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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN
SETOR DE CINCIAS AGRRIAS
CINTICA DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM CES IMUNIZADOS COM
Leptospira interrogans SOROVARES icterohaemorrhagiae , canicola, pomona
E grippotyphosa
CURITIBA
2005
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DEISE CRISTIANE FERRONATO DE SOUZA JASZCZERSKI
CINTICA DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM CES IMUNIZADOS COM
Leptospira interrogans SOROVARES icterohaemorrhagiae , canicola, pomona
E grippotyphosa
Dissertao apresentada como requisito parcial obteno do grau de Mestre. Curso de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, rea deConcentrao: Patologia, Setor de CinciasAgrrias, Universidade Federal do Paran.
Orientador:Prof. Dr. Jos Francisco Ghignatti Warth
CURITIBA
2005
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AOS MEUS PAIS
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AGRADECIMENTOS
Ao meu marido MARCO AURLIO e aos meus filhos EMANUELLE e MARCUSVINCIUS que conseguiram driblar o tempo e a organizao do lar sem a presenada mame.
Aos professores FOGAA e ROMILDO que confiaram em mim.
Ao professor ALEX que conhece os obstculos da pesquisa cientfica e quenobremente cedeu os ces para este experimento.
Ao MARCOS VINCIUS que abriu mo do seu sbado e do seu conhecimento emgrficos para enriquecer este trabalho.
minha irm DANIELLE que me ajudou com os ces e no transporte dedocumentos e filhos.
Ao meu sogro JOO CARLOS que me deu orientaes.
s mdicas veterinrias NANCY e KARINE e estagiria MARIAN que no mediramesforos para assistir to bem os ces.
s bibliotecrias SIMONE e VERA que se esforam, e muito, contribuindo com asinformaes necessrias para que este e muitos outros trabalhos cientficos possamser concludos.
mdica veterinria MARIA LUZA, do Centro de Diagnstico Marcos Enrietti-SEAB-PR, que contribuiu com a bibliografia.
MARIA JOS, da Ps-Graduao do Departamento de Medicina Veterinria queme atendeu prestativamente em relao aos prazos e documentaes exigidos.
Aos meus chefes TCel MELO e Maj STONOGA que me permitiram o tempo-livre.
E principalmente a ELE:Que me encheu de gs, quando eu s pedi mais um pouquinho de fora;
Que s ps gente amiga no meu caminho;Que me deu a luz necessria para enxergar alm;Que me permitiu chegar ao fim;Que a minha razo para continuar.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador, Prof. Dr. JOS FRANCISCO, por ter me aceito; pelo constanteotimismo e bom-humor; por ser to incansvel; por no medir esforos; por envolvera prpria famlia, abrindo mo do tempo e da privacidade; por nunca ter dito no;pela vontade de descobrir e questionar; pelo envolvimento e disposio; pela
honestidade; e finalmente, por sempre dizer: Fica tranqila, vai dar tudo certo!
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SUMRIO
LISTADETABELAS ................................................................................................. vi
LISTADEFIGURAS................................................................................................. vii
RESUMO....................................................................................................................xi
ABSTRACT............................................................................................................... xii
1 INTRODUO .......................................................................................................1
2 REVISO DE LITERATURA ..................................................................................4
2.1 HISTRICO DA LEPTOSPIROSE.......................................................................4
2.2 ETIOLOGIA E CLASSIFICAO.........................................................................5
2.2.1 As Espiroquetas ...............................................................................................52.2.2 Leptospira interrogans......................................................................................5
2.3 EPIDEMIOLOGIA.................................................................................................7
2.4 PATOGNESE ..................................................................................................11
2.5 SINAIS CLNICOS .............................................................................................15
2.6 DIAGNSTICO IMUNOLGICO DA LEPTOSPIROSE.....................................17
2.7 DIAGNSTICO DIFERENCIAL .........................................................................23
2.8 VACINAS ...........................................................................................................233 MATERIAL E MTODOS.....................................................................................28
3.1 ANIMAIS DO EXPERIMENTO...........................................................................28
3.2 IMUNGENO UTILIZADO.................................................................................28
3.3 VACINAES ...................................................................................................28
3.4 COLHEITA DE SANGUE E OBTENO DE SOROS.......................................29
3.5 BASE FSICA LABORATORIAL ........................................................................29
3.6
TCNICA SOROLGICA EMPREGADA ..........................................................29
4 RESULTADOS .....................................................................................................31
4.1 TTULOS PR-VACINAIS..................................................................................31
4.2 TTULOS PS-VACINAIS AOS 30 DIAS...........................................................33
4.3 TTULOS PS-VACINAIS AOS 60 DIAS...........................................................36
4.4 TTULOS PS-VACINAIS AOS 90 DIAS...........................................................39
4.5 TTULOS PS-VACINAIS AOS 120 DIAS.........................................................42
4.6 TTULOS PS-VACINAIS AOS 150 DIAS.........................................................45
4.7 TTULOS PS-VACINAIS AOS 180 DIAS.........................................................47
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4.8 TTULOS PS-VACINAIS AOS 210 DIAS.........................................................50
5 DISCUSSO ........................................................................................................56
6 CONCLUSES ....................................................................................................64
REFERNCIAS.........................................................................................................65
ANEXOS ...................................................................................................................71
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 TTULOS SOROLGICOS, PR-VACINAIS PARA L. interrogans,
SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenhageni, pomona
e grippotyphosa, DOS 16 CES, NO DIA CONSIDERADO 0 (zero) ...31
TABELA 2 -TTULOS SOROLGICOS AOS 30 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona egrippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......33
TABELA 3 TTULOS SOROLGICOS AOS 60 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona e grippotyphosa,DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......37
TABELA 4 TTULOS SOROLGICOS AOS 90 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......40
TABELA 5 TTULOS SOROLGICOS AOS 120 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......43
TABELA 6 TTULOS SOROLGICOS AOS 150 DIAS PS-VACINAIS PARA L.interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......45
TABELA 7 TTULOS SOROLGICOS AOS 180 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-
geni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......48
TABELA 8 TTULOS SOROLGICOS AOS 210 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae,canicola, copenha-geni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS.......50
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - TTULOS SOROLGICOS PR-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni..................................................32
FIGURA 2 - TTULOS SOROLGICOS PR-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVARES icterohaemorrhagiae, canicola, pomona E
grippotyphosa.......................................................................................32
FIGURA 3 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni aos 30 DIAS...........................34
FIGURA 4 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 30 DIAS ...................................34
FIGURA 5 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR grippotyphosaAOS 30 DIAS..........................35
FIGURA 6 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 30 DIAS ...................................35
FIGURA 7 - TTULOS SOROLGICOS PR E PS-VACINAIS PARA
Leptospira interrogansSOROVAR icterohaemorrhagiae DURANTE
OS 210 DIAS DE EXPERIMENTO.......................................................36FIGURA 8 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVARcopenhageni AOS 60 DIAS...........................37
FIGURA 9 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 60 DIAS ...................................38
FIGURA 10 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans sorovar grippotyphosaaos 60, 90, 120, 150, 180 E 210
DIAS.....................................................................................................38FIGURA 11 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 60 DIAS ...................................39
FIGURA 12 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni AOS 90 DIAS.........................40
FIGURA 13 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 90 DIAS ...................................41
FIGURA 14 -
TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospirainterrogans SOROVAR pomonaAOS 90 DIAS ...................................41
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FIGURA 15 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni AOS 120 DIAS.......................43
FIGURA 16 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 120 DIAS .................................44
FIGURA 17 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 120 DIAS..................................44
FIGURA 18 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni AOS 150 DIAS.......................46
FIGURA 19 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 150 DIAS .................................46
FIGURA 20 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 150 DIAS..................................47
FIGURA 21 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni AOS 180 DIAS.......................48
FIGURA 22 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 180 DIAS .................................49
FIGURA 23 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 180 DIAS..................................49FIGURA 24 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni AOS 210 DIAS.......................51
FIGURA 25 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 210 DIAS .................................51
FIGURA 26 -TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 210 DIAS..................................52
FIGURA 27 -
GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTESDOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 01.......................................................53
FIGURA 28 -GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTES
DOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 03.......................................................53
FIGURA 29 -GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTES
DOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 05.......................................................54
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FIGURA 30 -GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTES
DOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 07.......................................................54
FIGURA 31 -GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTES
DOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 09.......................................................55
FIGURA 32 -GRFICO COMPARATIVO ENTRE OS TTULOS AGLUTINANTES
DOS TRS PRINCIPAIS SOROVARES DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO ANIMAL 11.......................................................55
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LISTA DAS ABREVIATURAS
ALT Alanina Aminotransferase
AST Fosfatase Alcalina
BUN Nitrognio Sangneo Proveniente da Uria
C Clulas Completas
CP Cilindros Protoplasmticos
DNA cido Desoxirribonucleico
ELISA Ensaio Imunoenzimatico (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
IFD Prova de Imunofluorescncia Direta
Ig Imunoglobulinas Tipo A, G e M (IgA, IgGe IgM)
IOC Instituto Osvaldo Cruz
LDH Desidrogenase Ltica
M Mol
MAT Teste Microscpico de Aglutinao
ME Membrana Externa
NaCl Cloreto de Sdio
OMC Outer Membrane ComplexPCR Reao em Cadeia Polimerase
RPM Rotaes Por Minuto
SAM Teste de Soroaglutinao Microscpica
UFPR Universidade Federal do Paran
WHO World Health Organization
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RESUMO
Com o objetivo de verificar as respostas imunes humorais para Leptospira
interrogans, 16 ces da raa Beagle foram vacinados com bacterina inativada
comercial contendo como antgenos os sorovares icterohaemorrhagiae, canicola,
pomona e grippotyphosa.As imunizaes, em nmero de duas, foram realizadas no
dia considerado zero e no 90 dia. As sete colheitas de amostras sangneas foram
efetuadas a partir do dia da primo-vacinao com intervalos de 30 dias entre elas,
sendo submetidas a tcnica de Soroaglutinao Microscpica sob microscopia de
Campo Escuro. Verificou-se aos 30 dias ps-vacinais, um aumento, do tipo booster,
nos ttulos direcionados para o sorovar copenhageni, quando comparados com os
pr-vacinais, demonstrando a ntima relao antignica deste, com o sorovar
icterohaemorrhagiae,j relatada anteriormente. Os ttulos aglutinantes ps-vacinais
direcionados para os demais sorovares, mantiveram-se entre 1/25 e 1/100, no
sendo detectados nesta ltima titulao, aps o 90 dia. Neste estudo demonstrou-
se, diante da literatura pesquisada, a carncia de parmetros cientficos que
avaliem a eficincia vacinal das bacterinas anti-leptospira, assim como, informaes
a respeito da titulao ideal que seja protetora frente a infeces naturais. Apresente pesquisa alerta para os riscos infeco a que esto submetidos os ces,
mesmo vacinados, devido a efemeridade dos ttulos ps-vacinais alcanados,
devendo ser efetuadas imunizaes com intervalos mais curtos entre elas, com o
emprego de vacinas direcionadas unicamente para sorovares de Leptospira e no
includas em vacinas anti-virais polivalentes, como as atualmente utilizadas .
