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23/11/2017
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Princípios Básicos deGenética Molecular
Profª Ana Claudia17/11/2017
Fluxo da informação genética
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Estrutura do Material Genético
Replicação do DNA
Transcrição
Tradução
Regulação da Expressão Gênica
Fosfato
Base purina oupirimidina
Fosfato
Base purina oupirimidina
Nucleotídeos
Ribose
Desoxirribose
Ribonucleotídeo
Desoxirribonucleotídeo
RNA
DNA
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Nucleotídeos BasesNitrogenadas
Purinas
Pirimidinas
RNADNA
NucleotídeosDesoxirribonucleotídeos
Ribonucleotídeos
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Ligaçãofosfodiéster
Cadeia de Nucleotídeos
Polaridade oposta dadupla fita
Pontes de HidrogênioA = T C G
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Estrutura de dupla hélice doDNA
Watson e Crick – modelo dadupla hélice
Pares de bases empilhadas
Pares de basesempilhadas
Sulco menor
Sulco maior
Esqueletoaçúcar-fosfato
HidrogênioOxigênioCarbono e nitrogênioem pares de basesCarbono
Fósforo
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O Genoma compreende todo o materialgenético que um organismo possui
Estrutura de Genomas
Procariotos: tipicamente um único cromossomocircular
Eucariotos: conjunto de cromossomos nuclearesgenoma mitocondrialgenoma do cloroplato (em plantas)
Genomas Virais
Características de alguns genomas virais
Tamanho: mil pares de bases
DNA (dupla fita ou simples fita) ou RNA
Número de genes: 3 a >190
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Genomas Procarióticos
O cromossomo bacteriano tem alguns milhões depares de bases
Algumas bactérias apresentam pequenas moléculasindependentes de DNA Plasmídeos
Sequências codificadoras correspondem a maior partedo genoma
Genoma de Escherichia coli 4.639 kilobases
Genoma de Mycobacterium genitalium 580 kilobases
Genoma de Bradyrhizobium japonicum 9.105 kilobases
Genomas Bacterianos
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Genoma de Escherichia coli estirpe K12 MG16554.639.675 pb
4.149 genes – cerca de 80% do genoma
Genes/kbp = 0,894
Sequências codificadoras correspondem a maiorparte do genoma
Genomas Bacterianos
Genomas BacterianosPLASMÍDEOS:
Estrutura não essencial – pode
conferir vantagens seletivas. Ex.:
resistência a agentes antimicrobianos
Importantes ferramentas em Engenharia Genética
No variável em uma mesma bactéria
Tamanho variável (~1 a 200 kb)
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Genomas Eucarióticos
Species Common name Genome size(base pairs)
Predictednumber of
genesPlasmodium falciparum malaria protozoan 22,820,308 5,317Saccharomyces cerevisae baker’s yeast 12,057,909 6,268Caenorhabditis elegans roundworm 100,291,841 20,516Apis mellifera honeybee 197,657,892 29,832Drosophila melanogaster fruit fly 131,000,899 13,792Arabidopsis thaliana mouse ear cress 116,566,763 25,706Canis familiaris dog 2,359,826,366 18,201Homo sapiens human 2,851,330,913 22,287Mus musculus mouse 2,932,368,526 25,396Pan troglodytes chimpanzee 2,733,948,177 22,524
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~22.000 genes
~1-2%
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- A maioria é diplóide (alguns poliplóides)
- Cromatina: DNA, proteínas e RNA
EucromatinaCromatina ativa, pouco condensada: regiões do genomasuscetíveis à transcrição
HeterocromatinaCromatina altamente condensada ao longo de todo ociclo celular
-Proteínas: Histonas (básicas) muito conservadasH1, H2a, H2b, H3, H4
não-Histonas (ácidas) composição variada
Genomas Eucarióticos
Nucleossomo (1º nível de compactação)
DNA ligador: 8 a 114 pbNúcleo dehistonas
Octâmero de histonas
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DNA ligador
Octâmero de histonas
Fibra de nucleossomo(aproximadamente10 nm de diâmetro)
Fibra de cromatina(aproximadamente30 nm de diâmetro)
Fibra de cromatina (2º nível de compactação)
Representação esquemática do DNA cromossômicopreso a um arcabouço (scaffold) nuclear.
Cada dobra representa mais uma compactação.
Cromossomo metafásico (3º nível de compactação)
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Fibra de 10 nm
Fibra de 30 nm
Uma alça(≈ 75.000 pb)
Uma roseta(6 alças)
Uma espira(30 rosetas)
Duas cromátides(10 espiras cada)
DNA
Arcabouço formado porproteínas cromossômicasNão-histonas
Condensação das fibras de cromatina no cromossomo metafásico
Centrômeros e Telômeros
Centrômero
telômeros
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Centrômeros Separação de cromossomos homólogos (anáfase I dameiose)
Separação de cromátides (anáfase II da meiose e anáfaseda mitose)
Regiões ligadas pelas fibras do fuso
Cinetocoros irmãos
Cromátides
Microtúbulos do fuso
Centrômero
externa
média
interna
CamadasdoCinetocoro
Centrômeros
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Telômeros
Impedem a degradação das pontas dos cromossomos porDNAses
Evitam a fusão das pontas de um cromossomo com outro
Facilitam a replicação das pontas do DNA
Composição:
- Sequências curtas de nucleotídeos repetidas:
(TTAGGG altamente conservada em vertebrados)
- Região unifilamentar rica em G
Estrutura do Material Genético
Replicação do DNA
Transcrição
Tradução
Regulação da Expressão Gênica
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Replicação Semiconservativa
Pontes dehidrogênio
Ligaçõescovalentes
Início dadeselicoidização
Novosfilamentos
duplos
Replicação Semi-descontínua
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Síntese do DNA pelas DNA polimerases
Molde
Primer ou iniciador
Fidelidade da replicação
Em E. coli:
1 erro a cada 109 ou 1010 nucleotídeos adicionados
cromossomo ~ 4,6 x 106 pb 1 erro a cada 1.000a 10.000 replicações
atividade exonuclease 3’5’ das DNA polimerases
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Fidelidade da replicação
Atividade revisora exonuclease 3’5’
1
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3
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REPLICAÇÃO EM
PROCARIOTOS
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DNA polimerases em E. coli
DNA polimerase I = Replicação e reparo
DNA polimerase II = Reparo
DNA polimerase III = REPLICAÇÃO
DNA polimerase IV = Reparo
DNA polimerase V = Reparo
Replicação de DNA em E. coli
Iniciação Alongamento Terminação
Replissomo:
DNA Polimerase III DNA Polimerase I DNA ligase Primase ou Iniciase DNA girase (topoisomerase II) Proteína DnaB (helicase) SSB (Proteína de ligação ao DNA simples fita)
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Alongamento
3’
5’
DNA Polimerase
Fita Contínua
Fita Descontínua
Primer de RNA noínicio de umfragmento de
Okazaki
Terminação
Forquilha sentidohorário
Forquilha sentidoanti-horário
Cromossomos catenados
Cromossomos separados
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REPLICAÇÃO EM
EUCARIOTOS
Aspectos característicos de eucariotos
Várias forquilhas de replicação em um únicosegmento de DNA
Humanos e outros mamíferos:≈ 10.000 origens de replicação a intervalos de
30.000 a 300.000 pb
Em Saccharomyces cerevisiae:≈ 400 distribuídas pelo genoma
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DNA polimerases
alfa
delta
épsilongama
beta
zeta
etaiota
kapa
θ (teta), λ (lambda), φ (phi), σ (sigma), and μ (mi).
DNA polimerases nucleares
Pol - atividade de DNA primase
Pol - atividade de replicação – fita contínua- atividade de reparo
Pol - atividade de replicação – fita descontínua
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Modelo de replissomo eucariótico
DNA polymerase
Estrutura do Material Genético
Replicação do DNA
Transcrição
Tradução
Regulação da Expressão Gênica
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Transcrição em Procariotos
RNA Polimerase
Core ou núcleo da RNA polimerase
+
Subunidade sigma
1 erro a cada 10.000 a 100.000 nc
Core + sigma = HOLOENZIMA
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A transcrição inicia nos PROMOTORES
Iniciação Ligação ao DNA
Formação do ComplexoFechado
Formação do ComplexoAberto
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Iniciação
Início da síntese de RNA
Liberação do fator sigma
Alongamento
Sítio de desenovelamentoSítio de reenovelamento Região da héliceDNA/RNA
Cadeia crescente de RNA
Sítio de chegada deribonucleosídeos trifosfato
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Terminação
Terminadores do tipoRho () Dependente
Proteína Rho ()
Terminação
Cadeia de RNAdobrada
Terminadores intrínsecos
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RNA Polimerases
RNA Polimerase I RNA Polimerase II RNA Polimerase III
Enzima ProdutosRNA polimerase IRNA polimerase IIRNA polimerase III
rRNAs 18S, 5,8S e 28SmRNAs e snRNAstRNAs, 5S rRNA e snRNAs
Promotores
Promotores da RNA Pol II: elementos conservados curtos
Exemplo: gene da timidina quinase de camundongo
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Iniciação
Complexofechado
Complexoaberto
Iniciação e alongamento
Início da síntese de RNA
Alongamento
HE
F
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Processamento do mRNA eucariótico
Adição do capacete 5’
7-metil-guanosina Complexo de ligação de CAP
A extremidade 5’permanece ligada a RNApol II
Protege o mRNA dadegradação por ribonucleases
Participa da ligação domRNA ao ribossomo parainiciar a tradução
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Adição da cauda Poli (A) no terminal 3’
Filamento de 80 a 250 resíduos A
Serve como sítio de ligaçãopara proteínas específicas
A cauda e as proteínasassociadas protegem o mRNA dadegradação enzimática
Após a clivagem do mRNA, apoliadenilato polimeraseadiciona adeninas naextremidade 3’
Processamento de íntrons
Ribonucleossomos ou Spliceossomos: formadospor ribonucleoproteínas complexos RNA-proteínas
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Mecanismo de processamento acoplado à transcrição
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Processamento de mRNA eucariótico
Gene da ovoalbumina