PRODUÇÃO MICROBIOLÓGICA DEANTIBIÓTICOS

P. chrysogenum

P. notatum

A. niger

A. oryzae Monascus purpurea

AÇÃO DOS ANTIBIÓTICOSSOBRE BACTÉRIAS

antraciclinas

polienos beta-lactâmicos

bleomicinas

estreptomicinacloranfenicol

eritromicina tetraciclinas

rifamicinas

AÇÃO DOS ANTIBIÓTICOSSOBRE FUNGOS

Síntese de parede celular: Polioxinas inibem a síntese de quitina

Azóis e alilaminas inibem a síntese do ergosterol

Griseofulvina impede a agregação de microtúbulos durante a mitose

Os polienos se ligam ao ergosterol comprometendo a integridade da membrana

5-Fluorocitosina é um análogo de nucleotídeo que inibe a síntese de ácidos nucleicos

ANTIBIÓTICOS- Produtos de metabolismo secundário

- Não são produzidos durante o estágio de crescimento microbiano.- Contraindicada a fermentação contínua.- Sujeito a flutuações de rendimento.

ln n

úmer

o de

cél

ulas

tempo

Ótimo de produção (pode ser esticado)

Índice terapêutico

PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS

-Microrganismos do solo que sofrem processo de esporulação

- Streptomyces- Bacillus- Mixobactérias- Fungos

- Esporulação requer transcrição diferenciada de vários gens.- Transcrição depende de subunidade sigma da RNA polimerase (que faz parte da região de reconhecimento do DNA).- Streptomyces possui ao menos sete diferentes.- Embora não tenha sido provado acredita-se que os mecanismos são similares.

PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS

- Excesso de fonte de carbono inibe a síntese de antibióticos. (principalmente de açucares facilmente metabolizáveis).

- Resposta à competição por parte de outros microrganismos

Produção de antibióticos.

Ideal – mutantes que não sofrem repressão por catabólito.- Nitrogênio e fosfato também inibem produção (solo kanuma-tsushi no Japão – Bonzai)

PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS

- Antibióticos produzem retroalimentação negativa.(microrganismos superprodutores necessitam mais antibióticos adicionados ao meio para haver a mesma inibição).- Solução – promover a excreção de antibióticos, usando polienos que alteram a permeabilidade da membrana.-Problema – recuperação do antibiótico.

-Algumas eubactérias são vítimas do próprio antibiótico produzido, razão pela qual desenvolvem mecanismos de excreção e/ou genes de resistência. Frequentemente estes gens estão em cluster com os de produção

EFEITOS EM PRECURSORES

Condições de Fermentação

Esporulação

1a Ferm. 2a Ferm. 3a Ferm.

Reprodução vegetativa – com eventual perda de propriedadesEm Streptomyces os gens de produção estão localizados em braços terminais de cromossomos lineares e é frequente a deleção completa de todo o cluster.

Condições de Fermentação

- Organismos cultivados submersos com suprimento generoso de oxigênio e nutrientes.- Ao chegar à fase estacionária (onde há produção de antibiótico) o aporte de carbono, nitrogênio e fosfato é cuidadosamente controlado.- Para a penicilina G cerca de 10% do carbono adicionado é transformado no antibiótico (até ~ 30g.L-1)

Recuperação do antibiótico do meio - Extração em solvente orgânico e posterior ocristalização- Coluna trocadora de íons- Precipitação química- Adsorção

Tanques CristalizadoresDepois da fermentação o micélio é separado e a fase líquida sofre adição de butanol nos tanques. Ao evaporar ele arrasta a água consigo, resultando em uma pasta de penicilina com cerca de 99% de pureza

Método TradicionalS – mutação espontâneaX – raio-XUV eNM – nitrogen mustard Segue-se o screening ou a seleção

Melhoramento Genético

Screening – ensaio um a uma para se evidenciar a produção de metabólito. Laborioso e demorado.Seleção – encontra-se um meio em que somente o produtor de determinado metabólito cresça em cultivo.

Ex. como as penicilinas e as tetraciclinas são quelantes de metais pesados, a resistência à adição crescente dos ditos no meio de cultivo é medida da capacidade de produção dos antibióticos.