PALAVRAS-CHAVE: vacinao, ces, bacterinas, microaglutinao, Leptospira
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ABSTRACT
Sixteen beagles dogs had been vaccinated against Leptospira (commercial
bacterin with icterohaemorrhagiae, canicola, pomona and grippotyphosa serovars)
the objective was verify the humoral immune response of these animals. Two
vaccinations had been carried, one in the 0 day and another after 90 days. Seven
blood samples had been collected after the first vaccination with a period of thirty
days between them. All samples were submited to serological microscopic
agglutination test in dark camp. After 30 days to vaccination it verified an increase
(booster type) in titters to copenhageniserovar. It demonstrates the close antigenic
relation between this serovar with the serovar icterohaemorrhagiae, according to
literature description. The titters after vaccination to anothers serovars maintain
between 1/25 e 1/100 and do not be detected in the last samples collected. In this
study it was demonstrated the absence of scientific parameters to evaluate the
vaccinal efficiency of bacterins against leptospirosis and informations about the titters
to be effective in a natural infection. This research shows infection risks that the dogs
are submitted, when they are vaccinated, because had the short duration of the after
vaccination titters. Thus, it is suggested to reduce the time between the vaccinationsand use vaccine with Leptospiraserovars do not together in multi antiviral vaccines.
Key words: vaccination, dogs, bacterin, microscopic agglutination, Leptospira
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1 INTRODUO
A Leptospirose uma enfermidade cosmopolita grave que acomete
diferentes espcies de animais domsticos, silvestres e o homem. Sua ocorrncia
pode levar a elevados prejuzos econmicos na indstria pecuria e refletir
significativamente na sade pblica (RUSSELL; RUSSELL, 1994; LANGONI et al.,
2002).
Dados da Organizao Mundial de Sade (WHO, 2003) no precisam o
nmero exato de casos no mundo, mas a sua prevalncia estimada em 0.1-1 caso
para cada 100.000 pessoas ao ano nas demais regies do globo, aumentando para
10-100 casos para cada 100.000 pessoas ao ano nas regies de clima tropical
mido.
No Brasil, esta zoonose endmica. De acordo com a Fundao Nacional
de Sade do Brasil (FUNASA, 2001), considerada como uma doena sob
influncia scio-econmica, por possuir relaes estreitas com a falta de
saneamento que ocorre em propores aceleradas nas reas urbanas e rurais,
como o crescimento descontrolado de favelas e a carncia de uma poltica
educacional e de infra-estrutura.Somente as melhorias nas condies de habitao e saneamento, suprindo
a deficincia de urbanizao e drenagem, paralelamente com investimento em
educao e sade, podero minimizar a sua incidncia em populaes humanas
(LANGONI et al., 2002). Seu controle depender obrigatoriamente das aes
envolvendo o governo, os laboratrios e indstrias farmacuticas e o
comprometimento social.
Segundo dados doCentro de Informao em Sade para Viajantes (CIVES,2005),entre 1985 e 1997, foram notificados no Brasil 35.403 casos de leptospirose,
com 3.821 bitos (letalidade mdia de 12,5%). Apenas os casos mais graves
(ictricos) so, geralmente, diagnosticados e, eventualmente notificados, o que
representa apenas uma pequena parcela (provavelmente cerca de 10%) do nmero
real de casos no Brasil (FUNASA, 2001) (ANEXO 10).
A Secretaria de Sade do Paran rene dados que apresentam uma taxa de
letalidade que atinge 17% verificando-se um aumento progressivo desde 1997(SESA, 2004).
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Segundo MASUDA et al. (2003), o nmero de casos entre ces vem
aumentando gradativamente, particularmente na regio metropolitana de Curitiba-Pr,
onde observaram tambm alterao na dinmica da ocorrncia dos sorovares mais
freqentes, o que concluram ser uma conseqncia do crescimento populacional,
bem como, do resultado de uma seleo vacinal. Atravs de inqurito sorolgico
levantaram que 30,27% da populao canina teve contato prvio com o agente
infeccioso.
A epidemiologia e a incidncia desta zoonose urbana favorecida pelas
condies reinantes nas grandes cidades onde so encontradas grandes
populaes caninas e de roedores, bem como, bolses periurbanos de pobreza,
favorecendo a disseminao e a manuteno do agente infeccioso de maneirapermanente.
O rato de esgoto (Rattus novergicus) o principal responsvel pela infeco
humana, em razo de coexistir, em grande nmero, na proximidade de seres
humanos. A Leptospira interrogans multiplica-se nos rins destes animais sem
causar danos, sendo eliminada pela urina, s vezes por toda a vida do animal, o que
torna estes roedores o seu principal propagador. O homem infectado casual e
transitoriamente, no tendo importncia como transmissor da doena de umapessoa para outra (VASCONCELLOS et al., 1997; CIVES, 2005).
O controle da leptospirose urbana s poder ter sucesso atravs de um
programa de sade pblica adequado que vise prticas de higiene, eliminao de
roedores e isolamento de animais infectados, com conseqente tratamento
quimioterpico, aliado ao uso de vacinas na populao canina como medida
profiltica (RUSSELL, RUSSELL, 1994).
A vacinao contra a leptospirose em animais uma prtica comum e ummtodo eficaz de controle, geralmente adotado por proprietrios que possuem
condies econmicas razoveis. Muitas vacinas esto disponveis comercialmente,
mas existem evidncias conflitantes em se tratando da eficcia das mesmas
(BLOOD, RADOSTITS, 2002). Pesquisas sobre o tempo de manuteno desta
imunidade ps-vacinal, que realmente seja capaz de neutralizar uma possvel
infeco, no so encontradas na literatura cientfica especializada.
A grande quantidade de vacinas sendo oferecida no mercado, a tendncia
ao uso de vacinas polivalentes, a distribuio sazonal da doena em um pas
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continental como o Brasil, a diversidade e a dinmica dos sorovares levam a
necessidade de atualizaes constantes no que se refere aos aspectos
imunoprofilticos desta doena, justificando o presente estudo.
Com o objetivo de verificar a resposta sorolgica ps-vacinal e o tempo de
manuteno da mesma, idealizou-se a presente pesquisa.
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2 REVISO DE LITERATURA
2.1 HISTRICO DA LEPTOSPIROSE
Esta sndrome ictrica com falncia renal foi descrita pela primeira vez em
1880, no Cairo, por Larrey, provavelmente introduzida na Europa pelo Rattus
norvergicus proveniente da sia no sculo XVIII. Os estudos deram seqncia
atravs dos trabalhos de Landouzy, em 1883, mas foi Weil, porm, que em 1886,
descreveu-a minuciosamente, observando quatro casos clnicos em seres humanos.
Posteriormente, a leptospirose foi designada, por Goldschmidt, como Doena de
Weil. A etiologia bacteriana foi estudada concomitantemente, em meados do ano de
1915, por Inada e Ido, no Japo, e por Uhlenhuth e Frommer, na Alemanha. Estes
ltimos detectaram as espiroquetas na corrente sangnea de porcos inoculados
com sangue de soldados infectados pela Doena Francesa. Porm, foram os
estudos de Inada que deram origem as primeiras publicaes de trabalhos sobre
leptospirose (LEVETT, 2001; WHO, 2003).
No Brasil, de acordo com RIQUELME (1985), o interesse pela leptospirosecanina, comeou com os estudos de Dacorso Filho, em 1940. Desde ento,
inmeras pesquisas foram realizadas por diversos autores, entre eles Hagiwara e
Santa Rosa (1975), que detectaram anticorpos contra 18 sorotipos de leptospirasem
7,5% de ces investigados na cidade de So Paulo. De acordo com este mesmo
trabalho, Guida (1949) encontrou, tambm em So Paulo, 31% de casos; Veronesi
et al. (1956) 9,6% e Santa Rosa (1970) 13,8%. Dando seqncia ao levantamento
epidemiolgico, Caldas e Sampaio (1977) investigaram 888 casos em Salvador (BA),que resultaram em 15% de casos positivos para leptospirose. Yasuda et al.(1980),
em So Paulo, analisaram 1428 soros da espcie canina, detectando 21,6% de
soropositivos.
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2.2 ETIOLOGIA E CLASSIFICAO
2.2.1 As Espiroquetas
A ordem Spirochaetales inclui a famlia Spirochaetaceae e Leptospiraceae,
cujos gneros de importncia em animais e humanos so: Serpulina, Treponemae
Borrelia(famlia Spirochaetaceae) e Leptospira(famlia Leptospiraceae) (ANEXO 6).
Como o prprio nome define, as espiroquetas so formas bacterianas gram-
negativas que se apresentam como espiras delgadas, mveis, flexveis, unicelulares,
medindo de 0.1 a 0.3m de dimetro e 6 a 20m de comprimento. A parede externa
da clula bacteriana composta por uma membrana completamente coberta deflagelos periplasmticos que compe o filamento axial ou endoflagelo, o qual permite
movimentos de saca-rolhas (spin) e de flexo-extenso facilitando a mobilidade
bacteriana no ambiente. O cilindro helicoidal (corpo celular) consiste de material
nuclear, citoplasma, membrana citoplasmtica e a poro de peptidioglicano da
parede celular. O flagelo periplasmtico envolvido pelo cilindro e est no espao
periplasmtico celular. A poro final de cada flagelo est inserida prxima a um
plo de cilindro protoplasmtico firmemente aderido por estruturas denominadasdiscos de insero. O ponto distal de cada flagelo se estende para o centro da clula
e pode se sobrepor por flagelos originados no plo oposto (QUINN et al., 1994)
(ANEXO 1 e 2).
