TERAPIA FOTODINÂMICA EM COMBINAÇÃO COM ÁCIDO ACETILSALICÍLICO

Licenciatura em Bioquímica

Nuno Almeida

Terapia Fotodinâmica

A absorção de luz pelo PS leva à sua transição para um nível energético superior, sendo que após o decaimento energético ocorre transferência de energia para diferentes substratos, havendo a formação de espécies reactivas de oxigénio.

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Mecanismos de acção da PDT

• Reacção do tipo I: formação de 1O₂ através de intermediários• Reacção do tipo II: formação directa de 1O₂

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Retirado de Dolmans et al. 2003

PDT + Acido acetilsalicílico

A utilização de ácido acetilsalicílico em combinação com a PDT potencia a morte celular por apoptose.

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Objectivo

Verificar se o ácido acetilsalicílico potencia a PDT baseada no fotossensibilizador ACS881F1 in vitro.

+ =

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Materiais e Métodos WiDR OE19

DMEM RPMI

PS

Aspirina

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

ENSAIO CLONOGÉNICOSobrevivência

ENSAIO MTTProliferação

ENSAIO SRBConteúdo Proteico

Proliferação celular após tratamento com aspirina

ResultadosWiDr OE19

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

n≥4 n≥4

A aspirina sozinha apresenta baixa citotoxicidade nas concentrações testadas

A linha celular OE19 é mais susceptivel que a linha celular WiDR

ENSAIO MTT

*** *** ****** *** *** **

******

Proliferação celular após tratamento com AA+PDT

WiDr1mM AA 2,5mM AA

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

a) 3H AA + PS

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

b) 6H AA + PS c) 24H PS + AA

Obtenção de Curvas de Dose-Resposta

ENSAIO MTT

n≥4 n≥4

Proliferação celular após tratamento com AA+PDT

OE191mM AA 2,5mM AA

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

a) 3H AA + PS b) 6H AA + PS c) 24H PS + AA

Obtenção de Curvas de Dose-Resposta

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))1 2 3 4 5 6 7

0

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

ENSAIO MTT

n≥4n≥4

IC50WiDR OE19

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Parece haver sinergia na associação de PDT + AAMais evidente na linha celular OE19

1mM 2,5mM

3H AA+PS44,01nM

[36,04; 53,74]33,53nM

[28,51; 39,43]

6H AA+PS10,18nM

[7,04; 14,72]51,41nM

[48,29; 54,73]

24H PS+AA28,79nM

[26,83 ;30,90]24,24nM

[23,65; 24,85]

1mM 2,5mM

3H AA+PS6,47nM

[5,25; 7,98]8,05nM

[7,21; 8,99]

6H AA+PS7,23nM

[5,63; 9,33]6,37nM

[5,64; 7,20]

24H PS+AA7,26nM

[6,37; 8,27]1,90nM

[1,42; 2,54]

ACS881F1

WiDr 58,5nM

OE19 35,0nM

ENSAIO MTT

*↑ [AA] associada a maior inibição da proliferação

Conteúdo ProteicoWiDR

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

AA sozinho não tem efeito na viabilidade

1mM AA 107,0 ± 3,10

PS 44nM 7,86 ± 1,54

PS+AA 3,81 ± 1,32

ENSAIO SRB

3H 1mM AA + 44 nM PS

*** ***

[

***

***

[ *

PDT + AA reduz a viabilidade significativamente em relação a PDT

n≥4

Sobrevivência

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Não há diferenças significativas em relação ao controlo

1mM AA 47,9 ± 4,33

PS 44nM 40,6 ± 10,0

PS+AA 39,4 ± 30,2

ENSAIO CLONOGÉNICO

WiDR3H 1mM AA + 44 nM PS

Limitação devido ao baixo numero de experiências

n≥2

Conclusão

A combinação de AA com a PDT parece ser promissora podendo existir sinergia.

A linha celular OE19 é mais sensivel ao tratamento que a linha celular WiDr.

