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RITA DE CÁSSIA LIMA RIBEIRO
LEUCOSE ESPORÁDICA EM BOVINOS COM DOENÇAS
NEUROLÓGICAS NO ESTADO DO PARANÁ.
Londrina
2012
RITA DE CÁSSIA LIMA RIBEIRO
LEUCOSE ESPORÁDICA EM BOVINOS COM DOENÇAS
NEUROLÓGICAS NO ESTADO DO PARANÁ.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal (nível mestrado)
área de concentração: Sanidade Animal da
Universidade Estadual de Londrina como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Frederico
Rodrigues Loureiro Bracarense
Londrina
2012
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
R484l Ribeiro, Rita de Cássia Lima.
Leucose esporádica em bovinos com doenças neurológicas no estado do
Paraná / Rita de Cássia Lima Ribeiro. – Londrina, 2012. 52f. : il.
Orientador: Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarense.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universidade Estadual de
Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Leucose – Teses. 2. Linfoma bovino – Teses. 3. Sistema nervoso
Central – Teses. I. Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro. II.
Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de
Pós-Graduação em Ciência Animal. III. Título.
CDU 619:616.15
RITA DE CÁSSIA LIMA RIBEIRO
LEUCOSE ESPORÁDICA EM BOVINOS COM DOENÇAS
NEUROLÓGICAS NO ESTADO DO PARANÁ.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal (nível mestrado)
área de concentração: Sanidade Animal da
Universidade Estadual de Londrina como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro
Bracarense
UEL – Londrina –PR
Prof. Dr. Antonio Carlos Faria dos Reis
UEL – Londrina –PR
Prof. Dr. Kleber Moreno
UEL – Londrina –PR
Londrina, 12 de janeiro de 2012.
À Joaninha.
AGRADECIMENTOS
Professores:
Ana Paula, Giovana, Antônio Carlos, Júlio, Kleber e Karina.
Amigos:
Claudia, Raquel, Gislaine, Aline, Alessandra, Rogério, Juliana, Reginaldo,
Elisangela, Letícia, Gustavo, Priscila, Amude, Patrícia, Rebeca, Karina, Luciana, Danilo,
Laura, Rose.
Família:
Clodoaldo, Mãe, Pai, Caca, Rafael, tia Rudiane, tio Hélcio, Regina,
Genilson, Vica, Clara, Patrícia, Daine e os pequenos Maria, João e Gabi.
Aos animais:
Mingau, Leon, Che, Frida, Raissa, Lenin, Leco, Bianca, Paquita e todos que
já passaram em minha vida e que contribuíram para que eu ame esta que é a minha profissão.
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Patologia Animal e
Setor de Grandes Animais do Hospital Veterinário nos Departamentos de Medicina
Veterinária Preventiva e Clínica Veterinária do Centro de Ciências Agrárias (CCA),
Universidade Estadual de Londrina (UEL), como parte do projeto de pesquisa Diagnóstico
Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado do Paraná CNPq/MAPA/DAS
(processo 578645/2008-4).
Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos
junto à agência e órgão de fomento à pesquisa abaixo relacionado:
1 CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico.
RIBEIRO, Rita de Cássia Lima. Leucose esporádica em bovinos com doenças neurológicas
no estado do Paraná. 2012. 52 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, 2012.
RESUMO
As enfermidades do sistema nervoso em bovinos formam um grupo importante de doenças
que podem levar a perdas econômicas e problemas de saúde pública. As doenças de origem
infecciosa e tóxica são as moléstias com maior prevalência no Brasil. Outras enfermidades
como as neoplasias também tem sido diagnosticadas, embora ainda com dados escassos sobre
a prevalência no rebanho. Entre os neoplasmas de bovinos, o complexo leucose bovina é uma
enfermidade frequente e de ocorrência mundial. A maioria dos casos diagnosticados como
leucose refere-se a forma enzoótica da doença que tem como agente um retrovírus. A outra
forma da doença, denominada leucose esporádica, manifesta-se como linfoma e não está
associada a nenhum agente etiológico. Esta forma acomete animais jovens de até dois anos de
idade e possui três padrões de apresentação: juvenil, tímica e cutânea. Os objetivos deste
estudo foram identificar e caracterizar morfologicamente e imunohistologicamente bovinos
com manifestações neurológicas de leucose esporádica. Setenta e oito bovinos foram
submetidos ao exame clínico, análise de hemograma e líquor. Fragmentos de encéfalo,
medula espinhal, fígado, baço e linfonodos foram submetidos à análise histopatológica. O
exame imunoistoquímico foi utilizado para determinação do tipo de linfócito (B ou T). Quatro
animais tiveram o diagnóstico de linfoma (leucose esporádica). A idade dos animais variou
entre 2 a 29 meses. Os sinais clínicos foram tetraplegia, paraplegia paresia de membros
pélvicos e convulsões. Todos os animais apresentaram envolvimento do sistema nervoso
central caracterizado por infiltração de linfócitos atípicos ou neoformação no canal medular.
No exame histopatológico dois animais apresentaram linfoma de alto grau e dois de baixo
grau, sendo todos caracterizados fenotipicamente como linfoma de células T.
Palavras-chaves: Leucose. Linfoma bovino. Sistema nervoso central.
RIBEIRO, Rita de Cássia Lima. Bovine sporadic leukosis associated with neurologic
diseases in Paraná state. 52 f. Dissertation (Master’s degree in Animal Science) –
Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2012.
ABSTRACT
The nervous system diseases in cattle are an important group of diseases that can lead to
economic losses and public health problems. Infectious diseases are the most frequent in
Brazil, but also other diseases have been diagnosed as cancer. However, data about prevalence
in Brazilian herds are scarce. Among the neoplasms of cattle, bovine leucosis complex is a
common disease and occurs worldwide. Most of the cases diagnosed as enzootic leucosis
concerns the form related to a retrovírus. The other form of the disease is a lymphoma with no
etiologic agent known as sporadic leukosis. This form affects young animals up to two years
old and has three different patterns of presentation: juvenile, thymic and cutaneous. The
objective of this study was to characterize gross, histological and immunohistochemical
findings in cattle with neurological manifestations in sporadic leukosis. Seventy-eight animals
were subjected to clinical examination, analysis of blood count, and cerebral spinal fluid.
Fragments of the brain, spinal cord, liver, spleen and lymph nodes were submitted to
histopathological analysis. Immunohistochemical examination was used to determine the type
of lymphocyte (B or T). Four animals were diagnosed with lymphoma (sporadic leukosis).
The age of the animals ranged from 2 to 29 months. Clinical signs were tetraplegia,
paraplegia, paresia of hind limbs, and convulsions. All animals showed involvement of the
central nervous system characterized by infiltration of atypical lymphocytes or neoformation
in the spinal cord canal. The histopathological analysis of two animals showed high-grade
lymphoma and two low-grade, all characterized phenotypically as T-cell lymphoma.
Key words: Leukosis. Lymphoma bovine. Central nervous system.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Captura de imagem histológica. Massa neoplásica em canal medular HE.
Objetiva de 20x. Londrina 2011 ........................................................................ 32
Figura 2 – Captura de imagem histológica. Presença de linfócitos atípicos infiltrando
o fígado. Linfócitos grandes, com citoplasma escasso, núcleos
hipercromáticos com nucléolos proeminentes e dispostos perifericamente
(círculo). HE. Objetiva de 40x. Londrina 2011 ................................................. 32
Figura 3 – Leucose esporádica bovina juvenil. Paraplegia dos membros pélvicos.
Londrina, 2011 .................................................................................................. 33
Figura 4 – Leucose esporádica bovina. Neoformação no canal medular (setas) com
superfície homogênea, esbranquiçada e com 7cm de comprimento.
Londrina, 2011 .................................................................................................. 34
Figura 5 – Captura de imagem histológica da neoformação em canal medular,
composta por linfócitos atípicos. HE. Objetiva de 20x. Londrina, 2011 .......... 35
Figura 6 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular.Observar a
marcação de linfócitos para o anticorpo policlonal anti-CD3. Linfoma de
células T. Objetiva de 40x. Londrina, 2011....................................................... 35
Figura 7 – Leucose bovina esporádica em bezerro. Flacidez de língua. Londrina,
2011 ................................................................................................................... 37
Figura 8 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de
linfócitos atípicos no espaço perivascular. HE. Objetiva de 20x. Londrina,
2011 ................................................................................................................... 38
Figura 9 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de
linfócitos atípicos (círculos) e figuras de mitose (setas) no espaço
perivascular no córtex frontal. HE. Objetiva de 40x. Londrina, 2011 .............. 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação de linfomas pelo sistema Working Formulation (adaptado) ....... 17
Tabela 2 – Classificação e graduação dos linfomas de acordo com o sistema Kiel
Modificado ........................................................................................................ 18
Tabela 3 – Doenças do Sistema Nervoso Central diagnosticado em 78 casos entre
março de 2009 e abril de 2011, que fazem parte do projeto pesquisa
Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado
do Paraná. Londrina, 2011 ................................................................................. 27
Tabela 4 – Resultados dos exames de hemograma e líquor de bovinos com leucose
esporádica .......................................................................................................... 40
Tabela 5 – Achados clínicos e anátomo-patológicos em bovinos com leucose
esporádica com envolvimento do sistema nervoso central. Londrina 2011 ...... 41
SUMÁRIO
1 REVISÃO DA LITERATURA: LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA .....................11
1.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA ...................................................................................... 13
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 20
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 25
2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 25
3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL........................................................................ 26
4 MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO ....................................................................... 28
4.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA COM ENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO
CENTRAL: RELATO DE CASOS ......................................................................................... 28
4.1.1 Introdução ................................................................................................................... 29
4.1.2 Material e Métodos ..................................................................................................... 29
4.1.3 Relato de Casos .......................................................................................................... 31
4.1.3.1 Caso 1 ...................................................................................................................... 31
4.1.3.2 Caso 2 ...................................................................................................................... 33
4.1.3.3 Caso 3 ...................................................................................................................... 36
4.1.3.4 Caso 4 ...................................................................................................................... 37
4.1.4 Discussão .................................................................................................................... 41
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 44
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 45
ANEXOS ............................................................................................................................ 48
ANEXO A – Lista de Reagentes e Produtos ........................................................................ 49
ANEXO B – Soluções e Tampões ........................................................................................ 50
ANEXO C – Protocolo de Técnicas ..................................................................................... 51
11
1 REVISÃO DA LITERATURA: LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA
RESUMO
As enfermidades do sistema nervoso em bovinos acarretam importantes perdas econômicas e
podem representar também um problema de saúde pública. As doenças de origem infecciosa e
tóxica são as moléstias com maior prevalência no Brasil. No entanto, as neoplasias em
bovinos também contribuem com os prejuízos na cadeia produtiva. Entre os neoplasmas de
bovinos, a leucose bovina, originária do tecido linfoide, é a mais frequente, acometendo
principalmente bovinos leiteiros. A leucose bovina é classificada em enzoótica ou esporádica
de acordo com aspectos etiológicos e epidemiológicos. A maioria dos casos refere-se a forma
enzoótica que é associada à infecção por um retrovírus, afeta animais entre três a sete anos de
idade e tem apresentação multicêntrica. A transmissão do vírus é principalmente horizontal,
por meio de linfócitos infectados, sendo que 1 a 5% dos animais infectados desenvolverá a
forma clínica. A leucose bovina esporádica não está associada a nenhum agente etiológico e
não é transmissível. A ocorrência desta forma no rebanho é baixa e afeta animais jovens de até
dois anos de idade. Três apresentações anatômicas são descritas: juvenil, tímica e cutânea. A
forma juvenil acomete bezerros com menos de seis meses de idade, tem apresentação
multicêntrica e envolvimento da medula espinhal. A forma tímica ocorre em animais de até
dois anos de idade e acomete o timo. A forma cutânea afeta bovinos com menos de três anos
de idade e apresenta-se como placas ou lesões crostosas cutâneas. Histologicamente a leucose
bovina caracteriza-se pela proliferação de linfócitos atípicos. A imunofenotipagem classifica a
leucose como de linfócitos T ou B. Há poucos relatos de leucose esporádica bovina, sendo
necessários estudos adicionais em relação a aspectos epidemiológicos e ao envolvimento do
sistema nervoso central.
Palavras-chave: Leucose esporádica. Linfoma. Sistema nervoso central.
12
ABSTRACT
Cattle nervous system diseases lead to important economic losses and can represent public
health problems. Diseases of infectious and toxicological origin are the most prevalent in
Brazil, however, neoplasias of cattle also affect the productive chain. Among the cattle
neoplasms, the bovine leukosis from lymphoid tissue origin is the most frequent affecting
dairy cattle. The enzootic bovine leukosis is classified as enzootic or sporadic according to
etiological and epidemiological aspects. Most cases refers to the enzootic form associated
with a retrovirus infection, that affects animals between three to seven years old with a
multicentric presentation. Virus transmission is primarily horizontal through infected
lymphocytes, and 1-5% of infected animals will develop the clinical form. The sporadic
bovine leukosis is not linked to any etiolological agent and is not transmissible. The
occurrence of this form in the herd is low and affects young animals up to two years of age.
Three anatomical presentations are described: juvenile, thymic and cutaneous. The juvenile
form affects calves less than six months old, showing a multicentric presentation and
involvement of the spinal cord. Thymic form occurs in animals up to two years of age and
affects the thymus. Cutaneous form affects cattle under three years old and presents as
plaques or crusted skin lesions. Enzootic bovine leukosis is characterized histologically by
atypical lymphocytes proliferation. Immunophenotyping classifies leukosis from T or B
lymphocytes. There are few reports of sporadic bovine leukosis, additional studies are needed
in relation to epidemiological aspects and the involvement of central nervous system.
Key words: Sporadic leukosis. Lymphoma. Central nervous system.
13
1.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA
Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos compreendem
um grande grupo de doenças que causam perdas econômicas e impactos na saúde pública
(LEMOS et al., 2001; SANCHES et al., 2000; GALIZA et al., 2010). Vários estudos vêm
sendo realizados para determinar a prevalência destas doenças no rebanho brasileiro, sendo
que as doenças de origem infecciosas e toxicológicas são consideradas as de maior
prevalência. No entanto, outras enfermidades como as neoplasias também podem contribuir
com as perdas econômicas na cadeia produtiva bovina (LEMOS et al., 2001; BARROS, 2007;
GALIZA et al., 2010; RISSI et al., 2010).
Quase não há dados sobre a epidemiologia das neoplasias que acometem o
sistema nervoso central em bovinos e os neoplasmas primários deste sistema, são raramente
encontrados (SANCHES et al., 2000). De modo geral os estudos sobre a prevalência de
tumores em animais de produção são escassos, no entanto, considera-se que o linfoma é a
neoplasia mais frequente em bovinos adultos (VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997; RAMOS
et al., 2008; MCCONNEL et al., 2009; WALDNER et al., 2009).
Em um estudo retrospectivo em bovinos acometidos por neoplasias, 26,5%
dos animais apresentavam tumores do sistema hematopoiético que foram diagnosticados
como linfoma (RAMOS et al., 2008). Há duas formas clínicas de leucose em bovinos, a
Leucose Enzoótica Bovina (LEB) e a Leucose Esporádica (LE). A LEB está associada ao
vírus da leucose bovina (VLB) e apresenta duas formas clínicas: a neoplasia de linfócitos
(linfoma) e a linfocitose persistente (LP) (BUEHRING; KRAMER; SCHULTZ, 1994;
DOMÉNECH et al., 2000), sendo que alguns autores consideram a LP uma reação pré-
neoplásica em bovinos naturalmente infectados (REYES; COCKERELL, 1996). Já a leucose
esporádica não está associada a nenhum agente causal específico e apresenta frequência
menor do que a LEB (MILLER; MAATEN, 1992).
A LEB acomete mais frequentemente o gado leiteiro (MIGAKI, 1969;
BRAGA; LAAN, 2006), sendo que em rebanhos infectados pelo VLB a prevalência da
infecção pode alcançar taxas entre 60 a 90% (JOHNSON; KANEENE, 1992). Levantamentos
epidemiológicos nos Estados Unidos e Canadá demonstraram que a prevalência nos soros
testados foi de aproximadamente 24% em rebanhos leiteiros (SARGEANT et al., 1997),
enquanto que na Argentina a prevalência foi de 68,5% (GHEZZI et al., 1997).
Não há uma uniformidade dos dados apresentados no Brasil, porém sabe-se
que a região sudeste possui percentuais de prevalência da doença entre 46,4 a 49,8%. No
14
entanto, a região nordeste apresenta índices menores (Acre 7 %, Alagoas 9,6% e Paraíba
8,3%) (BARROS, 2007). Já nos estados da região sul, a prevalência variou entre 9,2% (Rio
Grande do Sul) e 40,8% (Paraná) (MORAIS et al., 1996). A prevalência nos bovinos de corte
situa-se entre 7 a 20%, sendo que taxas maiores são observadas em rebanhos submetidos à
premunição para babesiose (CARVALHO et al., 1996; BRAGA; LAAN, 2006).
A leucose enzoótica bovina geralmente manifesta-se em bovinos entre três a
sete anos de idade e está associada à infecção pelo VLB (BARROS, 2007). Os vírus
pertencentes à subfamília Oncoviridiae, como o VLB, são os principais agentes causadores de
leucemia e linfoma em muitas espécies de animais, como felinos, aves, símios e humanos
(LOWER, 1999). A principal forma de transmissão do vírus é a horizontal, por meio de
linfócitos infectados (LEUZZI; ALFIERI; ALFIERI, 2001). Nos bovinos jovens, embora com
uma menor frequência, o vírus pode ser transmitido verticalmente, por via uterina –
geralmente após o primeiro trimestre gestacional, ou pela ingestão do colostro e\ou leite
contendo linfócitos infectados pelo VLB.
Os animais portadores de altas concentrações do vírus, mas com baixos
títulos de anticorpos podem transmitir a infecção para o feto. Porém, as fêmeas com altos
títulos de anticorpos e baixa carga viral, proporcionam transferência passiva de imunidade,
que se perpetua por alguns meses (JACOBSEN, 1983; LIESSE et al., 1991).
Em relação a leucose esporádica os dados sobre prevalência são escassos
(DOIGE, 1987; HENDRICK, 2002; PEIXOTO et al., 2011), mas, sabe-se que, dificilmente há
mais de um caso no mesmo rebanho. Estima-se que aproximadamente 1 bovino em 100.000
animais desenvolve a leucose do tipo esporádica (ESPINOSA, 1994; BARROS, 2007). Esta
forma é mais comum em bovinos com menos de dois anos de idade (REED, 1981; JACOBS;
MESSICK; VALLI, 2002).
A LE apresenta variações na sua manifestação clínica, sendo classificada de
acordo com a idade e localização do tumor. A LE pode ter as seguintes apresentações clínicas:
cutânea, tímica e multicêntrica (ou juvenil). Em outras espécies a classificação anatômica do
linfoma é semelhante, sendo classificada em eqüinos nas formas multicêntrica, cutânea,
alimentar e esplênica (GREEN; DONOVAN, 1977) e em caninos também na forma
mediastínica e/ou tímica e extranodal. A forma extra-nodal é a menos frequente e pode ocorrer
nos olhos, sistema nervoso central, coração ou rins (MILNER et al., 1996; MELLANBY;
HERRTAGE; DOBSON, 2003).
Nos bovinos a forma multicêntrica é encontrada em animais de até seis
meses (DUNGWORTH; THEILEN; LENGYEL, 1964; JONES; HUNT; KING, 2000); a
15
forma tímica manifesta-se em bezerros de seis a dezoito meses (JACOBS; MESSICK;
VALLI, 2002) e a cutânea, geralmente ocorre em bovinos com menos de três anos
(ZWAHLEHA; TONTIS; SCHNEIDER, 1987).
A leucose juvenil é um linfoma multicêntrico em que ocorre aumento
generalizado dos linfonodos, frequentemente, com envolvimento do fígado e baço (HAMIR;
PERKINS; JONES, 1989). Ocasionalmente ocorre o envolvimento do sistema nervoso central
como parte da apresentação multicêntrica ou ainda manifestar-se como lesão primária
(SMITH; ANDERSON, 1977; SWEENEY et al., 1986). Nestes casos, as neoplasias podem
desenvolver-se no encéfalo, medula espinhal ou na região epidural levando a sinais clínicos
relacionados à localização da neoformação como, por exemplo, paralisia dos membros
posteriores e síndrome da cauda equina decorrente da compressão medular (DOIGE, 1987;
KOESTNER et al., 1999). A leucose juvenil pode envolver articulações, costelas, mandíbula,
coração e útero destacando assim a diversidade das manifestações da LE nesta apresentação
(HAMIR; PERKINS; JONES, 1989; ESPINOSA, 1994; JACOBS et al., 1992; HENDRICK,
2002; HARBO et al., 2004).
Os sinais clínicos mais freqüentes são a perda gradual de peso, depressão,
fraqueza e linfonodomegalia, sendo que febre, edema e insuficiência cardíaca congestiva são
alterações menos comuns (REBHUN, 1984; DIVERS et al., 1995). A doença pode ter um
curso rápido para a morte. Estima-se que após o aparecimento das primeiras manifestações
clínicas, o óbito pode ocorrer entre duas a oito semanas (ESPINOSA , 1994).
Outros sinais menos específicos podem ser notados como edema,
insuficiência cardíaca congestiva, que são observados conforme a região afetada (REBHUN,
1984; DIVERS et al., 1995).
Na apresentação tímica da leucose esporádica, o linfoma manifesta-se no
timo e regiões adjacentes (JONES; HUNT; KING, 2000). Os sinais clínicos mais comuns são
produzidos, principalmente, pela pressão que a neoplasia faz quando se infiltra na cavidade
torácica, com efeitos no sistema cardiovascular, como ingurgitamento da veia jugular e
acentuado edema na região subcutânea torácica que pode se estender até região
submandibular. Há possibilidade de ocorrer timpanismo discreto ou moderado, secundário à
compressão da neoplasia que impede a eructação. O animal pode ainda apresentar, depressão,
perda de peso, anorexia, podendo ter ou não o acometimento em linfonodos (DUNGWORTH;
THEILEN; LENGYEL, 1964). A leucose esporádica tímica tem etiologia desconhecida, no
entanto, a ocorrência desta forma em vários bezerros oriundos do mesmo touro, sugeriu uma
possível associação hereditária (PARODI et al., 1989).
16
A forma cutânea apresenta-se como múltiplos nódulos na pele do pescoço,
escápula, períneo e membros pélvicos. Os nódulos medem entre 2 e 3 cm de diâmetro, são
salientes, firmes e frequentemente alopécicos e ulcerados. As lesões podem evoluir para
escaras de coloração acinzentada com formação de crostas (OKADA et al., 1989). Outros
sinais clínicos podem ser observados, como aumento de linfonodos superficiais e edema de
subcutâneo (BARROS, 2007). As recidivas não são infrequentes e podem ocorrer entre um e
dois anos, com reaparecimento das lesões de pele e envolvimento de linfonodos e outros
órgãos como o que ocorre na apresentação multicêntrica (JACOBS et al., 1992; SMITH,
2006). Microscopicamente a neoplasia caracteriza-se como um linfoma epiteliotrópico de
células T semelhante a mycosis fungoides humana (NASU et al., 1985; ZWAHLENA;
TONTIS; SCHNEIDER, 1987).
De uma forma geral os sinais clínicos da LE podem levar a diminuição na
produção de leite, baixa fertilidade e redução no ganho de peso do animal acometido pelo
linfoma (BURTON et al., 2010).
A classificação histológica do linfoma na espécie humana e canina é de
extrema importância para estabelecer o tratamento e prognóstico (MORENO;
BRACARENSE, 2006). Existem várias classificações histológicas, sendo as mais utilizadas a
Kiel modificado e a Working Formulation (National Cancer Institute). Microscopicamente o
linfoma caracteriza-se como uma proliferação de linfócitos atípicos que de acordo com a
Working Formulation pode ser classificado em difuso ou folicular. Em relação ao aspecto
morfológico das células é graduado em baixo, intermediário e alto grau, sendo compostos por
células com diferentes aspectos (Tabela 1).
17
Tabela 1 – Classificação de linfomas pelo sistema Working Formulation (adaptado).
Baixo Grau Grau Intermediário
A- Difuso, pequenos linfócitos com leucemia linfocítica
crônica
Difuso, pequenos linfócitos-plasmocitóide
Difuso, pequenos linfócitos-intermediário
D-Folicular, predomínio de células
grandes
B- Folicular, predomínio de pequenas células clivadas E- Difuso, células pequenas e
clivadas
C-Folicular, misto, pequenas células clivadas e grandes
células não clivadas
F- Difuso, mista, células grandes e
pequenas
G- Difuso, células grandes e
clivadas e não clivadas
Alto Grau Miscelânea
H- Imunoblastico.
Plasmocitóide.
Células claras.
Células polimórficas
L- Composição
Mycosis fungoides
Histiocitoma
Plasmocitoma extra-medular
I- Imunoblastico.
Células enoveladas.
Células não enoveladas
J- Células pequenas e não clivadas
Não Burkitt
Burkitt
Fonte: Vernau et. al. (1992).
O Kiel modificado avalia a morfologia celular em centroblástico,
centrocítico e imunoblástico e a classificação imunofenotípica em linfócitos T e B, sendo a
graduação de malignidade determinada em dois padrões: alto e baixo grau (VALLI;
GENTRY, 2007) (Tabela 2).
18
Tabela 2 – Classificação e graduação dos linfomas de acordo com o esquema Kiel
modificado.
Células B
Baixo Grau
Células B
Alto Grau
Células T
Baixo Grau
Células T
Alto Grau
Linfocítico Centroblástico Linfocítico Células médias e
grandes, pleomórficas
Linfoplasmocitoide Imunoblástico Mycosis fungoides Imunoblástico
Centrocítico Linfoblástico Linfoma de zona T Linfoblástico
Burkitt
Pequenas células
pleomórficas
Grandes células
anaplásicas
Grandes células
anaplásicas
Fonte: Stansfeld et al. (1988).
Em bovinos, um estudo com 1198 animais utilizou a classificação Working
Formulation constatando que 89% dos linfomas eram de alto grau, com predomínio (65%) do
tipo difuso de células grandes e clivadas. Os autores observaram que a ocorrência dos tipos de
células diferiu significativamente entre os linfomas das formas enzoótica e esporádica. A
forma clivada difusa de células grandes ocorreu em 38% dos casos de leucose enzoótica,
enquanto que na leucose esporádica a ocorrência foi de 14%. Os índices mitóticos foram
maiores nos linfomas enzoóticos do que nos esporádicos (VERNAU et al., 1992).
Não foram encontrados na literatura outros relatos que classifiquem a
leucose esporádica bovina segundo as classificações acima citadas, porém alguns relatos
descrevem histologicamente a neoplasia.
Existem algumas características morfológicas celulares que são comuns em
alguns casos como predomínio de linfócitos neoplásicos grandes (DUNGWORTH;
THEILEN; LENGYEL, 1964; BUNDZA et al., 1980; ZWAHLENA; TONTIS;
SCHNEIDER, 1987; OKADA et al., 1989; DUBREUIL et al., 1998). Alguns trabalhos
descrevem predomínio de núcleos clivados (DUNGWORTH; THEILEN; LENGYEL, 1964;
DUBREUIL et al., 1998; NASIR, 2005). Não há um padrão quanto ao índice mitótico.
A caracterização fenotípica dos linfócitos neoplásicos é de linfócitos T e B
(ISHII; OKI, 1994; VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997. Estudos demonstraram que os
linfócitos B e T neoplásicos expressam uma mutação na proteína c-myc que está associada à
regulação celular (ASAHINA et al., 1996; SHINAGAWA et al., 1997).
Pouco se sabe sobre o conjunto de manifestações que podem preceder ou
acompanhar a LEB ou LE (JACOBS; MESSICK; VALLI, 2002). Dentre as alterações
19
descritas, relata-se o aumento na captação e a utilização da glicose, resultando em excesso de
produção de lactato (ELFENBEIN et al., 2008). Além do aumento da glicólise nas células
neoplásicas, a disfunção hepática tem sido uma das causas da hiperlactemia, pois o principal
local de metabolismo do lactato é no fígado, mas pode ocorrer em outros tecidos como
músculo esquelético e rim. O lactato é convertido em piruvato para entrar no ciclo de Krebs,
no fígado onde será transformado em glicose e utilizado em tecidos periféricos. A
hipoglicemia e a hiperlactemia se estabelecem desta forma como uma síndrome
paraneoplásica como a que ocorre em humanos (ELFENBEIN et al., 2008).
Existem poucos estudos sobre a leucose esporádica bovina, sendo que a
literatura refere-se em quase a sua totalidade a relatos de casos. Estudos enfocando aspectos
epidemiológicos, clínicos e patológicos são necessários para o melhor entendimento desta
neoplasia.
20
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508, 1987.
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar os casos de leucose esporádica em bovinos com sinais de doença
neurológica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar anátomo-patologicamente as formas da leucose esporádica
bovina.
Caracterizar histologicamente as formas da leucose esporádica bovina.
Caracterizar imuno-histoquimicamente as formas da leucose esporádica
bovina.
26
3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O trabalho foi desenvolvido no Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Departamento de Clínicas Veterinárias da Universidade Estadual de Londrina,
Paraná como parte do projeto de pesquisa Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas
dos Bovinos no Estado do Paraná CNPq/MAPA/DAS (processo 578645/2008-4).
Foram encaminhados ao projeto 78 casos de bovinos acometidos por
doenças neurológicas no período entre março de 2009 a abril de 2011. Os animais foram
submetidos ao exame clínico, exames complementares e nos casos que vieram a óbito ou
foram eutanasiados foi realizada a necropsia e exame histopatológico.
Nos casos em que havia suspeita de intoxicação, fragmentos de fígado
foram submetidos a exame toxicológico para a detecção de organofosforados, organoclorados,
carbamatos e dicumarínicos.
Na tabela 3 estão dispostos os diagnósticos estabelecidos para o total de
animais atendidos no projeto com sinais clínicos e distúrbios nervosos.
27
Tabela 3 – Doenças do Sistema Nervoso Central diagnosticadas em 78 bovinos atendidos
entre março de 2009 e abril de 2011 como parte do projeto de pesquisa
Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado do
Paraná. Londrina, 2011.
Alterações Inflamatórias Virais N %
Raiva 7 8,9
BHV-5 8 10,2
Alterações Inflamatórias Bacterianas
Abscesso cerebral e paravertebral 2 2,5
Enterotoxemia 2 2,5
Meningomielite 2 2,5
Alterações Degenerativas
Osteomielite com compressão de
medula
1 1,2
Polioencefalomalácea 1 1,2
Alterações Tóxicas
Tétano 2 2,5
Botulismo 3 3,8
Plantas Tóxicas 17 21,7
Carbamato 2 2,5
Nitrato/nitrito 5 6,4
Uréia 1 1,2
Micotoxinas 7 8,9
Metabólicas 1 1,2
Acetonemia Nervosa 1 1,2
Alterações Circulatórias
Babesiose 2 2,5
Trauma 3 3,8
Neoplasias
LEB 1 1,2
LE 4 5,1
Casos sem causas determinadas 6 7,6
Total 78 100%
Fonte: Ribeiro e Lisboa (2011).