2.2.2 Leptospira interrogans
No gnero Leptospira esto includas tanto as formas livres (no
patognicas) quanto as formas parasitrias (patognicas) onde as duas espcies
principais deste gnero eram subdivididas em: L. interrogans (parasita) e L. biflexa
(saprfita) (FORBES et al., 1998; ACHA; SZYFRES, 2001).
medida que as tcnicas de diagnstico molecular foram se aperfeioando,
os membros deste gnero passaram a ser classificados atravs de hibridizao do
DNA, por YASUDA et al. (1987) que definiram primeiramente mais de seis espcies
com diferentes genomas. Podem ocorrer sorovares patognicos e no patognicos
pertencendo mesma espcie. Estudos recentes demonstraram tambm
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heterogenicidade gentica entre os sorovares (BAROCCHI et al., 2001; OLIVEIRA;
PIRES NETO, 2004).
Atualmente, a diversidade taxonmica da Leptospira est baseada em
anlises de DNA, compreendendo 11 espcies, subdivididas em 31 sorogrupos,
sendo estes compostos de mais de 250 sorovares identificados laboratorialmente
atravs de suas composies antignicas (BAROCCHI et al., 2001) (ANEXO 3, 4 e
5).
microscopia observa-se morfologia em espiral, e freqentemente um
gancho nas extremidades da clula bacteriana e por isto denominada por Stimson,
de Spirochaeta interroganspor assemelhar-se a um ponto de interrogao.
Fisiologicamente as formas saprfitas diferenciam-se das patognicas pelasua facilidade de crescer a 10C ou at 5C menos que a temperatura requerida
para as patognicas (BARON et al., 1994). As patognicas tambm reagem
positivamente ao teste de converso de clulas espirais em formas esfricas, pela
adio de um molar (1M) de cloreto de sdio (NaCl), temperatura de 20 a 30C em
2 horas (QUINN et al., 1994).
O agente infeccioso sensvel luz solar direta, aos desinfetantes comuns,
dessecao, s variaes de pH (no resistem a pH abaixo de 6 ou acima de 8) e temperaturas superiores a 40C. Todavia, pode sobreviver por vrios dias em gua
(comprovadamente por at 180 dias) com pH neutro (7,2 a 7,4) e em solos com
grande umidade, demonstrando sua preferncia por estes locais. No entanto, s
resistem a 30 minutos quando o solo est seco. No solo com condies ideais de
umidade, a sobrevivncia da L. interrogansprovavelmente de no mnimo 42 dias.
Rios e lagos podem ser fontes de infeco, assim como aerossol de urina em
estbulos, leite e smen de animais infectados. Sobrevivem tambm ao frio emesmo ao congelamento (100 dias a 20C negativos), mas a temperatura ideal do
ambiente de 25 a 28 C (DICKESON; LOVE, 1993; QUINN et al., 1994; GARCIA;
MARTINS, 2004).
O co o hospedeiro primrio das espcies L. canicola e L. bataviae,
geralmente associadas aos sinais clnicos mais graves. Apesar de menos freqente,
o co pode tambm ser um hospedeiro acidental das outras espcies de leptospira,
como L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagiae e L. bratislava
(HARTMAN, et al., 1984; CIVES, 2005). Anlises sorolgicas realizadas na Frana,
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durante os ltimos anos, tm demonstrado que o sorovar icterohaemorrhagiae o
que mais vem prevalecendo entre os ces, bem como, em seres humanos (ANDR-
FONTAINE; GANIRE, 19_?).
2.3 EPIDEMIOLOGIA
A Leptospirose uma enfermidade de distribuio mundial. Tem sido
detectada em praticamente todos os pases que realizam investigaes adequadas.
Possui sorovares universais, como por exemplo, L. interrogans, sorovar
icterohaemorrhagiae e sorovar canicola, bem como, aqueles que se apresentamsomente em determinadas regies. Cada regio caracteriza-se por manter um
sorotipo determinado pela sua ecologia. de alta prevalncia nos pases tropicais
onde h grandes precipitaes pluviais e onde o solo neutro ou alcalino (ACHA;
SZYFRES, 2001).
Teoricamente, qualquer mamfero pode ser infectado pela L. interrogans. De
uma maneira geral, a L. interroganspode infectar inclusive rpteis, anfbios, peixes,
pssaros e invertebrados. O homem torna-se infectado atravs de contato direto ouindireto com a urina ou sangue de animais infectados (FORBES et al., 1998).
A doena mantida na natureza por portadores com infeco crnica e pela
presena bacteriana nos tbulos renais de hospedeiros adaptados. Nestes, a
infeco mantida independentemente das condies ambientais (OLIVEIRA;
PIRES NETO, 2004). O sorovar adaptado determinada regio pode tornar-se apto
a infectar uma ou mais espcies, como tambm pode infectar acidentalmente
(THIERMANN, 1984) (ANEXO 7 e 8).BLOOD e RADOSTITS (2002), classificam a epidemiologia da leptospirose
de duas formas com relao ao hospedeiro: a forma adaptada ao hospedeiro,
hospedeiro de manuteno ou reservatrio, onde o animal no desenvolve a
doena. E a no adaptada ao hospedeiro, onde este susceptvel a doena,
resultando em doena acidental. No primeiro caso, o hospedeiro passvel de
infeco e de transmissibilidade a outras espcies. A patogenicidade baixa, com
fraca resposta a imunizao e com tendncia a provocar doena crnica. O
hospedeiro acidental caracterizado pela doena aguda, resposta eficiente s
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vacinas, alta patogenicidade e alto ttulo de anticorpos facilitando o diagnstico
sorolgico.
considerada como uma doena ocupacional, com grande prevalncia em
pecuaristas. A leptospirose em humanos acomete principalmente trabalhadores
rurais, fazendeiros, magarefes e veterinrios (DICKESON; LOVE, 1993; SNASHALL,
1996; RENDE; VILA, 2003). Em pases desenvolvidos a leptospirose est
associada com atividades recreacionais aquticas (NASCIMENTO et al., 2004).
Segundo VILA et al. (1998), atualmente a leptospirose j no pode mais ser
relacionada apenas com atividades profissionais, mas com o statuseconmico, haja
vista a situao de misria em que vive grande parte da populao dos pases de
terceiro mundo, aumentando a proliferao de roedores facilitando o convvio destescom os animais domsticos e com o prprio homem.
TAVARES NETO et al.(1996), registraram a prevalncia de soros reagentes
em 45,3%, das 106 amostras provenientes de pessoas da zona rural. A forma de
contgio humano, provavelmente ocorre pelo contato com a urina ou contedo
uterino dos animais infectados. Apesar das leptospiras poderem estar presentes no
leite por poucos dias durante o pico febril, em caso de infeco aguda, a bactria
no sobrevive muito tempo no leite, no resistindo igualmente pasteurizao.Entretanto, os trabalhadores das fazendas que realmente ordenham as vacas, so
altamente suscetveis infeco pela L. interroganssorovares hardjo e pomona.
A apresentao em animais concentra-se primeiramente nos roedores
silvestres e domsticos e em aproximadamente 160 espcies de mamferos. Cada
sorovar possui o seu hospedeiro predileto, mas cada espcie animal pode ser
hospedeira de um ou mais sorovares. Como exemplo, o sorovar pomonaque tem
como hospedeiro principal o gado bovino, podendo infectar de forma transitriaoutras espcies de animais (ACHA; SZYFRES, 2001)(ANEXO 7e 8).
Reservatrios podem apresentar o fenmeno de leptospirria por toda a
vida, com taxa de portadores chegando a 50% ou mais. Animais domsticos,
geralmente, eliminam leptospiras intermitentemente, por meses, podendo chegar a
um ano, com declnio na intensidade (RUSSELL; RUSSELL, 1994).
A alta incidncia de reagentes a infeco bovina, como relatado por RENDE
e VILA (2003), com taxas cujas freqncias variam de 58,6% e 57,3%,
respectivamente, em bovinos de leite e corte na regio de So Paulo, tambm
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mostrou-se alarmante, pois a doena clnica nesses animais compromete o
desempenho reprodutivo por causar abortamento, natimortalidade, nascimento de
crias fracas e inviveis, alm de queda na produo de leite e custos relacionados
assistncia veterinria, medicamentos, vacinas e testes laboratoriais para
diagnsticos (VASCONCELLOS et al., 1993; BLOOD; RADOSTITS, 2002).
GENOVEZ et al., (1993), trabalhando com fetos abortados isolaram
bactrias causadoras de aborto bovino tendo identificado a Brucella abortus em
6.4% doscasos,Leptospira interrogans em 6.2% eStaphylococcus aureusem 5.4%
como os principais agentes abortivos.
Sunos, com freqncia, so infectados pelo sorovar L. pomona, mas
recentes estudos indicam a importncia do sorogrupo L. australiscausando aborto einfertilidade. Apesar de mais resistentes, rebanhos de ovinos tambm so
acometidos pela infeco onde se pode relatar agalactia, aborto e distrbios
reprodutivos (THIERMANN, 1984).
Em vrios locais do mundo, investigaes sobre a presena de sorovares de
Leptospira interrogans em animais silvestres tm sido demonstradas em roedores,
edentatas, carnvoros e artiodctilos, os quais podem atuar como fonte de infeco
(MICHNA, 1970). Os mamferos da Ordem Carnvora so espcies importantes nacadeia epidemiolgica devido as suas funes no equilbrio dos ecossistemas, de
uma maneira geral, onde so o topo da cadeia alimentar. So assim, indicadores de
sade ambiental e por este motivo, no pode ser desconsiderada a sua importncia
na transmisso da leptospirose para o homem (GUERRA NETO et al., 2004).
Estudos revelaram a baixa ocorrncia de infeco por leptospirose em gatos.
A virulncia varia entre as cepas. Evidncias sorolgicas indicam que uma variedade
de cepas pode infectar gatos, mas a doena demonstra ser incomum nestesanimais, nas quais, os microorganismos parecem no tomar parte na infeco renal
nesta espcie.
LANGONI et al. (1998), detectaram a presena de anticorpos aglutinantes
em gatos em nove amostras (4,5%) com ttulos que variaram de 100 a 400, sendo
que 4 (44,4%) reagiram para o sorovar L. icterohaemorrhagiae, 2 (22,2%) para o
sorovar L. patoc, 1 (11,1%) para L. canicola, 1 (11,1%) para L. grippotyphosa e 1
(11,1%) para L. andamana.
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DICKESON e LOVE (1993), no acharam diferena significativa de
prevalncia de soros reagentes na populao canina em relao felina. Das 107
amostras positivas obtidas dos procedimentos de rotina dos Hospitais Veterinrios
da Austrlia, 16,9% dos soros eram de gatos, 9.8% de ces e 28.6% de cavalos.
