Post on 21-Apr-2015
TÉCNICAS DE MARCADORES MOLECULARES
Antonio costa de Oliveira, PhD
Aula 6 - 2013
Marcadores moleculares
• Marcadores moleculares são fragmentos de DNA associados/responsáveis por uma característica genética, apresentando uma variação detectável entre indivíduos da população testada (marcador genético)
Marcadores podem ser dominantes?
• Dominantes (presença x ausência de banda)
• Codominantes (bandas de diferentes tamanhos)
Detecção de polimorfismo - Introdução
• Detectando polimorfismos de DNA • Molécula de DNA > 10 pb = mesma razão massa/carga.• Eletroforese em gel – ferramenta mais comum;• Detecção de um grande número de amostras – era pós
genômica;• Eletroforese capilar -capillary array electrophoresis• MALDI-TOF MS - matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
F2
P2
F1
P1 x
large populations consisting of thousands of plants
PHENOTYPIC SELECTION
Field trialsGlasshouse trials
DonorRecipient
CONVENTIONAL PLANT BREEDING
Salinity screening in phytotron Bacterial blight screening Phosphorus deficiency plot
F2
P2
F1
P1 x
large populations consisting of thousands of plants
ResistantSusceptible
MARKER-ASSISTED SELECTION (MAS)
MARKER-ASSISTED BREEDING
Method whereby phenotypic selection is based on DNA markers
Eletroforese
• Amostras são carregadas em um gel e submetidas a um campo elétrico. Como o DNA carrega-se negativamente, as moléculas migram para o pólo positivo. A separação de moléculas é estritamente devida a sua massa molecular;
• Matrizes: agarose e poliacrilamida
Agarose Poliacrilamida
% Resolução (kb) % Resolução (pb)
0.9 0.5 - 0.7 3.5 1000 – 2000
1.2 0.4 - 6.0 5.0 80 – 500
1.5 0.2 - 3.0 8.0 60 – 400
2.0 0.1 - 2.0 12.0 440 - 200
Poder de resolução
Idéias iniciais
• Dependendo do marcador, usa-se o polímero mais adequado.• RFLP e RAPD – agarose• Microsatélites e AFLPs – geram fragmentos menores – poliacrilamida é mais
indicado • Após a eletroforese, um agente de detecção é utilizado. Brometo de etídio
(agarose)ou Nitrato de prata (poliacrilamida). Pode-se incorporar um nucleotídeo marcado durante o passo de PCR (AFLP e SSR). A revelação é então feita com autorradiografia.
• Microsatélites – Também usada a técnica de laser. Neste caso o primer é marcado com um corante fluorescente e separado em gel de poliacrilamida.
• RFLPs – requer o uso de uma hibridização de Southern. Moléculas separadas em um gel de agarose são transferidas para uma mebrana de nylon. A membrana então contém uma cópia da distribuição dos fragmentos no gel. Uma sonda da sequência de interesse é então hibridizada à membrana. As sondas não ligadas são removidas por uma série de lavagens estringentes. A membrana é exposta a um filme de autorradiografia e o polimorfismo é revelado no filme.
TIPOS DE MARCADORES
FenotípicoFenotípicoss morfológicos
bioquímicos: isoenzimas, proteínas de reserva
GenotípicosGenotípicos
RFLP (restriction fragment length polymorphism)
RAPD (random amplified polymorphism DNA)SSR (simple sequence repeats) = microsatélitesAFLP (amplified fragment length polymorphism)ISSR (inter-simple sequence repeats)SCAR (sequence-characterized amplified regions)STS (sequence-tagged sites)SNPs (single nucleotide polimorphisms)
PCR
Locos RFLP• Uma análise de RFLP é uma aplicação da técnica de Southern. • • Clones, Enzimas e hibridizações informativas• Marcadores RFLP são definidos por uma combinação específica de enzima-sonda.• Clones genômicos escolhidos ao acaso podem frequentemente não funcionar por causa
que genomas de plantas muitas vezes consistem de um grande número de sequências repetitivas.
• As duas fontes primárias de clones para mapeamento dde plantas e animais usando RFLP são clones de cDNA e clones genômicos derivados de PstI. Clones PstI são baseados na idéia de que genes expressos não são metilados. A enzima PstI é sensível à metilação e protanto estes fragmentos teriam grande probabilidade de ter poucas cópias no genoma.
• Quando vários clones são obtidos, DNA de genótipos paternos são digeridos com uma série de enzimas e hibridizados com os clones. Algumas destas hibridizações irão gerar polimorfismos que podem ser utilizados para o mapeamento na progênie.
Genetics Techniques: Genetics Techniques: RFLP & PCRRFLP & PCR
RFLP
• To see RFLP, DNA is digested with the appropriate restriction enzymes and run on an agarose gel.
• A Southern Blot is performed to complete the analysis.
RFLP
• Stands for Restriction Fragment Length Polymorphism
• Takes advantage of differences in DNA between individuals that result in different fragments when digested with restriction enzymes
How many fragments will result when each of these alleles are digested with DdeI?
3 fragments
2 fragments
Southern Blotting
• A method to visualize specific segments of DNA– usually a particular gene.
• Uses radioactive probes that bind to the specific DNA segments– Ex. When testing for the
hemoglobin alleles, the probe would bind to these regions
Southern Blotting
• Steps: – Soak gel in basic solution to separate DNA
strands– Transfer DNA on to a nylon membrane
(spacing of DNA is maintained)– Incubate with radioactive probe for specific
segment– Wash away unbound probe– Detect probes using x-ray film
autoradiograph
RFLP
AUTORRADIOGRAFIA
Extração de DNA
TransferênciaDo DNA paramembrana denitrocelulose
Gel de agarose:Separação dosfragmentos
Digestão total
Hibridização c/sonda radioativa
RFLPs in varieties
• Availability of aneuploids
1 2 4 5 6 7
A
B
D
3
RFLPs group 3s