Post on 22-Apr-2015
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
Departamento de Biologia
IBILCE-UNESP
Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do
Trato Digestório
NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO
CÂNCER DE ESÔFAGO:3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos)~85% carcinomas
CÂNCER GÁSTRICO:2º tipo (mundo)3º tipo Brasil (23.200 casos)~95% adenocarcinomas
FATORES DERISCO
Ambiental e genéticos
ÁLCOOL E FUMO
Megaesôfago chagásicoEsôfago de BarrettLesões cáusticas
Agentes infecciosos(HPV)
História familial
AneuploidiasMutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu
CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO
Doença de Chagas - Fase crônica
Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas
2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso
(megacólon)
Esôfago(megaesôfago)
Coração
80%
Complicação tardia mais séria do megaesôfago
5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença
Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa estase alimentar aumento do crescimento bacteriano e irritação química esofagite crônica
Megaesôfago chagásico
Carcinoma de células escamosas do esôfago
Risco de 3-8%
C ARCINOMA DE ESÔFAGO
FISH:
aneuploidias 7, 11, 17
deleção TP53 amplificação CCND1
Megaesôfago chagásico (MC)
Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago
Esofagites crônicas
Molecular:
Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento)
T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa)
CGH
Imuno:
Expressão proteínas: p53, p16 e fhit
Apoptose: caspase-3 ativada
Proliferação celular: antígeno Ki-67
MC: 60% aneuploidias
(-7,+7, -17, +17)
54,5% deleção TP53CE: 100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1
CARCINOGÊNESE GÁSTRICA
•Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal
•Brasil: Estimativas para 2006 (INCA)
•23.200 casos novos
•Homens: 2x mais afetados
CÂNCER GÁSTRICO
TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
• ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO:
• Presença de lesões pré-neoplásicas• Predominante em homens e idosos
• ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO:
• Prognóstico pior• Não associado a lesões pré-cancerosas• Mais frequente em mulheres e jovens
Lesões do DNALesões do DNA
Lesões pré-Lesões pré-cancerosascancerosas
Predisposição Predisposição GenéticaGenética
ÁlcoolÁlcool
TabacoTabaco
Gastrectomia Gastrectomia AnteriorAnterior
Helicobacter Helicobacter pyloripylori
Alimentos salgados , Alimentos salgados , enlatados e defumadosenlatados e defumados
CARCINOGÊNESE GÁSTRICA
Colonização da mucosa gástrica pela Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pyloriHelicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000) (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000)
Lúmen
Camada de muco
H. pylori
aminoácidos
bicarbonato
uréia
pH 1 - 2
urease
2NH3 + CO2
pH 7
uréia
fígadosangue
• Prevalência da Hp: 40 a 50% na população
9 vezes risco de câncer gástrico
• Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA
• Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas
• Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑
Apoptose reguladaApoptose regulada
Proliferação Proliferação reguladaregulada
Homeostase Homeostase (renovação celular (renovação celular
normal)normal)
Homeostase Homeostase (( da proliferação da proliferação
celular)celular)
DesequilíbrioDesequilíbrio(perda de células)(perda de células)
Proliferação Proliferação
Proliferação Proliferação
Apoptose Apoptose Apoptose Apoptose
Gastrite Gastrite H.pyloriH.pylori
InflamaçãoInflamaçãoTNF TNF CD95CD95NONO
++
InflamaçãoInflamaçãoTNF TNF CD95CD95NONO
++
EstômagoEstômagoNormalNormal
ÚlceraÚlceraGastrite atróficaGastrite atrófica
HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner (modificado Wagner et al.et al., 1997), 1997)
CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO
• Alterações genéticas e epigenéticas• Oncogenes• Genes supressores de tumor• Reguladores do ciclo celular• Moléculas de adesão celular (caderinas)• Genes de reparo do DNA• Instabilidade genética• Ativação de telomerases
PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOSCromossomos Regiões Cromossômicas Genes
1 1p (1p36) ; 1q22-q31 p732 2pter-p23; 2q; 2q3 3p14; 3q (3q12-qter) FHIT4 4q325 5q21 APC7 7pq; 7q22; 7q31 ERBB; EGFR, HGF;
c-MET8 8pq; 8q (8q23-24) c-MYC9 9p (9p21) CDKN2A (p21)12 12q (12q24) EPS8; DOC-113 13q (13q21-22) receptor de serotonina14 14q (14q24)15 15q (15q11-q15)16 16pq, 16q22 E-Caderina17 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) TP53, c-ERBB2, gastrina18 18q21; 18q DCC19 19p(19p13); 19q(19q13)20 20pq; 20q11-q1222 22q
CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO (modificado Tahara, 2004)
