LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de Genética

Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - BrasilTelefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Controle de Insetos Praga Mediado por RNA de interferência

Aluno: Celso Spada Fiori

Orientador: Dr. Daniel Scherer de Moura

Controle de Pragas

� QuímicoAplicação de inseticidas

Milho: Aprox. 60 milhões de dólares anuais (40% lagarta-do-cartucho)

� BiológicoUtilização de controladores naturais

Ex.: Vespa Cotesia flavipes no controle da Diatraea saccharalis

� TransgênicosTecnologia Bt

Ex. Algodão Bt resistente a inseto

� Integrado

Defesas Naturais das Plantas

Nitrogenados

Terpenóides

Fenólicos

Físicas

Cutícula

Epiderme Espessa

Tricomas

Fibras

Químicas

Metabólitos Tóxicos e/ou Repelentes

RNA dupla fita (dsRNA):

onde tudo começa

siRNA: Em busca do alvo específico

DICER: A RNAse do processamento

Complexo RISC: Localizando e

eliminando os mensageiros

Silenciamento Gênico

O Silenciamento Gênico Pós-Transcricional

David Baulcombe, 2004. Nature

RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA)

Clivagem do mRNA

RNAiUm mecanismo suficientemente conservado!

Plantas Insetos Nematóides

Gordon & Waterhouse, 2007. Nature Biotech

Primeira Hipótese:

Plantas Insetos

Sileciamento Gênico

na Lagarta!

Possível! Porém, apenas em dietas artificiais com altas doses do siRNA correspondente

Nova Hipótese

Sileciamento Gênico

na Lagarta!

Amplificação!

BINGO: Funciona!!

Relativa

Expressão

Dias de dieta

Precedentes

Baum et al., 2007. Nature Biotech

Objetivo:

Promover a morte das lagartas!

Através de um “RNA Inseticida”

Genes candidatos: Funções essenciais para a lagarta

Baum et al., 2007. Nature Biotech

Alvos ideais: Silenciamento sob baixas quantidades de RNA

-Diluições seriadas

dsRNA aplicado na dieta artificial em concentrações elevadas (520-780 ng/cm2)

Determinação da “DL50”:

Concentração causadora de 50% de mortalidade em 12 dias

Anotação DL50

Dias

Controle

TubulinadsRNA

ATPase

dsRNA

Baum et al., 2007. Nature Biotech

Foram geradas plantas Transgênicas expressando dsRNA para silenciamento do gene

V-ATPase A

Selvagem Transgênica

Transgênica Selvagem Resistente

~1000 ovos

Baum et al., 2007. Nature Biotech

Dano

Radicular

Relativo

Coevolução inseto-planta

Como o inseto resiste aos metabolitos de defesa das plantas?

Análise da tolerância da lagarta ao Gossipol:(em dieta artificial)

Exemplo: Helicoverpa armigera

Tolera o gossipol produzido pelo algodão?

Ganho de

peso (mg)

s/ glândulas c/ glândulas

Ganho de

peso (mg)

Mao et al., 2007. Nature Biotech

P450 Monooxygenases: Enzimas

envolvidas na adaptação a inseticidas

e metabólitos naturais

Ganho de

peso (mg)

Ganho de

peso (mg)

Ganho de

peso (mg)

Como ocorre essa tolerância?

Neste caso específico, estaria a P450 Monooxigenase participando da tolerância

ao gossipol?

Respondendo

Experimentos:

Biblioteca de cDNA de intestino de lagartas expostas ou não ao Gossipol

Dentre os genes diferencialmente expressos – CYP6AE14

Mao et al., 2007. Nature Biotech

P450 Monooxigenase

Expressão de CYP6AE14 é

dependente de dose:...e tecido específica:

mg/g de gossipol

Existe relação do crescimento da lagarta (H. arimgera)

com a expressão desse gene?

Outra Monooxigenase envolvida?

Existe especificidade?

Mao et al., 2007. Nature Biotech

Ganho de

peso (mg)

Ganho de

peso (mg)

Provada a necessidade de alta expressão do gene para tolerância,

o silenciamento deste deve reduzir a resistência ao gossipol!

Hipótese: Alimentar a lagarta com plantas transgênicas expressando o dsRNA

do gene necessário à adaptação

Plantas transgênicas: dsGFP (controle)

dsCYP6AE14

Plantas de Arabidopsis e Tabaco sem fenótipo aparente

Mao et al., 2007. Nature Biotech

Análise dos transcritos do gene no intestino da lagarta:

Alimentadas com:

O dsRNA produzido pela planta pode efetivamente silenciar o RNA da

lagarta ao ser ingerido!Mao et al., 2007. Nature Biotech

E da proteína:

Alimentadas com plantas:

Selvagem

Transgênica

Influência no desenvolvimento da lagarta

Plantas transgênicas de algodão, expressando o dsRNA do gene CYP6A14

das células do intestino de lagarta, apresentam relativa resistência a essa praga!

Ganho de

peso (mg)

Mao et al., 2007. Nature Biotech

Ganho de

peso (mg)

Conclusões

� A utilização de RNAi no controle de insetos apresenta grande potencial

� Este sistema apresenta vantagens:

-Não requer a aplicação de um segundo componente.

-Não depende da produção de nenhuma proteína pela planta

-Alta especificidade (apenas organismos alvo)

-Reduzida pressão de seleção

Perspectivas

� Aumento da eficiência de controle

� Teste de viabilidade em campo

� Potencial extensão a demais insetos, fungos, bactérias e virus.

Obrigado!

� Dúvidas?