Post on 22-Apr-2015
Histórico• 1975: primeira descrição do sequenciamento.
• Esse procedimento foi feito usando DNA polimerase, primer, dNTP e ddNTP marcadas por 32P.
Sanger, Coulson, 1975.
ddNTPS
• Atkinson mostrou a atividade inibitória do ddTTP (2´3´dideoxitimidina trifosfato).
• Após a incorporação do ddTTP ocorre a inibição da síntese da cadeia.
ATKINSON, DEUTSCHER, KORNBERG, RUSSELL, MOFFATT. 1969 SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997
Metodologia
• Desnaturação do DNA de dupla fita.
• Primers: iniciam a reação feita pela DNA polimerase, nesse momento será definido qual a cadeia que será usada como molde.
Sanger, Coulson, 1975.
Metodologia
• Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs.
• Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente ao invés do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização.
Sanger, Coulson, 1975.
ddNTP marcada por 32P
• Feitas 4 reações: uma para cada base ddNTP marcada por 32P.
• Formados diversos fragmentos com tamanhos variados, de acordo com a posição e o ddNTP incorporado.
Sanger, Coulson, 1975.
ddNTP marcada por 32P
• Feito gel desnaturante de poliacrilamida.
• A autoradiografia é feita após a corrida do gel.
Sanger, Coulson, 1975.
Leitura
• Após autoradiografia a ordem dos nucleotídeos, pode ser visualizada.
• Porém, esta será complementar ao molde.
Sanger, Coulson, 1975.
Sequenciadores automáticos
• Criado em 1986 pela Applied Biosystems.
• O princípio é o mesmo do sequenciamento manual feito por Sanger.
• ddNTPs são marcados por fluorescência característica, permitindo a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência.
Sequenciadores automáticos
• Feita a eletroinjeção onde as moléculas de DNA(-) em suspensão são introduzidas nos capilares.
• Cada fragmento, recebe um feixe de laser de argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD.
Sequenciadores automáticos
• A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde.
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGTATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGGGTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCTGGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGTTCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNACCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCGGCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAGGGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAGGGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGACACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNACANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANCCCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNNCCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNNNNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN
Formato de saída – SEQ
Principal aspecto positivo
• Leitura de fragmentos longos.
Principal aspecto negativo
• Valor elevado por base sequenciada.