Recombinação genética

Introdução • Exatidão de replicação do DNA e do reparo dos danos para

manutenção da informação genética garante sua transmissão dos progenitores a sua prole

• Recombinação importante para a geração de diversidade genética, crucial para a evolução.

• Diferenças genéticas entre os indivíduos provêem o material inicial essencial para seleção natural, a qual permite que as espécies evoluam e adaptem-se a mudanças nas condições ambientais.

Recombinação geral ou recombinação entre homólogos

• Permite que genes sejam rearranjados em diferentes combinações.

• Resulta na troca de genes entre cromossomos homólogos pareados durante a meiose.

• Envolvida em rearranjos de seqüências especificas de DNA que alteram a expressão genica durante o desenvolvimento e diferenciaçao celular.

Recombinação geral

• A quebra e a religação de duas duplas hélices de DNA homologas geram duas moléculas de DNA que sofreram entrecruzamento (crossed).

• Na meiose, este processo permite que cada cromossomo contenha uma mistura de genes maternos e paternos.

A quebra bifilamentar inicia o processo de crossing-over

             Diacinese

             Zigóteno

             Diplóteno

              Prófase I

             Paquíteno

             Leptóteno

Meiose IFase: Profase I (sub-fases)

Leptóteno – inicia-se a individualização dos cromossomos estabelecendo a condensação (espiralização);

Zigóteno – aproximação dos cromossomos homólogos;

Paquíteno – máximo grau de condensação dos cromossomos, os braços curtos e longos ficam mais evidentes e definidos, dois desses braços, em respectivos homólogos, se ligam formando estruturas denominadas bivalentes ou tétrades. Momento em que ocorre o crosing-over, isto é, troca de segmentos (permutação de genes) entre cromossomos homólogos;

Diplóteno – começo da separação dos homólogos, configurado de regiões quiasmas (ponto de intercessão existente entre os braços entrecruzados, portadores de características similares);

Diacinese – com separação definitiva dos homólogos, já com segmentos trocados.

Recombinação na meiose

(1) Duas cromatides não irmãs (oriundas de diferentes cromossomos), se entrecruzam (crossing-over), isto é, suas duplas hélices são clivadas, e as duas extremidades são unidas as fitas opostas correspondentes, formando duas hélices intactas, cada uma composta por partes das duas moléculas DNA iniciais.

Recombinação na meiose

(2) O sitio da permuta (isto é, local em que a dupla hélice vermelha é ligada a dupla hélice cinza) pode ocorrer em qualquer lugar das seqüência nucleotídeos homólogas das duas moléculas participantes

(3) No local da permuta, a fita de DNA de uma molécula de DNA é pareada a fita da segunda molécula DNA, criando uma junção de heteroduplex (quiasmas) que une as duas hélices.

Esta região de heteroduplex pode conter vários nucleotídeos.

Recombinação na meiose

Recombinação de meiose

(4) Algum tipo de maquinaria celular toma estes grandes arranjos moleculares, os quebra na mesma posição relativa e os reúne em um novo arranjo.

(5)Nenhuma seqüência de nucleotídeos é alterada no local da troca, ou seja, nenhum material genético é perdido ou ganho.

Mecanismo molecular: Quebra bifilamentar: pontas quebradas de DNA são

recombinogênicas, promovem recombinação.

Formação de heterodúplice de DNA: uma molécula de DNA é composta de um único filamento de DNA a partir de uma cromátide derivada de um genitor, e um único filamento de uma cromátide derivada do outro genitor.

Como essa junção heteroduplex é formada e como as duas regiões homólogas reconhecem uma a outra no

local do crossing-over?

• Reconhecimento ocorre durante um processo chamado sinapse de DNA

• Ocorre a formação de pares de bases entre as fitas complementares das duas moléculas de DNA

Sinapse de DNA

• Essencial para recombinação geral na meiose,

• É necessária apenas uma quebra em uma das duas fitas de uma hélice de DNA, para produzir uma fita exposta para a sinapse,

• Ocorre a quebra de uma ligação fosfodiester permite que uma das extremidades separe-se de sua fita complementar, liberando-a para formar uma pequena heteroduplex com uma segunda hélice de DNA intacta – assim iniciando a sinapse.

Recombinação E.coli

• A proteína RecA de E. coli tem função central na recombinação entre cromossomos e catalisa a reação de sinapse de DNA de várias etapas entre uma dupla hélice e uma região de fita simples de DNA homologa.

Estudos em bactérias, levou ao desenvolvimento do modelo molecular de recombinação - Modelo de Holliday (1964).

Modelo de Holliday

• A recombinação é iniciada pela introdução de cortes em posições idênticas nas duas moléculas de DNA parental.

• As fitas de DNA clivadas sofrem desenrolamento parcial, e cada uma dessas junta a outra molécula por pareamento de bases complementares com fitas entrecruzadas.

Modelo de Holliday

• Após a formação de junção de Holliday, a junção das fitas entrecruzadas gera moléculas recombinantes.

• Pode gerar dois diferentes isômeros:– Heterodúplice recombinantes– Heterodúplice não recombinantes

• Entretanto, esse modelo não explica como a recombinação é iniciada por cortes simultâneos em ambas as moléculas parentais, na mesma posição.

Estrutura molecular de um junção de Holliday

Troca de cadeias

Quebra bifilamentar em uma cromátide leva a duas junções unifilamentares de Holliday circundando uma região heterodúplice.

Recombinação por quebra de dupla fita

• Ambas as fitas de DNA sofrem ressecção por nucleases que digerem o DNA no sentido 5’ para 3’, produzindo extremidades de fita simples.

• Estas fitas invadem outra molécula parental por pareamento homologo de bases.

Mapa genético ou cromossômico é a representação da posição dos genes no cromossomo.Está diretamente relacionada a taxa de crossing.

Unidades de Recombinação (U.R.) ou Morganídeos (M) são as unidades usadas para determinar a posição dos genes no cromossomo e correspondem a taxa de crossing.

Mapeamento por recombinação de cromossomos eucariotos

• Uso da análise de crossing-over para mapear as posições dos genes nos cromossomos;

• A posição de um gene no mapa é importante para análise de sua função;

• A maioria dos genes identificados pelo sequenciamento são de função desconhecida;

• O gene identificado pela análise fenotípica deve estar associado ao gene identificado pelo sequenciamento importância dos mapas cromossômicos.

• Depois que Sutton sugeriu a teoria cromossômica da hereditariedade em 1903, várias evidências foram acumuladas de que os genes estavam nos cromossomos

• Como existem muito mais genes do que cromossomos espera-se que vários genes possam estar no mesmo cromossomo

• Como os cromossomos tem forma linear é esperado que os genes também estejam alinhados ao longo dos cromossomos como "contas de um colar“ (Surtevant em 1913).

A SEGREGAÇÃO INDEPENDENTE SEMPRE É VÁLIDA ?

Os experimentos de Mendel mostraram que os pares de alelos para genes que influenciam características diferentes de ervilhas se distribuem independentemente proporções precisas na prole.

CromossomosNÃO

Homólogos

A

B

a

b

• O que ocorre quando pares de alelos de genes diferentes estão no mesmo cromossomo?

CromossomosHomólogos

aA

B b

•Quando dois ou mais genes, responsáveis por diferentes características, estão localizados em um mesmo cromossomo, a herança é chamada de Vinculação Gênica.

•Nestes casos a quantidade de gametas e a frequência da descendência apresentarão diferenças em relação ao di-ibridismo já que a incidência do crossing-over será fundamental.

• Podemos determinar que um gene está no mesmo cromossomo pela quebra da 2a Lei de Mendel (a da segregação independente) Ex. Drosófilas

• A explicação seria que os locus bn e det estão tão próximos uns dos outros e no mesmo cromossomo. Como conseqüência estão associados e movem-se juntos durante a meiose.

• Tais pares de alelos de genes diferentes apresentam algumas regularidades em seus padrões de herança.

Formação de gametas Diíbridismo

AB 25% Ab 25% Ba 25% ba 25%

A

B

a

b

GAMETAS (AaBb)

a

B

A

b

Anáfase

• Diíbrido: indivíduo heterozigoto para dois genes de interesse.

A

B

a

b

Com a quebra e união das cromátides parentais durante a meiose A seria herdado com b e a bom B crossing-over

Quanto maior a região entre dois genes, maior a probabilidade de que o crossing ocorra nessa região.

Frequência de novas combinações dois genes estão distantes ou próximos mapear a posição dos genes nos cromossomos.

Qual seria o resultado deste cruzamento?

Padrões de herança de genes ligados

• Bateson e Punnett estudando a herança de dois genes nas ervilhas-de-cheiro.

• Em uma autofecundação padrão de uma F1 diíbrida, a F2 não apresentou a proporção 9:3:3:1 prevista pelo princípio da segregação independente.

• Algumas combinações de alelos eram mais frequentes do que o esperado fisicamente ligados.

Desvios da distribuição independente

Bateson e Punnet ~1906

• Thomas Morgan estudou dois genes autossomos em Drosophila.

