Programa de Pós-Graduação em MicrobiologiaBiologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)ICB/UFMG

PCR quantitativaTeoria e Aplicações

Lucas Secchim RibeiroLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

• PCR Histórico Teoria Aplicações

• Desenho de primers

• qPCR MetodologiasCálculos Aplicações PCR Digital

Dogma central da Biologia Molecular• Francis Crick / 1956

PCRPCR

PCR - Polymerase Chain Reaction

Funções da PCR• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;

• Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.

Aplicações da PCR “convencional”• Diagnóstico

• Avaliação de mutações• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)

• Tipagem para transplantes - MHC

• Testes forenses• Paternidade• Investigações criminais

• Sequenciamento e clonagem• Epidemiologia molecular e bioinformática• Análise de OGM• ...

PCR “convencional”

Reagentes básicosIniciadores

senso/antissenso(primers forward/reverse)

Cátions(Na+/K+ e Mg2+)

DNA polimerasecom DNA modelo

Deoxinucleotídeos(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Importância do tampão e íon potássio na PCR• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C

• Tris/ Tris-Cl•Função enzimática da DNA polimerase

• K+

• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer pela neutralização de cargas negativas

↑ [K+] para fragmentos pequenos ↓ [K+] para fragmentos grandes

Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)

• Associados ao DNA na forma de dNMPs• Sequestradores de Mg2+

• Mg2+

• Cofator da DNA polimerase• Especificidade e eficiência da enzima•Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)• Rendimento x Concentração crítica e empírica

↑ [Mg2+] ↑eficiência ↓especificidade

Função e relevância dos primers• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre

Thermus aquaticus

DNA polimerase termorresistente• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo

• Taq DNA Polimerase• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+)

• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)

Parque Nacional de Yellowstone / EUA

DNA molde• Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração

• SDS (dodecil sulfato de sódio)• Fenol• Corantes• Heparina/EDTA/Citrato• Polissacarídeos vegetais/carragenina• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV

• Quantidade• Excesso de DNA é prejudicial• Aumento de reação inespecífica

Parâmetros de termociclagem• Temperatura de anelamento

↑ Tanelamento ↑estringência ↓produtos inespecíficos

↓ Tanelamento ↑rendimento ↑ produtos inespecíficos

• Tempo de extensão• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C• Mínimo = 1 minuto • Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´

Aditivos• Separação de fitas com alto conteúdo G:C• Estruturas secundárias fortes

• Betaína (1 M)• DMSO (1-10%)• Formamida (1-10%)

• Agentes estabilizantes da DNA polimerase• Redução da adesão de reagentes ao tubo

• BSA (0,1 mg/mL)• Gelatina (0,1 – 1,0%)• Detergentes não-iônicos (<0,5%)

Inibidores• Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;

• Fenol/álcoois• EDTA• Debris celular• Detergentes

Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)

Visualização dos resultados• Separação por eletroforese• Corantes/marcação fluorescente

Visualização dos resultados• Sequenciamento capilar• Dideoxinucleotídeos

Antes da PCR...• Clonagem!

Antes dos termocicladores...• Banho-maria!

Desenho deDesenho deprimersprimers

Características de bons primers• Tamanho adequado• 15 a 25 pares de bases• Tamanho x Temperatura de dissociação

• Temperatura adequada de dissociação (Tm)• Conteúdo G:C•Diferença entre primers < 5º C

Características de bons primers• Tamanho do fragmento a ser gerado• Tempo de extensão da polimerase

•Especificidade Primers específicos x degenerados

Características de maus primers• Inter-complementariedade• Formação de dímeros (primer dimer)• Atenção à extremidade 3´

Características de maus primers• Auto-complementariedade• Formação de auto-dímeros e hairpins

Características de bons primers• Adequação para qPCR• Tamanho do amplicon •Junção exon-exon e contaminação com gDNA

Ferramentas online de suporte• Primer-BLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

• Primer3bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3

• IDT Oligo Analyzer 3.1www.idtdna.com/calc/analyzer

• UCSC PCR in silicogenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

• RT Primer DB (específico para qPCR)• medgen.ugent.be/rtprimerdb

Problemadetectado

Workflow para desenho de primers

Verificar• Temp. de anelamento• Temp. de dissociação• Tamanho do amplicon• Estruturas secundárias• Complementaridade• EspecificidadeNãoSim

PCR para confirmação de funcionamento

PCR para confirmação de funcionamento

GenBank/NCBI

Encontrar sequência da região desejada

Encontrar sequência da região desejada

PrimerBLASTPrimer3, etcDesenhar primersDesenhar primers

Registrar e arquivarresultados obtidos

Registrar e arquivarresultados obtidos

Reaçãoadequada

OK?OK?

CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!

PCRPCRquantitativaquantitativa

PCR quantitativa

• Nomenclatura• qPCR• qRT-PCR• Real-time PCR

Ensaios químicos disponíveis

• SYBR Green I• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)• Molecular Beacons• LightCycler• LUX

Detecção de fluorescência!

↑ sensibilidade

SYBR Green I• Corante específico para DNA de fita dupla• Flourescência aumenta ao longo da reação• Não tem ação inibitória• Detecta produtos inespecíficos

SYBR Green I

Brometo de etídio

Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase• Altamente específica, sem produtos espúrios• Duas marcações simultâneas são possíveis• Tecnologia baseada em FRET• Flourescence Resonance Energy Transfer

FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz• Quencher/bloqueador

Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan

Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Discriminação alélica

Conceitos importantes• Fases exponencial, logarítmica e plateau

• Threshold• Baseline• Cycle threshold (CT)

Ciclos

Flou

resc

ênci

a(p

rodu

tos

de P

CR

)

Plateau

Linear

Exponencial

Threshold

Ciclos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072

Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360

~7,05 ~9,38

↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial

Quantidadeinicial

CT

Amostra A 3 9,38

Amostra B 15 7,05

Conceitos importantes• Quantidade inicial de amostra• Relação CT x Quantidade inicial

Conceitos importantes• Eficiência

2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%

Conceitos importantes• Eficiência

Qtde. inicial de

DNA1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000

CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1

Log 10da qtde. inicial

0 1 2 3 4 5 6 7 8

CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1

Conceitos importantes• Eficiência

E = 10(-1/slope)

Conceitos importantes• Eficiência

Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x

Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32

Slope(inclinação)

Conceitos importantes• Curva-padrão e blank sample

• Gene de referência/constitutivo/normalizador• Gene de interesse

Controle Infectado

GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação

Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0

Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0

Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0

Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33

Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0

Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67

Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;• Ligação específica do corante à fita dupla

Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers

Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex

Fatores que afetam a eficiência da qPCR• DNA degradado• Produtos inespecíficos• Tamanho do amplicon• Condições de termociclagem

• Prática laboratorial inadequada• Reagentes contaminados• Primers mal desenhados• Diluições mal feitas• Falta de calibração e manutenção

• Pipetagem errada!

Funções da PCR quantitativa• Quantificação absoluta• Curvas-padrão• Quantidade conhecida de “cópias por volume”• Semelhante a um ELISA• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano

• Avaliação relativa• Ausência de curva-padrão• Gene de referência para normalização• Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental• Exemplo: expressão gênica

CÁLCULOS E ANÁLISES

CÁLCULOS E ANÁLISES

Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas

Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas

Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)

Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)

Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)

Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold

Análise de resultados

Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação

Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta• Regressão linear simples• Método Pfaffl Método Pfaffl Curva de cópias (plasmídeos) Curva de cópias (plasmídeos)

Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse• Método Livak Método Livak 2 2--ΔΔΔΔCTCT

Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT

• Exemplo:

Controle Infectado

GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ

Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4

Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1

Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8

Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9

Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9

GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01

GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57

Controle

Infectado

ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT

ΔCT

Média ΔCT

16,32

Média ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT

Extração e manuseio de ácidos nucléicos• RNA = extremamente lábil!• Armazenamento correto• Dosagem e normalização das amostras• A260/280 e A260/230 > 1,8

• Contaminação com DNA genômico

Confecção de cDNA• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de RNA para todas as amostras;• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;• Ciclos de congelamento/descongelamento;

Escolha do gene de referência• É necessário ter opções!• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo

• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle• 6 diluições em triplicata

• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0

•Algoritmos gratuitos na internet•NormFinder: macro para Excel

Antes da qPCR...• Northern Blotting (RNA)• Southern Blotting (DNA)

PCRPCRdigitaldigital

PCR digital (dPCR)

Baseada na compartimentalização da amostra• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos• Chips com nanopoços

Individualização das moléculas!Distribuição de Poisson

Aplicações• Quantificação absoluta sem curva-padrão• Expressão gênica• Detecção de alelos raros e/ou mutações• Discriminação de baixas diferenças para CNV

Sample DNA

Target

Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)

http://www.gene-quantification.de/

O que é importante saber?

• Teoria e suas diferenças entre as técnicas

• Vantagens e desvantagens de cada uma

• Como aplicar a PCR ao seu projeto

• Aplicações gerais e específicas

• Boas práticas laboratoriais

Lucas Secchim Ribeiro

secchimribeiro@gmail.com

Dpto. MicrobiologiaLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

Sala C4 191 – Ramal 2735