A avaliação do conteúdo proteico confirmou que o abaixamento da proliferação está relacionado com diminuição da viabilidade.

A PDT, sozinha ou em combinação com AA, é uma terapêutica promissora que deve continuar a ser investigada.

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

Perspectivas para o futuro

Realizar os ensaios SRB e clonogénicos na linha celular WiDr tendo em conta a condição 6H 1mM AA+PS.

Realizar os mesmos estudos na linha celular OE19 na condição 24H PS + 2,5mM AA.

Realizar estudos de citometria de fluxo para avaliar viabilidade celular e tipos de morte, espécies reactivas de oxigénio e defesas antioxidantes.

Realizar estudos de microscopia de fluorescência para avaliar se o AA influencia a distribuição do PS na célula.

Introdução Objectivo Métodos Resultados Conclusões Perspectivas

BibliografiaDas imagens:http://www.ondineblog.com/wp-content/uploads/2011/10/preclinical-data-periowave.jpghttp://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRJ7SHL_GMLFBUktS_oSiuFSIATZ8dCAG1dOC0SwWE1nOooFNIw4Ahttp://www.nature.com/nrc/journal/v3/n5/images/nrc1071-f2.jpghttp://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRHF3VIe425Qi8AxDy5a9jmFRE9NInyneHyKWfLh9pTufokdFP_http://us.123rf.com/400wm/400/400/radiantskies/radiantskies1212/radiantskies121200128/16629179-abstract-word-cloud-for-photodynamic-therapy-with-related-tags-and-terms.jpghttp://www.discoverymedicine.com/Diana-M-Tacelosky/files/2012/04/discovery_medicine_no_71_brian_m_barth_figure_1.pnghttps://d2dct7y3250e4n.cloudfront.net/ht-staging/user_answer/reference_image/3071/large/Aspirin.jpeg?1350074265http://3.bp.blogspot.com/_7xzZi5UF2yw/TQTsjb9VSFI/AAAAAAAAAC8/HWQsOkiUmAQ/s1600/Aspirin+picture.pnghttp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/91/MTT_Plate.jpg/200px-MTT_Plate.jpghttp://www.nature.com/nprot/journal/v1/n5/images/nprot.2006.339-F1.jpg

Dos artigos:Braga, M., 2012. Terapia Fotodinâmica em Associação com o Ácido Ascorbico. Chiaviello, a, Paciello, I., Postiglione, I., Crescenzi, E., Palumbo, G., 2010. Combination of photodynamic therapy with aspirin in human-derived lung adenocarcinoma cells affects proteasome activity and induces apoptosis. Cell proliferation 43, 480-93.Datki, Z., Juhász, A., Gálfi, M., Soós, K., Papp, R., Zádori, D., Penke, B., 2003.Method for measuring neurotoxicity of aggregating polypeptides with the MTT assay on differentiated neuroblastoma cells. Brain Research Bulletin 62, 223-229. Dikshit P, Chatterjee M, Goswami A, Mishra A, Jana NR (2006) Aspirin induces apoptosis through the inhibition of proteasome function. J. Biol. Chem. 281, 29228 – 29235. Dolmans DE, Fukumura D, Jain RK (2003) Photodynamic therapy for cancer. Nat. Rev. Cancer 3, 380–387.H. Papazisis, K. A. Kortsaris, K. T.Geromichalos, G. D. Dimitriadis, Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay. Journal of

Immunological Methods, 1997; 208(2):151-8. Laranjo, M., 2010. Acção Intracelular da Terapia Fotodinâmica.Robertson, C.A., Evans, D.H., Abrahamse, H., 2009. Photodynamic therapy (PDT): a short review on cellular mechanisms and cancer research

applications for PDT. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology 96, 1-8.

TERAPIA FOTODINÂMICA EM COMBINAÇÃO COM ÁCIDO ACETILSALICÍLICO

Licenciatura em Bioquímica

Nuno Almeida