Desvios da distribuição independente

pr/pr . Vg/vg x pr+/pr+ . Vg+/vg+

pr+/pr . vg+/vg(diíbrido)

Cruzamento Teste

pr+/pr . vg+/vg x pr/pr . Vg/vg (fêmea diíbrida de F1) (Macho testador)

P

F1

Cor dos olhospr púrpurapr+ vermelho

Tamanho da asavg vestigialvg+ normal

Alelo tipo selvagem dominante

Morgan ~1911

Os resultados do cruzamento teste de Morgan:

pr+ . vg+

pr . vg

pr+ . vg

pr . vg+

1.339

1.195

151

154

2.839

Desvio da previsão mendeliana da proporção 1:1:1:1 indica associação de alguns alelos.

Morgan sugeriu que os dois genes em sua análise estavam situados no mesmo par de cromossomos homólogos.

Alelos associados

• Morgan chamou a combinação não-parental de genes ligados de recombinantes.

• Ele esperava 50% de fenótipos recombinantes se a segregação ocorresse independentemente.

• Morgan observou 900/2.441 (36,9%) de fenótipos recombinantes. Então, concluiu que os dois genes devem estar ligados.

Desvios da distribuição independente

Simbolismo e terminologia da ligação

Os locus carregados em um mesmo cromossomo são ditos "ligados“.

A

B

a

b

CromossomosHomólogos

Locus 1

Locus 2

• Grupos de ligação nº haplóide de autossomos + os cromossomos sexuais

Ex.1 Drosófila tem 5 grupos de ligação (2N = 8; 3 autossomos + X + Y)

Ex.2 Humano tem 24 grupos de ligação (2N = 46; 22 autossomos + X + Y).

Obs. Quando não há cromossomos sexuais, considera-se "grupo de ligação" o número haplóide. Ex. Tomateiro (2N = 24 ou seja possui 12 grupos de ligação)

• CIS: os dois alelos dominantes ou tipo selvagem estão presentes no mesmo homólogo.

• TRANS: estão em homólogos diferentes.

Quanto ao arranjo dos alelos em diíbridos

Não possuem pontuação entre si;Separados por uma barra;Escritos na mesma ordem em cada homólogo; Genes em cromossomos diferentes são separados por ponto-e-vírgula: A/a ; C/cGenes de ligação conhecida são separados por ponto: A/a . D/d

configuração Cis: ambos os selvagens ou os recessivos se encontram em um mesmo cromossomo.

Trans quando se tem um selvagem e um recessivo no mesmo cromossomo.

Quanto ao modo de representação dos alelos nos cromossomos

bb pr pr cc Usado quando não é sabido o sistema de ligação

b/b pr/pr c/c ou b pr c b pr c

Quando os 3 locus estão em cromossomos diferentes

b pr c / b pr c ou b pr c b pr c ou (b pr c) / (b pr c)

Quando estão no mesmo cromossomo

Surgem novas combinações de alelos através do crossing-over;

Recombinantes são o produto da meiose possuidores de combinações alélicas diferentes das células haplóides que formaram o diplóide meiótico

CRUZAMENTO DE "DOIS PONTOS“É a análise de 2 locus. É útil para evidenciar associação ou não de locus de um mesmo

cromossomo

Humanos de 105 a 107 pares de base Schizosacharomyces pombe 6.000

• A freq. de recombinantes pode ser usada como indicadora da distância entre os genes. Um % de recombinantes = 1 centimorgan.

• No exemplo, os locus bn e det estão distanciados de 0,5 centimorgans (figura)

• A relação centimorgan / pares de base é variável entre espécies, sexo, regiões do cromossomo.

CRUZAMENTO DE “TRÊS PONTOS“É a análise de 3 locus, cada um segregando 2 alelos. É útil para verificar a posição relativa de cada

um dos locus

• A análise de 3 locus, cada um segregando 2 alelos controlando a cor do corpo (preto b); cor do olho (púrpura pr) e a morfologia da asa (curvada c) (figura)

• Os dados são posicionados em "classes recíprocas" colocando-se as parentais como primeiras e as duplo recombinantes como as últimas

POSSÍVEIS RESULTADOS DE UM CRUZAMENTO TESTE DA PROGÊNIE DE UM TRIHÍBRIDO b pr c

? Preto, púrpura, curvada x ? Selvagem P1 bb prpr cc b+b+ pr+ pr +c+c+

Selvagem x Preto, púrpura, curvada Cruzamento teste do trihíbrido b+ b pr+ pr c+ c bb prpr cc Possibilidades Sem ligação Com ligação completa 1/8 b/b pr/pr c/c (Parental) 1/2 b pr c / b pr c 1/8 b/b pr/pr c+/c 1/2 b+ pr+ c+ / b pr c 1/8 b/b pr+ /pr c/c 1/8 b/b pr+ /pr c+/c (Recombinantes) 1/8 b+ /b pr/pr c/c 1/8 b+ /b pr/pr c+/c 1/8 b+ /b pr+ /pr c/c 1/8 b+ /b pr+ /pr c+/c (Parental)