Dentre os animais domsticos sujeitos a infeco por Leptospira, os ces
destacam-se como os mais susceptveis a ela. Em filhotes alta a letalidade
exterminando ninhadas inteiras e o seu aparecimento, geralmente sbito, no
permite nem mesmo que se possa tomar alguma medida, quer seja curativa ou
preventiva (GENOVEZ, 1996).
Atualmente, o co tambm desponta como a principal fonte de infeco
humana devido a sua relao e convvio estreitos, que crescem a cada dia. Estaimportncia perde apenas para os roedores, reservatrios naturais da doena, que,
histrica e epidemiologicamente sempre assumiram posio de destaque como fonte
de infeco para os humanos e outros animais. Dentre os roedores domsticos, as
espcies mais comuns so: Rattus norvergicus(ratazana, rato de esgoto ou gabiru),
Rattus rattus(rato de telhado, rato preto) e Mus muscullus(camundongo ou catita).
Nas zonas rurais, embora as trs espcies sejam prevalentes, podemos encontrar
pequenos roedores do campo chamados, genericamente, ratos da lavoura ou ratosdo campo representados, principalmente, pelo Holochillus sp. Os animais de vida
livre que so predadores para estes roedores, no parecem exercer um papel
relevante na rota natural de transmisso da infeco (RENDE; VILA, 2003).
No Brasil, inquritos soro-epidemiolgicos em vrios estados tm revelado
resultados variados quanto ocorrncia dos diferentes sorovares na leptospirose
canina (GENOVEZ, 1996; VILA et al., 1998; ALVES et al., 2000; FAVERO et al.,
2002). Segundo VILA et al.(1998), os principais sorovares encontrados em ces,no municpio de Pelotas-RS, no ano de 1995 foram: L. canicola (58,1%); L.
icterohaemorrhagiae (20,9%); L. copenhageni (11,4%); L. grippotyphosa e L.
castellonis (2,7%); L. andamana, L. autumnalis e L. pyrogenes com 1,4% dos
reagentes, onde 34,8% foram reagentes positivos com ttulos maiores ou iguais a
1/100. Corroborando com os achados de YASUDA e SANTA ROSA (1981),
notificando prevalncia do sorovar canicola como sendo o melhor adaptado aos
ces depois de ter isolado 91,4% deste sorovar, seguido dos sorovares copenhageni
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pelas manifestaes clnicas de doenas como meningites e disfunes hepticas e
renais (MURRAY et al., 1998).
A fase de localizao heptica e renal , provavelmente, resultado da
capacidade de aderncia das leptospiras virulentas s diferentes clulas, alm da
capacidade de penetrao atravs das clulas endoteliais e da dissociao dos
hepatcitos. esta interao celular que d origem s coagulopatias, hipxia
tecidual e agregao plaquetria com ativao do sistema de coagulao e
fibrinlise (ANDR-FONTAINE; GANIRE., 19_?).
Tambm penetram no tero gravdico e multiplicam-se nos fetos, podendo
levar a morte e reabsoro fetal, aborto ou prole fraca. No feto bovino, se a infeco
acontecer durante o terceiro trimestre, pode ocorrer produo de anticorposespecficos que, ocasionalmente, superam a manifestao da doena (QUINN et al.,
1994).
Algumas cepas produzem hemolisina que , provavelmente, a responsvel
pela hemoglobinria em animais infectados. Protenas citotxicas tambm so
produzidas por cepas virulentas, mas a funo destas toxinas ainda desconhecida
(QUINN et al., 1994).
A ao txica bacteriana ainda no est bem compreendida. Sabe-se que, aatividade hemoltica dependente dos fosfolipdios da membrana dos glbulos
vermelhos que podem ser sensveis, ou no a fosfolipase produzida pelas
leptospiras (ANDR-FONTAINE; GANIRE., 19_?).
A hemolisina produzida na fase septicmica pode estar em quantidade
suficiente para provocar extensa hemoglobinria, resultante de hemlise
intravascular intensa. Essa hemlise depender da capacidade de um sorotipo em
produzir hemolisinas como ocorre com o sorovar ballom, em hamsters e o sorovarpomona,em bovinos (BLOOD; RADOSTITS, 2002).
Os sorovares pomonae copenhagenielaboram uma protena citotxica cuja
atividade detectada no plasma dos animais infectados que provoca infiltraes de
macrfagos e outras clulas polimorfonucleares em rgos afetados (LEVETT,
2001).
Entre o 4 e 11 dia de infeco, a bactria invade a corrente sangnea
multiplicando-se rapidamente, dando origem a leptospiremia. No incio desta fase
observam-se febre, leucocitose e albuminria. Em animais susceptveis, pode
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ocorrer a septicemia ao dar-se a invaso nos rgos pelos quais a bactria tem
maior tropismo, como fgado, rins, bao, sistema nervoso central e globo ocular,
podendo ocasionar grandes danos teciduais. A Leptospirapode provocar petquias
ou equimoses, ictercia, infiltrado inflamatrio difuso de clulas plasmticas nos rins,
necrose focal de parnquima heptico, colestase intra-heptica com leso heptica
severa. Neste estgio da doena o animal poder sucumbir devido insuficincia
renal ou heptica. Ao final da bacteremia (sete a dez dias aps a infeco),
geralmente a febre diminui e a bactria eliminada da circulao sangnea devido
presena de anticorpos, o que possibilita a recuperao. Esta mais rpida
quanto menor forem as leses orgnicas. No entanto, as bactrias que se alojaram
em locais onde os anticorpos no tm acesso, como crneas e tbulos renais,podem levar uvetes e leptospirria. O fenmeno de leptospirria ocorre em uma
fase mais tardia da enfermidade. Ela pode permanecer por meses, at mesmo anos,
constituindo-se uma fonte de contaminao ambiental e de infeco para os outros
animais. Nesses animais portadores e eliminadores da bactria, a concentrao de
anticorpos decai, j que o microorganismo se encontra situado nos tbulos renais,
no estimulando o sistema imune podendo apresentar-se soronegativos quando
testados (CIVES, 2005).ACHA e SZYFRES (2001) descrevem a doena no homem e nos animais,
particularmente bovinos e ces, da seguinte maneira:
- Em seres humanos em geral, distinguem-se dois tipos clnicos: o anictrico, que podeser discreto, sendo freqentemente rotulado de sndrome gripal ou virose; e o ictricoou hepatonefrtico (Doena de Weil) tipo clnico mais grave, com disfuno renal,fenmenos hemorrgicos, alteraes hemodinmicas, cardacas, pulmonares e deconscincia, associadas a taxas de letalidade que variam de 5% a 20% nas diversascasusticas. Na forma clssica da Doena de Weil os sintomas se instalam bruscamente
com febre, dores de cabea, mialgias, conjuntivites, nuseas, vmitos, diarrias econstipao. A prostrao marcante. Petquias na pele, hemorragias gastrointestinaise proteinria so comuns.Se o paciente evolui at a cura, a diurese se restabelece ediminui a ictercia. Qualquer sorovar pode determinar as diversas formas deapresentao clnica, sendo que alguns esto mais comumente relacionados a casosmais graves, como o sorovar icterohaemorragiae. Na forma anictrica muitas vezes ocurso benigno e o paciente se recupera dentro de um ms.
- Em bovinos tm-se isolado mais de 13 sorovares onde os universais so pomona ehardjo, este ltimo vem se comprovando com cada vez mais freqncia. A infecopode se dar na forma aguda, subaguda ou permanecer clinicamente inaparente. Aenfermidade se manifesta por uma febre de quatro a cinco dias, anorexia, conjuntivite ediarria. A leptospiremia comea a desaparecer quando se formam os anticorpos,desaparecendo as leptospiras da corrente sangnea em uma semana devido a
imunidade humoral. As leptospiras sobreviventes alojam-se nos tbulos convolutos dosrins e a infeco passa a uma fase crnica. Nos primeiros meses a leptospirria eliminagrandes quantidades de leptospiras diminuindo ou cessando com o tempo. O sorovar
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hardjo, cuja leptospirria mais prolongada que o pomona, caracteriza-se por causaragalactia, ou reduo de leite e abortos ou crias fracas. Infeces por hardjo podemresidir nos rgos genitais o que pode indicar transmisso venrea. A infertilidade podeser seqela da infeco. Em casos graves h ictercia. So susceptveis animais detodas as idades, sendo mais severa em bezerros.
- Nos ces os sorovares predominantes no mundo so canicolae icterohaemorrhagiae. Ainfeco pode variar desde uma forma assintomtica at quadros clnicos mais graves.A hemorrgica a forma mais grave, instalando-se repentinamente em trs a quatrodias com sinais de febre seguida por rigidez e mialgias dos membros posteriores,hemorragias na cavidade bucal podendo levar a necrose e faringite, seguidasposteriormente de hemorragias gastrointestinais, nefrite aguda e ictercia.
A ictercia ocorre principalmente devido leso heptica e no hemlise
intravascular. Os rins comeam a ter problemas de filtrao ocorrendo a seguir
quadro de uremia onde o animal apresenta hlito de amnia. Este o quadro agudo
da doena no homem e no co com durao de quatro a sete dias (GARCIA;
MARTINS, 2004).
Alm da ocorrncia de hemorragia difusa, de anemia e ictercia, os animais
tambm apresentam na leptospirose aguda, edema pulmonar, fgado plido, frivel e
corado por bile. Os rins aparecem tumefeitos e escuros devido impregnao
hemoglobnica. Mais tarde, no curso da doena, os rins apresentam focos plidos
causados por infiltrados de clulas inflamatrias no interstcio. As hemorragias so
numerosas e disseminadas. Diante do envolvimento heptico notvel em ces a
hepatomegalia, onde o fgado tambm se apresenta frivel e com colorao
amarelo-acastanhado. Freqentemente os tecidos esto ictricos. O fgado pode
no exibir alteraes notveis, presumivelmente porque a disfuno heptica pode
ser causada por toxina que produz, basicamente, leso subcelular. A infeco
crnica com o sorogrupo grippotyphosa tem-se caracterizado por hepatite crnica,
fibrose heptica e a presena do microorganismo no fgado. A infeco persistente e
a hepatite crnica parecem ser raras com este sorovar, porque apenas poucosartigos documentaram este desfecho. Ces que morrem de leptospirose aguda
representam hemorragias disseminadas e necrose heptica focal. Os rins
consistentemente apresentam leses e, na forma aguda da doena, esto
tumefeitos e apresentando hemorragias equimticas subcapsulares e corticais. Mais
tarde, no curso da doena crnica, tornam-se diminudos de tamanho com
aderncias capsulares superfcie cortical e vrios graus de fibrose cortical
(GREENE, 1998).
