RNA interference in biology and disease

Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams

Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri

Mariana Marques de Sá Coutelo Chagas

Blood, 1º de Agosto de 2005/ volume 106, nº3

Introdução RNA interference (RNAi): Processo pós-transcricional

RNA fita-dupla (dsRNAs)

Silenciamento do gene específico(Degradação do mRNA)

Processo que ocorre naturalmente em diversos organismos

1. Proteger os organismos contra vírus

2. Eliminar produtos de degradação anômalos

Funções:

1928 - Descrito primeiramente em plantas. Planta Tabaco infectada com vírus – Níveis altos de resistência. (Wingard SA, 1928)

1998 - Primeiro trabalho utilizando a técnica de RNAi:

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.

(Fire A. and Cols., 1998)

Antisense

dsRNA

Introdução

Hibridização do RNA marcado com o mRNA

Micrografia de contraste

2001 – Análises em Drosophilas (RNAi em 2 etapas)

Descoberta da clivagem do mRNA em Drosophila. (Zamore and cols., 2001)

Descoberta da clivagem do dsRNA em Drosophila.Fragmentos de 21 a 23 nt

(siRNAs)

Processo de RNAi provocado experimentalmente – (siRNAs sintéticos)

Síntese química e transcrição in vitro

Kits produzidos por empresas

Introdução

RNAi realizado com plasmídeos – expressão de siRNAs

Grampos de siRNAs (shRNAs) sob o controle de uma RNA pol III

Introdução

Inicia a síntese a uma distância conhecida dos promotoresTermina quando encontra cadeia de 4 a 5 uridinas.

Outros dois tipos de silenciamento de genes:

1. Silenciamento do mRNA por micro RNAs endógenos (miRNAs)

Formação de uma grampo de RNA fita dupla

2. Silenciamento por modificação do empacotamento do DNA celular e Histonas que levando ao silenciamento transcricional da heterocromatina.

Introdução

Degradação de mRNAs anômalos ou produzidos indevidamente

Passo inicial: adição de dsRNA que é reduzido a partes menores conhecidas como siRNA. Estes por sua vez se ligam a complexos enzimáticos endoribonucleases RISC.

Passo efetor: siRNA se conjugam ao RISC e são guiados ao mRNA, onde ocorrem as clivagens

Mecanismo de Ação

Mecanismo de Ação

Enzimas:– DICER– RISC

Eficiente em baixo número de cópias Eficiente em baixo número de cópias e altamente específicoe altamente específico

Manutenção e persistênciaManutenção e persistência

Efeito rápido e eficazEfeito rápido e eficaz

Características da técnica

Experimentos genômicos

Cientistas estão utilizando esta tecnologia para desativar genes humanos ou de agentes transmissores de doenças.

Já foram desenvolvidos instruções para silenciar, de maneira rápida e eficiente, 15.000 genes humanos.

HIV

Silenciamento de células com HIV está sendo feito “in vitro”

Bloqueio da invasão

e replicação do vírus

Câncer Pesquisadores

têm silenciado mais de uma dúzia de genes

Pesquisadores estão trabalhando para decifrar 15.000 genes em uma variedade de Câncer

Hepatite C

Experimentos em ratos obteve sucesso

Produção de vetores virais para tratamento de células humanas

Doença de Huntington

RNAi pode silenciar genes problemáticos

O tratamento também têm silenciado genes saudáveis

Infecções respiratórias Criação de drogas

inalatórias que poderão servir para o tratamento de SARS e influenza.

RNA são inalados e atingem seus alvos intactos e controlam vírus.

Aplicações do RNAi

Aplicações do RNAi

Contruir uma seqüência efetiva de siRNAs que possa ser

reconhecida e amplificada pelas polimerases.

(Limitação vem sendo diminuída)

Limitações da RNAi

Eficácia do RNAi depende:

Estrutura do siRNA

Receptividade do tipo celular

Meia vida do mRNA e/ou proteína

Aumento cada vez maior da estabilidade (“in vivo”)

Avanços estão sendo realizados para fazer os siRNAs

adequados para propostas terapêuticas.

Efeitos não específicos e fora do alvo da RNAi

1. Mecanismo eficiente do siRNA “ in vivo ”.

2. Evitar efeitos não específicos ou fora do alvo do siRNAs.

siRNAs ativando uma resposta celular alternativa, regulando genes associados com a resposta imune.

Alteração da expressão de outros genes em resposta a presença do siRNA.

Interferon – citocinas da primeira linha de defesa contra infecções virais em mamíferos, que induz a ativação transcricional de genes.

Ativação da resposta imune inata é ativada pelos dsRNAs

Produto dos genes ativados – atividade antiviral e antiproliferativa.

2 considerações importantes:

Conclusões

Estratégias para aumentar o nível de eficiência da RNAi e minimizar os efeitos não específicos ou fora do alvo:

1. Utilizar informações disponíveis para sintetizar siRNAs mais específicos e que possam ser usados numa concentração cada vez menor, mas mantendo a sua eficácia.

2. Utilizar os siRNAs contra as sequências alvo sem que eles causem efeitos não específicos;

3. Resgatar fenótipos causados pela expressão de um siRNA ectópico de um gene que não poderia ser silenciado pelo siRNA.

Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de silenciamento gênico.

OBRIGADO!!!!!