28
4 MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO
4.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA COM ENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:
RELATO DE CASOS
RESUMO
A leucose esporádica bovina é considerada uma neoplasia de rara ocorrência caracterizada
pela proliferação de linfócitos atípicos. O objetivo deste trabalho foi relatar quatro casos desta
afecção em bovinos com sinais de doença neurológica. A idade dos animais variou entre 2 a
29 meses. Os bovinos foram submetidos a exame clínico, hematológico, de líquor e
imunodifusão em ágar-gel para determinação de anticorpos contra o vírus da leucose
enzoótica. Fragmentos de encéfalo, medula espinhal, fígado, baço e linfonodos foram
submetidos à análise histopatológica. O exame imuno-histoquímico foi utilizado para
determinação do tipo de linfócito (B ou T). Os sinais clínicos foram tetraplegia, paraplegia
paresia de membros pélvicos e convulsões. Todos os animais apresentaram envolvimento do
sistema nervoso central caracterizado por infiltração de linfócitos atípicos ou neoformação no
canal medular. No exame histopatológico dois animais apresentaram linfoma de alto grau e
dois de baixo grau, sendo todos caracterizados fenotipicamente como linfoma de células T. Os
resultados histológicos e imuno-histoquímicos associados ao resultado negativo para a
imunodifusão permitiram o diagnóstico de leucose esporádica nos quatro bovinos.
Palavras Chaves: Leucose esporádica. Linfoma. Sistema nervoso central.
ABSTRACT
The sporadic bovine leukosis is considered a rare occurrence of neoplasia, characterized by
proliferation of atypical lymphocytes. The objective of this study was to report four cases of
this disease in cattle with signs of neurological disease. The age of the animals ranged from 2-
29 months. The animals were subjected to clinical examination, haematological and spinal
fluid analysis and immunodiffusion in agar gel for determination of antibodies against the
virus of enzootic leukosis. Fragments of brain, spinal cord, liver, spleen, lymph nodes were
submitted to histopathological analysis. The immunohistochemical examination was used to
determine the type of lymphocyte (T or B). Clinical signs were tetraplegia, paraplegia,
paresia of hind limbs, and convulsions. All animals showed involvement of the central
nervous system characterized by infiltration of atypical lymphocytes or neoformation in the
spinal cord canal. The histopathological analysis of two animals showed high-grade
lymphoma and two low-grade, all characterized phenotypically as T-cell lymphoma. The
histological and immunohistochemical findings associated with negative result for
immunodiffusion allowed for the diagnosis of enzootic bovine sporadic in the four animals.
Key words: Sporadic leukosis, lymphoma, central nervous system
29
4.1.1 Introdução
Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos compreendem
um grande grupo de doenças que causam perdas econômicas e afetam a saúde pública em
todo o país (SANCHES et al., 2000; LEMOS et. al., 2001; GALIZA et al., 2010). As
principais doenças neurológicas em bovinos são de origem infecciosa e tóxica, porém outras
enfermidades como as neoplasias também são relatadas (RISSI et al., 2010). Os dados sobre
os neoplasmas primários do SNC em bovinos são escassos, sendo estes considerados raros
(SANCHES et al., 2000).
Dentre as neoplasias que acometem os bovinos, o linfoma é uma das mais
frequentes. Em um estudo retrospectivo com 98 bovinos acometidos por tumores, 26 % dos
animais tiveram o diagnóstico de linfoma (RAMOS et al., 2008). O linfoma é um grupo
heterogêneo de neoplasmas originários de células linfoides frequentemente diagnosticado em
animais domésticos (SEARCY, 1998). A leucose bovina é classificada em enzoótica ou
esporádica. A leucose enzoótica é uma doença infecciosa transmissível associada à infecção
por um oncovírus, enquanto que a leucose esporádica não tem etiologia definida e não é
transmissível (BARROS, 2007).
A forma esporádica tem três apresentações anatômicas: a juvenil que é
encontrada em animais de até seis meses de idade (DUNGWORTH; THEILEN; ENGYEL,
1964; JONES; HUNT; KING, 2000); a tímica que se manifesta em bezerros de seis a dezoito
meses (JACOBS; MESSICK; VALLI, 2002) e a cutânea que geralmente ocorre em bovinos
com mais de três anos (ZWAHLENA; TONTIS; SCHNEIDER, 1987). As três formas
esporádicas são de raras apresentações no rebanho, estimando-se um caso em cada 100.000
animais (ESPINOSA, 1994).
O objetivo deste trabalho foi relatar quatro casos de leucose esporádica em
bovinos com envolvimento do sistema nervoso central e seus aspectos clínicos, anátomo-
patológicos e imunofenotípicos.
4.1.2 Material e Métodos
Foram encaminhados ao Hospital Veterinário (HV) da Universidade
Estadual de Londrina, quatro bovinos que foram submetidos a anamnese, exame clínico e
30
exames complementares. Um dos animais já estava morto quando foi encaminhado ao HV. Os
exames complementares consistiram em avaliar os parâmetros hematológicos e líquor.
As amostras do líquido cefalorraquidiano foram colhidas por punção em
cisterna magna no espaço atlanto-occipital e acondicionadas em tubos de ensaio e foram
mantidas refrigeradas até o momento do exame
As amostras de sangue foram colhidas por venopunção e acondicionadas em
tubos de ensaio contendo EDTA a 10%. Estas amostras foram mantidas refrigeradas até o
momento da realização do exame para determinação do eritrograma e leucograma. Para
avaliação sorológica da presença dos anticorpos anti-vírus da leucose enzoótica bovina, foi
utilizada imunodifusão em gel de Agar-IDGA (MILLER; MATTEN,1992).
Nos casos em que a evolução do quadro não cursou com a melhora geral do
animal, realizou-se eutanásia dos animais com solução de cloreto de potássio a 20% após
anestesia com cloridrato de xilazina (0,2 mg/Kg) e tiopental sódico (10 mg/Kg).
Os animais foram necropsiados e fragmentos de órgão colhidos para exame
histopatológico. Fragmentos de pulmão, fígado, baço, linfonodos, rim e encéfalo foram
fixados em solução tamponada de formalina a 10%, sendo então submetidos ao
processamento de rotina. Os cortes com 4µm de espessura foram corados pelo método de
hematoxilina e eosina (HE) para exame histológico conforme procedimento padrão.
Com o objetivo de caracterizar o fenótipo das células neoplásicas nos casos
de linfoma utilizou-se o exame imuno-histoquímico. Para tanto, os cortes histológicos dos
animais foram distendidos sobre lâminas histológicas previamente silanizadas. Após a
desparafinização, as lâminas foram submetidas à recuperação antigênica em tampão citrato
(pH 6,0) em forno microondas durante 15 minutos e bloqueio da peroxidase endógena em
solução de água oxigenada e metanol (1:1). Posteriormente foram incubadas com anticorpo
monoclonal anti-CD79 (1:50, clone JCB117, Dako), policlonal anti-CD3 (1:50, Dako) e
policlonal anti-lisozima (1:200, Invitrogen) por 18 horas em câmara úmida a 4C. As lâminas
foram então tratadas pelo método do polímero (Envision, Dako) durante 30 minutos à
temperatura ambiente, sendo a reação revelada em solução de 3,3 diaminobenzidina. Os
cortes foram submetidos à contra-coloração com hematoxilina de Harris, desidratação e
montagem com lamínula e resina sintética. Todas as reações foram acompanhadas com
controle negativo e positivo para a reação de acordo com o fabricante.
31
4.1.3 Relato de Casos
4.1.3.1 Caso 1
Um animal de espécie bovina, fêmea, 60 dias, raça Nelore, apresentou
apatia e quadro súbito e progressivo de paraparesia de membros pélvicos, progredindo para
decúbito esternal, posteriormente lateral e morte em 11 dias após o inicio dos sinais. Não
foram realizados os exames clínicos e colheita de amostras para exames complementares
porque o animal já estava morto quando o atendimento foi efetuado.