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O sorogrupo icterohaemorragiae est associado leso heptica, enquanto
o sorogrupo canicolaest associado insuficincia renal, com rins hipertrofiados e
plidos. Acredita-se que a infeco por outros sorotipos seja, na maioria das vezes
inaparente, embora a infeco persistente com o L. interrogans, sorogrupo
grippotyphosatenha sido associada hepatite crnica em ces (GREENE, 1998).
2.5 SINAIS CLNICOS
A severidade dos sinais clnicos em ces depende da idade, statusvacinal,
virulncia do sorovar, da rota de infeco e do grau de exposio. As formas clnicaspodem variar de hiperaguda, aguda, subaguda, crnica e assintomtica. Raas de
ces acima de 15 kg, agravados pelo fato de viverem ao ar livre, so mais afetadas.
Uma infeco hiperaguda decorrente de uma leptospiremia massiva pode levar a
morte e ocorrer sem o aparecimento de sinais prvios (GREENE, 1998).
A leptospirose canina afeta animais de diferentes raas ou idades e de
ambos os sexos. A doena possui um espectro extremamente amplo, indo de uma
infeco subclnica a uma sndrome severa de vrios rgos com alta mortalidade.Pode manifestar-se inicialmente com sinais de letargia, febre, vmito, diarria,
mialgia evoluindo para petquias e sufuses em mucosas, ictercia e dores
abdominal e lombar (GREENE, 1998; ACHA; SZYFRES, 2001; LEVETT, 2001).
Segundo GENOVEZ (1996), os sorovares icterohaemorrhagiae e canicola,
prevalentes em ces, determinam aspectos clnicos distintos. Em ambos verifica-se
infeco aguda com febre de 39.5 a 40 C, calafrios, conjuntivite e fraqueza como os
primeiros sinais. Aps, surgem os vmitos, a desidratao e o colapso perifricovascular.
No caso do sorovar canicola comum a evoluo para as formas aguda ou
subaguda, onde no primeiro caso tambm conhecida como Doena de
STUTTGART, atingindo nveis crticos de desidratao (10 a 15%), melena, devido
as hemorragias intestinais; odor oral ftido, devido s estomatites e glossites, que
evoluem para necrose da mucosa e perda do bordo anterior da lngua. A taxa de
letalidade elevada, com bitos ocorrendo entre 36 horas e quatro dias. Sinais de
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nefrite, sbitos de febre, edema renal sensvel palpao e morte so freqentes na
forma subaguda deste sorovar.
O sorovar icterohaemorrhagiae tambm responsvel pela forma hiper-
aguda da doena, denominada Sndrome de Weil canina. de evoluo mais
fulminante que a precedente e em cerca de dois dias aps o aparecimento dos
primeiros sinais, ocorre visvel piora do estado geral do animal. As dores musculares
ou a hiperestesia paraespinhal limitam o animal em seus movimentos, o que
GREENE (1998) atribui como uma conseqncia da inflamao muscular, meningeal
ou renal.
A temperatura corporal pode cair abaixo da normalidade (36 C) e so
visualizadas hemorragias por leso vascular, principalmente das mucosas oral econjuntival, bastante ictricas, com saliva espessa e sanguinolenta (GENOVEZ,
1996). A leso renal severa evolui para insuficincia renal aguda com poliria,
oligria ou anria e conseqente uremia. A ictercia responsvel pela eliminao
da urina rica em bilirrubina e albumina (ANDR-FONTAINE; GANIRE., 19_?).
A morte ocorre em 85% dos casos no tratados e pode ser abrupta dentro
de algumas horas ou dias (GENOVEZ, 1996).
A ictercia ocorre mais freqentemente na fase aguda da doena,relacionada s infeces pelo sorovar icterohaemorrhagiae.Nesta fase podem ser
observadas fezes de colorao acinzentada, em virtude da colestase heptica
resultante de uma inflamao no fgado. Os ces com hepatite ativa crnica
manifestam sinais de inapetncia, perda de peso, ascite e, em casos crnicos,
hepatoencefalopatia. As manifestaes pulmonares, como a pneumonia intersticial,
so menos freqentes em ces do que em seres humanos, sendo acompanhadas
de respirao difcil e tosse. J, as intussuscepes ocorrem mais vezes nestesanimais associadas com inflamaes gastrointestinais (RIBEIRO et al., 2003).
SHCREIBER et al. (2005), inocularam cepas virulentas de L.
icterohaemorrhagiae e de L. canicola em ces do grupo controle, que no
receberam a pr-imunizao com bacterinas comerciais destes sorovares.
Observaram os seguintes sinais clnicos: hipotermia (35.6 C), depresso, anorexia,
dor abdominal, desidratao, ictercia e perda de peso. Na hematologia, foram
verificadas leucocitose e trombocitopenia, enquanto na anlise bioqumica, aumento
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nas taxas de uria, creatinina e bilirrubina total, alm de leses como petquias e
nefrite subaguda.
Em gatos os sinais clnicos so raros e variam de suaves a inaparentes
mesmo na presena de leptospiremia e leptospirria e inflamaes renais e
hepticas (GREENE, 1998; ACHA; SZYFRES, 2001).
LARSSON et al. (1985), com o objetivo de verificar a susceptibilidade dos
felinos infeco por leptospirose constataram que, dos dez gatos inoculados com
os sorovares icterohaemorrhagiae e canicola nenhum deles apresentou sinais
clnicos nem laboratoriais e, 90 % apresentaram aglutininas antileptospricas aps a
inoculao bacteriana, que ainda eram detectveis na urina por at 12 semanas.
Trabalho de NAVARRO et al. (1981) ao inocularem Leptospira interrogans
sorovar icterohaemorrhagiae em cinco ces, observaram sinais clnicos diferentes
que variavam de febre, como nica manifestao inicial detectvel, at severa
ictercia, uremia e morte. necropsia, foram detectadas petquias na mucosa
intestinal e hemorragia subpleural nos pulmes.
NAVARRO e KOCIBA (1982) dando seqncia a estes estudos verificaram
entre os dez ces inoculados com Leptospira interrogans sorovar
icterohaemorrhagiae, que trs desenvolveram a forma subclnica com febrepersistente de 39,4 a 40.5 C, durante trs dias. Quatro animais desenvolveram a
forma branda, com febre mais persistente, suave ictercia, esclera congesta e incio
de desidratao. E os trs ltimos animais fizeram a forma severa da doena com
sintomas de febre alta, anorexia, ictercia, diarria, depresso at a morte no stimo
dia ps-inoculao.
2.6 DIAGNSTICO IMUNOLGICO DA LEPTOSPIROSE
Segundo TIZARD (1998), as respostas imunolgicas podem auxiliar na
obteno do diagnstico da doena de duas formas. Primeiramente, de forma direta,
atravs de anticorpos especficos que identificam ou detectam o antgeno em
tecidos, lquidos ou rgos do animal infectado. Ou ento, de forma indireta,
detectando-se o anticorpo especfico no soro que acusar se houve ou no
exposio do animal ao agente infeccioso. A presena de anticorpos no soro de um
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animal indica a exposio prvia a um determinante antignico. Entretanto, esta
forma indireta de diagnstico, no propicia automaticamente uma prova de que
existe infeco ativa. Em geral, testes imunolgicos utilizados em diagnstico de
infeces bacterianas ou virais, variam em sensibilidade, especificidade, e
complexidade de execuo, muitas vezes exigindo alto grau de destreza tcnica e
sofisticados equipamentos necessrios para a sua realizao.
De acordo com a Organizao Mundial de Sade (WHO, 2003), os mtodos
laboratoriais atualmente em uso para o diagnstico da leptospirose incluem: provas
sorolgicas de detectao de anticorpos (ELISA, Fixao de Complemento,
Soroaglutinao Microscpica), Cultura da bactria, visualizao atravs de
Microscopia de Campo Escuro, Microscopia de Imunofluorescncia, e maisrecentemente, mtodos genticos utilizados somente em grandes centros que
dominem as tcnicas de Hibridizao de DNA, Endonucleases de Restrio e a
Reao em Cadeia pela Polimerase (PCR).
Os resultados de testes sorolgicos aplicados ao diagnstico da leptospirose
dependem da tcnica empregada, da coleo de antgenos utilizada, do ponto de
corte da reao e tambm de variveis relacionadas localizao das propriedades,
perodo do ano em que as colheitas foram efetuadas e da movimentao dosanimais (FAINE et al., 1999).
Quando ocorre o fenmeno da leptospiremia a bactria comumente
encontrada no sangue perifrico, fluido cerebroespinhal, urina e tecidos podendo ser
colhidos em diferentes fases da infeco. Estas clulas bacterianas apresentam
movimentos serpentiformes e so melhor visualizadas pelo exame de lquidos em
microscopia de campo escuro, onde aparecem como espirilos delgados
apresentando extrema mobilidade. Este tipo de pesquisa pode ser realizado a partirde uma gota de sangue, at o quarto dia de infeco, ou de uma amostra de urina,
entre a primeira e segunda semana. A demonstrao de microorganismos atravs
de microscopia de campo escuro em lquidos orgnicos e emulses teciduais,
colhidos necropsia, requer que os tecidos estejam frescos. A Leptospira pode ser
excretada na urina intermitentemente e ttulos de anticorpos, nesses animais
portadores podem variar consideravelmente, dificultando o diagnstico correto
(MURRAY et al., 1998).
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BLOOD e RADOSTITS (2002) defendem que o exame de amostra urinria
representa a melhor oportunidade para a demonstrao da infeco. Aps a
infeco inicial, um grande nmero de leptospiras eliminado na urina por diversas
semanas, com declnio progressivo em seguida, que pode estar associado com um
aumento considervel dos ttulos de anticorpos antileptospiras, das classes IgG e
IgA, na urina.
A tcnica de isolamento do microrganismo por cultivo ou inoculao de
material suspeito em animais de laboratrios requer a presena de organismos vivos
e a sua multiplicao pode levar semanas at que se chegue a um resultado
conclusivo. Esta dificuldade de ordem prtica desestimula a utilizao deste tipo de
diagnstico, principalmente se o objetivo for verificar o estado de portador renal deleptospiras (YASUDA; SANTA ROSA, 1981; RIQUELME, 1985; RENDE; VILA,
2003)
Por se tratar de uma doena que no apresenta sinais patognomnicos, faz-
se necessrio aliar os exames laboratoriais ao diagnstico clnico a fim de serem
tomadas medidas que possam evitar uma epidemia, j que a eficcia do tratamento
vai depender do diagnstico precoce da doena (RIBEIRO et al., 2003).