RESULTADOS DE UM CROSSING OVERENTRE OS LOCUS PRETOS E PÚRPURA

EM CROMOSSOMOS DROSÓFILA

RESULTADOS DE UM CROSSING OVER DUPLO NAS REGIÕES b - pr - c

EM CROMOSSOMOS DE DROSÓFILA

RESULTADOS DO CRUZAMENTO TESTE ENTRE UMA FÊMEA DE DROSÓFILA PARA CORPO PRETO, OLHOS PÚRPURA E ASAS CURVADAS E UM MACHO SELVAGEM (b+b pr+pr c+c x bb prpr cc )

Distâncias de mapa

25,4

(a distância mais longa é + correta) 5,9 19,5 b pr c 23,7

(% de recombinantes de b e c)

Mapa cromossômico de Drosófila

Cálculos• Número observado de Duplo Recombinantes (NODR)

• = 60+72= 132; a freq. é 132/15.000 = 0,88%

• Freqüência esperada de Duplo Recombinantes (dois eventos independentes ocorrendo simultaneamente regra de multiplicação)

• (prob. de b pr) x (prob. de pr c) = 0,059 x 0,195 = 0,0115 = 1,15%. Esta percentagem de 15.000 da 172 que é o Número esperado de Duplo recombinantes (NEDR)

• Coeficiente de Coincidência (CC) = NODR /NEDR = 132/172 = 0,77 = 77%. Isto significa que somente 77% dos Crossing Over esperados realmente ocorreram

• Coeficiente de Interferência (CI)= 1 - CC = 1- 0,77 = 0,23 = 23%. Isto significa que 23% dos Crossing Over esperados não ocorreram

• A interferência é positiva quando a ocorrência do primeiro Crossing Over reduz a chance de ocorrência do segundo

Evidência de que o crossing-over é um processo de quebra e reunião

Demonstração citológica do Crossing Over em milho.

Experimento de H. Creighton e B. McClintock.

Mapeamento gênico em eucariotos

• Genes sobre cromossomos não homólogos segregam independentemente.

• Genes sobre o mesmo cromossomo (sintênicos) estão fisicamente ligados (grupo de ligação) e podem ser herdados juntos.

Objetivo:• Analisar a freqüência de recombinação alélica em cruzamentos;• Novas combinações de alelos parentais são produzidos por

recombinação (“crossing-over” durante a meiose I);• Cruzamentos-teste são usados para determinar quais genes estão

ligados e criar um mapa de ligação (mapa genético de cada cromossomo).

Ligação e padrão de segregação

• Como a ligação afeta o padrão de segregação mendeliano?

• Descoberta da ligação em Drosophila:– Morgan demonstrou que o gene para olhos brancos (w) e

o gene para asas miniatura (m) ocorrem sobre o cromossomo X;

– Cruzando uma fêmea de olhos brancos/asas miniatura com macho selvagem:

wm/wm X w+m+/Y F1 w+m+/wm e wm/Y– Ou seja, F1 fêmeas tipo selvagens (w+m+/wm) e machos

com olhos brancos e asas miniatura (wm/Y).

Autossomos ligados

P

pr+pr+ vg+vg+ prpr vgvg

Gametas pr+ vg+ pr vg

F1

pr+pr vg+vg

X

Autossomos ligados

XP

pr+pr vg+vg pr+pr vgvg prpr vg+vg prpr vgvg

F1

1339

Parental

151

Recombinante

154

Recombinante

1195

Parental

Recombinação

Intercromossômica Intracromossômica

Entendendo a recombinação

Cis Trans

Entendendo a recombinação

Crossing over

Mapeamento cromossômico

• A porcentagem de recombinantes genéticos produzidos num cruzamento teste reflete a relação de ligação entre os genes.

• Os experimentos de recombinação podem ser usados para gerar mapas genéticos.

– Teste de dois pontos– Teste de três pontos

Teste de dois pontos

415

92

88

405

820Parentais

Recombinantes 180

Total 1.000

Freqüência de recombinação =

_____1801.000

vg b18 u.m.

Teste dos três pontos

sc ec cv9,1 10,5

Interferência: