Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG

Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas

Erica Maria de Queiroz

Orientador: José Miguel Ortega

Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento

Introdução

As proteínas Tead

domínio TEA (90% conservado)

estrutura 3D

homologia: camundongos (Tead1, 2, 3, 4)

galináceos (TEF-1A, B, C e D)

Drosophila (SD)

Aspergilus nidulans (Aba A)

leveduras (TEC-1)

Introdução

4 parálogos (camundongos):

expressão

estágios embrionários: pré-implantação/ final

adulto

Proteínas mTead: Função no desenvolvimento:

mTead1 (, e ) coração/ músculomTead2 neurônios/ rinsmTead3 placenta/ músculo/ coração / pulmões/ rins/ intestinomTead4 (4a e 4b) pulmões/músculo esquelético

Introdução

especificidade de ativação e repressão de diferentes genes

interações com outras proteínas

Proteínas: Função:Referências:

YAP65 co-ativador transcricional DePamphilis et al., 2001

Max fosfoproteína nuclear Gupta et al., 1997

TBP proteína de ligação a TATA box Jiang et al., 1996

TONDU/hVgl-1, hVgl-2 e hVgl-3 co-ativadores transcricionais Vaudin et al., 1999

MEF2 fator de transcrição de soro Stewart et al., 2002

SRF fator de transcrição de miócito Gupta et al., 2001

PARP modificador de histonas Ordahl et al., 1999

P160 (SRC1,TIF2 e RAC3) co-ativadores nucleares Parker et al., 2000

Introdução

A proteína mTead1 99% de homologia a Tead1 humana

domínios caracterizados

PROMOTOR PROMOTOR

52

NAD

- - -

TEA

+++

PR STY ZF

134 236 342 426

PROMOTOR Rodrigues, 2001

Objetivo Geral

Desenvolver e aplicar tecnologias genéticas para o estudo de domínios reguladores da

transcrição gênica utilizando proteínas Tead como modelo

Objetivos Específicos

Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead

Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA

Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

Triagem de uma biblioteca de cDNA de embrião de camundongo de 7 dias utilizando PR e ZF como “isca”

Aplicar nova tecnologia de análise de alteração da proliferação celular para verificar a atuação de mTead4 na regulação do ciclo celular

Objetivos Específicos

Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead

Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA

Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

Metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio

líquido

Sistema de Duplo-Híbrido

mRNA

Gene Repórter HIS3UASGal

Proteína 1

DL

Proteína 2

DA

Interações detectadas com o sistema de Duplo-Híbrido

Proteínas: Referências:

SNF1 / SNF4 Fields et al., 1989

Proteínas cinases de SNF1 Yang et al., 1992

SRF / SAP1 Dalton et al., 1992

RAP1 / RIF 1 Hardy, 1992

C-jun / c-fos Katoet al., 1992

Maize B / maize C1 Goff et al., 1992

HIV gag / ciclofilina A e B Luban et al., 1993

Max / Mxi 1 Zervos et al., 1993

Rb / proteína fosfatase tipo 1 Durfee et al., 1993

Ras / Raf van Aelst et al., 1993

p53 / antígeno-T Li & Fields, 1993

Grb2 / Sos1 Chardin et al., 1993

várias proteínas hélice-alça-hélice Standinger et al., 1993

DBF4 / CDC7 Jackson, 1993

Seleção em Meio Líquido

Modelo Deepwell

Modelo Erlenmayer

A Proposta

Transformação em Leveduras

Seleção

0,5.107células/mlInóculo

108células/mlTransformação

com LiActrp leu

Seleção em meio líquido

não transformantes

transformantes

duplo-híbrido positivo -trp –leu -his 3AT -trp -leu

n X

104 transformantes<1 “duplo-híbrido”

Seleção em meio sólido

Seleção em Meio Líquido: Elaborando o Protocolo

Metodologia

Elaborando o protocolo

p53

GBD

Gal4DL-p53 (1 g)

GAD

+ Gal4DA (1 g)

•

• Adição de Gal4DA-largeT– 0 ng – 0,1 ng – 1 ng – 10 ng– 100 ng

largeT

GAD

•

• Adição de Gal4DA-largeT– 0 ng – 0,1 ng – 1 ng – 10 ng– 100 ng

Metodologia

Os 4 experimentos

-trp –leu

-trp –leu -his

-trp –leu –his

0,1mM 3AT

-trp –leu –his

0,5mM 3AT

Tra

nsf

orm

ação

1:10 1:100 OD (1+1+1)