Em relao aos mtodos de diagnstico laboratorial destacam-se: os gene-especficos e os sorogrupo-especficos (LEVETT, 2001).
O teste de Soroaglutinao Microscpica (SAM) ou teste Microscpico de
Aglutinao (MAT), sorovar-especfico sendo a tcnica de referncia padro mais
utilizada por pesquisadores de todo o mundo para o diagnstico da leptospirose
devido a sua praticidade, rapidez de execuo, baixo custo e baixo risco de infeco
para o operador (SANTA ROSA, 1970).
O teste Microscpico de Aglutinao (MAT) realizado colocando-se frentea frente microorganismos vivos, juntamente com o soro teste. Caso haja anticorpos
no soro, ocorre a aglutinao que poder ser visualizada pelo aglomerado de
leptospiras. uma tcnica excelente para detectar preferencialmente anticorpo IgM
conseqentemente, detectar surtos recentes e distinguir animais infectados de
vacinados (TIZARD, 1998).
Esta tcnica indicada pela Organizao Mundial de Sade (WHO, 2003),
por apresentar elevada sensibilidade e especificidade.
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Seu principal inconveniente a necessidade de infra-estrutura laboratorial
com o emprego de mltiplos antgenos vivos e a necessidade de se manter um
grande nmero de culturas em constante renovao para obteno de antgenos
novos. A demora em at dez dias para que o limiar de aglutininas sricas atinja nvel
detectvel pode implicar no retardo do tratamento, o que pode ser fatal (YASUDA;
SANTA ROSA, 1981; RIQUELME, 1985). Para COLE et al. (1973) a principal
desvantagem desta tcnica que somente leptospiras aglutinantes so observadas.
Apesar de ser uma tcnica de uso universal, difcil obter resultados
consistentes e idnticos entre os laboratrios. Anticorpos resultantes do uso de
bacterinas multivalentes podem interferir no diagnstico, que depende de anlise
subjetiva no diferenciando entre doena e imunizao (THIERMANN, 1984).Para melhor aproveitamento desta tcnica, so utilizados pools contendo
vrios sorotipos de Leptospira em cada pool. Os resultados positivos so
visualizados em campo escuro onde se verificam as aglutinaes das mesmas.
Caso se verifiquem microaglutinaes, procede-se a microaglutinao em separado
para cada sorovar contido no pool.As disponibilidades de reagentes comerciais para
a confeco dos meios de cultura facilitam o emprego desta tcnica (FORBES et al.,
1998).Para RIBEIRO et al. (2003), esta prova requer cuidados em sua
interpretao para a obteno de um diagnstico definitivo. Como no caso dos
animais que apresentarem reaes positivas onde pelo menos 50% de Leptospiras
encontrar-se-o aglutinadas. Estes soros so testados novamente em diluies ao
dobro, at verificar-se ausncia da aglutinao para o respectivo sorovar. No
entanto, alguns animais podem reagir para vrios sorovares ou podem apresentar
reaes cruzadas com sorovares do mesmo grupo (co-aglutinao), dificultando ainterpretao de uma nica amostra sorolgica. Nestes casos e, sempre que
possvel, recomenda-se a realizao da sorologia pareada, que consiste na
execuo de duas provas sorolgicas intercaladas de duas a quatro semanas. Ttulo
maior ou igual a 100, na primeira tomada de sangue, seguido da quadruplicao
deste ttulo numa segunda tomada, uma prova de soroconverso, confirmando
assim, a infeco. Ttulos elevados da ordem de 1600 ou maiores so considerados
significantes, juntamente com dados clnicos compatveis. Um nico exame com
ttulo maior ou igual a 100 pode ser interpretado como residual de infeco
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pregressa, resposta inicial a uma infeco corrente ou vacinao. Mesmo ttulos
elevados so questionveis se a amostra testada advm de animais sujeitos a
sucessivas vacinaes, pois, ttulos vacinais podem ser detectados at trs meses
aps a vacinao. Na avaliao sorolgica dos animais importante questionar o
histrico vacinal contra leptospirose. Ces vacinados recentemente podem
apresentar resultados falso-positivos, j que anticorpos vacinais no so
diferenciados daqueles provenientes de infeco.
O MAT um teste especfico para um sorogrupo e todos os sorogrupos
suspeitos devem ser testados. O teste detecta o anticorpo da classe IgM com mais
facilidade que o da classe IgG. Na leptospirose crnica, o teste apresenta pouca
sensibilidade em detectar hospedeiros de manuteno. Ele tambm no determina ograu de imunidade infeco, pois a vacinao promove a elevao de IgG com
ttulos baixos (100 a 400) e transitrios (um a quatro meses). A imunidade
normalmente persiste em animais vacinados por um longo tempo, mesmo aps os
ttulos, obtidos atravs do MAT, tornarem-se negativos (BLOOD; RADOSTITS,
2002).
Tambm como diagnstico, faz-se mister ressaltar o mtodo da Reao em
Cadeia Polimerase (PCR), do Centro Nacional de Referncia para Leptospirose doInstituto Oswaldo Cruz (IOC), da FIOCRUZ (2005 in: FAPESP) onde, segundo
aqueles pesquisadores, o principal problema das tcnicas utilizadas a demora nos
resultados. O exame sorolgico s consegue identificar a infeco uma semana
aps o incio dos sintomas da doena, enquanto a cultura das bactrias pode levar
at dois meses. O PCR amplifica em escala potencial o DNA bacteriano permitindo o
diagnstico em poucas horas. capaz ainda de identificar a presena deste DNA
mesmo em pessoas ou animais que apresentem poucas bactrias na correntesangnea.
O teste de PCR identifica geno-espcies, mas no o sorovar. Tem sido
usado para diferenciar sorovares patognicos dos no patognicos (SMYTHE et al.,
2002; OLIVEIRA; PIRES NETO, 2004).
Mtodos sorolgicos possuem limitaes e por isto, devem ser
complementados com o isolamento do agente causal (THIERMANN, 1984;
RIQUELME, 1985; WHO, 2003;).
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A prova de Imunofluorescncia Direta (IFD) valendo-se de rins, trato genital
e urina, tem se mostrado uma tcnica diagnstica alternativa mais rpida que as
demais. Comparada tcnica de Isolamento, a Imunofluorescncia Direta, segundo
RIQUELME (1985), detectou maior nmero de casos positivos recomendando o seu
uso como prova complementar ao diagnstico da leptospirose.
THIERMANN (1983) comparou as sensibilidades apresentadas atravs das
tcnicas de MAT e ELISA onde obteve os seguintes resultados: dos 200 soros de
bovinos colhidos, observou a presena de reagentes em 29 (14.5%) soros pela
tcnica de MAT contra 79 (39.5%) pela tcnica de ELISA. Ambas as tcnicas
indicaram hardjocomo sorovar predominante.
No diagnstico bioqumico pode-se verificar na hematologia: petquias etrombocitopenia (em ces severamente afetados), leucocitose com desvio
esquerda (>20.000 leuccitos/dl) e um aumento no fibrinognio plasmtico, alm de
graus variveis de anemia. Nas provas bioqumicas podem estar aumentados:
nitrognio sangneo proveniente da uria (BUN), alanina aminotransferase srica
(ALT), desidrogenase ltica srica (LDH), aspartato aminotransferase srica (AST),
fosfatase alcalina srica (FA) e bilirrubina srica. Estes se constituem nos principais
exames de monitoramento da evoluo do quadro clnico e, conseqentemente, doprognstico de animais com leptospirose. A urinlise revela piria, proteinria, e/ou
bilirrubinria, densidade baixa e glicosria, acompanhadas de elevao de cilindros
granulosos, leuccitos e eritrcitos no sedimento urinrio (NAVARRO et al., 1981).
No pos-mortemverificam-se hepatomegalia, degenerao e fibrose heptica,
congesto pulmonar, petquias e sufuses pleurais, lceras na lngua, edema,
congesto e necrose renal, hemorragias e aderncia de cpsula renal, congesto,
edema e hemorragias gastrintestinais. Os rins esto aumentados em animais quemorrem durante a fase aguda. A necropsia de grande valia para o diagnstico. O
sorovar icterohaemorrhagiae pode provocar pronunciada ictercia de serosas e
conjuntivas. O diagnstico histopatolgico realizado principalmente com base em
fragmentos renais ou hepticos, corados por tcnicas de impregnao pela prata
(coloraes de Gomori, Warthin-Starry ou Levaditti). Rins e fgado constituem-se nos
rgos de eleio para que o agente seja isolado (GREENE, 1998; RIBEIRO et al.,
2003).
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A histopatologia melhor visualizada em rgos como rins, fgado, corao
e pulmes, porm outros rgos podem ser afetados de acordo com severidade da
infeco (LEVETT, 2001).
2.7 DIAGNSTICO DIFERENCIAL
Em ces, o diagnstico diferencial inclui (GREENE, 1998):
Erliquiose e Riquetsiose
Anemia Hemoltica Auto-Imune
Hepatite Canina (Doena de Rubarth)
Brucelose
Cinomose
Herpes Vrus
Piroplasmose
2.8 VACINAS
O controle ambiental do agente da leptospirose mostra-se extremamente
dificultado pelas caractersticas especficas desta bactria sendo capaz de
sobreviver por muito tempo nos solos midos, esgotos, banhados e reservatrios de
gua (NASCIMENTO et al., 2004).
Em razo de ser uma enfermidade que abrange uma ampla variedade de
hospedeiros, sua transmissibilidade e as conseqncias que pode gerar, medidascomo: vigilncia, higiene e, especialmente, a imunoprofilaxia atravs da vacinao,
so as armas mais eficazes utilizadas nos procedimentos de controle da leptospirose
(MURRAY et al., 1998). Considerando atualmente em nossa sociedade, a estreita
relao do homem com o co e, a fim de prevenir danos causados por esta doena
zoontica, a imunizao ainda a forma mais contundente de se evitar a infeco
humana frente facilidade de contato direto ou indireto com o animal infectado
(THIERMANN, 1983; LEVETT, 2001).
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A vacinao humana contra leptospirose no confere imunidade permanente
aos imunizados, no sendo ainda praticada ou disponvel no Brasil. Em alguns
pases utilizada em pessoas sob exposio ocupacional, em reas de alto risco. A
vacinao canina disponvel evita a doena clnica mas no impede a infeco nem
a transmisso para seres humanos, principalmente atravs da urina (CIVES, 2005).
Segundo HARTMAN et al. (1984), os primeiros experimentos vacinais com
ces resultando em sucesso, deram-se em 1926 por Dalling e Okell com cepas
inativadas de icterohaemorrhagiae, seguidos por Ottosen, em 1946, com o sorotipo
canicola.
