Post on 24-Jul-2015
Regulação da Regulação da Expressão Gênica em Expressão Gênica em
EucariotosEucariotos
• Diferentes tipos celulares ≠ estrutura e função
• Pensamento inicial:genes seletivamente perdidos quando a célula se diferenciava Ovelha Dolly
Diferenciação celular
Mudanças na expressão gênica
Diferentes tipos celulares
Sintetizam e acumulam ≠ RNAs
e proteínas
Sem alteração na seqüência de DNA
http://psych.um
b.ed
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http://www.pucrs.br/fabio/histologia/
atlasvirtual/maxim
/57a7leg.htm
• Muitos processos comuns em células diferentes (genes housekeeping)
• Algumas proteínas são abundantes nas células especializadas onde atuam, mas não em outras células (hemoglobina)
• Diferença nos tipos de mRNA subestima a variação total de diferenças no padrão de produção de proteínas
modificações pós-traducionais
• Alteração da expressão gênica em resposta a sinais externos (hormônios glicocorticóides)
• Diferentes tipos celulares respondem de maneiras diversas ao mesmo sinal extracelular
• Para a maioria dos genes: controle transcricional + importante (evita síntese desnecessária)
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Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
Regulação da Expressão Regulação da Expressão Gênica em EucariotosGênica em Eucariotos
TranscriçãoTranscrição
Promotor
• A iniciação da transcrição em eucariotos envolve um grande número de fatores (fatores de transcrição - FT)
• Os FT são necessários para a iniciação e os principais responsáveis pelo reconhecimento do promotor
• Todos os promotores da RNA pol II tem elementos de seqüência próximos ao ponto de início
ligação do aparato basal – determinação do sítio de iniciação
• Seqüências mais distantes -- tipos celulares
Genes housekeeping
Genes tecido-específicos
• Genes housekeeping: tem elementos de seqüência a montante que são reconhecidos por fatores ubíquos
• Reforçadores (enhancers): a vários Kb distante do promotor
Alvos para regulação tecido-específica e temporal
• A transcrição eucariótica está nas maioria das vezes sob regulação positiva
Tamanho do genoma
Média de 5 sítios regulatórios por gene em organismos multicelulares
30000-35000 genes regulados - ???
• O repressores também atuam na regulação
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Promotor
Promotor
Elementos reguladores
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Procariotos x Eucariotos
3 RNApol
Estrutura complexa da cromatina
Requerimento de vários FT
Complexidade RNApolII
Fatores de transcrição
• Reconhecem seqüências reguladoras presentes nos promotores e reforçadores (enhancers) dos genes
• Podem ser de dois tipos:– Fatores gerais – necessários para a
expressão de todos os genes transcritos pela RNA pol II
– Fatores específicos – responsáveis pela expressão de proteínas célula-específicas (ativadores, co-ativadores, repressores e co-repressores)
Fatores gerais de transcrição
• TFIID: TBP + 11 TAFs
• Diferentes TAFs, algumas são tecido-específicas
• TBP se liga à cavidade menor do DNA (domínio C-terminal DNA, N-terminal interação com proteínas
• Ligação de TBP ao DNA inconsistente com a presença de nucleossomos
• Ligação de TBP ao DNA-- associação ao DNA RNApolII + fatores
• RNA pol só se liga após a ligação dos FT ao promotor
Fatores gerais de transcrição
TATAbox:- Ocorre na maioria dos genes- Principal região promotora da transcrição- Sítio primário de adesão dos fatores de transcrição + TBP (TATA-Binding Protein)
Fatores de Transcrição (FT)- Se ligam a elementos reguladores nos promotores- Modificam a taxa de transcriçãoNão ocorre início de transcrição na ausência de proteínas acessórias.