MUCOSANORMAL
METAPLASIAINTESTINAL ADENOMA
CÂNCERINICIAL
DIFERENCIADO
CÂNCERAVANÇADO
INVASÃOMETÁSTASES
D1S191
HIPERMETLAÇÃOTP53
APC
TP53
p27
C-ERBB2
C-MET
CICLINA E
H. pylori
MUCOSANORMAL
CÂNCER INICIAL
DIFERENCIADO
CÂNCERAVANÇADO
INVASÃOMETÁSTASES
TELÔMEROS
INSTABILIDADE
GENÉTICA
TELOMERASE
hTERT
CD44 ALTERADO
CICLINA E
LOH 7q
p27
CD44 ALTERADO
LOH 1p36 (p73)
LOH 17q21MUTAÇÃO/LOH
TP53
MUTAÇÃO/PERDA
E CADERINAAMPLIFICAÇÃO
K-SAM
c-MET
DIFUSO
INTESTINAL
Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos de adenocarcinomas gástricos ressaltar alterações genéticas ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização benignas, e maior risco de malignização utilizadas no utilizadas no diagnóstico precoce e prognósticodiagnóstico precoce e prognóstico
Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico indicar marcadores
cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica
FISHFISH
-aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene -deleções no gene TP53TP53, ,
-amplificação CCND1 e -amplificação CCND1 e
Her-2/neu (c-erbb-2)Her-2/neu (c-erbb-2)
lesões gástricas benignas e lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástricoadenocarcinoma gástrico
IMUNO-HISTOQUÍMICA
expressão das proteínas: expressão das proteínas:
-p53-p53
-ciclina D1 e p185 -ciclina D1 e p185 (Her-2/neu)(Her-2/neu)
MOLECULARAvaliação da Avaliação da H. pyloriH. pylori
Polimorfismos: Polimorfismos: CYP, CYP, GSTGST, , XRCC1, XRCC3,XRCC1, XRCC3, COX2, NOS2COX2, NOS2
Expressão gênica: Expressão gênica: PCR Real TimePCR Real Time
RaSH (hibridação RaSH (hibridação subtrativa rápida)subtrativa rápida)
MetilaçãoMetilação
MATERIALMATERIAL
Controle: 10 biópsias mucosas gástricas Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e histologicamente normais e H. pylori negativasH. pylori negativas
Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico)Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico)
• 38 gastrites crônicas38 gastrites crônicas
• 13 gastrites atróficas crônicas13 gastrites atróficas crônicas
• 21 úlceras gástricas21 úlceras gástricas
• 21 metaplasias intestinais21 metaplasias intestinais
• 20 adenocarcinomas gástricos20 adenocarcinomas gástricos
•Gastrite crônica e gastrite atrófica associada com H. pylori precede a formação do câncer gástrico
•Úlcera péptica maior risco de câncer gástrico
•Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53.
Amostras: 38 gastrite crônica
13 gastrite atrófica
21 úlcera gástrica
Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%)Gastrite crônica: 8/38 casos -7, +7 75% Hp+Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos +7, +8 100% Hp+
Deleção TP53: não observada
Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%)
Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%) +7,+8; +17 69% Hp+
Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%)
GC: +7 GC: -7
UG: +8
↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori)
Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal)
•Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor.
•Objetivo:
•Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico.
•71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9
•Associação: aneuploidias x H. pylori
•60% (3/5) casos: deleção TP53
•12% (2/17) casos: expressão p53
•100% casos: aneuploidias (tri/tetra)
•30% (6/20 ): trissomias múltiplas
•3/3 casos: deleção TP53
•80% (12/15): expressão p53
Metaplasia: +7
Adenocarcinoma +9; +17
Mucosa normal:
TP53 (vermelho)
17 (verde)
adenocarcinoma
Deleção TP53
1 sinal vermelho
0
20
40
60
80
100
GC GAC UG MI CG
3
7
8
9
17
0
20
40
60
80
100
GC GAC UG MI CG
3
7
8
9
17
AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIASCOMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS
monossomias trissomias
IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53
Mucosa normal
p53-
Metaplasia
p53+ (fraca)
Adenocarcinoma
p53+ (forte)
•Cromossomos 7, 8, 9 e 17 carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular
•7q31: MET
•8q24: MYC
•9p21: CDKN2A
•17p13: TP53
•17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU)
•Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico alterações presentes em frequências adenocarcinoma conecção cronológica entre essas lesões expansão monoclonal
•Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago
Dosagem anormal e expressão gênica vantagem proliferativa
APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND
EXPRESSIONS OF p53
• Apoptose: homeostase do tecido equilíbrio entre proliferação e morte celular programada
• Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva potencializa o efeito de carcinógenos risco de câncer
• Associação: H. pylori x Apoptose lesões gástricas ???
• H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico
OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e
comparar com adenocarcinoma gástrico técnicas que detectam apoptose em fases diferentes:
•Caspase-3 ativada (CPP32) mais precoce
•TUNEL fragmentação do DNA
•Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53
•AM0STRAS: 8 mucosa normal Hp-
34 gastrite crônica
11 gastrite atrófica
17 úlcera gástrica
12 adenocarcinomas
Índice Apoptótico (IA)
Técnica
Amostra
s
N x DP Mínimo Mediana Máximo
Casos
TUNEL TUNEL positivos
MN 08 1,820,47 0,0 2,0 3,6 0/8
GC 34 2,600,32 0,0 2,3 7,4 3/34 (26,5%)
GAC 11 3,930,63* 0,0 4,4 7,0 6/11 (54,5%)
UG 17 2,030,39 0,0 2,0 7,0 2/17 (11,8%)
MI 15 2,360,41 0,0 2,4 5,2 2/15 (13,3%)
AG 12 1,970,42 0,4 1,6 6,0 1/12 (8,3%)
CPP32 CPP32 positivos
MN 08 3,201,31 0,0 2,7 11,0 0/8
GC 34 13,822,58
*
0,0 8,4 52,0 15/34 (44,1%)
GAC 11 6,201,57 0,0 5,0 13,4 3/11 (27,3%)
UG 17 9,472,92 0,0 3,4 34,8 4/17 (23,5%)
MI 15 6,721,47 0,8 6,8 24,4 1/15 (6,7%)
AG 12 8,072,75 0,0 4,7 30,8 4/12 (33,3%)
IA aumentados:
TUNEL: GAC
CPP32: GC
Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso
A B
C D
E F
G H
G-H: adenocarcinoma gástrico
TUNEL CPP32
A-B:gastrite crônica
C-D: úlcera gástrica
E-F: metaplasia
intestinal
CONCLUSÕES• Não houve associação entre apoptose aumentada e
infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53
• não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas,
• aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori reforçando a participação de lesões gástricas com potencial pré-canceroso na tumorigênese do estômago enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose.
aumento do número de cópias: dezenas a aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação)centenas de vezes (erros de replicação)
Aumento da expressão gênicaAumento da expressão gênica→proteína→proteína
Double minutes (DM)
Regiões homogeneamente coradas (HSR)
Carcinogênese: Genes Amplificados
-CCND1
-c-MET
-c-MYC
-c-ERBB-2 (HER-2/NEU)
Avaliar a relação entre amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico
-40 carcinoma esôfago
-12 mucosa normal
-40 adenocarcinoma gástrico
-14 mucosa normal
FISHCyclin D1 (vermelho)
Her-2 (vermelho)
Centrômeros (verde)
IMUNO
Anticorpos:
ciclina D1(nuclear)
Her-2 (membrana)
AMPLIFICAÇÃO:
CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40)
câncer gástrico 10% (4/40)
HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40)
IMUNO:Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40)
Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40)
FISH:
(A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho)
FISH:
(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico
(C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico
CONCLUSÕES:
-CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas
neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador
molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida,
-Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão
alteração na síntese ou estabilidade da proteína
alterações na regulação de transcrição gênica
EQUIPEEQUIPE• COORDENADORA:COORDENADORA:• Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP• COLABORADORES:COLABORADORES:• Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA • Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP• Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP• Dr. Alaor Caetano – FAMERP• Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP
• PÓS-GRADUANDOS:PÓS-GRADUANDOS:• Ana Cristina Gobbo César• Lucimari Bizari • Fernanda da Silva Manoel Caetano• Marilanda Ferreira Bellini• Márcia Cristina Duarte• Juliana Garcia de Oliveira• Aline Cristina Targa• Aparecida Perpétuo Fedossi• Héctor Matiolli• INICIAÇÃO CIENTÍFICA:• Isabella Katz Migliori• Yvana Cristina Jorge
• Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPqAuxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq