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MARINA BARGUIL MACÊDO
PAPEL PROTETOR DA QUINASE ATIVADA POR ADENOSINA
MONOFOSFATO (AMPK) NA PROGRESSÃO E SEVERIDADE
DA NEFRITE TUBULOINTERSTICIAL EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
SÃO PAULO
2017
MARINA BARGUIL MACÊDO
PAPEL PROTETOR DA QUINASE ATIVADA POR ADENOSINA
MONOFOSFATO (AMPK) NA PROGRESSÃO E SEVERIDADE
DA NEFRITE TUBULOINTERSTICIAL EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara
Versão original
SÃO PAULO
2017
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidata: Marina Barguil Macêdo
Titulo da Dissertação: Papel protetor da quinase ativada por adenosina monofosfato
(AMPK) na progressão e severidade da nefrite tubulointersticial experimental
Orientador: Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão
pública realizada em ........./......../.........., considerou a candidata:
( ) Aprovada ( ) Reprovada
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Presidente: Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Plínio e Mariane, por estarem sempre presentes, apesar da
distância. Distância, aliás, que não foi empecilho algum para vivenciarem cada momento
relevante da minha formação acadêmica. Que o diga o papai, que, mesmo morando nas
proximidades da Linha do Equador, cruzou o Trópico de Capricórnio muitas e muitas vezes
para me visitar, e chegou mesmo a atravessar duas vezes o Trópico de Câncer para me
acompanhar.
A very special thanks para o meu orientador, o Prof. Niels, que estava sempre em sua
salinha disposto a me dar food for thought & food for tummy. Sempre recebi de bom grado
seus conselhos valiosos. Já não posso dizer o mesmo sobre suas iguarias gourmets... Acho que
ele não vai me perdoar por todas as vezes que recusei as tortas e bolos. Mas sou capaz de
garantir que estavam todos muito bons, mesmo sem ter provado!
Um muitíssimo obrigada à Angela, que assumiu fielmente o posto de guardian angel
na minha pesquisa. Enquanto o Prof. Niels me ensinou como pensar ciência, a Angela me
ensinou como fazer ciência. Pacientemente ela me explicou todas as técnicas de bancada
sobre as quais eu apenas tinha uma vaga ideia de como funcionavam. E pacientemente ela me
fez perceber que era necessário ter paciência com os resultados. Já dizia Ambrose Bierce,
“paciência é uma forma menor de desespero, disfarçada de virtude”. No caso da Angela,
paciência é uma virtude nata. No meu caso, é tão somente desespero contido. Que bom ter
podido conhecê-la e aprender tanto com ela!
O Paulo também merece meus mais sinceros agradecimentos. Afinal não foram poucas
as vezes em que eu fui reclamar do material de western blotting que tinha acabado e precisava
preparar mais. Ou que seria necessário antecipar um sacrifício e a ajuda dele seria requisitada
antes do combinado. Ou que a reação de genotipagem parou de funcionar e teríamos que
testar uma combinação diferente de primers ou de mix para que a banda voltasse a aparecer no
local certo. Enfim, foram muitos os percalços que sofremos juntos, mas que ficaram mais
leves por estarmos trabalhando em equipe.
Para o Thiago, um obrigada do fundo do coração por todos os momentos que
passamos, mesmo aqueles em que ele inventava as mais absurdas histórias e brincadeiras só
para chamar a atenção. Entramos juntos no Mestrado, mas eu concluí antes. Acho que foi
melhor assim, porque se tivesse sido ele a terminar antes de mim, eu teria sofrido, pois metade
da alegria do lab iria embora com ele.
Merecem ainda uma menção especial: o Vinícius, que, apesar de ter convivido pouco
comigo, foi muito importante no começo do meu trabalho; a Cris Aguiar, pela companhia, em
especial nas quartas e quintas-feiras, os dias mais gostosos da semana; a Meire, que sempre
faz o seu melhor para o bom andamento do laboratório, e que tem meu sincero
reconhecimento por isso; a Fernanda, que compartilha comigo o amor por contos de fada e
que é, ela mesma, quase uma personagem saída deles, com um senso de dever e uma
sensibilidade próprios de uma princesa; e a Natália, que eu conheço há pouco tempo, mas que
é uma colega dedicada e esforçada.