RNApolII
A ligação de TFIID ao TATA box é o primeiro passo da iniciação da transcrição em eucariotos
TFIIA ativa TBP – alivia repressão por TAFII230
TFIIB promove a superfície que será reconhecida pela RNApol
TFIIF- helicase
TFIIH –ATPase, helicase, quinase (fosforilação da CTD da RNApol)
TFIIE e TFIIH movimento da polimerase
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• Elementos de seqüência (curtos): eficiência e especificidade de reconhecimento do promotor. Ex: genes Hsp
• Vários elementos de resposta em um gene. Ex: gene metalotioneina
• ~100pb distantes do ponto de início ou + distantes (enhancers)
• Influenciam a freqüência de iniciação (freqüência de montagem)
Fatores específicos
MRE resposta a metais pesados
TRE resposta a ésteres de forbol
Um único gene regulado por vários elementos
Fatores específicos
Reforçadores (Enhancers)• Promotores eucarióticos não funcionam sempre sozinhos
• Reforçadores podem ativar o promotor de locais a montante ou a jusante
• Podem estar a vários kb distantes da região promotora ou localizado dentro do gene
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• Podem aumentar a transcrição em centenas ou mais vezes
• Em leveduras UAS (upstream activator sequence)
• Estrutura + cooperativa entre os fatores de ligação: todos os componentes requeridos
• Superfície que se liga ao complexo de co-ativação (auxilia complexo de pré-iniciação)
Reforçadores (Enhancers)
• Os reforçadores atuam aumentando a concentração de ativadores nas proximidades do promotor
• cis e trans-atuantes: reforçando a idéia da necessidade de “proximidade” entre promotor e reforçador
Reforçadores (Enhancers)Le
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Proximidade reforçador-promotorPete
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Levedura
Mediador: complexo de 20 subunidades (co-ativador)
• Os isoladores são capazes de bloquear a passagem de qualquer efeito de ativação ou inativação de reforçadores, silenciadores
• Promovem barreiras contra a propagação da heterocromatina
• Dois isoladores podem proteger a região entre eles de efeitos externos
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Isoladores
Regulação do enhancer: isoladoresW
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Ativadores• São FT que reconhecem seqüências específicas no promotor ou reforçador
• Aumentam a eficiência da ligação do aparato basal ao promotor, aumentando assim a freqüência da transcrição
• Co-ativadores promovem a conexão entre ativador e aparato basal (RNA pol II + fatores basais)
• Atuação:
Recrutamento da maquinaria de transcrição
Recrutamento de modificadores de nucleossomos
• Interagem com os fatores basais
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Ativador: domínios• Possuem regiões separadas independentes para ligação ao DNA e para a ativação (geralmente domínios protéicos separados)
Plasmídeo repórter: promotor GAL1 fundido ao gene LacZ de E. coli
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Duplo híbrido
Proteínas fundidas a diferentes domínios do ativador
A interação entre as duas proteínas possibilita que o gene repórter seja expresso
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Duplo híbrido
Ligação entre proteína e DNA
• Proteínas regulatórias geralmente se ligam a seqüências específicas do DNA.
• As proteínas regulatórias possuem domínios de ligação ao DNA, que incluem um ou mais motivos estruturais.
• Os sítios de ligação ao DNA para proteínas regulatórias são freqüentemente seqüências de DNA repetidas e/ou invertidas (palindrômicas), onde múltiplas subunidades (normalmente duas) da proteína se ligam.
Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Hélice-volta-hélice (helix-turn-helix)Em laranja e vermelho
Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Homeodomínio (helix-turn-helix)
Homeobox codifica domínio de 60 aa
Identificados originalmente no loci homeótico de Drosophila
Muitas vezes o homeodomínio é combinado com outros motivos em FTs de animais
A região C-terminal apresenta homologia com o motivo helix-turn-helix
Braço N-terminal: contato com cavidade menor do DNA
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Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Homeodomínio (helix-turn-helix)
Podem atuar como ativadores ou repressores
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Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Dedo de zinco (zinc finger)
“Dedo” ~23 aa
Ligação entre os dedos 7-8 aa
Cys2/Hys2Wats
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Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Dedo de zinco (zinc finger)
GL1 proteína monomérica com 5 dedos de zinco. O “dedo”1 não interage com o DNA
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Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Dedo de zinco (zinc finger)
Três dedos de zinco ligados ao DNA
Comum em proteínas eucarióticas
Poucos exemplos em procariotos
Receptores de esteróides (forma distinta)
Receptor de glicocorticóide C4 zinc finger
Os receptores de glicocorticóides e estrogênio tem 2 dedos de zinco (Cys2/Cys2)
Formam dímeros quando se ligam ao DNA
Dedo de zinco (à esquerda) determina a seqüência de DNA que será reconhecida
Dedo de zinco (à direita) controla o espaçamento entre os sítios alvo reconhecidos por cada subunidade do dímero
Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
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Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias
Os receptores de glicocorticóides e estrogênio diferem pela composição de aminoácidos no dedo de zinco
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GR - TGTTCTMR - TGTTCTAR - TGTTCTER -TGACCT
Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas
regulatórias• Além de motivos de ligação ao DNA, as
proteínas regulatórias possuem motivos de ligação a outras proteínas
– RNA polimerase– Outras proteínas regulatórias– Outras subunidades da mesma
proteína regulatória
Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas
regulatóriasZíper de leucina (Leucine zipper)
Um motivo leucine zipper ligado ao DNA.Resíduos de Leu são mostrados em vermelho.
Muito encontrado em eucariotos.Pouco encontrado em procariotos.
Cada hélice é parte integrante de uma cadeia polipeptídica, mantidas ligadas pelo motivo leucine zipper na formação do dímero.
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O zíper de leucina é uma α hélice anfipática que dimeriza
O zíper possui uma região básica adjacente que se liga ao DNA
A dimerização forma o motivo bZIP (braços que se ligam ao DNA) no qual duas regiões básicas simetricamente ligam repetições invertidas no DNA
Ex: Ativador AP1 (formado por proteína Jun e Fos)Jun forma homo e heterodímerosFos só forma heterodímeros
Seqüências alvo: repetições invertidas sem espaçamento
Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas
regulatórias
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Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas
regulatóriasHélice-alça-hélice (helix-loop-helix)
Proteínas HLH
Motivo de 40-50 aa (2 α hélices anfipáticas de 15-16 aa separadas por uma alça)
Formam homo e heterodímeros
Um único par de Leu liga as hélices (vermelho no topo)
Alça permite liberdade para as 2 hélices interagirem independentemente
A maioria das HLH possuem uma região adjacente ao motivo HLH que é altamente básica
Proteínas bHLH
Dímero com ambas subunidades bHLH podem ser ligar ao DNA
Possibilidade de associação combinatória
Combinações particulares possuem função diferente com relação à ligação ao DNA e regulação transcricional
Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas
regulatórias
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Controle combinatório
Ativadores trabalham sinergicamente para integrar os sinais
Em alguns casos vários sinais são necessários para ligar um gene
O controle combinatório permite um aumento na complexidade
Dois ativadores podem recrutar um mesmo complexo ou diferentes
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Controle combinatório
A sinergia pode também resultar do auxílio mútuo entre ativadores para ligação ao sítio de atuação
Ligação cooperativa
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Controle combinatórioGenes do tipo acasalante em leveduras
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Remodelamento da cromatina
+ comum: alterar a organização dos nucleossomos
Gasto de ATP para o remodelamento
Alguns ativadores podem se ligar ao DNA na superfície do nucleossomo
Gene ativo: estrutura da cromatina no promotor e na região próxima
Remodelamento da cromatinaLe
