Post on 31-Aug-2020
Vítor Manuel Jorge Duque
Serviço de Doenças Infeciosas
Faculdade de Medicina
Universidade de Coimbra
Introdução
Partícula e genoma VIH-1
gp120
gp41
p17
Capsídeo p24
TI
ARN
MHC
Dupla
camada
lipídica
Matriz
Envelope
Envelopegp105
gp36
Matrix p15
Capsídeo p26
TI
ARN
MHC
Camada
lipídica
vpx
vpr
Partícula e genoma VIH-2
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Fauci et al. Ann Intern Med 1996;124:654-663
MÉTODOS DIRECTOS
— CULTURA VÍRICA
— DETECÇÃO DE ác. NUCLEICOS - PCR, bDNA, NASBA
— ANTIGENÉMIA p24
MÉTODOS INDIRECTOS
— MÉTODOS DE RASTREIO
— MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO
Infecção VIH - métodos laboratoriais
MÉTODOS DE RASTREIO
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays)
Métodos rápidos
Métodos simples
MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO OU SUPLEMENTARES
Western Blot
Imunofluorescência indirecta (IFA)
Line Immunoassay
Infecção VIH - métodos laboratoriais
MÉTODOS INDIRECTOS
RASTREIO
Detectam todos os indivíduos infectados
Alta sensibilidade (99,9%)
Falsos negativos (0,03 a 0,001%)
CONFIRMATÓRIOS
Identificam todos os não infectados com teste de rastreio positivo
Alta especificidade (99,94%)
Falsos positivos (0,0004 a 0,0007%)
Infecção VIH - métodos laboratoriais
FORMATO DOS TESTES
Microplaca
Esferas
Microesferas
Tiras de papel
Tiras de plástico
SISTEMAS INDICADORES
Produção de cor
Inibição da cor
Radioactividade
Fluorescência
Quimioluminescência
Infecção VIH - métodos laboratoriais
SISTEMAS ELISA
Indirecto
Competitivo
Sandwich de acs
Sandwich de ags
Captura de acs específicos
PLATAFORMAS
Manual
Semi-automatizado
Automatização total
Infecção VIH - métodos laboratoriais
CLASSIFICAÇÃO:(fonte de antigénio e formato)
1ª Geração — lisados víricos
— culturas em linhas humanas de linfócitos T
2ª Geração — ags recombinantes expressos em sistemas
— bacterianos ou fúngicos
— oligopeptídeos sintéticos (15-20 aa)
3º Geração — ags recombinantes ou sintéticos
— em formato de sandwich
4º Geração — detecção simultânea de ags e acs
Infecção VIH - métodos laboratoriais
ANTIGÉNIOS DE LISADO VÍRICO
sensibilidade baixa
especificidade baixa (amostras de África)
contaminantes celulares - locus HLA
falsos positivos se anticorpos anti - HLA
exposição a leucócitos
durante a gravidez
transfusões sanguíneas
Infecção VIH - métodos laboratoriais
ANTIGÉNIOS RECOMBINANTES
antigénios produzidos em grande quantidade
único produto vírico produzido
usados em combinação
alta sensibilidade
alta especificidade
contaminantes provenientes do veículo
alguns falsos positivos
Infecção VIH - métodos laboratoriais
ANTIGÉNIOS DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS
sequência de aa conhecida
sintetizador de peptídeos
escolha de porções (epitopos) de antigénios
cadeia de 10-40 aa
isoladamente ou em combinação
menos reacções cruzadas
maior especificidade (confirmação da infecção VIH)
maior grau de pureza
ausência de contaminantes
desvantagens - sensibilidade
- ags não glicosilados
Infecção VIH - métodos laboratoriais
TESTES DE RASTREIO
Detecção por ELISA
MÉTODO INDIRECTO
Ags ligados a microplaca ou esfera
Incubação com a amostra - 30’ a 37 - 40ºC
Lavagem
Incubação com o conjugado - 30’ a 37 - 40ºC
Lavagem
Incubação com substrato
Leitura em espectrofotómetro
Infecção VIH - métodos laboratoriais
TESTES DE RASTREIO
Detecção por ELISA
MÉTODO SANDWICH
Ags ligados a microplaca ou esfera
Sandwich de ag-ac-ag marcado
Vantagens:
Método mais sensível
Todas as classes de acs são detectadas
Detecção de acs anti VIH-1 e VIH-2
Isoladamente ou em combinação
Infecção VIH - métodos laboratoriais
ELISA para a detecção de anticorpos anti-VIH
Microplaca para pesquisa de anticorpos anti-VIH por ELISA:
poços coloridos indicam reactividade
Após várias etapas de incubação e de lavagem, há desenvolvimento de
reacção colorimétrica na presença de anticorpos específicos contra o VIH
Resultados
Positivo
Negativo
Enzyme ImmunoAssays (EIAs)
MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO
Western blotMétodo padrão para a validação dos resultados
Ags de VIH obtidos por lisado de cultura
Separação por electroforese em gel de poliacrilamida
Transferência (blot) para nitrocelulose
Tiras com bandas de antigénios
Amostra - diluída 1/50 a 1/100
Identificação de Acs - método indirecto
Padrão de bandas típico para o VIH
gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, p15
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Line immunoassay (LIA)
para a pesquisa de anticorpos anti-VIH-1
• Há critérios diferentes para a
interpretação dos resultados do
Western blot para HIV ex.:
CDC, WHO, American Red
Cross.
• As bandas de positividade de
anticorpos mais importantes
são contra as glicoproteínas do
envelope gp120, gp160 e gp41
• O anticorpo anti-p24 está
habitualmente presente mas
pode estar ausente nas fases
tardias da infecção VIH
FDA 3 bandas: p24, p31, e gp41
ARC 1 banda de cada gene estrutural (gag, pol e env)
CDC 2 bandas das seguintes: p24, gp41 e gp120/160
CRSS 1 banda do core (gag ou pol) e outra do env
OMS 2 bandas do envelope
CNTS/PEI 2 bandas, uma delas do envelope
ARC - American Red Cross
CRSS - Consortium for Retrovirus Serology Standardization
CNTS/PEI - Centre National de Transfusion Sanguine
Western blot
Resultado positivo:
MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Western blot
Resultado negativo: ausência de todas as bandas
OMS - banda p17 fraco (sem seguimento posterior)
Resultado indeterminado: não positivo – reactividade para 1 ou mais bandas
ocorre em 15% dos indivíduos não infectados
bandas fracas mais frequentes (gag) p17, p24 e/ou p55
não prediz uma infecção precoce
sugerem infecção precoce — p24, p31 e p55
banda do envelope isolada (seguimento - OMS)
MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Métodos de rastreio:ELISA para VIH-2
ELISA combinado VIH-1/VIH-2
Métodos de confirmação:
Western blot para VIH-2 ou Combinado VIH-1/VIH-2Resultado positivo:
OMS — reactividade para dois ags do envelope (gp36 ou gp105) (env)
Outros — reactividade p26 (gag)
RIPA (Radioimmunoprecipitation assay)método de investigação (rigor técnico)
necessita de material radioactivo
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Métodos directos
Células primárias
Linfócitos T varia com o dador
CD4 purificados ausência de CD8+, isolamento
Monócitos
Linhas celulares T
Jurkat presença de marcadores celulares
CEM variantes diversas
Sup-T1 expressão de CD4+ e CD8+
MOLT-4 muito citopática e fusogénica
HUT-78/H9 fusogénica
MT-4 infectada por HTLV-1. Citopática
Linhas celulares monocíticas
HL-60 susceptível à infecção, por contacto
U937 moderadamente citopática
THP-1 muito citopática
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Métodos de cultura celular
Cultura qualitativa
Cultura quantitativa
PCR (Polymerase chain reaction)
1 – Recém-nascidos de mães infectadas pelo VIH-1
PCR DNA e/ou RT-PCR RNA
2 – Rastreio de dádivas de sangue
3 – Diagnóstico precoce da infecção primária VIH-1
4 – Padrão serológico indeterminado
Subtipos não-B