Métodos Genéticos Clássicos- Em Penicillium muitas cepas mutantes perdem muito de sua capacidade vital: crescem lentamente e/ou são susceptíveis a condições adversas.- Embora não possuam ciclo sexual verdadeiro, o ciclo parasexual chega a formar heterocarions.

Solução – retrocruzamento com cepa selvagem.

Clusters de genes em StreptomycesComo eles possuem DNA conjugacional é possível o rearranjo para a formação de progênie mais efetiva.Frequentemente ocorrem deleções que chegam a comprometer toda a capacidade produtora de uma cepa. Existem fragmentos de DNA linear com seqüências teloméricas.

Fusão de Protoplastos

Tratamento comlisina

Célulasvegetativas

Adição de polietilenoglicol

protoplastos(sem parede)

Protoplasto comduplo material nuclear

Fusão do material nuclear

Restauração da parede celular

Deleção do material genético redundante

Nova célula vegetativa recombinada

Streptomyces coelicolor – modeloS. avermitilis - produtor da avermectin (antiparasítica)

Genoma de 9 milhões de pares de base (E.coli – 4,7 mi)60 a 65 de fatores sigma (constituinte da RNA polimerase reconhecedores de promotores genéticos).Perto de 800 proteínas secretadas.Pela clonagem o P. chrysogenum pode ter 50 clusters produtores de antibióticos.Muito antibióticos são produzidos pela vias poliquetídeo e isoprenóide, as sínteses peptídicas não ribossomais.

Antibióticos polipeptídicos com síntese não ribossomal

Acil carrier protein Acil transferase-cetoacil ACP sintase e -cetoacil ACP redutase (exceto módulo 3) Síntese da eritromicina no

Saccharopolispora erythrea

(open reading frames)

Inserção genética

Transformação da ANTIBIÓTICOS

Uma vez obtido o ácido penilinânico ele serve de ponto de partida para a síntese de outros -lactâmicos semi-sintéticos.

Estratégia Microbiológica de Transformação

Linhagens auxotróficas

EXEMPLOS DE VARIANTES

Resistência

Mecanismos

- Inativação enzimática (Ex: -lactamases)- Mutação da proteína alvo- Transferência genética- Mecanismos de não transferência intracelular e/ou ativação de mecanismos bombeadores.

Resistência cruzada: Determinado antibiótico propicia a resistência de outro

Tilosina eritromicina

Um dos maiores fatores de resistência é o uso indiscriminado em agropecuária, onde sub-doses

são usadas para prevenir enterites no gado, diminuindo o tempo para

abate

Alguns países Europeus proíbem o uso

Proibição é driblada por prescrições veterinárias

Resistência à tetraciclina não diminuiu

Acredita-se que 84 % dos antimicrobianos sejam usados na agopecuária.

Usa-se antibióticos para controlar o crescimento de Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc e Weissella.(3 a 5% de perda)

Embora tenha-se propalado que o processo enzimático inativa os antibióticos usados na indústria alcooleira, a análise do extrato seco (posteriormente usado como ração animal) confirmou a presença de vários antibióticos (eritromicina, virginiomicina, tilosina)

ResistênciaNão suscetibilidade

Evolução dos casos de não suscetibilidade entre Streptococcus pneumoniae na Ingletarra e no país de Gales.

Resistência à Ciprofloxacina

Nos EEUU, os antibióticos mais comumente usados são a penicilina, a estreptomicina e as tetraciclinas

Estes são os antibióticos que possuem casos mais numerosos de

resitência

Plasmídeos isolados antes de 1983 apresentavam apenas um gen de resistência codificando uma enzima modificadora dos

aminoglicosídeos

Hoje estes plasmídeos apresentam inúmeros gens de

resistência que podem ser repassados em cadeia.

MRSA – Methicillin Resistant S. aureus maior causador de casos de infecções hospitalares. A vancomicina foi então ressuscitada pois não se encontrava resistência a ela entre MRSA; Atualmente já existem cepas resistentes, embora raras, por transferência horizontal de gens do Enterococcus

DRIBLES NA RESISTÊNCIA

KAMIKASEAmplo espectro (gram negativas e positivas) resiste ao ataque de lactamases