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Remodelamento da cromatina
Região N-terminal
Co-ativador
Ativador
Co-repressor
Repressor
Histonas acetiladas:Cromatina ativa
Histonas desacetiladas:Cromatina inativa
Grupo Acetil(Ac)
Lisina
Região N-terminal
Co-ativador
Ativador
Co-repressor
Repressor
Histonas acetiladas:Cromatina ativa
Histonas desacetiladas:Cromatina inativa
Grupo Acetil(Ac)
Lisina
Acetilação das histonas pelas histonas acetiltransferases (HAT)
As HAT podem ser recrutadas pelos ativadores
Complexo de remodelamento da cromatina (SWI/SNF) estimulam a ligação de fatores de transcrição (subunidades com atividade helicase)
Acetilação das
histonasTodo o core de histonas pode ser acetilado
Principais alvos: lisinas da cauda N-terminal da H3 e H4
Cromatina acetilada é mais sensível a DNaseI
Ativadores conhecidos pos-suem atividade HAT
Momentos: Replicação e ativação gênica
TAFII145: acetilase
HAT A: transcrição
HAT B: montagem do nucleos-somo
Complexo de remodelamento da cromatinaP
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Histona - acetilase
Remodelamento da cromatina
Ativação de um
promotorPredominância de regulação positiva em eucariotos: armazenamento do DNA na cromatina
Silenciamento gênicoPete
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Histonas podem ser deacetiladas por histonas deacetilases (HDACs)
Deacetilação de histonas está relacionada à repressão gênica
Ausência de acetilação de histonas é uma das características de heterocromatina
HDAC
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nMetilação do DNA e
histonasA metilação do DNA e histonas está relacionada à cromatina inativa
Locais para metilação de histonas: 2 lisinas na cauda da H3 e uma arginina na cauda da H4
A maioria dos sítios de metilação do DNA: ilhas CpG
CpG em heterocromatina: metiladas
Conexão entre metilação de DNA e histonas: algumas HMT contém sítios para ligação a CpG metilado (o contrário é observado em leveduras).
De-acetilação -- metilação
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Metilação do DNA
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Efeito da Metilação do DNA
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Metilação do DNA
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nMetilação do DNA e imprinting
Insulin-like growth factor 2
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Metilação do DNA e
imprinting
Xic (X-inactivation center): região de ~450 kb
Xic contém o gene Xist, expresso no cromosso X inativo
X inativo: sem acetilação, metilação da seqüências CpG
Metilação do promotor Xist no X ativo
Inativação do cromossomo X
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Repressores
a – menos comum em eucariotos
Sítio de ligação do repressorSítio de ligação do ativador
Superf ície de ativação
TATA
TATA
Sítio de ligaçãodo repressor
Sítio de ligaçãodo ativador
Sítio de ligação do ativadorSítio de ligação do repressor
Repressor
TATA
TFIID
Ativador
Sítio de ligação do repressorSítio de ligação do ativador
Superf ície de ativação
TATA
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Sítio de ligaçãodo repressor
Sítio de ligaçãodo ativador
Sítio de ligação do ativadorSítio de ligação do repressor
Repressor
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Repressores
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Repressores
Repressão do gene GAL1 na presença de glicose
Mig1 recruta complexo repressor Tup1 que recruta a deacetilase
E também inibe a maquinaria de transcrição
Regulação da utilização de galactose em levedura
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Ação do hormônios peptídicos e hormônios esteróides
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Modelo para a ação de hormônios esteróides
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Modelo para a ação de glicocorticóide em células de mamíferos
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Regulador com atividade controlada por localização nuclear
Silenciamento gênico mediado por RNA de
interferência
Dicer = endonuclease ~ a RNAaseIII
stRNA = small temporal RNA
Dicer
siRNA
O mecanismo de RNAi em plantas: defesa contra vírus
Pode controlar a atividade de transposons
Micro RNAs (miRNAs) podem inativar genes do mesmo modo que o siRNA
Mecanismo prático e eficiente para silenciamento gênico
siRNAs 21-23 nt: 2 bases na ext. 3´são não pareadas
RNA-induced silencing complex (RISC)
Silenciamento gênico mediado por RNA de
interferência
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Splicing alternativo
Gene Sex-lethal em moscas (só nas fêmeas)Sexo determinado pela relação entre cromossomos sexuais e autossomos
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Splicing alternativo
Gene Sex-lethal em moscas (só nas fêmeas)
Sxl auto-regulação (proces-samento)
Vários mRNA eucarióticos estão sujeitos a repressão
traducional
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Controle traducionalGcn4 ativador transcricional – proteínas da biossíntese de aminoácidos