Infecção VIH - métodos laboratoriais
PCR negativa em indivíduos com teste VIH-1 positivo
Transmissão passiva (materno-fetal) Positivo verdadeiro
Mutações críticas na região analisada Problema da PCR
Presença errática da sequência estudada
Baixa sensibilidade da análise
Erro técnico Problema do laboratório
Anticorpos com reactividade cruzada:
lúpus,
fibrose quística, Positivo falso
vacina da gripe,
transfusões
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Infecção HIV perinatal
18 meses 18 meses
ELISA Serologia IgGNÃO É ÚTIL
+–
WB
–
+
Ind
Algoritmo de diagnóstico
2
Dias
Infecção Aguda
3 4 57
Semanas
14 24
Infecção Estabelecida
NAT (10 a 12 dias)
P24 (16 dias)
4ª geração
3ª geração (22 dias)
WB
EIA*
CD4+
Acs anti-VIH
Viremia
Eliminação Genital
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Estratégias e algoritmos de
diagnóstico
Algoritmo padrão
Rastreio com ELISA Resultado negativo
Resultado positivo
Repetir ELISA em duplicado
Testes confirmatórios
Infecção VIH - métodos laboratoriais
Métodos rápidos de diagnóstico
Reativo ou “Positivo”
• Banda teste
• Banda de controlo
Não Reativo ou “Negativo”
• Banda de controlo isolada
Inválido
• Não há banda de controlo
• Teste não válido. Repetir com novo dispositivo
Resultados possíveis
Métodos rápidos de diagnóstico
Colheita e transporte de amostras
Amostras usadas em métodos
rápidos
• Sangue total
• Soro
• Plasma
• Saliva
• Urina
Colheita de sangue – por punção
venosa
Colocar todos os componentes
à temperatura ambiente (15-30 ºC)
1. Colocar os reagentes e amostras
à temperatura ambiente (15-30 ºC)
2. Amostras:
10 mL de plasma ou soro (2-8 ºC –14 dias)
20 mL de sangue total (2-8 ºC – 3 dias)
1. Preparar os reagentes e
restante material necessário
2. Colocar o suporte numa superfície
plana e nivelada.
Remover o dispositivo da
embalagem e marcar o dispositivo e
a “developer vial” com o número
de identificação da amostra.
3. Cuidadosamente destape a
“developer vial” e coloque-a no
suporte.
4. Colher cerca de 5 µl da
amostra com uma ansa
descartável.
4. Usar a ponta almofadada do dispositivo
teste para colher a amostra esfregando
uma vez a superfície exterior das gengivas
inferiores e superiores.
5. Transferir a amostra colhida para o
frasco. 6. Agitar a amostra no frasco com a ansa.
OraQuick: transferência da amostra
7. Inserir a almofada do dispositivo completamente no frasco
com a janela dos resultados voltada para o observador.
OraQuick: Inserir o dispositivo teste no frasco
tampão
8. Encubar 20 minutos (não superior a
40 min.) antes da leitura dos resultados.
9. Ler e registar os resultados
na folha de trabalho.
OraQuick: Obtenção de resultados
Reativo InválidoNão-reativo
OraQuick: Interpretação
Os métodos indirectos (ELISA e Western blot) são o padrão para o diagnóstico da infecção VIH quando utilizados de forma sequencial em meio hospitalar.
Os métodos moleculares têm indicação no diagnóstico precoce da infecção VIH-1 (síndroma vírica aguda e transmissão vertical), rastreio de dádivas de sangue e em algumas situações particulares (alternativa aos métodos suplementares).
Vários métodos rápidos têm sido desenvolvidos com o objectivo de rastrear a infecção VIH e permitir em simultâneo o aconselhamento pré e pós-teste.
Métodos rápidos de diagnóstico podem ser utilizados no diagnóstico da infecção em locais “point of care”.
Os objectivos são o de permitir o acesso universal à prevenção, cuidados de saúde e ao tratamento consistente com as declarações da OMS (Millenium development goal 6) e UNAIDS.