1:10 1:100 OD(2+1+1)

(3+1+1)1:10 1:100 OD

(2+1+2)1:10 1:100 OD

dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

Resultados Preliminares

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Tu

rbid

ez

[OD

60

0 n

m]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,3 Transformantes em placas

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Tu

rbid

ez

[OD

60

0 n

m]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Tu

rbid

ez

[OD

60

0 n

m]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3 Transformantes em placas

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

idez

[OD

600

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3

0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

idez

[OD

600

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

idez

[OD

600

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3

Resultados Preliminares

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

ide

z [O

D 6

00

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,3

transformantes em placa

Resultados Preliminares

0 0,5 0,8 44,5 119,3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

ide

z [O

D 6

00

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

transformantes em placa

Resultados Preliminares

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

ide

z [O

D 6

00

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,3

transformantes em placa

Resultados Preliminares

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 1 10 100

pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]

Turb

ide

z [O

D 6

00

nm

]

+h

-h

-h 0.1mM 3AT

-h 0.5mM 3AT

-h, -h 0.1mM 3AT

-h, -h 0.5mM 3AT

0 0,5 0,8 44,5 119,3

transformantes em placa

Sumarizando

O protocolo

OD

=600 nm

5° dia

Diluição 1:100

4° dia

ON 30°C

Diluição 1:10

3° dia

ON 30°C

Transformação

1° dia

Seleção em Meio Líquido: Modificando o Protocolo

Metodologia

Modelo Deepwell

10,9 ml –trp –leu -his

1 ng 0 ng 5 ng 10 ng

Transformações

Gal4DL-p53 Gal4DA

100 ng Gal4DA-largeT

Gal4DL-p53Gal4DA

4,36l 21,8l 43,8l

Gal4DL-p53 Gal4DA

100 ng Gal4DA-largeT436l

Gal4DL-p53Gal4DA

Metodologia

Modelo Deepwell

Modelo Deepwell

Gal4DA-largeT

Gal4DL-p53 (1 g) + Gal4DA (1 g)

0 ng

1 ng

5 ng

10 ng

controle

4 p

laca

s gr

ande

s =

1 d

eepw

ell

0%

20%

40%

0 2,5 5 7,5 10

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 1 5 10

0%

10%

20%

30%

0 1 5

[pTD1] (ng)

Resultados Preliminares

Modelo Deepwell

% poços com crescimento

% 22 setores em placas

pGBT9, pVA3, pVA3* + pTD1- p53 p53mut

PerspectivasModelo Erlenmayer

transformação, diluições com seleção em 3-aminotriazol

1 pVA3 : 3 pVA3* enriquecimento pVA3

Perspectivas

p53p53mut

amplicon

Construção GBD-p53 GBD-p53mut GBD

Proteína p53 p53mut -Interação forte fraca não

Isolamento de mutantes do domínio N-terminal de mTead1

Sistema de Mono-Híbrido Reverso

mRNA

CAN1 / LacZUASGal

ProteínaGBD

MORTE / AZUL

100%

0,2%

[L-can]

domínio ativador? GBD??

plasmídio

compete?Não = GBD

Sim = domínio ativador

Sob

revi

vênc

ia

Starling, 2000

Sistema L-can Domínio ativadorGBD

Ensaio de Competição contra Gal4p inteira

Gal4p mais expressa = cor azulpCL1 (Gal4p)

+Competidor

(contém GBD)

Co-transformação(repórter LacZ) GBD competidor mais expresso =

Leveduras brancas(domínio ativador mutado, GBD não)

Gene Repórter LacZUASGal

ProteínaGBD

GADGBD

XGal4p

0% 20% 40% 60% 80%

62%

0% 20% 40% 60% 80% 100%

80%

0% 20% 40% 60% 80% 100%

29%

Relação entre plasmídio competidor X pCL1 (Gal4p) e porcentagem de colônias azuis em ensaio com X-gal

Gonçalves, 2003

Metodologia

Sistema de Mono-Híbrido ReversoGene repórter = transportador de L-arginina/L-canavanina (tóxica)

A seleção

-w -uraTransformação

YJOZcanRON 30°C

colônia individual

N-terminal

mTead1/4GBD

105 células/ml

meio seletivo

L-canavanina

Obrigada!