À necropsia observou-se acentuado edema pulmonar, fígado com discreto
aumento de tamanho com inúmeros nódulos brancos circulares de tamanho entre 0,2 e 0,3 cm
em seu diâmetro maior; linfonodos inguinais direito e esquerdo com discreto aumento. Na
inspeção do canal medular verificou-se na região epidural entre a quarta e sexta vértebras
lombares a presença de massa de coloração branca, consistência firme, medindo
aproximadamente 0,5 cm de comprimento.
Ao exame histopatológico da neoformação no canal medular observou-se
padrão difuso de grandes células linfóides que apresentavam citoplasma escasso,
discretamente eosinofílico, núcleo volumoso, com acentuada anisocariose e baixo número de
figuras de mitoses (1/10 campos) (Figura 1). Em algumas células o núcleo apresentava-se
com reentrâncias e nucléolos na periferia. A infiltração por linfócitos neoplásicos estendia-se
até as leptomeninges da região medular e ocasionalmente no espaço perivascular de córtex
frontal, parietal, temporal e occipital. Observou-se ainda pneumonia intersticial discreta e
edema alveolar difuso. O fígado apresentava esteatose difusa e infiltração de linfócitos
neoplásicos entre os hepatócitos. Nos linfonodos constatou-se proliferação difusa de
linfócitos, com perda do padrão folicular constituído por grandes células linfóides que
apresentavam citoplasma escasso e de coloração eosinofílica, núcleo volumoso, com
acentuada anisocariose e baixo número de figuras de mitoses (1/10 campos), caracterizando
um linfoma de alto grau. Ao exame imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram
predominantemente imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.
32
Figura 1 – Captura de imagem histológica. Massa neoplásica em canal medular HE. Objetiva
de 20x. Londrina 2011.
Foto: A autora (2011).
Figura 2– Captura de imagem histológica. Presença de linfócitos atípicos infiltrados no
fígado. Linfócitos grandes, com citoplasma escasso, núcleos hipercromáticos com
nucléolos proeminentes e dispostos perifericamente (círculo). HE. Objetiva de
40x. Londrina 2011.
Foto: A autora (2011).
33
4.1.3.2 Caso 2
Um bezerro da raça Girolanda, macho, 90 dias de idade foi encaminhado ao
HV/UEL apresentando paraplegia e decúbito esternal. Ao exame clínico o animal apresentou
temperatura de 38,9°C, discreta taquipnéia e bom estado nutricional. Não foram observadas
alterações em linfonodos.
Ao exame neurológico constatou-se que o animal estava alerta, com perda
de reflexos cutâneos a partir das primeiras vértebras sacrais, flacidez de cauda, ausência de
reflexo perineal, relaxamento do esfíncter anal, leve prolapso retal, incontinência urinária e
ausência de reflexo patelar e reflexo de flexão (Figura 3).
Foram colhidas amostras para realização de exames complementares. Os
resultados do hemograma e líquor encontram-se na tabela 4.
Figura 3 – Leucose esporádica bovina juvenil. Bezerro apresentando paraplegia. Londrina,
2011.
Foto: Julio Lisboa (2010).
O animal apresentou discreta atrofia muscular. Sem a melhora do estado
clínico geral do animal decidiu-se pela eutanásia. À necropsia verificou-se no canal medular
presença de massa de 7cm de comprimento, macia, branca comprimindo a medula entre o
sexto segmento lombar e o primeiro segmento sacral (Figura 4).
34
Figura 4 – Leucose esporádica bovina. Neoformação no canal medular (setas) com superfície
homogênea e esbranquiçada. Londrina, 2011.
Foto: Julio Lisboa (2010)
Ao exame microscópico observou-se discreta infiltração de células linfoides
atípicas em leptomeninges do córtex frontal e parietal. A massa no canal medular era
constituída por pequenas células linfocíticas, com distribuição difusa, citoplasma escasso,
núcleo central, cromatina reticular, nucléolos múltiplos, evidentes e discreto número de
figuras de mitoses (1 em 10 campos, objetiva de 40X), caracterizando um linfoma de baixo
grau (Figura 5). A medula na região da neoformação apresentava áreas de malácia e
infiltração por linfócitos neoplásicos na região de substância branca. Observou-se ainda
tumefação axonal na medula nos segmentos lombares e de cauda equina e formação de
trombo nessa região. Nos demais órgãos analisados não foram observados alterações
microscópicas. Ao exame imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram
predominantemente imunoreagentes ao anticorpo anti - CD3. (Figura 6)
35
Figura 5 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular, composta por
linfócitos atípicos.HE .Objetiva de 20x. Londrina, 2011.
Foto: A autora (2011)
Figura 6 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular. Observar a marcação
de linfócitos para o anticorpo policlonal anti-CD3. Linfoma de células T. Objetiva
de 40x. Londrina, 2011.
Foto: A autora (2011)
36
4.1.3.3 Caso 3
Uma novilha da raça Gir, fêmea de 29 meses de idade foi atendida no
HV/UEL com histórico de desconforto abdominal. Ao exame clínico constatou-se que o
animal estava alerta e com incoordenação de membros pélvicos. O animal foi internado e nos
três primeiros dias apresentou episódios convulsivos. Durante os 28 dias de internamento
observou-se a manutenção dos sinais clínicos, além de tremores musculares nos membros
pélvicos. O animal permanecia em decúbito esternal, porém quando estimulada levantava-se
sem auxílio. Constatou-se ainda reação dolorosa do membro torácico direito e membro
pélvico esquerdo. Os exames de hemograma e líquor encontram-se na tabela 4. Devido ao
agravamento do quadro clínico, o animal foi submetido à eutanásia e necropsia.
Ao exame macroscópico observou-se a presença de material fibrino-
purulento e necrótico em articulação tarso-metatársica esquerda e radio-cárpica direita. O
músculo serrátil ventral do tórax apresentava um abscesso com aproximadamente 15 cm de
diâmetro. As gorduras abdominal e perirrenal apresentavam focos de 2 a 3 cm de diâmetro de
coloração branca e aspecto arenoso. Observou-se aderência do omento e retículo ao peritônio
com presença de foco contendo material purulento. Os linfonodos mesentéricos apresentavam
discreto aumento de volume. No sistema nervoso central não foram observadas alterações
macroscópicas.
Ao exame histopatológico observou-se extensa necrose muscular
acompanhada de calcificação distrófica multifocal no músculo serrátil e nefrite intersticial
crônica. A gordura perirenal apresentava múltiplos granulomas micóticos com presença de
hifas na região central. No retículo observou-se também a formação de granulomas micóticos
na região mucosa e a presença de linfócitos atípicos no lúmen intravascular. No sistema
nervoso central constatou-se espongiose da camada cortical no córtex cerebral. Nas regiões do
colículo rostral, distal, ponte e medula oblonga observaram-se linfócitos atípicos no lúmen
vascular e degeneração walleriana em raízes nervosas da medula. Os linfonodos apresentaram
perda do padrão folicular e proliferação difusa de linfócitos com discreta atipia. As células
apresentavam padrão linfocítico com núcleo central, nucléolos proeminentes, sem presença de
figuras de mitoses, caracterizando um linfoma de baixo grau. Ao exame imuno-histoquímico
os linfócitos atípicos foram imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.
37
4.1.3.4 Caso 4
Um bezerro sem raça definida, macho, com 10 meses de idade,
apresentando decúbito lateral permanente foi atendido no HV/UEL. Ao exame clínico
observou-se aumento de volume no linfonodo pré-escapular esquerdo. Ao exame neurológico
constatou-se que o animal apresentava depressão, cegueira, nistagmo, sialorréia, trismo
mandibular, tremor de cabeça e muscular e ausência de reflexos cutâneos. Tetraplegia,
ausência de tônus da cauda e flacidez de língua (Figura 7) também foram observados.
Amostras de sangue e líquor foram colhidas para análise. Os resultados
estão dispostos na tabela 4.
Figura 7 – Leucose bovina esporádica em bezerro. Flacidez de língua. Londrina, 2011.
Foto: Julio Lisboa (2010).
O animal apresentou agravamento do quadro clínico e veio a óbito. Foi
realizada a necropsia e foram observadas áreas de hepatização em lobo cranial no pulmão,
fígado com bordos arredondados, baço com hiperplasia de polpa branca e linfonodos pré-
escapulares aumentados. Verificou-se também necrose focal na musculatura do pescoço e
ligamento supra-espinhoso, necrose de cornetos e malácia focal no córtex frontal e temporal.
38
Ao exame histopatológico observou-se moderada broncopneumonia,
discreta esteatose hepática, discreta hiperplasia linfoide esplênica e de linfonodos. No córtex
cerebral frontal e parietal observou-se a presença de linfócitos neoplásicos grandes do tipo
imunoblástico e centroblástico no espaço perivascular e lúmen (Figura 8 e 9), com frequentes
figuras de mitoses (6/10 campos. Objetiva 40x), caracterizando um linfoma de alto grau.
Malácia focal da substância branca e nódulos gliais também foram observados. Ao exame
imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.
Figura 8 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de linfócitos
atípicos no espaço perivascular. HE. Objetiva de 20x. Londrina, 2011.
Foto: A autora (2010)
39
Figura 9 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de linfócitos
atípicos (círculos) e figuras de mitose (setas) no espaço perivascular no córtex
frontal. HE. Objetiva de 40x. Londrina, 2011.
Foto: A autora (2011).
Para a determinação da presença de anticorpos para o vírus da leucose
bovina foi colhido soro e realizado o exame baseado no método de imunodifusão em gel de
ágar-IDGA. Os animais dois, três e quatro apresentaram resultados negativos para este exame.
No animal 1 o exame não foi realizado. Na tabela 5 são apresentados os principais achados
dos casos.
40
Tabela 4 – Resultados dos exames de hemograma e líquor de bovinos com leucose
esporádica.
Parâmetros laboratoriais
Valores
referenciais
Caso 2
Caso 3
Caso 4
Hemácias 8 – 15 mm3 8,0 mm3 15,6 mm3 7,46 mm3
Hemoglobina 5 – 10 g/dl 5 g/dl 6,31 g/dl 11,7 g/dl
VG 24 – 46 % 29,8 % 37,9% 37,3 %
VCM 40 – 60 F.L 60 F.L 60 F.L 50,1 F.L
CHCM 30-36 % 33,33 % 34,1% 31,5 %
Fibrinogênio 300 – 700 g/dl 600 g/dl 800 g/dl 1.000 g/dl
Proteínas Totais 7- 8,5 g/dl 7 g/ dl 7,4g/ dl 7,0 g/ dl
Total de leucócitos 4.000 – 12.000 7.900 10.500 10.020
Segmentado 15 – 45 % 15 % 66 % 54 %
Linfócito 45 – 75 % 85 % 32 % 42 %
Eosinófilos 2– 20 % - - 2 %
Monócitos 2 – 7 % - - 2 %
Exame do líquor
Coloração Incolor Incolor Incolor Incolor
Aspecto Límpido Límpido Límpido Límpido
Glicose 40 – 80 mg/dl 61,1mg/dl 37,5 mg/dl 37,5mg/dl
Densidade 1003 – 1006 1004 1006 1003
Número de leucócitos 1 - 3/mm3 6/mm3 - 486/mm3
Segmentados - 10 % - 30%
Linfócitos - 90 % - 70%
VG - volume globular, VCM - volume corpuscular médio, CHCM - concentração de hemoglobina
corpuscular média, F.L. - fentolitro
Fonte: A autora (2011)
41
Tabela 5 – Achados clínicos e anátomo-patológicos em bovinos com leucose esporádica com
envolvimento do sistema nervoso central. Londrina 2011.
Animal e
raça Sexo
Idade
Exame clínico-
neurológico
Aspectos
macroscópicos
Achados
histopatológicos Fenótipo
1 Nelore
Fêmea
2 meses
Apatia,
paraparesia dos
membros
pélvicos,
diminuição dos
reflexos
espinhais em
membros
pélvicos.
Neoformação no
canal medular (L4-
L6), linfonodos
aumentados e
nódulos
brancacentos no
parênquima
hepático.
Linfoma no canal
medular,
linfonodo e
fígado.
CD3 +
2 Girolanda
Macho
3 meses
Alerta,
paraplegia,
ausência de
reflexo na
cauda.
Neoformação no
canal medular (L6-
S1)
Linfoma no canal
medular. Malácia
focal em medula.
Linfócitos
atípicos em
leptomeninges do
córtex cerebral.
CD3 +
3 Gir
Fêmea
29 meses
Episódios de
convulsão.
Artrite fibrino-
purulentaem tarso-
metatarso esquerdo
e rádio-cárpo
direito
Linfócitos
atípicos no lúmen
e espaço
perivascular do
SNC. Linfoma
em linfonodo.
CD3 +
4 SRD
Macho
10 Meses
Depressão,
cegueira,
nistagmo,
convulsão,
tremores de
cabeça e
músculos.
Tetraplegia.
Malácia em córtex
frontal e temporal
Linfócitos
atípicos no lúmen
e espaço
perivascular do
córtex cerebral.
Malácia focal
cerebral.
CD3 +
Fonte: A autora (2011)
4.1.4 Discussão
Os aspectos macroscópicos observados neste estudo foram sugestivos de
leucose esporádica juvenil em dois casos (caso 1 e 2) em que foram visualizadas
neoformações no canal medular. Essa forma acomete bezerros de até seis meses de idade, mas
eventualmente pode ser congênita e caracteriza-se por linfodenopatia generalizada com
envolvimento de outros órgãos como o canal medular (VALLI, 2007). O caso 1 apresentava
os aspectos macroscópicos clássicos de um linfoma multicêntrico acompanhado de infiltração
42
hepática, no entanto, no caso 2, apenas a neoformação medular foi observada, sem
envolvimento de órgãos linfóides. Dentre as neoplasias que causam compressão medular, o
linfoma é o mais comum, ocorrendo frequentemente em região lombossacra e com menor
frequência no plexo braquial e áreas cervicais (BLOOD; RADOSTITS, 1983).
Leucemia acompanhada de anemia normocítica, normocrômica e
trombocitopenia (VALLI, 2007) ocorrem frequentemente na forma juvenil, no entanto neste
estudo alterações hematológicas ou no líquor não foram observadas. O exame do liquor tem
pouca sensibilidade para a detecção de linfócitos neoplásicos principalmente quando as lesões
se localizam em vértebras lombares e sacrais e a colheita é realizada entre as vértebras
atlanto-occipital (ESPINOSA, 1994; BURTON et. al., 2010).
Nos casos 3 e 4, os aspectos macroscópicos não foram indicativos de
nenhuma patologia do sistema linfóide, visto que nenhum órgão linfóide apresentava
alterações significativas. As lesões macroscópicas observadas no caso 3 estavam relacionadas
à artrite supurativa e a presença multifocal de granulomas micóticos e no caso 4 a malácia
focal cortical. A pleocitose observada no líquor do animal 4 pode estar relacionada à presença
de linfócitos atípicos infiltrando o sistema nervoso.
O aumento generalizado de linfonodos acompanhado ou não de espleno e
hepatomegalia é frequentemente observado tanto na leucose enzoótica como na esporádica. A
proliferação de linfócitos atípicos resultando no desaparecimento do padrão folicular dos
linfonodos ou baço é uma das características do linfoma (HENDRICK, 2002). Neste estudo o
envolvimento de linfonodos foi observado em dois casos (1 e 3), sendo que em ambos, apenas
um ou dois linfonodos foram afetados. As características morfológicas microscópicas
observadas tanto nos linfonodos como nas neoformações do canal medular estão de acordo
com o descrito na literatura (VERNAU et al., 1992). Em dois animais as lesões estavam
restritas à infiltração perivascular no sistema nervoso central, uma apresentação rara, mas já
evidenciada e pouco esclarecida na literatura (SMITH; ANDERSON, 1977; SWEENEY et al.,
1986). Considerando os aspectos macro e microscópicos, o caso 4 pode ser classificado como
uma forma atípica da leucose esporádica com envolvimento do sistema nervoso. Em outras
espécies, estas apresentações são classificadas como extra-nodais, manifestando-se em locais
como globo ocular, coração, medula e cérebro (COUTO, 1992; SLATTER, 1992; FIGHERA,
2000), sendo o aspecto descrito, associado ao linfoma primário do SNC (KOESTENER,
1978).
Outras alterações observadas no tecido nervoso medular, como malácia e
degeneração walleriana, foram associadas à compressão exercida pela neoplasia (caso 2).
43
Achados semelhantes foram descritos na literatura (REBHUN, 1984; SHERMAN, 1987;
DIVERS et al., 1995; BURTON et al., 2010). No caso 1, estas alterações não foram
observadas, provavelmente porque o tamanho da neoformação (0,5 cm) não foi suficiente
para induzir compressão.
A imunofenotipagem é um procedimento necessário para a classificação dos
linfomas pelo sistema Kiel. Os primeiros relatos em bovinos classificaram os linfomas como
de células T (ISHII; OKI, 1984), no entanto linfomas bovinos de células B também foram
descritos (VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997). Neste estudo, todos os casos estavam
associados a linfócitos T. Em outras espécies, como os cães, à determinação do tipo celular
influencia no prognóstico e tratamento, tendo o linfoma de células T pior prognóstico
(GREENLEE, et al. 1990; TESKE, 1994). Em bovinos os relatos envolvendo
imunofenotipagem de linfomas são escassos, sendo necessários mais estudos para se verificar
se há diferenças no prognóstico entre linfomas de células T ou B.
Em conclusão, os achados anátomo-patológicos e imuno-istoquímicos
associados à ausência de reatividade no teste de imunodifusão em ágar-gel permitiram o
diagnóstico de leucose esporádica bovina nos quatro casos relatados.
44
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46
VERNAU, W.; JACOBS, R. M.; VALLI, V. E. The immunophenotypic characterization of
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508, 1987.
47
CONCLUSÕES
A leucose esporádica bovina foi observada em quatro animais de um total
de 78 examinados.
Dois animais apresentaram a forma juvenil da leucose esporádica com
envolvimento do canal medular.
Dois animais apresentaram forma atípica da leucose esporádica associada
à infiltração de linfócitos neoplásicos no SNC.
As neoplasias foram classificadas fenotipicamente como linfomas T.
48
ANEXOS
49
ANEXO A
Lista de Reagentes e Produtos
1. 2-Mercaptoetanol (C2H6O5) P.M. 78,13 (Fluka®)
2. Acetona, P.A. (CH3COCH3) P.M. 58,08 (Dinâmica®)
3. Ácido acético glacial, P.A. (CH3COOH) P.M. 60,05 (Nuclear®)
4. Ácido bórico (H3BO3) P.M. 61,83
5. Ácido cítrico P.A. – Anidro (Reagen®)
6. Ácido clorídrico (HCl) P.M. 36,46 (Reagen®)
7. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A. (C10H14N2O8Na22H2O) P.M. 372,24
(Reagen®)
8. Ácido fórmico P.A. / ACS (Reatec®)
9. Agarose (Gibco BRL®)
10. Álcool etílico absoluto (C2H2OH) P.M. 46,07 (Nuclear®)
11. Álcoolisoamílico ((CH3)2CHCH2CH2OH) P.M. 88,15 (Synth®)
12. Anticorpos (E-caderina e Ki-67) (Zymed®)
13. Azul de bromofenol (Sigma®)
14. Bicarbonato de sódio P.A.(NaHCO3) P.M. 84,01 (Biotec®)
15. Cloreto de potássio, P.A. (KCl) P.M. 74,56 (Reagen®)
16. Cloreto de sódio, P.A. (NaCl) P.M. 58,45 (Reagen®)
17. Clorofórmio, P.A. (CHCl3) P.M. 119,38 (Dinâmica®)
18. DAB (Invitrogen Life TechnologiesTM
)
19. EDTA
20. Eosina (Nuclear®)
21. Ethidiumbromide (C21H20N3Br) P.M. 394,3 (Sigma®)
22. Formaldeído P.A. (Vetec®)
23. Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) P.M. 141,96 (Synth®)
24. Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.2H2O) P.M. 155,99 (Reagen®)
25. Gelatina U.S.P. (Sinth®)
26. Hematoxilina (Nuclear®)
27. Hidróxido de Sódio, P.A. (NaOH) P.M. 40,00 (Dinâmica®)
28. Hidroximetil amino metano – TRIS 99% P.M. 121,14 (Inlab®)
29. Metanol, P.A. (CH3OH) P.M. 32,04 (Allkimia®)
30. Tris (Nuclear®)
31. Xileno P.A. (Nuclear®)
50
ANEXO B
Soluções e Tampões
PBS pH 7,2
Misturar 1,98 g de Na2HPO4.7H2O em 500 mL de água MilliQ®
Acrescentar 0,36 g NaH2PO4.H2O e 8.17 g de NaCl
Adicionar água MilliQ® q.s.p. 1.000 mL
Ajustar solução para pH 7,2
Tampão citratopH 6,0
2,1 g de acido cítrico H3C6H5O7.H2O
1000 mL de Água destilada
TampãoTris-EDTA Tween20 pH 9,0
1,211 g de TRIS
0,372 g de EDTA
1000 mL de Água destilada
0,2ml de Tween20
51
ANEXO C
Protocolo de Técnicas
Imuno-histoquímica (CD79, CD3 e lisozima)
- Xilol 1 – 20min (em estufa)
- Xilol 2 – 15min
- Álcool abs. 1 – 10min
- Álcool abs. 2 – 10min
- Álcool 90% 1 – 5 min
- Álcool 90% 2 – 5min
- Álcool 80% 1 – 5min
- Álcool 80% 2 – 5min
- Álcool 70% 1 – 5min
- Álcool 70% 2 – 5min
- Lavar em água corrente por 10min.
- Enxaguar duas vezes em água destilada.
- Recuperação Antigênica
- Para CD3, CD79 e lisozima: Colocar as lâminas em recipiente metálico com solução
tampão citrato
- pH 6,0 e por em banho–maria (placa aquecedora) por 35 minutos após iniciar
formação de bolhas. Ir controlando temperatura manualmente para não permitir
fervura. Deixar esfriar em temperatura ambiente, na solução tampão citrato pH 6,0 por
1 a 2 horas.
- Lavar em água corrente por 10min.
- Enxaguar duas vezes em água destilada.
- Colocar as lâminas em solução de metanol (140ml) + água oxigenada 20volumes (10ml).
Deixar em câmara escura por 20 minutos.
- Lavar em água corrente por 10 minutos.
- Enxaguar duas vezes em água destilada.
- Secar as lâminas individualmente com papel absorvente e colocar uma gota de anticorpo
primário (anti-CD79, CD3 e lisozima) cobrindo todo o corte.
- Incubar em câmara úmida, deixando em geladeira por 18 horas.
- Lavar as lâminas com solução PBS pH 7,2 por 5min (repetir duas vezes).
52
- Secar as lâminas individualmente e colocar uma gota do anticorpo secundário, cobrindo todo
o corte. Cobrir e deixar incubando em temperatura ambiente por 20min.
- Lavar as lâminas com solução de PBS pH 7,2 por 5 min (repetir duas vezes).
- Cobrir o corte com o DAB e observar revelação.
- Lavar as lâminas em água corrente por 10min.
- Enxaguar duas vezes com água destilada.
- Contra-corar com hematoxilina (20 segundos).
- Lavar em água corrente por 10min.
- Enxaguar em água destilada duas vezes.
- Álcool 70% - 5min.
- Álcool 80% - 5min
- Álcool 90% - 5min.
- Álcool 100% - 10min.
- Xilol - 15min.
- Montagem das lâminas.