RODRIGO ROCHA LATADORODRIGO ROCHA LATADO

2

PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

VEGETAIS

3

MICROPROPAGAÇÃO DE PLANTAS

4

PROPAGAÇÃO DE PLANTAS

• Semente (via sexuada): espécies com poucas sementesespécies sem sementesperda da germinaçãoprogênie heterogênea

• Vegetativa (via assexual)in vivo: estaca, enxertia, borbulha

processo lentopropagação de doençassazonalidadeespaço físico

in vitro: meristema apicalsegmento nodal estímulo a gemas axilares

5

MICROPROPAGAÇÃO: propagação clonal de genótipos selecionados, utilizando técnicas de cultura de tecidos, visando a produção de plantas em massa, a um preço competitivo• uso de explantes com meristemas pré-existentes

• meristema apical: dome com células totipotentes divisão constante

não tem conexão com xilema e floema

• ápice meristemático: dome meristemático + primórdios foliares

Vantagens: > número de mudasrapidezrejuvenescimentolivre de doençasespaço físico reduzidosazonalidade

Desvantagens: variação somaclonalcontaminaçãoaclimatizaçãocustoprotocolo

6

meristema x ápice meristemático

7

MICROPROPAGAÇÃO: descoberta das citocininas descrição do meio MS

EXPLANTES

• ápice meristemático

• segmento nodal: alongamento de ramo com vários nós

• proliferação de gemas axilares: quebra de dominância apical brotos axilares são explantes secundários para próximos ciclos

Principais culturas: Banana, Cana-de-açúcar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

8

ETAPAS DA MICROPROPAGAÇÃO

Introdução do explante

Indução de brotações

Aclimatizaçãodas plantas

Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro

9

Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca

10

MICROPROPAGAÇÃO

Estádio 0: seleção da planta matrizsanidadeestádio fisiológicoestado nutricional

Estádio 1: estabelecimento da cultura asséptica e viávelépoca de retirada do explanteposição do explante na planta matrizbaixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina

Estádio 2: multiplicaçãoalta [ ] de citocininanúmeros de subcultivos

Estádio 3: alongamento e enraizamentoácido giberélico, auxinas (IBA, NAA)

Estádio 4: aclimatizaçãocontrole de umidade e luz

11

MICROPROPAGAÇÃO

Meio de Cultura Sólido: ágar, gelmelhor aeraçãoabsorção de nutrientes é deficiente

• Meio de Cultura Líquido: estacionário, agitaçãomaior disponibilidade de nutrientesmaior disponibilidade de águaoxigenaçãosuporte: papel de filtro, espuma

• Imersão Temporária: alternância de meio de cultura líquido com ausência de meio de cultura

melhor aeração maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)

12

CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VÍRUS

13

LIMPEZA DE VÍRUS

Doenças de Plantas: fungos, bactérias, vírustransmitidas na propagação vegetativa

White (1934): vírus estão distribuídos de maneira desuniforme em raiz de fumoredução da concentração em direção à

extremidadeápice radicular livre de vírus

Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentração de vírus na parte aérea

Morel & Martin (1952): plantas de dália livres de vírus

14

LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência

Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata,

Plantas ornamentais

15

LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência

16

LIMPEZA DE VÍRUS

• termoterapia + cultura do ápice meristemático

ex: vírus do mosaico da cana-de açúcarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) +

termoterapia (45oC / 8 horas)

• quimioterapia + cultura do ápice meristemáticoincorporação de antivirais no meio de cultura

• Indexação: avaliação da presença do vírusensaios biológicosmicroscopia eletrônicaserologia (ELISA)hibridação com ácido nucleico

17

CULTURA DE CALOS

18

CULTURA DE CALOS

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...)

3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO - INDUÇÃO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas)

Calos em citros (meio contendo BAP)

4. DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR - retorno das células ao estado meristemático

Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

19

CULTURA DE CALOS

5. SUBCULTIVOS MENSAIS

- mesmo meio de indução

- outros meios

6. DIFERENCIAÇÃO CELULAR- utilizando uma das duas vias,

- Organogênese somática

- Embriogênese somática

7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

20

CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

21

CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

FASES

1. EXPLANTES (calos - células meristemáticas, alta taxa de divisão celular)

2. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO LÍQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos

3. AGITAÇÃO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenação do meio

4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias

22

CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

SELEÇÃO in vitro - adição de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumínio, PEG (seca) e outros

5. ALTA TAXA DE CONTAMINAÇÃO - motivo: meio líquido

6. TRANSFERÊNCIA PARA MEIO SÓLIDO - obtenção de calos

7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

23

CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

Células Células em meio contendoalta osmolaridade

Células em suspensãoAgitador orbital

24

CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

25

CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (anteras (micrósporo), pólen, óvulos, ovários vegetais)

3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO (pré-tratamento)

4. INDUÇÃO DE ORGANOGÊNESE OU ÊMBRIOGÊNESE - direta (sem passar pela fase de calos)

- indireta (com passagem pela fase de calos)

Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

26

CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES

FASES

5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro

- alongamento das plantas - enraizamento - aclimatização

6. OBTENÇÃO DE PLANTAS HAPLÓIDES OU DUPLO-HAPLÓIDES

- duplicação cromossômica natural ou com utilização de drogas antimitóticas

- drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )

27

CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES

Flor Anteras Micrósporogerminando

Embriogênesesomática

MultiplicaçãoAclimatização

28

CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES

Flor - Ovário Óvulos Calos

Organogênesesomática

Obtenção de plantasMultiplicação

29

CULTURA DE PROTOPLASTOSVEGETAIS

30

CULTURA DE PROTOPLASTOS

- Células vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas)

Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas

- sensíveis a modificação na osmolaridade do meio e a luz

- meio mais concentrado protoplastos perdem água para o meio

- meio mais diluído protoplastos absorvem água do meio

meios geralmente entre 0,4 e 0,8M

31

CULTURA DE PROTOPLASTOS

- usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio

- A ausência de parede celular possibilita a fusão de protoplastos

- Isolamento, purificação e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade

MEIOSMeios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)

Solução de enzimas 0,4M

Solução de Polietileno glicol a 50%

Agarose tipoVII (baixo ponto de fusão) - 1,2%

32

MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989)

Composição mg/L

1. CaCl2*2H2O 1.4802. MgSO4*7H2O 2463. KNO3 1014. KH2PO4 27,25. KI 0,16

- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)- ajustar o pH 6,0- esterilizar

SOLUÇÕES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L

A. CaCl2*2H2O 50x 20 mL/L

B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L

33

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Material esterilizado

- placas de Petri

- peneiras com poros de 50 m

- tubos 8 ml com tampa

- pipetas Pasteur

34

CULTURA DE PROTOPLASTOS

FASES1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspensão celular, pétalas, anteras)

2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitação 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h.

3. PURIFICAÇÃO - peneiramento, centrifugação, retirada da solução, lavagem com CPW

4. FUSÃO - adição de PEG ou eletrofusão

5. RETIRADA DO PEG

6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSÃO - meio MS 0,4M(2X) e agarose

35

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Explante Protoplastos Viabilidade deprotoplastos

FusãoFusãoFusão múltipla

36

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Primeira divisão Microcalo Microcolônia

Calos e embriões somáticos

Embrião somáticoEmbrião

germinando

37

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Plantasin vitro

Placa com embriões germinando

Desenvolvimento das plantase enraizamento

Aclimatização ao meio ambiente