De uma maneira geral, a alta capacidade de proteo e antigenicidade
conferida pelas vacinas atenuadas tornaram-nas preferidas quando comparadascom vacinas inativadas, consideradas agentes imunognicos pobres. Porm, a
inocuidade e a ausncia de riscos de reverso no seu uso mantm as vacinas
mortas como uma opo segura e preferida em muitos casos, sendo esta a razo
de sua utilizao na leptospirose animal (TIZARD, 1998).
No entanto, a exposio de ces vacinados com leptospiras vivas resulta em
rpida elevao de ttulos de anticorpos ps-vacinais, que atingem os seus picos
com duas semanas aps a primeira dose imunoprofiltica, dando boa proteocontra o desenvolvimento da doena, apesar dos baixos ttulos e da curta durao
da resposta imune humoral (KRAMER, 1978; GREENE, 1998).
Diante disto, vacinas com cepas de leptospiras vivas e atenuadas, apesar de
serem capazes de induzir a ttulos de anticorpos mais elevados do que os induzidos
pelas bacterinas quimicamente inativadas, ainda no conseguiram aceitao dos
laboratrios farmacuticos devido aos riscos inerentes ao seu uso (RUSSELL;
RUSSELL, 1994).De acordo com APPEL (1999), embora a maioria das vacinas comerciais
confira segurana e eficcia, existem as excees onde a doena induzida pela
prpria vacina ou no traz a proteo adequada para o animal.
Atualmente, a preveno da leptospirose em ces se d atravs de vacinas
provenientes de bacterinas quimicamente inativadas contendo vrios sorotipos e seu
uso amplamente disseminado (HARTMAN et al., 1984).
Vacinas contra leptospirose so inativadas em grande parte, por formalina
produzidas a partir de leptospiras patognicas, contendo um ou mais sorotipos, que
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apresentam a desvantagem de induzirem respostassorolgicas baixas e por apenas
um curto perodo de tempo (BLOOD; RADOSTITS, 2002; NASCIMENTO et al.,
2004).
BEY e JOHNSON (1982), estudando a imunogenicidade humoral em
resposta a vacinas produzidas somente com a membrana externa (ME) da clula
bacteriana, cilindros protoplasmticos (CP) ou clulas completas (C) de Leptospira
interrogans, verificaram que as primeiras (ME) produziram melhor resposta humoral
sorovar-especfica.
Vacinas contra leptospirose com adjuvante completo de Freund induzem a
uma maior resposta humoral, no significando necessariamente maior proteo,
alm de ser um complemento que apresenta caractersticas carcinognicas(TIZARD, 1998; BLOOD; RADOSTITS,2002;).
O crescimento bacteriano de leptospiras em meios de cultura sintticos, sem
a utilizao de soros de animais como forma de enriquecimento nutritivo,tem levado
produo de vacinas sem os riscos usuais, como a ocorrncia de reaes de
hipersensibilidade soro-mediadas que podem levar a um quadro de choque
anafiltico (BEY; JOHNSON, 1982; BROUGTON; SCARNELL, 1985).
Na profilaxia das doenas infecciosas caninas, de uma maneira geral, tem-se levado ao uso de vacinas mistas polivalentes, cujo emprego ganhou notoriedade
graas a considervel economia de tempo e esforo despendida por parte do
veterinrio aplicador e do cliente. No entanto, a sua utilizao, que na grande
maioria abrange antgenos virais atenuados e bactrias mortas, relativamente
complexa, onde muitas de suas vantagens podem ser perdidas no que tange a
imunidade conferida, na qual os ttulos sorolgicos ps-vacinais no so
obrigatoriamente homogneos e igualmente protetores contra todas as doenas aque se prope o imungeno (TIZARD, 1998).
Com relao s vacinas empregadas no controle da leptospirose animal, a
imunidade conferida a um sorovar extremamente restrita aos sorovares homlogos
ou muito prximos, portanto so sorovares-especficos, no permitindo proteo
cruzada, perdendo sua eficcia em relao a outros sorovares (FAINE et al.,1999;
LEVETT, 2001). Da, a necessidade de vacinas polivalentes para a leptospirose.
Vacinas comerciais para ces incluem geralmente os sorovares canicola e
icterohaemorrhagiae (GREENE, 1998). Onde o sorovar icterohaemorrhagiae,
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segundo BROUGTON e SCARNELL (1985), apresenta maior antigenicidade.
Atualmente, os laboratrios que a produzem j trabalham com a adio dos
sorovares grippotyphosae pomona.
A utilizao de imungenos para esta enfermidade visa apenas o seu
controle. Segundo THIERMANN (1983), nenhum pas erradicou a enfermidade. A
eliminao completa do patgeno atravs de vacinas muito pouco provvel, o que
se deve no somente ao estado de portador renal, mas tambm pelas prticas
descontinuadas dos esquemas de vacinao, alm do envolvimento de animais de
vida livre que contribuem na transmisso.
Em muitos casos o sorovar enzotico predominante em um pas, no
conhecido e a ausncia do sorovar problema torna a vacinao uma medida ineficazj que, os anticorpos especficos para cada sorovar no oferecem a proteo
adequada e ainda confundem os exames sorolgicos (THIERMANN, 1984).
No Brasil, o sequenciamento dos genomas dos sorovares iniciado pelo
copenhageni realizado pelo Instituto Osvaldo Cruz (RJ), abre a possibilidade de
utilizao de 23 protenas na produo de uma nova vacina para leptospirose. Hoje,
o sorovar copenhageni o principal responsvel pela prevalncia da leptospirose no
Brasil (2005 in: FAPESP).BLOOD e RADOSTITS (2002) apresentam como uma desvantagem terica
da vacinao o fato desta proteger contra uma invaso sistmica, mas no contra a
colonizao renal, permitindo a ocorrncia de uma leptospirria transitria, fenmeno
este que no invalida a vacinao. BOLIN (1991) afirma que a vacinao em
bovinos, depois de ocorrida a infeco, no reduz a colonizao renal dos
infectados. Em contrapartida, especificamente em relao vacinao canina, nos
trabalhos de HUHN et al. (1975) e SCHREIBER et al. (2005) a sua utilizaoconferiu boa proteo contra a leptospiremia, leptospirria e infeco renal.
MARSHALL e KERR (1974) verificaram ausncia de leptospiremias e de
portadores renais em ces previamente vacinados e posteriormente desafiados com
inculos contendo altas concentraes de icterohaemorrhagiae. No entanto, os
autores admitem que os resultados obtidos neste aspecto, podem ser diferentes
devido a muitas variveis como no caso de uma infeco prvia na qual j se
estabeleceu o status de portador renal tendo como conseqncia a manuteno
permanente da colonizao renal e do estado de portador.
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Nos trabalhos de HUHN et al. (1975), BEY e JOHNSON (1982),
BROUGTON e SCARNELL (1985) e SCHREIBER et al. (2005) nenhum dos ces
inoculados ps-imunizao, indiferentemente do tipo de vacina ou dosagem,
apresentaram sinais clnicos de leptospirose, confirmando a boa proteo vacinal.
Assim, proteger contra a infeco renal um importante critrio de qualidade
imunognica a ser alcanado para uma vacina contra a leptospirose ser considerada
eficiente (BEY e JOHNSON, 1982).
O esquema de vacinaes caninas, de um modo geral, um tema polmico,
que causa profundas divergncias (APPEL, 1999). Considerando apenas as vacinas
inativadas, o intervalo entre as doses de reforo exige reforos freqentes. Por outro
lado, vacinas vivas ao produzirem imunidade mais duradoura podem requererreforos apenas anuais. Clnicos veterinrios recomendam a revacinao anual
contra as diversas doenas. Outros recomendam a dose reforo a cada trs anos,
quando se tratando de vrus. Os fatores que causam tal discusso vo desde a
primeira imunizao, em detrimento aos nveis de anticorpos maternos, vacinas
vivas atenuadas ou vacinas inativadas, at o uso de vacinas polivalentes ou
monovalentes (AVMA, 1989; PHILLIPS et al.1989; TIZARD, 1998; APPEL,1999).
RUSSELL e RUSSELL (1994) sugerem um calendrio de imunizao onde avacina contra leptospirose deve ser realizada a cada seis meses. Este procedimento
no usado na prtica, visto que, as vacinas comerciais polivalentes associadas
com vrus preconizam a revacinao anual. LEWIS et al.(1988) recomendam trs a
quatro doses com intervalo de duas a trs semanas, com proteo assegurada por
seis a oito meses. FORD (1992), recomenda uma revacinao aps duas a trs
semanas em animais adultos vacinados pela primeira vez.
Com os 23 sorogrupos sorologicamente classificados para L. interrogansedivididos em mais de 250 sorovares ainda h muito que ser pesquisado entre as
caractersticas moleculares desta espcie, pois pouco se sabe a respeito dos seus
antgenos protetores (GITTON et al., 1992).
Para RIBEIRO et al. (2003), o levantamento da ocorrncia de diferentes
sorovares como pomona, hardjo, grippotyphosa e bratislava induz a relevncia da
pesquisa continuada no desenvolvimento de novas vacinas contra leptospirose
canina e a necessidade de incluso de novos sorovares, visando a elaborao de
vacinas mais eficazes e de respostas mais prolongadas.
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3 MATERIAL E MTODOS
3.1 ANIMAIS DO EXPERIMENTO
O experimento contou com animais provenientes do Laboratrio
Experimental da BASF-UFPR, Curitiba-Pr, constitudo de 16 ces da raa Beagle
sendo 06 machos e 10 fmeas, todos com idades entre dois e trs anos,
alimentados com a mesma rao comercial balanceada para manuteno de ces
adultos, oferecida duas vezes ao dia e gua ad libitum, em regime semi-aberto deconfinamento.
3.2 IMUNGENO UTILIZADO
Foi utilizado como imungeno bacterina produzida pelo Laboratrio Fort
Dodge (Duramune Max5-CvK/4L) contendo os seguintes sorovares: L.
icterohaemorrhagiae, L. canicola, L. pomona e L. grippotyphosa.
Esta vacina comercial liofilizada polivalente, constituda de cepas virais
atenuadas contra as seguintes doenas caninas: Cinomose, Hepatite Infecciosa
Canina, Adenovrus Canino Tipo 2, Parainfluenza, Parvovirose e Coronavirose.
As fraes Leptospirada vacina so preparadas a partir de componentes de
membrana externa, atravs da tecnologia usada para extrair os antgenos altamente
imunognicos das clulas desta bactria, designados de O.M.C. (Outer MembraneComplex).
3.3 VACINAES
O protocolo utilizado consistiu na vacinao de todos os animais no dia
considerado zero, realizando-se um reforo vacinal (booster) 90 dias aps a primo-
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vacinao, aplicando-se a dose de um mililitro, por via subcutnea, recomendada
pelo fabricante.
3.4 COLHEITA DE SANGUE E OBTENO DE SOROS
No dia considerado zero, foram colhidas amostras de sangue obtidas por
puno da veia ceflica utilizando-se seringas descartveis e agulhas calibre 25/7,
no volume de cinco mililitros, sendo alocados em tubos previamente esterilizados.
Uma vez obtido o cogulo, o soro foi centrifugado a 2.000 r.p.m. durante
quatro minutos, de modo a obter soros lmpidos. O mesmo procedimento foirealizado aos 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 dias ps-vacinais perfazendo um total
de sete colheitas ps-vacinais.
3.5 BASE FSICA LABORATORIAL
As amostras de soro foram processadas no Laboratrio Veterinria
Preventiva, em Curitiba-Pr.
3.6 TCNICA SOROLGICA EMPREGADA
As amostras de soro foram submetidas ao Teste de Soroaglutinao
Microscpica (SAM) preconizado por COLE et al.(1973), padronizado pelo Ministrio
da Sade (2001), utilizando-se antgenos vivos cedidos pelo Centro de Diagnstico
Marcos Enrietti-SEAB-PR, em Curitiba, onde as reaes aglutinantes foram testadas
frente a cinco sorovares: canicola, icterohaemorrhagiae, copenhageni, pomona e
grippotyphosa utilizando-se as diluies de 1/25, 1/50/, 1/100, 1/200 e 1/400.
Consideraram-se como soros reagentes aqueles que apresentaram qualquer reao
ao teste. Os ttulos obtidos foram anotados e comparados com objetivo de
elaborao de grficos das flutuaes observadas. Quanto a utilizao do sorovar
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copenhageni, foi devido a literatura, no decorrer do trabalho, ter apresentado um
grande aumento da presena deste sorovar na regio de Curitiba.
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4 RESULTADOS
As tabelas a seguir apresentam os resultados dos exames de
Soroaglutinao Microscpica realizados nos 16 animais do estudo.
Os ttulos de anticorpos aglutinantes foram obtidos nas sete colheitas
distintas.
4.1 TTULOS PR-VACINAIS
Os valores descriminados na Tabela 1 apresentam os ttulos de anticorpos
pr-vacinais, considerados, ento, a partir desta primeira titulao, como dia 0
(zero). Somente as amostras 05, 08, 09, e 11 mostraram-se no reagentes para o
sorovar copenhageni. No se obteve reao aglutinante para os sorovares canicola,
grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e pomona.
TABELA 1 TTULOS SOROLGICOS, PR-VACINAIS PARA L. interrogans,
SOROVARES icterohaemorrhagiae, canicola, copenhageni, pomona e
grippotyphosa, DOS 16 CES, NO DIA CONSIDERADO 0 (zero)
AnimaisL.icterohaemorrhagiae
L.canicola L.copenhageni L.pomona L.grippotyphosa
1 - - 1/25 - -2 - - 1/25 - -3 - - 1/25 - -4 - - 1/25 - -5 - - - - -
6 - - 1/50 - -7 - - 1/50 - -8 - - - - -9 - - - - -10 - - 1/25 - -11 - - - - -12 - - 1/100 - -13 - - 1/25 - -14 - - 1/25 - -15 - - 1/25 - -
16 - - 1/25 - -
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FIGURA 1 - TTULOS SOROLGICOS PR-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni
FIGURA 2 - TTULOS SOROLGICOS PR-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVARES icterohaemorrhagiae, canicola, pomona E
grippotyphosa
Sorovarcopenhageni Pr-vacinal
25%13% 6%
56%
0%0%
No reagente - 4 (1/25) - 9 (1/50) - 2
(1/100) - 1 (1/200) - 0 (1/400) - 0
Pr-vacinais para os sorovaresicterohaemorrhagiae, canicola, pomona e
grippothyphosa
100%
0%0%0%0%0%
No reagente - 16 (1/25) - 0 (1/50) - 0
(1/100) - 0 (1/200) - 0 (1/400) - 0
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4.2 TTULOS PS-VACINAIS AOS 30 DIAS
Aps 30 dias da administrao da vacina comercial os resultados ps-
vacinais obtidos para os sorovares copenhageni, canicola, pomonae grippotyphosa
esto descritos na Tabela 2; Figuras 3, 4, 5 e 6.
No se observou ttulo aglutinante para o sorovar icterohaemorrhagiae
(Tabela 2; Figura 7).
As amostras sorolgicas pertencentes aos animais nmeros 01, 02, 03, 13 e
16, que no exame pr-vacinal apresentaram ttulos 1/25, frente ao sorovar
copenhageni, tiveram os mesmos aumentados para 1/400. Nas amostras 04 e 10
observou-se uma alterao na titulao ps-vacinal de 1/25 para 1/200. A amostra
nmero 06 evoluiu de 1/50 para 1/200 no ps-vacinal e a amostra nmero 07 de
1/50 para 1/400. As amostras 05 e 08, inicialmente no reagentes, evoluram, para
1/200, e as amostras 09 e 11, igualmente no reagentes, aumentaram para 1/400. A
amostra 12, com ttulo inicial de 1/100, passou para 1/200. A amostra 14 de 1/25
aumentou para 1/100 e a amostra 15 de 1/25 para no reagente.
TABELA 2 - TTULOS SOROLGICOS AOS 30 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae, canicola, copenha-
geni, pomona egrippotyphosa, DOS 16 CES EXPERIMENTAIS
AnimaisL.icterohaemorrhagiae
L.canicola L.copenhageni
L.pomona L.grippotyphosa
1 - 1/100 1/400 - 1/252 - - 1/400 - 1/253 - - 1/400 1/25 1/254 - - 1/200 -5 - 1/50 1/200 - 1/256 - 1/50 1/200 - -7 - - 1/400 1/25 -8 - - 1/200 - -9 - - 1/400 1/25 -10 - 1/50 1/200 - -11 - - 1/400 - -12 - 1/25 1/200 1/25 1/5013 - 1/50 1/400 - 1/2514 - - 1/100 - 1/2515 - - - 1/25 1/25
16 - 1/100 1/400 - 1/50
7/25/2019 Tese Lepto
47/95
34
FIGURA 3 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR copenhageni aos 30 DIAS
FIGURA 4 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 30 DIAS
Sorovar copenhageni aos 30 dias
7%
40%
0%0% 0%
53%
No reagente - 0 (1/25) - 0 (1/50) - 0
(1/100) - 1 (1/200) - 6 (1/400) - 8
Sorovarcanicola aos 30 dias
56%
6%
25%
13%0% 0%
No reagente - 9 (1/25) - 1 (1/50) - 4
(1/100) - 2 (1/200) - 0 (1/400) - 0
7/25/2019 Tese Lepto
48/95
35
FIGURA 5 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR grippotyphosaAOS 30 DIAS
FIGURA 6 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR pomonaAOS 30 DIAS
Sorovargrippothyphosa aos 30 dias
43%
44%
13%0%
0%
0%
No reagente -7 (1/25) - 7 (1/50) - 2 (1/100) - 0 (1/200) - 0 (1/400) - 0
Sorovar pomona aos 30 dias
69%
31%0%0%0%0%
No reagente - 11 (1/25) - 5 (1/50) - 0
(1/100) -0 (1/200) -0 (1/400) - 0
7/25/2019 Tese Lepto
49/95
36
FIGURA 7 - TTULOS SOROLGICOS PR E PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogansSOROVAR icterohaemorrhagiae DURANTE OS 210 DIAS
DE EXPERIMENTO
4.3 TTULOS PS-VACINAIS AOS 60 DIAS
Observou-se aos 60 dias uma queda dos ttulos sorolgicos, principalmente
naqueles obtidos para o sorovar copenhageni. Quatro amostras que apresentavam
ttulos de 1/400 baixaram para 1/200 (amostras 01, 03, 07 e 16); trs amostras com
mesmo ttulo de 1/400 baixaram para 1/100 (amostras 02, 09 e 11) e uma amostra
de mesmo ttulo (1/400) baixou para 1/50 (amostra 13). Cinco amostras com ttulos
de 1/200 baixaram para 1/100 (amostras 05, 06, 08, 10 e 12); uma amostra comttulo de 1/200 manteve o mesmo ttulo (amostra 04). Somente duas amostras no
reagiram: uma amostra j anteriormente no reagente (amostra 15) e outra que
apresentou anteriormente ttulo de 1/100 (amostra 14) (Tabela 3; Figura 8).
Sorovar icterohaemorrhagiae durante os 210 diasde experimento
100%
0%0%0%0%0%
No reagente -16 (1/25) - 0 (1/50) - 0
(1/100) - 0 (1/200) - 0 (1/400) - 0
7/25/2019 Tese Lepto
50/95
37
TABELA 3 TTULOS SOROLGICOS AOS 60 DIAS PS-VACINAIS PARA L.
interrogans, SOROVARES icterohaemorrhagiae, canicola,
copenhageni, pomona e grippotyphosa, DOS 16 CES
EXPERIMENTAIS
AnimaisL.icterohaemorrhagiae
L.canicola L.copenhageni L.pomona L.grippotyphosa
1 - 1/25 1/200 - -2 - - 1/100 - -3 - - 1/200 1/25 -4 - - 1/200 - -5 - 1/50 1/100 - -6 - 1/25 1/100 - -
7 - - 1/200 - -8 - - 1/100 - -9 - - 1/100 - -10 - 1/50 1/100 - -11 - - 1/100 - -12 - - 1/100 - -13 - 1/25 1/50 - -14 - - - - -15 - - - - -
16 - 1/50 1/200 - -
FIGURA 8 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVARcopenhageni AOS 60 DIAS
Sorovar copenhageni aos 60 dias
50%
31%
13%
6%
0%0%
No reagente (1/25)-0 (1/50) - 1(1/100) - 8 (1/200) - 5 (1/400) - 0
7/25/2019 Tese Lepto
51/95
38
FIGURA 9 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR canicola AOS 60 DIAS
FIGURA 10 - TTULOS SOROLGICOS PS-VACINAIS PARA Leptospira
interrogans SOROVAR grippotyphosaAOS 60, 90, 120, 150, 180 E 210
DIAS
Sorovargrippotyphosa aos 60