PROTEÔMICA

Ferramentas para identificação de antígenos e

imunógenos

10/06/2008

O que é Proteômica?

“Identificação, caracterização e quantificação de todas as proteínas envolvidas em uma cadeia particular, organela, célula, tecido, órgão ou

organismo que pode ser estudado com o objetivo de fornecer dados confiáveis para o

entendimento de determinado sistema.”

Genômica DNA (Gene)

GenômicaFuncional

Transcriptômica RNA

Proteômica PROTEÍNA

Metabolômica METABÓLITOS

Transcrição

Tradução

Reação enzimática

A nomenclatura ômica…

Lições sobre os Projetos genômicos A complexidade evolucionária não é primariamente determinada

pelo maior número de genes, mas sIm pela variação do número de proteínas sintetizadas.

Isso é alcançado pela geração de múltiplas proteínas a partir de um único gene, como por exemplo: Diferentes combinações de exons por splicing alternativo

Processamento pós-traducional (ex, clivagem de pró-peptídeos)

Modificações pós-traducionais (ex acetilação, glicosilação)

Modificações no dogma central: DNA --> RNA --> proteína(s)

É importante então realisar análises a partir dos PRODUTOS do gene, e não tanto dele mesmo.

Por que estudar a expressão de proteínas?

DNA

Transcritode RNAPrimário

mRNA mRNA

proteína Proteína

ControleTranscricional

Controledo ProcesDe RNA

ControleTransport

RNA

mRNA inativoControle

DegradaçãoRNA

Controle de Tradução

ControlePós-Transducional

Vantagens centrais da proteômica:

Pesquisadores trabalham no nível de produtos gênicos, que são realmente expressos e levam a um produto real, não somente sendo expresso e tendo mRNA.

Limitações centrais da proteômica:

Geralmente, somente uma fração das proteínas sintetizadas pode ser detectada num experimento, enquanto a expressão de todos os genes pode ser monitorada num experimento de array.

Pré-requisito básico da proteômica:

O genoma sequenciado do organismo investigado ou pelo menos uma coleção de cDNAs.

Background experimental

Eletroforese 2D Método para separação e visualização de

proteínas Separação por carga e massa

Espectometria de Massa Análise de alta confiabilidade e identificação de

proteínas. Fragmentação de proteínas Análise de peptídeos

A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico)- Gel com um gradiente de pH imobilizado-Corrente elétrica leva proteínas carregadas a se mover até alcançar o ponto isoelétrico

2D-SDS PAGE gel

Ponto Isoelétrico (pI)

Separação por carga:

4

5

6

7

8

9

10

Gra

die

nte

de p

H

está

vel

Alto pH:

Proteína carregada

-

Baixo pH:ProteínaCarregada+

No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico.

A segunda dimensão (separação por massa)-pH gel strip e colocado em um gel SDS-SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga.

2D-SDS PAGE gel

A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico)- Gel com um gradiente de pH imobilizado- Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico

2D-SDS PAGE gel

Exemplo de técnica de 2D-gel

Vantagens vs Desvantagens Boa resolução

para proteínas Detecção de

modificações pós-transcricionais

Não funciona bem para proteínas altamente hidrofóbicas

Limitado pelo range de pH

Difícil detecção de proteínas pouco abundantes

Análise e quantificação sáo difíceis

Exemplo de experimento 2-D gel

Exemplo de experimento 2-D gel

Exemplo de experimento 2-D gel

Gautam et al, 2007

Exemplo de experimento 2-D gel

Gautam et al, 2007

Exemplo de experimento 2-D gel

Gautam et al, 2007

Exemplo de experimento 2-D gel

Thomas et al, 2005

O que é Mass Spec? Ferramenta analítica para determinar a composição

molecular de uma amostra ou os pesos moleculares

Somente picomolares de concentrações são requeridas

Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas moléculas orgânicas

Para 40 kDa, erro de 4 Da

Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou modificações pós-traducionais

Que tipo de informação é gerada?

Informação estrutural

Tandem mass spectrometers – particularmente, uma sequencia definida

Fragmentação de amostra – análise de produtos

Sequenciamento de peptídeos

Identificação de compostos individuais em misturas complexas

Como funciona um espectômetro? 3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e

o detector

Amostras fáceis de manipular se ionizadas

Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga (m/z)

Detecção de íons em separado e abundância relativa

Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um espectro m/z

Esquematização

O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para evitar movimento indesejado de íons

A operação está sob completo controle de sistema

Esquema típico de um TOF-MS

Introdução da amostra e Ionização

Ionização direta ou via cromatografia para separação de componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar)

Ionização pode resultar em íons positivamente

carregados (proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e oligonucleotídeos)

Metodologias de Ionização Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) Chemical Ionisation (CI) Electron Impact (EI) Electrospray Ionisation (ESI) Fast Atom Bombardment (FAB) Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

(MALDI) Thermospray Ionisation

Detecção dos Íons O detector monitora o íon, amplifica seu sinal

e o transmite para o sistema

Detectores comuns: photomultiplier, electron multiplier, micro-channel plate

Espectometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações:

Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA

A técnica não tem abilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa

Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.

Tandem MS ou MS/MS tem 2 mass spec em série:

O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2.

MS2MS1

Sequenciamento de peptídeos Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.

Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas

Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem mass spectrometry

Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5 aa

Geralmente essas “tag” sequences são suficientes para identificação por database

Identificação de proteínas por MS

Espectro

artificial

Tripsinizado

artificialmente

Database desequências

(ex. SwissProt)

Spot removido do

gel

Fragmentação

com tripsina

Espectro dos

Fragmentos

MATCHLi

bra

ry

Como funciona o sequenciamento de proteínas Tandem MS: dois analisadores de

massa em série com uma célula de colisão no meio

Célula de colisão: um local aonde os íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) resultando em fragmentação do íon

A fragmentação dos petídeos na células de colisão ocorre de maneira predizível, principalmente nas ligações peptídicas

Os íons resultantes tem massas que são consistentes com uma database de pesos moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos...

Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp

Célula de colisão

Ser-Glu-Leu-Ile-Arg

Ser-Glu-Leu

Ser-Glu-Leu-Ile

Etc…

Bioinformática e Integração de técnicas e conhecimentos

Exemplo de Experimento com MS

Gautam et al, 2007

Exemplo de Experimento com MS

Gautam et al, 2007

Vantagens vs. Desvantagens

Determinação de peso molecular e sequencia de aa.

Detecção de modificações pós-transcricionais

Alta confiabilidade

Alto custo Requer sequencia

de peptídeos em databse

Após a proteômica…..

Genômica funcional

ProteinChipTM.

Limitações da Proteômica

Limitações experimentais:Análise em larga escala de proteínas pode ser difícil devido a alguns problemas, como:

-Proteínas são frágeis

-Podem existir em múltiplas isoformas

-Não há equivalente para proteína de um PCR para amplificação em larga escala

Limitações na análise de dados:

-Dados as vezes contêm muito ruído, que podem ser difíceis de separar dos sinais específicos. Pode resultar em gasto de tempo desnecessário analisando espectros não importantes.

-As análises de banco de dados para os espectros de mass spec são somente SCORES, deixando a análise para intervenção manual para eliminação de falsos positivos.

Limitações biomédicas:

-Na prática é muito difícil de traçar a completa progressão da doença.

-As vezes, usar proteômica para monitorar a bioquímica de uma doença é como usar uma câmera fotográfica para filmar jogo de futebol

Metodologias de Ionização

1. MALDI beginner:http://www.srsmaldi.com/Maldi/Guide.html

2.MALDI lab user:

http://www.srsmaldi.com/Maldi/Lab.html 3. MALDI tutorial:

http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/maldi/maldi-ie_files/frame.htm 4. Ionization Methods 1:http://www.jeol.com/ms/docs/ionize.html

5. Ionization Methods 2:http://www.waters.com/Waters_Website/Applications/lcms/lcms_itq.htm