et al. 2008). A escolha de sementes de cor clara garantiu que
nenhuma delas apresentasse fotoblastismo positivo que, de acordo com (CORDAZZO e
ARACAMA 1998, apud VASCONCELOS, 2011), teriam sua germinação inibida pela
ausência de luz, o que poderia induzir a erros de interpretação nas respostas dos testes. É
provável que a forma da semente também tenha influência na germinação, pois as sementes
de Albelmoschus esculentus são redondas e, embora apresentem um diâmetro menor, a sua
área superficial é grande.
Os resultados demonstram que o tratamento foi eficiente para reduzir os efeitos
fitotóxicos do solo sobre o Abelmoschus esculentus ( quiabo) e o Cucumis sativus (pepino).
Já para Rudbeckia hirta ( margarida amarela), o efeito fitotóxico alto persistiu após os 60 dias
de bioprocesso. Tem-se, assim, a fitotoxicidade à Rudbeckia hirta como sendo uma
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 108
importante variável de resposta para experimentos futuros de biorremediação deste solo
(ANASTASI et al. 2009).
5.8- Micro-organismos isolados durante os 60 dias de processo em laboratório
A capacidade de degradar hidrocarbonetos do petróleo é apresentada por diversos
organismos, principalmente as bactérias, os fungos filamentosos e as leveduras. Esses micro-
organismos são geralmente isolados de sítios contaminados por petróleo e derivados,
considerando a adaptação ao contaminante (BRITO et al. 2010, ZHONG et al. 2011,
JANBANDHU e FUKLER, 2011). Desde a década de 1950 do século passado, vem sendo
isoladas e identificadas bactérias e fungos degradadores de hidrocarbonetos. Dentre os
isolados, destacam-se os gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Norcadia,
Sphingomonas, Mycobacterium e Gordonia, dentre outras, e de fungos do gênero
Cunninghamella, Fusarium, Candida, Penicillium e Aspergillus (CERNIGLIA et al. 1997,
JAQUES et al. 2005 apud JAQUES et al. 2007).
No presente estudo, os cultivos em placa demonstrou uma diversidade de micro-
organismos cultiváveis, conforme apresentado na Figura 5.13. Podem ser observadas colônias
de fungos e bactérias, com distintos aspectos e, considerando os elevados teores de HTP no
solo, temos inferência da presença de organismos hidrocarbonoclásticos.
Fungos e bactérias predominantes nos cultivos em placa foram isolados com a
finalidade de identificar os micro-organismos relacionados com a degradação dos
hidrocarbonetos de petróleo, nas três concentrações de HTP testadas.
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 109
Figura 5.13: Colônias de fungos e bactérias com distintos aspectos
Foi possível isolar oito estirpes microbianas, sendo quatro fungos filamentosos e
quatro bactérias. As bactérias isoladas foram codificadas como: TCB-1; TCB-2; TCB-3 e
TCB- 4. As estirpes de fungos, por sua vez, foram codificadas como TCF-I; TCF-II; TCF-III
e TCF-IV. A identificação dos isolados bacterianos está apresentada na Tabela 5.12, e dos
isolados fúngicos, na Tabela 5.13. Estes resultados corroboram aqueles apresentados por
Araújo et al. (2002) e Chailan et al. (2004). Estes autores isolaram e identificaram estirpes de
fungos e bactérias capazes de degradar hidrocarbonetos de petróleo em solos contaminado
com petróleo.
Tabela. 5.13: Isolados bacterianos em solo contaminado com resíduos oleosos
Código Linhagem Identidade (%) TSO* Nº de Acesso
TCB-1 Rhodococcus gordoniae 89% 1039 pb EU741104.1#
TCB-2 Micrococcus luteus 99% 1439bp FJ189776.1#
TCB-3 Bacillus cereus ** 100% 1000bp LBF##
TCB-4 Serratia marcescens 100% 1149 pb AB680122.1#
Nota: * TSO – Tamanho da Sequencia Obtida, ** Sensu stricto
# GenBank ## FIOCRUZ1641
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 110
Tabela 5.14: Fungos Filamentosos isolados de solo contaminado com resíduos oleosos
Código Linhagem Banco Fiocruz*
TCF-I Aspergillus flavus IOC- 4615
TCF-II Aspergillus niger. var. niger IOC- 4616
TCF-III Aspergillus clavatus IOC- 4617
TCF-IV Cunninghamella echinulata IOC- 4618
Nota: * Após catalogação
A identificação das linhagens de Rhodococcus gordoniae, Micrococcus luteus e
Serratia marcescens, corrobora os trabalhos de Jones et al. (2004), Wongsa et al. (2004) e de
Ramirez et al. (2010), que também isolaram espécies destas bactérias de solos contaminados
com hidrocarbonetos de petróleo.
O gênero Rhodococcus tem capacidade para degradar muitos compostos orgânicos, o
que pode ser devido à sua capacidade de produzir surfactantes, Ruggeri et al. (2009). A sua
presença e disseminação no ambiente torna-os candidatos ideais para promover a remediação
de sítios contaminados (van LEEUWENHOEK, 1998). Além disso, Rhodococcus mostra uma
grande diversidade metabólica, contribuindo para degradação de xenobióticos (Dabbs, 1998,
Goodfellow et al. 2004, Jones et al. 2004), e também são reportados na literatura como
degradadoras de HPA (KIM e LEE, 2007, JANBANDHU e FULEKAR, 2011). Rodococcus
gordoniae pertencentes à família Nocardeaceae, são aeróbicas, Gram-positivas e catalase
positiva, que formam filamentos ramificados que se fragmentam em elementos coco-bacilos.
Formam colônias de forma côncava, brilhantes, de coloração variando entre rosa pálido a
coral, e apresentam bordas filamentosas (JONES et al. 2004). Rodococcus sp. isoladas de
sedimentos contaminados, se mostraram capazes de metabolizar fenantreno via orto e meta
clivagem (DEAN-ROSS; MOODY e CERNIGLIA, 2002).
Serratia, por sua vez, pertence à família das Enterobactereaceae e pode ser descrita
como uma bactéria que apresenta forma de bastonetes curtos (0,5 a 0,8 μm de diâmetro e 0,9 a
2,0 micrometro de comprimento) com bordas arredondadas. Em geral, apresenta mobilidade
pela presença de flagelos peritríquios. É facultativa, podendo crescer em ampla faixa de pH, 5
a 9, fortemente catalase positiva. Apresenta crescimento em ampla faixa de temperatura (10 a
36 ºC), e salinidade (0 a 4% NaCl). As colônias da linhagem Serratia marcences isoladas
nesta pesquisa apresentam pigmentação vermelha, formato côncavo, de aspecto brilhante e
liso. Sendo um micro-organismo quimioheterotrófico, cresce em distintas fontes de carbono e
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 111
pode ser cultivada em meio mínimo com uma única fonte de carbono e sulfato de amônio,
como fonte de nitrogênio (GRIMONT e GRIMONT, 1984). A literatura relata vários
experimentos de degradação de petróleo e derivados utilizando-se espécies de Serratia
marcences (WONGSA et al. 2004, RAMIREZ et al. 2010, ANYANWU; OBI e OKOLO,
2011). A produção de biossurfactante por Serratia marcences também foi comprovada nos
trabalhos de Ferraz et al. (2002).
Micrococcus luteus se caracteriza pela eficiência na biodegradação de hidrocarbonetos
de petróleo, por sua capacidade de emulsificar os hidrocarbonetos pela produção de
biossurfactantes, que aumentam a adesão das células ao substrato (TULEVA et al. 2009).
A espécie Bacillus cereus, sensu lato, que compreende o grupo de micro-organismos
denominado de Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis e Bacillus cereus (sensu stricto), já
foi bastante estudada, por suas características patogênicas (JENSEN et al. 2003).
Segundo as considerações citomorfológicas, bioquímicas e fisiológicas, e a utilização
do sistema API 50 CHB (BioMériex®), a amostra do isolado TCB-3 foi identificada como
Bacillus cereus sensu stricto. Trata-se de bastonetes com esporos preponderantemente
elípticos subterminais não deformantes
Consórcios de bactérias contendo Bacillus cereus, isolado de resíduos petroquímicos,
demonstraram eficácia na degradação de borras oleosas (CERQUEIRA et al. 2011). De
maneira geral, a capacidade hidrocarbonoclástica desses micro-organismos, segundo alguns
autores, se deve a produção de biossurfactantes, que é uma estratégia utilizada para acentuar a
biodisponibilidade de compostos hidrofóbicos (BANAT et al. 2010, CALVO et al. 2009,
NILKIFOROVA et al. 2009, CERQUEIRA et al. 2012).
O gênero Aspergillus é freqüentemente encontrado no ar e no solo. Apresenta-se sob a
forma de um micélio septado escuro ou hialino. Parte da massa micelial se diferencia em
conidióforo, terminalmente com vesícula, que pode ser globosa, hemisférica, elíptica ou
clavada, e de coloração hialina ou pigmentada. Na vesícula são formados os esterigmas ou
fiálides, diretamente ou sobre metulas (BARNETT e HUNTER, 1986, SAMSON;
HOEKSTRA e FRISVAD, 1995 apud IEDA ROTTAVA, 2005). As colônias de Aspergillus
niger são compostas de micélio aéreo, com conidióforos eretos, distribuídos densamente
sobre a superfície do meio, além de grande produção de conídios. As espécies pertencentes ao
grupo produzem o aspergilo ou cabeça aspergilar. Tal estrutura consiste em uma haste não
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 112
septada e estípede, terminando em uma vesícula, sobre a qual nascem às células
conidiogênicas, denominadas por fiálides. Estas, por sua, vez são responsáveis por sintetizar
os conídios, bem como as métulas (SAMSON et al. 1995, SANTOS, 2007 apud SIMAS
2011).
Como regra geral, são células multinucleadas. O micélio jovem produz conidióforo
solitário abundante decorrente somática hifas. Conidióforos hialinos ou pigmentados são
longos, lisos, cada um terminando em uma cabeça bulbosa chamada de vesícula. As vesículas
têm dimensões de 20-100 µm de diâmetro. Um grande número de células conidiogénicas
ocorre na superfície da vesícula multinucleadas, por isso são observados como cabeças
conidiais irradiadas. Células Conidiogênicas, primárias ou secundárias, são fiálides típicas.
Quando os fiálides atingem a maturidade, eles começam a produzir conídios um após o outro,
em cadeias. Conídios são globosos, com paredes ásperas medindo entre 3,5 e 5,0 mm de
diâmetro. Os conídios são formadas na extremidade tubular das fiálides. Como conidióforos e
conídios são produzidos em abundância, sua cor é predominante na pigmentação da colônia,
aparecendo na coloração preta ou marrom (USECHE; VALENCIA e PÉREZ, 2004).
A espécie Aspergillus flavus apresenta hifas hialinas, esporos rugosos, vesícula
globulosa ou piriforme e esporos globulosos de cor verde oliva. Pode ser uniseriado,
apresentando métulas de onde originam-se os esporos, ou podem ser biseriados, possuindo
metulas e fialides. Os conidióforos originam se de uma estrutura chamada célula pé.
Macroscopicamente possui textura pulverulenta, micélio branco, com esporulação cuja
tonalidade varia de verde oliva a amarelado. Dependendo do meio de cultura, pode ou não
haver coloração no reverso da placa, sendo radiado em qualquer condição de cultivo em meio
solido.
As colônias são constituídas por micélio fino, mas de textura densa. Cobrem-se de
conídios de cor geralmente entre o amarelo e o verde. O reverso é branco ou róseo. As
cabeças conidiais são radiadas; os conidióforos incolores e de paredes espessas; as vesículas
alongadas, quando jovens, e mais tarde globosas com 10 e 65m de diâmetro; os esterigmata
unisseriados ou bisseriados; os conídios globosos e geralmente com 3,5 a 4,5m de diâmetro.
Muitas estirpes produzem esclerócios, particularmente quando isoladas recentemente, que por
vezes dominam a morfologia da colônia. A sua forma, cor e dimensões são variadas;
raramente excedem 1mm de diâmetro e podem tomar cor castanho-avermelhada escura. A
Nascimento, T.C.F. Resultados e Discussão 113
presença de esclerócios é acompanhada, muitas vezes, do aparecimento à superfície da
colônia de gotas de um exsudado castanho-averemelhado (PAULINO, 1998).
Aspergillus clavatus são fungos saprófitos (BEZERRA Jr. et al. 2009). Os esporos de
A. clavatus apresentam conídeos de dimensões 3-4,5 x 2.5-4,5 µm (ALLERGY et al. 1984).
O gênereo Cunninghamella caracteriza-se pela ausência de hifas septadas, o que indica
que ele é um Zygomyceto. Exibe a presença de esporângios globosos. O tamanho de uma
esporangiola é de cerca de 6-7 µm de diâmetro (MURAD et al. 2011).
Foram realizadas as observações das características macroscópicas após crescimento
em meio Agar Sabouraud e verificou-se a presença de colônias de coloração verde azulado
(Cunninghamella echinulata), verde musgo (Aspergillus flavus); marrom escuro (Aspergillus
clavatus); e preta (Aspergillus niger. var. níger), todas com aspecto aveludado.
Os fungos filamentosos isolados e identificados dos solos em estudo, têm sua
característica hidrocarbonoclástica já citada em trabalhos anteriores com Aspergillus níger
(RAMIREZ et al. 2010, EJA et al. 2005 ).
Lotfinasabasi et al. (2012) reportaram o isolamento e crescimento de estirpes de
Aspergillus em solos contaminados com óleo cru e verificaram o potencial de um isolado de
Aspergillus níger na biodegração de hidrocarbonetos em altas concentrações (5 a 20% m/m).
PÉREZ-ARMENDÁRIZ et al. (2010) também reportam o êxito de isolado de Aspergillus
niger na degradação de hidrocarbonetos intemperizados isolados de solo mexicano, com
remoção de aproximadamente, 60% do HTP.
Cutright (1995), estudou a cinética envolvida de biodegradação de HPA por
Cuninghamella echinulata var. elegans e sugeriu que, para uma cinética de primeira ordem, a
taxa de degradação na concentração do contaminante é proporcional à concentração do
contaminante no solo e ao tipo de contaminante (HARITASH e KAUSHIK, 2009).
O fungo filamentoso Cunninghamelalla utiliza o sistema citocromo P450, (via de
degradação de HPA ilustrada na Figura 3.5), no metabolismo de uma variedade de poluentes,
entre eles os hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos. É um gênero catabolicamente versátil (YADAV et al. 2000).
Nascimento, T.C.F. Conclusões 114
CAPÍTULO 6 – CONCLUSÕES
6.1 – Conclusões
Em 60 dias de processo, o aumento da concentração de TPH inicial no solo de 15,3 e
19,0 g/kg, não impediu que o TPH residual alcançasse valores abaixo do limite de
intervenção estipulado pela Legislação Holandesa para solos em áreas industriais, que
é de 5 g/kg de solo. No entanto, o aumento da concentração de TPH inicial para 29,2
g/kg, promoveu uma diminuição do percentual de biodegradação dos hidrocarbonetos
e o solo apresentou valor de TPH residual próximo de 12 g/kg, justificando, assim,
estudos de alternativas de tratamento.
O aumento da concentração inicial do TPH do solo, de 15,3 para 29,2 g/kg,
influenciou negativamente a biodegradação do criseno, que passou de 66 para 19%. Já
para o caso do benzo(a)pireno, não foi verificado qualquer efeito do TPH inicial na
biodegradação.
O emprego do glicerol comercial ou do óleo de soja influenciou positivamente na
biodegradação do TPH, do criseno e do benzo(a)pireno, quando testado com TPH
inicial de 29,2 g/kg.
Pôde-se verificar que as relações mássicas entre a quantidade do cossubstrato e o TPH
inicial do solo influenciaram a biodegradação dos hidrocarbonetos. Os melhores
resultados de remoção dos contaminantes foram obtidos na relação 40:1 (TPH:
Cossubstrato). Nesta condição, observaram-se também maiores percentuais de
biodegradação de criseno e benzo(a)pireno, a saber, 55 e 53% com o uso do glicerol e
41 e 36% com o emprego do óleo de soja.
Em valores de TPH inicial de 60 g/kg, não foi verificada diferença significativa na
biodegradação dos hidrocarbonetos totais de petróleo pela suplementação com glicerol
comercial ou com glicerol bruto (um resíduo), revelando o potencial de
Nascimento, T.C.F. Conclusões 115
reaproveitamento deste resíduo do setor de energia. Este mesmo comportamento foi
observado para o criseno e benzo(a)pireno.
Com os experimentos desta pesquisa, foi possível obter oito isolados microbianos
capazes de se manter ativos em solos contendo altos teores de hidrocarbonetos,
indicando o potencial da microbiota nativa da Amazônia na biodegradação de
compostos recalcitrantes produzidos pelo setor de petróleo e gás.
6.2 – Sugestões
Verificar o efeito da suplementação de glicerol bruto em solos com altas contrações de
HTP por períodos de tempo maiores, por exemplo, 90 e 120 e 240 dias, na relação
(HTP: Cossubstrato) de 40:1.
Promover o bioaumento em laboratório, na biorremediação de solos contendo altas
concentrações de HTP, utilizando os micro-organismos isolados nesta pesquisa;
bactérias e fungos filamentosos, uma vez que os mesmos se mostraram bons
degradadores de hidrocarbonetos recalcitrantes.
Realizar os testes de Fitotoxicidade ao final de cada experimento, utilizando sementes
da espécie que se mostrou mais sensível aos efeitos fitotóxicos, testados nesta
pesquisa; semente da espécie Rudbeckia hirta (margarida amarela).
Testar a biorremediação com a suplementação de glicerol bruto, excedente da
produção de biodiesel, utilizando outras fontes de matérias-primas renováveis.
Investigar a biodegradação dos HPA, de 4, 5 e 6 anéis aromáticos, dos 16 listados pela
USEPA em outras relações (HTP:Cossubstrato), partindo de um planejamento
experimental, testando solos contaminados com altas concentrações de HTP, (30g/kg,
60g/kg e 100g/kg de solo) e glicerol bruto como cossubstrato.
Nascimento, T.C.F. Referências Bibliográficas 116
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2972, 2011.
Nascimento, T.C.F.
ANEXOS
Nascimento, T.C.F.
ANEXOS
ANEXO B – Produção bibliográfica
Trabalho publicado em periódico de circulação internacional
NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Potential of glycerol and
soybean oil for bioremediation of weathered oily-sludge contaminated soil. Brazilian
Journal of Petroleum and Gas, v.6, n.2, p. 043-051, 2012.
Trabalho aceito para publicação em periódico de circulação internacional
NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Biorremediación de um
suelo tropical contaminado con residuos aceitosos intemperizados. Revista Internacional
de Contaminación Ambiental, v.29, n.1, p. 21-28, 2013.
Trabalhos completos em eventos cientícos
NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Efeito do Glicerol e
Biodiesel na Biorremediação de solo contaminado com resíduos de refinaria. In: XVIII
CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUÍMICA - COBEQ, 19-22/09,
2010, Foz do Iguaçu. Anais... São Carlos: Cubo Multimidia, 442 p., 2010.
NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Efeito da adição de
cossubstratos na Biorremediação de Solos de Landfarming de Refinaria de Petróleo. In:
XVIII SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS - SINAFERM, 24-27/07, 2011.
Apresentação oral. Caxias do Sul, 2011.
NASCIMENTO, T. C. F.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Identificação de micro-
organismos hidrocarbonoclásticos isolados de solo de landfarming suplementado com
fontes adicionais de carbono. In: XIX CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA
QUÍMICA, 09-12/09, 2012, Búzios-RJ. Anais...: Cubo Multimidia, 439 p., 2012.
Nascimento, T.C.F.
ANEXOS
BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS INTEMPERIZADOS
Teresa Cristina FERREIRA DO NASCIMENTO1, Fernando Jorge SANTOS OLIVEIRA2 y Francisca PESSOA DE FRANÇA3*
1 Departamento de Engenharia Bioquímica. Alumna de Doctorado en la Universidade Federal do Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil
2 Petróleo Brasileiro S.A - PETROBRAS, Brasil3 Departamento de Engenharia Bioquímica da Escola de Química, DSc, Tecnología de Procesos Químicos y
Bio-químicos, Universidad Federal do Rio de Janeiro*Autor responsable: fpfranca@eq.ufrj.br
(Recibido agosto 2011, aceptado noviembre 2012)
Palabras clave: biorremediación, biodegradación, residuos aceitosos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, suelo intemperizado
RESUMEN
En este trabajo se evaluó la biorremediación de un suelo de clima tropical, contamina-do con residuos aceitosos intemperizados. Fueron ensayadas tres concentraciones de hidrocarburos totales de petróleo (HTP) iniciales: 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo. Los ensayos fueron llevados a cabo en 60 días, monitoreando los siguientes parámetros: humedad, pH, concentración de bacterias heterotróficas totales (BHT), hongos totales (HT), hidrocarburos totales de petróleo (HTP) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): benzo(a)pireno (BaP) y criseno (CHR). La concentración inicial de los HTP influenció inversamente la biodegradación: 84, 72 y 55 %, respectivamente, en 60 días. El aumento de la concentración inicial de HTP también influenció negativamente la degradación del CRH, no siendo observado efecto alguno en la degradación del BaP.
Key words: bioremediation, biodegradation, oily residues, polycyclic aromatic hydrocarbons, intemperized soil
ABSTRACT
This study evaluates the bioremediation of a tropical soil from tropical climate, contaminated with weathered oily residues. Three initial concentrations of total petroleum hydrocarbons (TPH) were tested: 15.3, 19.0 and 29.2 g/kg of soil. The experiments were conducted over 60 days, by monitoring the following param-eters: moisture, pH, concentration of total heterotrophic bacteria, total fungi, total petroleum hydrocarbons and polycyclic aromatic hydrocarbon: benzo(a) pyrene (BaP) and chrysene (CHR). The initial concentration of TPH inversely influenced biodegradation: 84, 72 and 55 % respectively, during 60 days. By increasing the initial concentration of TPH, the degradation of CHR was also influenced; however, no effect on the degradation of BaP was observed.
Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (1) 21-28, 2013
T.C. Ferreira do Nascimento et al.22
INTRODUCCIÓN
El sector del petróleo y del gas natural genera varios residuos peligrosos y, entre estos, los residuos empetrolados que pueden presentar compuestos tóxicos como los hidrocarburos aromáticos policí-clicos y ser inflamables. Los residuos empetrolados son generados en las operaciones normales de las unidades, en las paradas para mantenimiento y en los casos de emergencia ambiental, incrementando su cantidad. La gestión ambiental de los residuos con miras a minimizar los efectos adversos de los eventos de contaminación ambiental por residuos aceitosos, el desarrollo sostenible y los costos relacionados con las operaciones de almacenamiento, transporte y tratamiento de los residuos son preocupaciones actuales, tanto del sector industrial, como del sector académico.
La incorporación de residuos aceitosos en un suelo constituye una ruta para el tratamiento de estos materiales; sin embargo, cuando es mal conducida genera pasivos ambientales. Los derrames de petróleo crudo y sus derivados y el almacenamiento inade-cuado de residuos también aumentan el valor de lo que corresponde a pasivos ambientales del sector del petróleo y del gas natural, impulsando investigacio-nes para el desarrollo de alternativas efectivas, tanto desde el punto de vista técnico como desde el punto de vista económico.
La biorremediación de suelos contaminados es una técnica de tratamiento que tiene como objetivo utilizar el potencial de la micro biota autóctona o exógena, para degradar los compuestos orgánicos constituyentes de los residuos, con la consecuente disminución de la toxicidad. Esta tecnología está influenciada por factores internos y externos. Entre los factores internos se destaca el genotipo de los microorganismos y entre los externos, la temperatura, la aireación, el tipo y la concentración de los con-taminantes, su grado de intemperismo, así como las fuentes y las concentraciones de los macronutrientes (Huang et al. 2004, Zahed et al. 2010). Esta tecnolo-gía es, en general, eficiente y económica cuando se compara con las alternativas físicas y fisicoquímicas convencionales de tratamiento de suelos (Oliveira y de França 2005).
Se ha realizado estudios buscando la biorremedia-ción de suelos impactados por hidrocarburos como una función de factores externos, como el tipo y la concentración de fuentes de N y de P, el pH y la pre-sencia de surfactantes (Venosa y Zhu 2003, Das et al. 2008). Por otra parte, se encuentran pocos estudios sobre el efecto del intemperismo de los residuos
empetrolados en los suelos, en especial suelos de clima tropical, y de la concentración de estos residuos intemperizados sobre la biorremediación (Trindade et al. 2005). Esto aún a sabiendas que este es un problema contemporáneo para los países en desarro-llo, considerando el número de áreas contaminadas abandonadas y los aspectos de sostenibilidad, salud y ambiente.
Las consideraciones ambientales y económicas dieron impulso a la elaboración de esta investi-gación, la cual buscó verificar la eficacia de la biorremediación de un suelo tropical contaminado con distintas concentraciones de residuos aceitosos intemperizados.
MATERIAL Y MÉTODOS
El suelo utilizado en este estudio es proveniente de un área de landfarming usada para el tratamiento de residuos aceitosos de la industria de petróleo y gas, y recibió residuos petrolizados hace un poco más de cinco anos. Este sitio está cerca de la línea del ecuador. Se registran, en el área, temperatura media de 27 ºC, humedad relativa entre 75 y 86 % y precipitación entre 1750 y 2500 mm. De acuerdo con estos datos, el área es típica de un clima tropical.
Para ejecutar el muestreo de suelo el área del landfarming fue dividida en tres lotes justificando las tres diferentes concentraciones de HTP ob-servadas. El suelo, fue colectado de siguiendo la normativa brasileña vigente, ABNT NBR (10004). Las muestras de suelo utilizadas para los ensayos de biorremediación fueron acondicionadas en cajas de cloruro de polivinilo (PVC), con capacidad para 20 litros y refrigeradas a 4 ± 1 ºC, con el fin de realizar los ensayos de biotratamiento.
Granulometría, humedad, pH y capacidad de retención de agua (CRA)
La distribución granulométrica del suelo fue eje-cutada de acuerdo con la Norma Brasileña (ABNT NBR 7180 1984), que corresponde a la homogenei-zación de la muestra, secado al aire, paso por una serie de tamices y finalmente, sedimentación de los granos en solución de orto-polifosfato de sodio. La humedad fue determinada mediante el uso de crisoles de porcelana y un analizador de humedad por infra-rrojo, Gehaka, mod. IV-2000, hasta peso constante. Los valores de pH de los suelos fueron determinados mediante suspensiones en agua destilada. Se utilizó el procedimiento descrito por Embrapa (1979), con potenciómetro Digimed, mod. DM-20. La CRA de
BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 23
las muestras de suelos fue determinada siguiendo la metodología descrita por Watwood et al. (1991). Las determinaciones fueron llevadas a cabo por triplicado.
Hidrocarburos totales de petróleo (HTP) y HAPPara la determinación de HTP y sus fracciones
fue utilizada la metodología USEPA 8015, que determina compuestos orgánicos no halogenados a través de cromatografía gaseosa, acoplada a un detector de ionización de llama. Los extractos orgá-nicos fueron obtenidos siguiendo el método USEPA 3540C (Soxhlet extraction) y la preparación previa a la cromatografía siguió el método USEPA 3630C (Silica gel cleanup). Los valores de HTP consideran los resultados de HTP en las fracciones de gasolina, querosén, diesel y aceite combustible, así como la fracción no resuelta en el cromatograma.
Fueron determinados los tenores de criseno (CHR) y de benzo(a)pireno (BaP) por cromatogra-fía gaseosa acoplada a espectrometría de masas, de acuerdo con el método USEPA 8270 C.
Los extractos orgánicos fueron obtenidos si-guiendo el método USEPA 3540C y la preparación previa a la cromatografía siguió el método USEPA 3630C. Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado.
Cuantificaciones microbianasLas cuantificaciones de los grupos microbianos,
bacterias heterotróficas totales y hongos totales en las muestras de suelo fueron llevadas a cabo utilizando la Técnica Pour Plate. Se agregaron 10 g de suelo a 90 mL de solución salina (NaCl al 0.9 %) y se promovió la agitación en batidora (Tecnal - TE-420) por 15 minutos a 150 rpm. Alícuotas de 1 mL fueron sometidas al procedimiento de diluciones decimales sucesivas, cultivadas en medio de cultivo específico para cada grupo microbiano. Para la cuantificación de hongos se utilizó el medio agar Sabóraud (Vetec, Río de Janeiro, Brasil), con 2 % de glucosa y suplemen-tado con ampicilina 50 mg/L (Cimed, Pouso Alegre Brasil). Para la cuantificación de bacterias se utilizó el medio agar nutriente (Merck, Darmstadt, Alema-nia), suplementado con nistatina, 50 mg/L (Teuto, Anápolis, Brasil). Las placas fueron incubadas en estufa bacteriológica a 30 ± 1 ºC, por 48 horas para el crecimiento y conteo de bacterias y por 120 horas para el crecimiento y conteo de hongos. Después de ese periodo los resultados fueron expresados en unidades formadoras de colonia por gramo de suelo (UFC/g de suelo). Todas las determinaciones y ex-perimentos fueron realizados por triplicado.
BiorremediaciónLos ensayos de biodegradación fueron realizados
en reactores de polietileno con dimensiones de 20 cm × 20 cm × 10 cm (largo, ancho, alto). Cada reactor fue alimentado con 2 kg de suelo contaminado y se procuró mantener las mismas condiciones de hume-dad en todos los reactores, fracción de 70-80 % de la capacidad de retención de agua, correspondiendo a valores de humedad entre 20 a 25 %. Cada uno de los tres ensayos de biorremediación fue realizado por triplicado, totalizando nueve tratamientos.
Para el monitoreo del bioproceso fueron vigilados los siguientes parámetros: humedad, pH, concentra-ción de bacterias heterotróficas totales (BHT), hongos totales (HT), hidrocarburos totales de petróleo (HTP) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): benzo(a)pireno (BaP) y criseno (CHR). Todos los resultados analíticos son presentados como la media de tres ensayos.
Los resultados de las medias de biodegradación de HTP (en un delineamiento completamente ca-sualizado) fueron sometidos al análisis de varianza (ANOVA) y a la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey, a 5 % de significancia. En todos los casos, los análisis estadísticos fueron realizados con el auxilio del programa computacional Statistica, versión 5.5 (Statsoft Inc).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de algunos parámetros de la carac-terización física y química del suelo se presentan en el cuadro I. Se trata de un suelo con 28 % de ma-teriales finos. Considerando que las arcillas y limos presentan elevada área superficial, los fenómenos de adsorción de los contaminantes en esos materiales son bastante favorecidos, lo cual dificulta el proceso de solubilidad de esas moléculas y, por consiguiente,
CUADRO I. CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL SUELO
Parámetro Resultado
pH (en H2O) 6.9 ± 0.2Arcilla (%) 13 ± 1Limo (%) 25 ± 2Arena Fina (%) 18 ± 1Arena Media (%) 28 ± 2Arena Gruesa (%) 12 ± 1CRA (%) 32 ± 1P total (mg P/kg de suelo) 16 ± 1N total (mg N/kg de suelo) 680 ± 50HTP (mg/kg de suelo) 29179 ± 450
T.C. Ferreira do Nascimento et al.24
la biodegradación. Por otro lado, el suelo presentó un porcentaje importante de materiales arenosos, 58 %, que puede favorecer la biodegradación por una mejor transferencia de masa del oxígeno del aire atmosférico y el suelo, debido a la porosidad (Marin et al. 2005, Trindade et al. 2005). El pH próximo a la neutralidad se considera adecuado para la actividad de degrada-ción de hidrocarburos por bacterias y hongos (Franco et al. 2004). La CRA, aproximadamente del 30 %, es compatible con suelos limosos, así como también el pH levemente ácido que es coincidente con la presencia de minerales de arcillas, concordando con los resultados granulométricos.
En los cromatogramas fueron detectados com-puestos orgánicos en la fracción de gasolina (HTP GRO) 5 %, de diesel (HTP DRO) 5 %, y de lubri-cantes (HTP ORO) 90 %. La poca concentración de compuestos de cadenas menores indica, con-juntamente con la ausencia de compuestos lineares resueltos y a la elevación de la línea de base, el proceso de intemperismo de los residuos, incre-mentando la resistencia del residuo y la dificultad para el biotratamiento. El intemperismo se refiere al resultado de procesos químicos, biológicos y físicos sobre el residuo, que pueden afectar el tipo de compuestos que permanecen en el suelo. Las muestras presentaron HTP inicial de 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo y estas elevadas concentraciones del contaminante dificultan aún mas la biorreme-diación, conforme lo reportado por Del´Arco y de França (2001).
En todos los ensayos de biorremediación el pH inicial del suelo fue de aproximadamente 6.9 ± 0.1 decayendo a 6.2 ± 0.1 a lo largo de los 60 días del proceso. El metabolismo de las fracciones leves y pesadas de petróleo produce diversos tipos de ácidos orgánicos que pueden reducir el pH del suelo y este hecho da evidencias de una microbiota metabólica-mente activa (Watson et al. 2002).
Durante los ensayos, la humedad de los suelos fue mantenida entre 70 y 80 % de la capacidad de retención de agua; intervalo considerado ideal para los procesos de biodegradación de acuerdo con Ra-mírez et al. (2009). Estos valores de humedad fue-ron mantenidos ya que se encuentran en la fracción óptima que favorece el proceso de biodegradación aeróbica de hidrocarburos en suelos ya que la hu-medad en exceso puede dificultar la dispersión del oxígeno (Marin et al. 2005). Las temperaturas de los suelos no fueron controladas para reducir costos de proceso y se mantuvieron en 30 ± 2 ºC. De acuerdo con Oliver y Magot (2005), en temperaturas entre 25 ºC y 30 ºC se desarrolla una gran variedad de
especies de microorganismos capaces de oxidar hidrocarburos. Muchos ensayos de laboratorio han demostrado que la biodegradación de hidrocarburos por microorganismos ha sido llevada a cabo de ma-nera más conforme con temperaturas en el intervalo de 20 a 35 ºC (Stempwort y Biggar 2008).
Las pérdidas abióticas fueron estimadas como menores al 10 % y, en las condiciones establecidas en esta investigación, posiblemente son el resultado de la volatilización y fotooxidación, como describe la literatura consultada (Imfeld et al. 2009).
La evolución de la biodegradación de los HTP del suelo disminuyó con el aumento de los niveles de contaminación (fig. 1). En 30 días de proceso, la de-gradación en todos los bioreactores conteniendo 15.3 o 19 g/ kg alcanzó el mismo nivel, aproximadamente 55 %, indicando que había una tolerancia de los mi-croorganismos autóctonos a estos niveles de conta-minación. En este mismo período, la biodegradación de los contaminantes fue 10 % menor en cuanto se operó con el nivel de contaminación de 29 g/kg que alcanzó 45 % de remoción solamente a los 60 días de proceso. Esta menor actividad microbiana está probablemente relacionada con la susceptibilidad de algunas cepas al contaminante. En 60 días, solamente en los ensayos con suelo conteniendo 15.3 y 19.0 g/kg fueron alcanzados HTP residuales por debajo del límite de intervención estipulado por la Legislación Brasileña para suelos en áreas industriales, que es de 5 g/kg de suelo (Brasil 2009).
El análisis del perfil cromatográfico de los estratos de los suelos permite verificar que, en las tres condi-ciones estudiadas, los compuestos en la fracción de HTP GRO fueron totalmente biodegradados y que la degradación del HTP ORO fue superior a 50 %, a pesar de ser considerado resistente, indicando la adaptación de la microbiota nativa.
40
50
60
70
80
90
100
30 60Tiempo (días)
Bio
degr
adac
ión
(%)
HTP inicial 15.5 g/kg
HTP inicial 19.0 g/kgHTP inicial 29.2 g/kg
Fig. 1. Porcentaje de biodegradación de HTP, en 30 y 60 días de proceso, en los ensayos de biorremediación con HTP inicial 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo
BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 25
Trindade et al. (2005) estudiaron la biodegradación de petróleo crudo y petróleo crudo intemperizado en suelo tropical y verificaron que la facilidad con que los hidrocarburos pueden ser removidos de los suelos varía inversamente con el intemperismo del contami-nante. Del´Arco y de França (2001) trabajaron en la biorremediación con suelo arenoso contaminado con petróleo árabe liviano, en concentraciones de HTP no superiores a 14 g/kg de suelo, debido a los efectos inhibidores del contaminante. En el presente trabajo, la concentración de hidrocarburos de aproximadamente 29 g/kg de suelo tropical estudiado no fue inhibidora, revelando la importancia de la realización de estu-dios específicos para cada sistema y el potencial de la microbiota autóctona de los suelos. Dado que fue utilizado suelo de un área de landfarming para trata-miento de residuos aceitosos, la microbiota del suelo ya estaba adaptada, contribuyendo a la remoción de los hidrocarburos intemperizados.
El comportamiento de los micro-organismos revela informaciones respecto de la presencia o ausencia de las variables de la biodegradación y, además, la interpretación de los resultados es de un valor con-siderablemente importante para el entendimiento del
proceso (Pala et al. 2006). La concentración inicial de BHT y HT totales fue similar en todos los ensa-yos (Fig. 2a y 2b). En la mayoría de los ensayos las concentraciones de BHT y de HT alcanzaron valores máximos en siete días de proceso, disminuyendo a lo largo del tiempo y alcanzando las menores concen-traciones microbianas en 30 días de proceso, pero en valores comparables a los reportados en la literatura consultada para suelos impactados con petróleo y sus derivados (Oliveira y de França 2005). El análisis de las figuras 2a y 2b, conjuntamente con la figura 1, permite además concluir que el suelo impactado no tenía concentración inhibidora de macronutrientes (N y P), que son elementos importantes para la producción de biomasa y, por lo tanto, biodegradación en condi-ciones aeróbicas, provocada por la agitación del suelo en los ensayos. Se verifica además que la presencia de mayores concentraciones del contaminante provocó la reducción de la concentración de HT y de BHT a lo largo del proceso; sin embargo, el perfil de las curvas se mantuvo. En los ensayos llevados a cabo con HTP inicial de 29.2 g/kg fueron obtenidas las menores concentraciones de HT, a partir de 30 días de proceso, sin comprometer la biodegradación de los
Fig. 2. Evolución del crecimiento microbiano durante la biorremediación (a) BHT; (b) HT
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+09
BH
T (U
FC/k
g de
sue
lo)
HTP Inicial 15.3 g/kg
HTP Inicial 19.0 g/kg
HTP Inicial 29.2 g/kg
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (dias)
HT
(UFC
/kg
de s
uelo
)
T.C. Ferreira do Nascimento et al.26
contaminantes. Esto corrobora lo expresado por Pérez-Armendáriz et al. (2010) y por Tortella et al. (2005) que reportan hongos filamentosos como microorga-nismos con elevado potencial hidrocarbonoclástico, principalmente en la degradación de las fracciones más pesadas del petróleo, como aquellas predominantes en los residuos aceitosos. La reducción de las concentra-ciones de los grupos microbianos monitoreados puede también ser atribuida a la reducción o agotamiento de los nutrientes requeridos para la asimilación del carbono (Ballaminut y Matheus 2007).
En el cuadro II se encuentran los resultados de las comparaciones múltiples de las medias de biode-gradación de HTP en 30 y en 60 días de proceso. En 30 días, el ANOVA indicó que la diferencia mínima significativa para la biodegradación fue 5.34 % con un desvío estándar de 2.13. La prueba Tukey comprobó, con base en las comparaciones múltiples de las medias, para p < 0.05, que la biodegradación es diferente sólo entre los dos niveles más altos de concentración de HTP estudiados. Sin embargo, en dicho periodo de tiempo le suelo no pudo ser clasificado como tratado, con base en la legislación brasileña.
El ANOVA, realizado con los datos de biodegrada-ción en 60 días, llevó a un valor de diferencia mínima significativa para la biodegradación de 7.16 %, con un desvío estándar de 2.86 %. Complementariamente, con el conjunto de datos obtenidos con la prueba de Tukey, es posible verificar que en este periodo de tiempo las biodegradaciones porcentuales obtenidas son estadísticamente diferentes, a un nivel de signifi-cancia de 5 %. De esta manera, está confirmando que la concentración inicial del contaminante influenció a la biodegradación de los hidrocarburos, tanto a los 30 como a los 60 días de proceso. Nuestros resultados corroboran aquellos reportados por Del’Arco y de França (2001) e indican la importancia del control de la concentración inicial de HTP para el éxito del
tratamiento. Se verifica además, que la biodegrada-ción es inversamente proporcional a la concentra-ción inicial del contaminante, probablemente por la inhibición del metabolismo celular y formación de intermediarios tóxicos (Alexander 1999, Del’Arco y de França 2001).
La biorremediación también fue analizada con relación a la biodegradación de los HAP CHR y BaP (Cuadro III). El análisis del cuadro permite veri-ficar que el aumento de la concentración inicial de hidrocarburos en el suelo influyó negativamente en la biodegradación del CHR, no siendo observado efecto en la degradación del BaP. Los HAP son compuestos tóxicos y moléculas de interés ambiental en suelos impactados (Jaques et al. 2007). Su biodegradación depende de muchos factores como biodisponibilidad, muy influenciada por la matriz del suelo y el intempe-rismo del contaminante. El CHR posee cuatro anillos aromáticos en cuanto que el BaP posee cinco anillos condensados y, por lo tanto, mayor peso molecular. Varios estudios comprueban que los HAP de alto peso molecular son menos biodegradables cuando son comparados con los de menor masa molecular (Alexander 1999, Vasconcelos et al. 2011). Otro hecho que se debe considerar es el intemperismo del suelo que aumenta la adsorción de contaminantes orgánicos hidrofóbicos, como los HAP en la matriz sólida, diminuyendo la velocidad y la extensión de la biodegradación. Como consecuencia, después de un período inicial de tratamiento, la concentración de algunos HAP puede tender a estabilizarse en un valor residual, como lo observado para el caso del BaP. Una de las hipótesis mas aceptadas propone que los fenómenos de transferencia de contaminantes cons-tituyen la etapa limitante del bioproceso (Nocentini et al. 2000). En tales situaciones, la concentración residual del contaminante depende mayormente de las partículas finas de los suelos y del intemperismo del contaminante.
CUADRO III. BIODEGRADACIÓN DEL CRISENO Y DEL BENZO(A)PIRENO EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE HTP EN EL SUELO
HTP inicial(g/kg de suelo)
Biodegradación (%)
CHR BaP
15.3 66 ± 5 (6.9) 37 ± 4 (3.5)19.0 53 ± 4 (7.3) 29 ± 2 (4.5)29.2 19 ± 2 (7.8) 35 ± 3 (8.1)
Nota: Los números presentados entre paréntesis son de la concentración inicial media del HAP, en mg/kg
CUADRO II. PRUEBA DE TUKEY, DIFERENCIAS SIGNI-FICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS REALIZADOS
HTP inicial(g/kg de suelo)
MSB*
30 días 60 días
15.3 54.93 a** 83.83 c**19.0 55.03 a** 71.97 d**29.2 45.07 b** 55.28 e**
Nota: *MSB – media significativa de la biodegradación (p < 0.05)** Letras minúsculas distintas, en cada columna, indican medias significativamente diferentes
BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 27
CONCLUSIÓN
Los resultados de biodegradación de HTP en-contrados son alentadores y revelan el éxito del biotratamiento propuesto para tratamiento de los suelos impactados con altas concentraciones de residuos aceitosos intemperizados. El aumento de la concentración inicial de hidrocarburos tota-les influyó negativamente. Al final de 60 días de bioproceso, los suelos con las dos concentraciones menores ensayadas de HTP inicial fueron consi-derados tratados, de acuerdo con la Legislación Brasileña (HTP < 5 g/kg). La concentración inicial de HTP también influyó negativamente en la bio-degradación del CHR, no siendo observado efecto en la degradación del BaP, probablemente debido a la biodegradación preferencial de los HAP de menor peso molecular, sumado al intemperismo del suelo estudiado, contribuyendo la adsorción de este compuesto en las partículas finas del suelo, dificultando la biodegradación.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y a PETROBRAS por el apoyo financiero.
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POTENTIAL OF GLYCEROL AND SOYBEAN OIL FOR BIOREMEDIATION OF WEATHERED OILY-SLUDGE CONTAMINATED SOIL
a Nascimento, T. C. F.;
b Oliveira, F. J. S.;
a França, F. P.1
a Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, Brazil
b Petróleo Brasileiro S.A., Rio de Janeiro, Brazil
ABSTRACT The bioremediation of petroleum-contaminated soil was investigated on laboratory scale. This work evaluated the effect of co-substrate addition in tropical climate soil highly contaminated with oily residue. Glycerol and soybean oil were used as auxiliary co-substrates for contaminant degradation. Three different concentrations of co-substrate were tested, and the experiments were carried out over 60 days. The following parameters were monitored: humidity, pH, total heterotrophic bacteria, total fungi, total petroleum hydrocarbons (TPH), and the concentrations of benzo[a]pyrene and chrysene. The soil supplementation with renewable co-substrates improved the efficiency of the biodegradation TPH, with removals of 85% and 83% for glycerol and soybean oil, respectively, compared to a 55% removal yielded by the biodegradation process without supplementation. The use of glycerol increased Chrysene and Benzo[a]pyrene biodegradation by 50%, while soybean oil supplementation increased their removal by 36%.
KEYWORDS bioremediation; biodegradation; oily waste; glycerol; soybean oil
1 To whom all correspondence should be addressed.
Address: Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira Ramos, 149, Bloco E, Sl E-201 - Ilha do Fundão Rio de Janeiro- Brazil - CEP 21941-909 Telephone / Fax: +55 21 2562-7621 / +55 21 2562-7567 | E-mail: fpfranca@eq.ufrj.br doi:10.5419/bjpg2012-0004
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1. INTRODUCTION
One of the greatest unsolved issues in the oil and natural gas industry is the adequate disposal of oil residues, such as tank slops and sludge, generated in refinery thermal units. The costs related to sustainable and efficient treatment and disposal procedures for these residues are of great concern to both industrial and academic sectors. Society is concerned about these issues because all people are ultimately affected by hazardous events like oil spills that can happen on or offshore.
The biodegradation of oily waste into a contaminated soil is a recently developed treatment route. The objective of this treatment is to use the potential of natural soil microbiota to degrade the organic compounds in oily waste, decreasing its toxicity whenever adequate physical and chemical conditions for biodegradation are present (Huang et al., 2004). Biotechnological treatments not only are energy highly efficient but also cost less than conventional treatments. These treatments offer a large range of applications in terms of types and concentrations of contaminants (Oliveira and de França, 2005). While bioremediation is known for its low cost and its efficiency, it can be influenced by several factors, such as microbiota, climate, the weathering of contaminants, and the concentrations of organic compounds (Das et al., 2008; Marin et al., 2005). Soil structure is another important factor that influences bioremediation, as the solid matrix affects the availability of contaminants for the microbiota. For instance, the bioremediation of weathered soil with high concentrations of clay and silt can be difficult due to the decreased availabilities of the pollutants (Chaîneau et al., 2003; Gong et al., 2008). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are toxic compounds that have become an environmental issue due to their high concentration in oily residues, being carcinogenic, and accumulating biologically (Haritash and Kauship, 2009). Additionally, the chemical structure of the 16 priority PAH listed by the United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA) pollutant list may favor the sorption in soil particles, decreasing removal of the pollutants (Trindade et al., 2005).
A method to enhance biodegradation of hydrocarbons in natural soils may be the utilization of co-substrates, which can either play the role of
alternate carbon source or act as mass transfer agent between the liquid phase of the soil and the solid matrix (Huang et al., 2004; Mellendorf et al., 2010). Commercial glycerol (GLY) and soybean oil (SBO) are renewable and low cost co-substrates, used to enhance process efficiency without increasing significantly bioremediation costs. This work investigates the potentials of GLY and SBO as auxiliary co-substrates in the bioremediation of a tropical soil with highly concentrated with weathered oily waste contamination.
2. MATERIAL AND METHODS
Soil originated from a landfarming area was collected from the Brazilian oil and gas industry located in the north of the country. All the samples were taken at a depth of 15cm from the surface.
2.1 Physical analysis
Soil size distribution analysis was performed using conventional screen procedures for the separation of stones and sand. Screening was followed by sedimentation of fine materials in sodium ortho-phosphate solution. Soil water content was determined using porcelain crucibles and an infrared humidity analyzer. Soil pH values were measured in 1:1 (w/w) distilled water suspensions. The water holding capacity (WHC) of the soil samples were determined by weight analysis (Watwood et al., 1991).
2.2 Chemical analysis
To determine Total Petroleum Hydrocarbon (TPH), the soil samples were supplemented with deuterated tricontane. Samples were submitted to 16 EPA priority determinations, and deuterated PAH compounds were used as standards. The samples were subjected to Soxhlet extractions with ultra pure methylene chloride for 16h according to EPA Method 3540C (EPA, 1996). The extracted phase was submitted to a cleanup procedure in a silica gel chromatographic column according to EPA Method 3630 (EPA, 1996). The sample volume was reduced to 1mL under N2. TPH was measured following EPA Method 8015 (EPA, 1996) using a Thermo Finnigan Focus gas chromatograph equipped with a DB-5 capillary column and a flame ionization detector. PAH, on the other hand, were quantified using EPA Method 8270 (EPA, 1996)
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with a Thermo Finnigan Focus gas chromatograph equipped with DB-5-MS column and a DSQ 2 Thermo Finnigan mass spectrometer operating at selective ion mode (less than 3 cycles/s).
Total nitrogen and total phosphorus were measured by conventional methods using a UV-Vis spectrophotometer according to methods described previously (Embrapa, 1997).
2.3 Microbiological count
Quantification of the microbiological groups present in the soil samples, both Total Heterotrophic Bacteria (THB) and Total Fungi (TF), was conducted using the pour plate Technique. A 0.9% (m/v) NaCl solution (90mL) was transferred to Erlenmeyer flasks containing 10g of soil samples, which were shaken for 15 min at 150 RPM. Samples (1mL) were submitted to a successive dilution procedure and cultivated in a culture medium specific to each microbial group. Agar Sabouraud with glucose 2% (m/v) was used for TF while the Agar Nutrient Medium was used for THB. The plates were placed in a bacterial incubator at 30±1oC for 48h for bacterial cell growth and counting and for 120h for fungi cell growth and counting. The results were expressed as colony-forming units per gram of dry soil (CFU/g dry soil). All microbiological counts and experiments were carried out in triplicate.
2.4 Bioremediation tests
Biodegradation experiments were conducted in polyethylene reactors 20cm long, 20cm wide and 10cm high. Contaminated soil (2kg) was added to each reactor, and the soil humidity was adjusted to
20-25%, which corresponds to 70-80% of the soil water holding capacity (Watwood et al., 1991).
THB, TF, TPH, PAH, pH, and moisture were monitored throughout the process. The potential of two co-substrates - GLY and SBO - in the biodegradation of TPH was tested. Commercial soybean oil was used. Each co-substrate soil was supplemented with 375, 750, and 1500mg of co-substrate per kg of soil. To guarantee oxygen supply, the soil was aerated manually every 72h using a glass stirring rod. Soil sampling for experimental analysis was carried out by collecting 10g of the soil from three equidistant locations. This was performed to mix and to homogenize the soil samples to get a unique final sample. To determine abiotic losses, control tests were carried out using a silver nitrate solution 10% (m/v) biocide instead of water in moisture control. All tests were conducted in triplicate, and the results were presented as the mean of the three independent experiments. Blank tests were executed without co-substrate supplementation using same procedure for water addition and aeration.
3. RESULTS AND DISCUSSION
Some parameters related to the physical and chemical characterization of the soil are presented in Table 1. The contaminated soil contained 38% fine materials (clay and silt). Although clay and silt have high surface areas, the sorption phenomenon of contaminants on these materials was favored, making it harder for contaminants less bioavaliable. Hydrocarbon degradation by bacteria and fungi were favored at pH values close to
Table 1. Physical and chemical characterization of soil.
Parameters Results
pH (in distilled water) 6.9 ± 0.2 Clay (%) 13 ± 1 Silt (%) 25 ± 2 Fine Sand (%) 18 ± 1 Medium Sand (%) 28 ± 2 Coarse Sand (%) 12 ± 1 Water Holding Capacity (WHC) (%) 32 ± 1 Total P (mg P/kg) 16 ± 1 Total N (mg N/kg) 680 ± 50 TPH (mg/kg) 29,179 ± 450
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neutral (Franco et al., 2004). A WHC of approximately 30% was consistent with weathered soils. A slightly acidic pH is characteristic of clay minerals, which was in agreement with the granulometric distribution observed.
The chromatogram of the soil organic extract (Figure 1) presented an Unsolved Complex Mixture (UCM) or organics, and neither pristane nor phytane were detected. The following organic compounds were present in the UCM: gasoline (TPH GRO), 4%; kerosene (TPH-KRO), 1%; diesel (TPH DRO), 5%; and lubricants (TPH ORO), 90% (w/w). The absence of pristane and phytane, the concentrations of TPH GRO and TPH DRO, and the elevated base line suggested that the weathering process was taking place in the petroleum waste, increasing the difficulty of biotreatment. In fact, the hazardousness of the residue is a result of chemical, physical, and biological processes occurring within the residue that may affect the types of compounds that remain in the soil. In addition, a high concentration of TPH was observed, which also makes bioremediation difficult (Del’Arco and de França, 2001). Among the 16 U.S. EPA priority PAHs, the soil contained chrysene (CHR) and benzo[a]pyrene (BaP) as predominant compounds, with concentrations of 21,640 and 41,048 µg/kg, respectively. Other PAHs were detected at concentrations very close to the sample quantification limit 1,083 µg/kg for each PAH.
All of the bioremediation assays began with a pH 6.9±0.1, decreasing slightly through the test period (60 days), reaching values of 6.5 for the tests without co-substrates and 6.0 for the tests with co-substrates. The decrease in pH may be explained by the fact that when the microbiota present in the soil are active, the metabolic breakdown of the light and heavy fractions of petroleum produces several types of organic acids which, in turn, reduce pH (Watson et al., 2002). It is also important to report that soil phyllosilicates, iron, and aluminium oxyhridroxides may provide some buffering capacity, contributing to the slight pH decrease.
During the tests, the soil moisture was kept between 70 to 80% of the WHC, which is considered ideal for biodegradation processes (Ramírez et al., 2009). Another reason to maintain the soil moisture in that range is that a greater percentage of water would decrease oxygen dispersion in the soil, demanding greater effort to accomplish the aerobic biodegradation of hydrocarbons (Marin et al., 2005). The aqueous phase in soil enhances the microbial solid/liquid interface, facilitates contaminant transport to the microbial cells, and permits the diffusion of microbial excreta. In addition, water competes for the same binding sites as PAH in the solid phase of soil, resulting in an increase in the degree of desorption of these organics.
Figure 1. TPH chromatogram of contaminated soil before bioremediation.
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To reduce process costs, soil temperatures were not controlled. During the 60-day experiment, soil temperatures remained at 30±2oC. Temperatures between 25 and 30°C are suitable for the growth of a great variety of species of microorganisms capable of oxidizing hydrocarbons (Olivier and Magot, 2005). Also, laboratory experiments indicate that hydrocarbons degradation by microorganisms is best conducted at temperatures between 20 and 35°C.
Abiotic losses were less than 10%. Abiotic losses are attributed to volatilization and photo-oxidation (Imfeld et al., 2009). Regardless of the co-substrate used, there was a decrease in soil TPH concentration during the 60-day process (Figure 2). Both GLY and SBO supplements, at concentrations
of 375 and 750mg of co-substrate per kg of soil, produced good results, provided that TPH were lower than 5 g/kg of soil, which is the limit for intervention for fine soils in industrial areas according to an international quality standard (Netherlands Government Gazette, 1994). When the soil was supplemented with 1500 mg of co-substrate per kg of soil, biodegradation was slightly reduced, most likely because soil microorganisms biodegraded the co-substrate to the exclusion of the contaminants (Silva et al., 2010). U.S. EPA Method 8015 reports the concentrations of extractable hydrocarbons, sometimes referred to as gasoline, kerosene, diesel, and oil range organics; or TPH GRO, TPH KRO, TPH DRO and TPH ORO, respectively, because the boiling point ranges of the hydrocarbons in each roughly correspond to
Figure 2. Bioremediation tests with glycerol and vegetable oil supplementation at 60 days.
50
60
70
80
90
Blank 375 750 1500
Bio
deg
rad
atio
n (%
)
Co-substrate concentration (mg/kg)
Glycerol
Soybean oil
Table 2. Biodegradation of Chrysene and Benzo[a]pyrene.
Co-substrate Biodegradation (%)
Type Concentration (mg of co-substrate/kg of soil)
CHR BaP
GLY
375 38 ± 2 30 ± 1
750 55 ± 2 53 ± 2
1500 19 ± 1 35 ± 2
SBO
375 38 ± 2 31 ± 2
750 41 ± 2 36 ± 3
1500 22 ± 2 17 ± 2
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those of gasoline (C6 to C10-12), kerosene (C11 to C14), diesel fuel (C8-12 to C24-26), and oil (C20 to C28-C30), respectively. The chromatographic profiles (Figure 3) from the soil organic extracts from soils that had been supplemented with co-substrates confirm that TPH GRO and TPH KRO were strongly biodegraded. TPH ORO was degraded to a great extent despite its recalcitrant nature, clearly indicating native microbiota adaptation.
In contrast to results reported by Del’Arco and de França (2001), who worked with sandy soil contaminated with Light Arab oil, with TPH concentrations not greater than 14g/kg of soil, due to inhibitory effects, the initial hydrocarbon concentration of approximately 29g/kg of tropical soil did not exhibit bioprocess inhibition, illustrating the need to investigate each system and the potential of its soil microbiota individually. This work used landfarming soil for the treatment of oily wastes; therefore, the native microbiota was already adapted, contributing to the removal of hydrocarbons.
Regarding CHR and BaP biodegradation, both SBO and GLY enhanced PAH biodegradation (Table 2). PAHs are very toxic compounds, being of great interest in contaminated sites. CHR has four aromatic rings while BaP has five condensed rings. These compounds are classified as PAHs of high molecular weight (Daugulis and McCracken, 2003), having low vapor pressures and tending to remain adsorbed on the soil fine material, inhibiting biodegradation. High molecular weight PAHs are less biodegradable than those having low molecular weights (Alexander, 1999; Atagana et al., 2006; Vasconcelos et al., 2011), which is related to the bioavailability of the compounds.
The use of co-substrates increased CHR and BAP removal, with a co-substrate concentration of 750 mg/kg resulting in the greatest removal of the two PAHs for both types of co-substrates. Another issue to be taken into account is the soil intemperism (with a soil fine particle content of 38% clay and silt), which increases the sorption of hydrophobic organic contaminants such as PAH in the solid matrix, decreasing the rate and extension of biodegradation. In intemperised soils, the transfer of pollutants is the step that limits the bioprocess (Nocentini et al., 2000). Glycerol is a water soluble carbon source that is more available as a nutrient to different types of microorganisms. Because GLY is able to enhance biosurfactant production, it can have a favored bioremediation process (Calvo et al., 2009; Silva et al., 2010). Soybean oil may have helped in the mass transfer of contaminants from the solid matrix to the microbiota present in the soil (Yapa et al., 2010). Hence, the effects of both co-substrates on soil biotreatment are clear.
The behavior of microorganisms is related profoundly to the biodegradation parameters, and the test results reveal a great deal about the process. The tests supplemented with 750mg of co-substrate per kg of soil are presented in Figures 4a and 4b. The initial concentrations of THB and TF were the same in all the tests, and the curve profiles were similar. THB and TF concentrations reached their maximum values after 7 days and then started to decrease, with THB concentrations reaching their minimum values after 60 days and TF concentrations reaching minimum values after 45 days for both co-substrates. These values are compatible with values reported in the literature for soils contaminated with petroleum and other refinery products (Oliveira and de França, 2005).
Figure 3. TPH chromatogram during bioremediation tests with glycerol and vegetable oil supplementation at 60 days.
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Figures 4a and 4b reveal that: 1) microbial concentrations increased during 7 days of the process, so the contaminated soil initially had non-inhibitory concentrations of macronutrients (N and P), which are important elements for biomass production; 2) co-substrate supplementation favored bacteria growth but only influenced fungal metabolism slightly, which exhibited similar profiles with or without supplementation with either co-substrate. This result is corroborated with findings reported in the literature (Atagana et al., 2006; Pérez-Armendáriz et al., 2010, Tortella et al., 2005), in which filamentous fungi were identified as microorganisms with great capabilities of degrading hydrocarbons, especially the heavy fractions of petroleum such as those found in oily sludge.
4. CONCLUSIONS
GLY and SBO were used as co-substrates in the biodegradation of oily waste in contaminated soil. At a concentration of 750mg of co-substrate per kg of soil, each co-substrate attained optimal TPH and PAH removals in terms of CHR and BaP removal from an intemperized soil. Sorption of organic hydrophobic contaminants to the solid matrix is favored in this type of soil, decreasing the rate and extension of biodegradation. The supplementation of co-substrates is of great importance because it can favor contaminant mass transfer from the solid matrix to microorganisms. The use of the co-substrates also increased THB and TF, enhancing soil biotreatment. As GLY is an abundant by-product of biodiesel production, its utilization as a
Figure 4. Microbial growth during bioremediation - (a) Total Heterotrophic Bacteria (THB) and (b) Total Fungi (TF).
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co-substrate in contaminated soil bioremediation constitutes an important product destination. Finally, the potentials of GLY and SBO for biotreatment of soil were verified experimentally.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors wish to thank CNPq and CAPES for their financial support.
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