Post on 17-Apr-2015
Pesquisas em genoma funcional
- O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados
- O genoma de duas plantas completamente sequenciado
- Genoma de Drosophila completamente sequenciado
Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies
Fatos:
- Barateamento do preço dos sequenciamento
“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas
Quando? Década de 90
Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante
Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas
- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino
- Genoma do camundongo completamente sequenciado
Consequências atuais
- Grande quantidade de informação disponível
- Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010
- Análise científica mais holística
Consequências futuras:
- Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas
- Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens
Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma
Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente
Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica
Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo
Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra
Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema
Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas
Estudos genéticos
Testes funcionais
Estudos de expressão in situ
Estudos das interações
Clonagem e sequênciamentoData mining
Posição no mapa gen. ou físico;Baseado na inserção de
sequência alvo
Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos
Descoberta de genes
Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas
Estudo expressão gênica em larga escala
cDNA macro/microarrays; genechips
Seleção de mutantes
EMS, radiação, T-DNA, transposons
Criação e análise de um banco de dados
Complementação leved.
Mutante em Arabidopsis
Superexpressão
Antisenso.
Supressão por RNAi
Sistema duplo-hibrido de leveduras
Phage display
Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação
AlelismoAditividade
EpistasiaSupressãoFusão proteína com GFP
Expressão GFP ou luciferina com o promotor
Construção de modelos de controle dos processos envolvidos
Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultâneada expressão de vários genes
Transcriptoma:
Análise dos níveis de RNAde varios genes simultaneamente
Um genoma possui variostranscriptomas
…varios transcriptomas temporais
Ex: tempo apos sujeicao a um estresse
Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento
…varios transcriptomas espaciais
Ex: transcriptoma celular-especifico
Ex: transcriptoma tecido-especifico
Ex: transcriptoma orgao-especifico
Etapas para a realizacao de um transcriptoma
1) Filme Macroarray.mov
2) Filme oligochip.mov
Isolamento de DNAdo banco de cDNA
1a Etapa de um transcriptoma
Preparacao do Micro/Macroarranjo(Micro/macroarray)
2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda
Duraçãodo protocolo: 5 horas
2a Etapa de um transcriptoma: hibridação
3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica
DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo toleranteSonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresseSonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse
Gene com reduzida expressãona presença do estresse
Gene expressão acentuadana presença do estresse
Genes sem alteraçãona expressão
a
bd
Nível de expressão na presença do estresse:a) + x%
b) + y% (y>x)c) -z%
3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
11
2 3
4
5
Descoberta da função de genes desconhecidos
Análise da homologia das sequênciasAnálise da biologia molecular do gene: co-regulação?
Confirmação pela genética reversa
6626 genes alvos19 sondas
197 genes orgão-específicosraiz=64
folha=94flor=36
influorescencia=3
Matriz da expressãonos orgaos
Analise da abundância do transcrito
Agrupamento deexpressão global
Exemplo de data mining
Agrupamento
Dinamica daexpressao
Identificação de sequências regulatórias
Caracterizacaogene/rota
347 genes constitutivos
5247 genes alvossondas: 5 pontos temporais
8300 genes alvos
Sondas:
folha =6raizes=4flores=2
Siliqua=3Influorescencia=2
Plantula=2
Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241
Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma
Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses
ambientais em Arabidopsis
Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses
Análise de Grupos: 2 genótipos
Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita)
Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)
Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular
Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos
Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator
transcripcional DREB1A
Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator
transcripcional DREB1A
Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot
Classes de genes afetadas pelo estresse salino
Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno
Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico
Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico
Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno
DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis
Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias
Vantagens:oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes
- estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada
Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress
8100 genes (Genechip)
Genes > 2x = Total 2678 Genes
ControleMeio Fresco
741 genes
4oC
2086 genes
58% 42%
Manitol(200 mM)
NaCl(100 mM)
1123 genes
46% 53%
1008 genes
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
Folhas: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
279
243
68
65
78 29
120
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
Raízes: 27 horas após
NaCl Manitol
4oC
63
1111
9
5
59 23
87
Folhas: 27 horas após
NaCl Manitol
4oC
82
1094
4
19
47 90
59
Folhas: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
279
243
68
65
78 29
120
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h
NaCl Manitol
4oC
6
173
4
2
9 8
22
Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h
NaCl Manitol
4oC
40
188
4
8
5 40
5
Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raizEstresse por frio: sobreposição 3-27h
Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇPistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz
Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h)
200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato)
Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estressesMais induzido gene ELIP: liga a chl a
Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes
Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas
3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial
Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state”
Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse:ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes
Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1:a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores
b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.
Segregacao alelica
Transcriptoma
Caracteriz. do fenotipo
Proteoma
Caracteriz. do genotipo
Identificacao degenotipos tolerantes
e susceptiveis
Transcriptoma e proteoma
Identificacao de genes eproteinas associados a tolerancia
Mapeamento de populacoes
QTL
Locus genico candid.
Locus quant. transcrito
Locus quant. proteina
Mapa genetico
Identificacao de genes/marcadores
ligados a tolerancia
Selecao assistida por marcadores
Transformacao
Melhoramentomolecular
Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma
Em colaboracao:Instituto de Quimica USP
Embrapa-CenargemUnicamp
UNESP-Araraquara
Realizado na UFV
Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes
Melhores resultados