A equipe do LIT é grande e está envolvida em diferentes áreas de pesquisa, então
houve muitas pessoas que não colaboraram diretamente no meu trabalho, mas que nem por
isso deixaram de dar sua contribuição, seja através de comentários oportunos, seja
simplesmente por se mostrarem ouvintes atentos nas discussões de resultado das sextas-feiras.
Foram elas: a Tati, o Rafael, o Tárcio, a Amanda, a Camila, a Cris Naffah, a Aline, o
Guilherme, e a Raquel. Um muito obrigada a todos que conviveram comigo nesses quase dois
anos!
ENTIDADES DE FOMENTO
O presente trabalho foi desenvolvido com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP, Processos 2016/02299-1 e 2012/02270-2) e do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Processo 130128/2016-3).
“But the scientist is intensely religious - he is so religious that he will not accept quarter-
truths, because they are an insult to his faith.” (Sinclair, 1925)
RESUMO
Macêdo MB. Papel protetor da quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK) na
progressão e severidade da nefrite tubulointersticial experimental. [Dissertação (Mestrado em
Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2017.
A quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK) é um sensor e regulador metabólico,
cujo efeito sobre a polarização de macrófagos (MØ) vem sendo investigado como potencial
alvo terapêutico. Objetivou-se investigar o papel da ativação dessa molécula pela metformina
(Met) na doença renal crônica (DRC) experimental, tendo por hipótese que ela exerceria um
impacto positivo sobre a progressão da doença, ao levar os MØ para um fenótipo menos pró-
inflamatório. Para tal, inicialmente induziu-se nefrite tubulointersticial (NTI) crônica em
camundongos C57BL/6, através de ração suplementada com adenina 0,25% por 10 dias.
Concomitantemente, os animais foram tratados com Met 200 mg/kg/dia ou salina, por
gavagem. Intencionando comprovar que o efeito da Met sobre os MØ era dependente de
AMPK, experimento idêntico foi realizado em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
. Com o
intuito de identificar outras células relevantes para a fisiopatologia da lesão, e passíveis de
alteração metabólica pela AMPK, administrou-se clodronato lipossomal 50 mg/kg, uma droga
depletora de MØ, em camundongos C57BL/6 com NTI, e associou-se a gavagem com Met.
Trabalhou-se ainda com camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
. Realizou-se experimento in
vitro com células tubulares epiteliais renais murinas (CTERM, linhagem MM55.K), em que
se avaliou o efeito do estímulo com Met 20 mM sobre a transição epitélio-mesenquimal
(TEM). Os camundongos C57BL/6 tratados com Met apresentaram menor deterioração da
função renal, ao que se associou uma redução do número de granulomas no interstício renal;
uma maior frequência de MØ M1, em detrimento dos M2; e uma redução da expressão da
citocina pró-fibrótica TGF-β. Os camundongos LyzM-cre AMPK-/-
não diferiram dos LyzM-
cre AMPK+/+
quanto à intensidade da lesão, o que se justifica por a molécula já se encontrar
menos expressa no contexto da NTI. Por outro lado, ao se estimular a fosforilação da quinase
com Met, os LyzM-cre AMPK+/+
evoluíram melhor do que os não tratados, o mesmo não se
verificando nos LyzM-cre AMPK-/-
, o que sugere que a ação da Met nos MØ é de fato
dependente de AMPK. Apesar disso, a Met ainda foi capaz de limitar o grau de fibrose nos
rins dos LyzM-cre AMPK-/-
. O experimento com o Clo apontou para a existência de outros
alvos celulares da Met, uma vez que os animais tratados com ambas as drogas se mostraram
significativamente melhores do que os que receberam apenas uma delas. Os camundongos
CD4-cre AMPK-/-
e CD4-cre AMPK+/+
manifestaram a doença com igual gravidade. Não
houve diferenças no infiltrado linfocitário dos linfonodos renais entre os grupos controle e
com NTI, o que insinua que os linfócitos T CD4, nesse modelo de DRC, desempenham papel
pouco relevante para o estabelecimento da lesão. As CTERM apresentaram aumento da
fosforilação da AMPK e ativação da via glicolítica após o estímulo com Met, ao que se
correlacionou maior captação de glicose e expressão do transportador Glut-2. Houve menos
TEM nas CTERM que receberam Met. Assim, conclui-se que, na NTI experimental, a
ativação da AMPK reduz acentuadamente a gravidade da doença, ao modular os MØ para um
fenótipo menos pró-fibrótico, e ao tornar as CTERM resistentes à TEM.
Palavras chave: Quinase Ativada por Adenosina Monofosfato (AMPK). Imunometabolismo.
Macrófagos. Metformina. Doença renal crônica.
ABSTRACT
Macêdo MB. Protective role of adenosine monophosphate activated kinase (AMPK) on the
progression and severity of experimental tubulointerstitial nephritis. [Dissertação (Mestrado
em Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo;
2017.
Adenosine monophosphate activated kinase (AMPK) is an energy sensor and a master
regulator of metabolism, whose role on macrophage (MØ) polarization has been proposed as
a potential therapeutic target. We aimed to investigate the role of AMPK activation by
metformin (Met) on chronic kidney disease, hypothesizing that it could have a positive impact
on disease progression, mainly by leading MØ to a less inflammatory phenotype. We induced
tubulointerstitial nephritis (TIN) on C57BL/6 mice by feeding of adenine-enriched (0.25%)
diet for 10 days. Mice were gavaged daily with either saline or Met 200 mg/kg. In order to
certify that Met was acting through an AMPK-dependent pathway on MØ, the same model
was tested in LyzM-cre AMPKflox/flox
mice. With the intent of identifying other cells
meaningful to TIN pathogenesis, and prone to the beneficial interference of AMPK on their
metabolism, we administered liposome-encapsulated clodronate 50 mg/kg to C57BL/6 mice
with TIN, and additionally treated them with Met. We also worked with CD4-cre
AMPKflox/flox
mice. We performed an in vitro experiment on a lineage of murine renal tubular
epithelial cells (RTEC, MM55.K) to assess the effect of Met 20 mM on epithelial to
mesenchymal transition (EMT). Met-treated C57BL/6 mice presented a less marked
deterioration of renal function, to which it was associated a reduction of the number of
granulomata on renal interstitium; a greater frequency of infiltrating M1 MØ; and a reduced
expression of pro-fibrotic cytokine TGF-β. Severity of renal injury did not differ between
LyzM-cre AMPK-/-
and AMPK+/+
mice, what can be explained by AMPK being
downregulated on TIN. On the other hand, upregulation promoted by Met resulted in
improvement of LyzM-cre AMPK+/+
, but not AMPK-/-
mice, thus suggesting that the effect of
Met on MØ is indeed dependent of AMPK. Nevertheless, Met was able to reduce renal
fibrosis on LyzM-cre AMPK-/-
mice. The experiment with Clo pointed to other cellular targets
of Met, since mice treated with both drugs faired even better than those treated with each one
in separate. CD4-cre AMPK+/+
and AMPK-/-
mice presented the same intensity of injury, and
there was no difference on the lymphocytic infiltrate of renal lymph nodes from control and
diseased mice, indicating that CD4 T cells, on this model, do not present a prominent role.
Met-stimulated RTEC expressed higher levels of phosphorylated AMPK, and exhibited
activation of glycolysis, to which correlated increase of glucose uptake and enhanced
expression of the transporter Glut-2. EMT was impaired on Met-treated RTEC. We therefore
conclude that, in experimental TIN, activation of AMPK sensibly reduces disease severity
both by modulating MØ to a less fibrotic phenotype, and turning RTEC resistant to EMT.
Keywords: Adenosine monophosphate activated kinase (AMPK). Immunometabolism.
Macrophages. Metformin. Chronic kidney disease.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Modelo da via de sinalização da AMPK. ................................................................ 22
Figura 2 - Representação esquemática dos mecanismos celulares envolvidos na progressão da
doença renal crônica. ................................................................................................................ 25
Figura 3 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com
metformina. .............................................................................................................................. 32
Figura 4 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para LyzM. ............ 33
Figura 5 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com clodronato
e/ou metformina. ....................................................................................................................... 34
Figura 6 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para Prkaa. ............ 36
Figura 7 - Esquema representativo do cultivo de células tubulares epiteliais renais murinas,
linhagem MM55.K. .................................................................................................................. 43
Figura 8 - Parâmetros clínico-laboratoriais dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por
adenina, e tratados com metformina. ........................................................................................ 46
Figura 9 - Peso renal e histologia dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina,
e tratados com metformina. ...................................................................................................... 47
Figura 10 - Marcação imunoistoquímica para iNOS nos rins dos camundongos C57BL/6 com
NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ........................................................... 49
Figura 11 - Estratégia de gating para caracterização do infiltrado leucocitário nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ............ 50
Figura 12 - Frequência de células CD45+ nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................................... 50
Figura 13 - Caracterização da população de monócitos nos rins dos camundongos C57BL/6
com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................... 51
Figura 14 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD86+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ............ 51
Figura 15 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD206+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ............ 52
Figura 16 - Expressão gênica das citocinas IL-6, TNF-α e TGF-β nos rins dos camundongos
C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................... 52
Figura 17 - Frequência das populações CD45+ CD4+ e CD45+ CD8+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ............ 53
Figura 18 - Frequência da população CD45+ CD11c MHCII nos rins dos camundongos
C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................... 54
Figura 19 - Avaliação da transição epitélio-mesenquimal, através da expressão de αSMA, nos
rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina. ........................................... 55
Figura 20 - Expressão de colágeno nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida
por adenina, e tratados com metformina. ................................................................................. 56
Figura 21 - Expressão de pAMPK em tecido renal de camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................................... 57
Figura 22 - Gravidade clínica da NTI em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox. ............. 57
Figura 23 - Caracterização dos M de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI. ....... 58
Figura 24 - Frequência da população CD45+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre
AMPKflox/flox
com NTI. ............................................................................................................. 59
Figura 25 - Distribuição das células CD45+ F4/80 CD11b no tecido renal de camundongos
LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI. ............................................................................................ 59
Figura 26 - Frequência da população CD45+ F4/80low
CD11bhigh
Ly6C+ no tecido renal de
camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI...................................................................... 60
Figura 27 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD86+ no tecido renal de
camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI...................................................................... 60
Figura 28 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD206+ no tecido renal de
camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI...................................................................... 61
Figura 29 - Fibrose renal em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI. ..................... 62
Figura 30 - Histologia dos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI. ............. 63
Figura 31 - Coloração imunoistoquímica para CD11b nos rins de camundongos LyzM-cre
AMPKflox/flox
com NTI. ............................................................................................................ 64
Figura 32 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK-/-
tratados com
metformina. .............................................................................................................................. 65
Figura 33 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK+/+
tratados com
metformina. .............................................................................................................................. 65
Figura 34 - Histologia dos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI tratados
com metformina. ....................................................................................................................... 66
Figura 35 - Frequência das populações CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD86+ e CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD206+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI
tratados com metformina. ......................................................................................................... 67
Figura 36 - Expressão de αSMA nos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI
tratados com metformina. ......................................................................................................... 68
Figura 37 - Marcadores de função e lesão renal nos camundongos C57BL/6 tratados com
metformina e/ou clodronato...................................................................................................... 69
Figura 38 - Variação do peso dos camundongos C57BL/6 tratados com metformina e/ou
clodronato. ................................................................................................................................ 69
Figura 39 - Expressão gênica de IL-6 e TNF-α no tecido renal de camundongos C57BL/6
tratados com metformina e/ou clodronato. ............................................................................... 70
Figura 40 - Expressão proteica de αSMA em tecido renal de camundongos C57BL/6 tratados
com metformina ou clodronato................................................................................................. 70
Figura 41 - Parâmetros clínicos dos camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
com NTI. ............. 71
Figura 42 - Estratégia de gating nas células do parênquima renal de camundongos CD4-cre
AMPKflox/flox
. ............................................................................................................................ 71
Figura 43 - Caracterização dos LT CD4+ infiltrando o parênquima renal de camundongos
CD4-cre AMPKflox/flox
. ............................................................................................................. 72
Figura 44 - Estratégia de gating nas células do linfonodo renal de camundongos CD4-cre
AMPKflox/flox
. ............................................................................................................................ 72
Figura 45 - Frequência da população de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-
cre AMPKflox/flox
. ...................................................................................................................... 73
Figura 46 - Ativação de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
.
.................................................................................................................................................. 73
Figura 47 - Caracterização da expressão de IFN-γ por linfócitos T CD4 no linfonodo renal de
camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
. ...................................................................................... 74
Figura 48 - Ensaio de viabilidade das CTERM cultivadas na presença de metformina 20 mM
ou de composto C 10 μM por 24h. ........................................................................................... 74
Figura 49 - Expressão de AMPK fosforilado nas CTERM após estímulo com metformina 20
mM. .......................................................................................................................................... 75
Figura 50 - Expressão de αSMA por CTERM submetidas à TEM e tratadas com Met 20 mM
e/ou CompC 10 μM. ................................................................................................................. 75
Figura 51 - Concentração de glicose e lactato no sobrenadante das CTERM cultivadas com
Met 20 mM ou CompC 10 μM. ................................................................................................ 76
Figura 52 - Captação de 2-nbdg pelas CTERM cultivadas com Met 20 mM ou CompC 10 μM.
.................................................................................................................................................. 76
Figura 53 - Expressão do transportador de glicose Glut2 nas células tubulares renais tratadas
com Met 20 mM ou CompC 10 μM. ........................................................................................ 77
Figura 54 - Esquema representativo do mecanismo de ação da metformina na nefrite
tubulointersticial induzida por adenina em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
................. 90
Figura 55 - Sumário gráfico...................................................................................................... 91
LISTA DE SIGLAS
Ad Adenina
AMPK Quinase ativada por adenosina monofosfato
AU Ácido úrico
CD Cluster de diferenciação
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar
CEL Clodronato encapsulado por lipossoma
Clo Clodronato
CompC Composto C
Cr Creatinina
CTERM Células tubulares epiteliais renais murinas
Ctrl Controle
DNA Ácido desoxirribonucleico
DRC Doença renal crônica
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
Glut Transportador de glicose
IHQ Imunoistoquímica
IL Interleucina
IP Intraperitoneal
KIM-1 Kidney injury molecule 1
LB Lipossomas brancos
LT Linfócitos T
MØ Macrófago
MEC Matriz extracelular
Met Metformina
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
NK-ƙB Fator nuclear kappa B
NTI Nefrite tubulointersticial
pAMPK Quinase ativada por adenosina monofosfato, molécula fosforilada
RC Ração convencional
REA Ração enriquecida com adenina
RNA Ácido ribonucleico
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa
αSMA Actina alfa do músculo liso
TEM Transição epitélio-mesenquimal
TGF-β Fator transformador do crescimento beta
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
Ur Ureia
WB Western blotting
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................19
1.1 A doença – considerações clínico-epidemiológicas .................................................20
1.2 A molécula – considerações químico-estruturais e funcionalidades no sistema imune
.........................................................................................................................................21
1.3 O agonista – considerações mecanísticas e terapêuticas ..........................................23
1.4 As células – considerações fisiopatológicas .............................................................24
1.5 O modelo – considerações fisio e histopatológicas ..................................................26
1.6 Justificativa................................................................................................................27
2 OBJETIVOS..........................................................................................................................28
2.1 Objetivo Geral...........................................................................................................29
2.2 Objetivos Específicos................................................................................................29
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................30
3.1 Experimentos in vivo....................................................................................................31
3.1.1 Modelo de NTI em camundongos selvagens tratados com metformina................31
3.1.2 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em
macrófagos.......................................................................................................................32
3.1.3 Modelo de NTI em camundongos selvagens depletados de macrófagos...............34
3.1.4 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em linfócitos T
CD4..................................................................................................................................35
3.1.5 Avaliação da função renal através da quantificação de creatinina e ureia no soro.36
3.1.6 Avaliação histológica do tecido renal.....................................................................37
3.1.7 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por RT-PCR.............................39
3.1.8 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por western blotting..................40
3.1.9 Análise do infiltrado inflamatório e ativação celular no rim por citometria de fluxo
.........................................................................................................................................40
3.2 Experimento in vitro....................................................................................................41
3.2.1 Cultura de células tubulares renais.........................................................................41
3.2.2 Ensaio de viabilidade celular..................................................................................41
3.2.3 Avaliação da indução de AMPK por metformina..................................................42
3.2.4 Avaliação da influência da AMPK sobre a captação de glicose............................42
3.2.5 Avaliação da influência da AMPK sobre a transição epitélio-mesênquima..........43
3.2.6 Avaliação da via glicolítica pela dosagem de glicose e lactato .............................44
3.3 Processamento de dados e análise estatística...............................................................44
4 RESULTADOS......................................................................................................................45
4.1 A metformina protege camundongos selvagens da NTI induzida por adenina ..........46
4.1.1 Parâmetros clínico-laboratoriais ............................................................................46
4.1.2 Parâmetros histomorfológicos................................................................................48
4,1.3 Infiltrado inflamatório ...........................................................................................50
4,1.4 Análise de marcadores de fibrose...........................................................................54
4.2 O efeito da metformina sobre a polarização dos macrófagos é dependente de
AMPK................................................................................................................................58
4.3 A metformina atua, também via AMPK, nas células tubulares renais........................67
5 DISCUSSÃO.........................................................................................................................79
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................................88
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................93
1 INTRODUÇÃO
20
1.1 A doença – considerações clínico-epidemiológicas
Definida como uma anormalidade funcional ou estrutural do rim que persiste por mais
de três meses, com implicações para a saúde do indivíduo, a doença renal crônica (DRC) vem,
de forma crescente, angariando atenção das comunidades médica e acadêmica ao se
estabelecer como um problema de saúde pública [2].
Estima-se que entre 11 e 13% da população mundial apresente DRC. Esta cifra é
particularmente alarmante ao se constatar que pode representar uma subestimativa, sendo o
diagnóstico feito comumente de forma tardia, uma vez que os pacientes não costumam
apresentar queixas a não ser em estágios avançados, quando a terapia renal substitutiva já se
torna imperativa como pilar da proposta terapêutica [3].
Associada ao fato de ser uma condição indolente e assintomática em seus estágios
iniciais, outra razão para o subdiagnóstico da perda da capacidade de filtração dos rins é a
falta de uma sistematização visando a seu rastreamento. De fato, como ocorre com outras
doenças crônico-degenerativas com que ela compartilha fatores de risco, tais como
hipertensão arterial sistêmica e diabetes mellitus, a DRC entra no rol de doenças preveníveis.
Assim, na atualidade, a investigação ativa de seus fatores causais, aliada à intervenção
precoce, é a principal estratégia de que se dispõe para tentar reduzir sua prevalência [4].
Apesar de se ter conhecimento de uma abordagem custo-efetiva para conter seu
alastramento, opções terapêuticas para os mais de 200 milhões de pacientes que já convivem
com a doença são escassas, de modo que, anualmente, cerca de 850 mil indivíduos vão a óbito
pela DRC, que assim se configura como a 12ª causa de mortalidade no mundo [5-7].
Sabe-se que, a despeito de qual seja a causa subjacente à deterioração da função renal,
a fisiopatologia da DRC envolve um estado persistente de inflamação local e sistêmica que
resulta na perda do parênquima renal, que gradativamente vai sendo substituído por fibrose.
Logo, a identificação de alvos celulares e moleculares que permitam a interrupção de uma
cascata inflamatória que tende a se amplificar e se retro-alimentar, levando à inexorável perda
da função e à desestruturação anatômica dos rins, representa o cerne das pesquisas atuais que
buscam sobrepujar o problema [8-9].
Contudo, a elaboração de novos compostos que possam vir a se tornar drogas no
combate à progressão da DRC é um processo lento, longo e laborioso, sendo premente o
surgimento de alternativas que possam, ao menos a médio prazo, constar como opção
terapêutica viável e acessível [10].
21
Nesse contexto, o entendimento das mudanças metabólicas que ocorrem nas células do
sistema imune, as principais responsáveis pelos danos estruturais que se estabelecem durante
a progressão da doença, representou um avanço na busca de possíveis soluções terapêuticas
para a DRC. Diante da perspectiva de modulação de vias imunometabólicas, uma molécula
em especial tem despertado o interesse da comunidade científica por já ter um modulador
largamente utilizado na prática clínica – essa molécula é a quinase ativada por adenosina
monofosfato (AMPK), e seu modulador de emprego corrente é a metformina (Met) [11].
1.2 A molécula – considerações químico-estruturais e funcionalidades no sistema imune
A AMPK é um heterotrímero composto por três subunidades, α, β e γ, pertencente à
família das serina/treonina quinases. Expressa em todos os organismos eucarióticos, trata-se
de uma quinase conservada evolutivamente com função de sensor energético, capacitando a
célula a responder a desafios energéticos. A exposição a ambientes pobres em glicose ou o
aumento da concentração intracelular de AMP desencadeiam a fosforilação da treonina 172
da subunidade α, com função catalítica, estimulando, portanto, a ativação da quinase [12,13].
Várias são as vias metabólicas que convergem para ou interagem com a AMPK.
Enquanto algumas têm o propósito de transmitir estímulos tróficos vindos do extracelular,
mediando a comunicação entre a célula e o meio em que ela se insere (a exemplo dos
receptores hormonais de adiponectina e leptina), outras sinalizam para alterações no próprio
intracelular (como a disfunção mitocondrial causando a elevação da razão AMP/ADP, um
forte gatilho para deflagrar a ação da AMPK) [14].
Muito ainda se desconhece sobre quais sejam as moléculas intermediárias entre a
AMPK e os receptores localizados na membrana celular; sabe-se, porém, que as três
principais quinases envolvidas na fosforilação da treonina 172 são a quinase dependente de
cálcio-calmodulina (CAMKKβ), a quinase hepática B1 (LKB1), e a quinase ativada pelo fator
transformador do crescimento β (TAK1) [15].
Tem-se demonstrado que variadas situações fisiológicas e patológicas são capazes de
deflagrar a ativação da AMPK, por exemplo, a contração muscular, a hipóxia, a inflamação e
a sepse [13]. Todas essas situações convergem quanto ao fato de representarem um stress
metabólico, requisitando da célula um alto consumo energético.
A AMPK concorre para o estabelecimento de um balanço energético favorável agindo
em duas frentes: ao regular positivamente as vias catabólicas que produzem trifosfato de
adenosina (ATP), e negativamente as vias anabólicas que consomem ATP [16]. Desta forma,
22
em condições de escassez de glicose, a AMPK atua tanto na redução do gasto energético,
suprimindo a tradução de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm) de citocinas, quanto na
ativação de vias metabólicas alternativas, como o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, que utiliza
o aminoácido não essencial glutamina como substrato básico [17,18].
Figura 1 - Modelo da via de sinalização da AMPK.
A AMPK age em concerto com outras quinases no sentido de promover redução do consumo e aumento da
produção de energia pela célula. Para tal, ela reprime enzimas envolvidas em vias anabólicas, seja através da
inibição de sua transcrição, ao interagir com a proteína de ligação do elemento regulador de esterol (SREBP1c),
seja através da fosforilação de enzimas relacionadas à etapa limitante de reações, tais como a hidróxi-metil-
glutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase) e a acetil-CoA carboxilase (ACC), que controlam a síntese de
lipídios e ácidos graxos. Além de seus efeitos negativos sobre a lipidogênese, a AMPK também suprime a
síntese proteica ao inibir direta e indiretamente (via ativação do complexo da esclerose tuberosa - TSC) o
complexo do alvo molecular da rapamicina (mTOR). Paralelamente, a AMPK eleva a síntese de trifosfato de
adenosina (ATP) ao estimular a glicólise e o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs). Fonte: Zadra et al.
(2010) [19].
O estudo in vivo realizado por Blagih et al. (2015) demonstrou que linfócitos T (LT)
nos quais se induziu deficiência da isoforma AMPKα1 apresentam maior apoptose quando
submetidos a ambientes adversos em termos de oferta nutricional [12]. Tais ambientes, apesar
de elaborados artificialmente no estudo em questão, são, em verdade, a realidade com a qual
os LT devem confrontar durante sua transição de naïve, quando habitam órgãos linfoides em
23
condições otimizadas de oferta nutricional, para efetores, quando passam a ocupar sítios em
que a competição por nutrientes, oxigênio e fatores de crescimento é a regra, conforme
sugeriu estudo de Pearce et al. (2013) [20].
Além de atuar como moduladora do metabolismo celular no processo de diferenciação
dos LT, a AMPK também exerce papel central na mudança do padrão de comportamento dos
macrófagos. Seu envolvimento na polarização dos macrófagos do fenótipo de M1 para M2, já
foi demonstrado em diversos estudos. Isso porque ela parece ser particularmente relevante
para as células cuja principal fonte energética advém da oxidação dos ácidos graxos, como é o
caso dos macrófagos M2 [21,22].
Ao promover a biogênese mitocondrial, através da estimulação do coativador do
receptor ativado pela proliferação de peroxissomos γ (PPARγ), e ao elevar captação de ácidos
graxos pela mitocôndria, através da estimulação da carnitina palmitoiltransferase 1α (Cpt1α),
a AMPK maximiza a síntese de citocinas antiinflamatórias pelos macrófagos M2, como a IL-
10 [23]. Não apenas isso: a AMPK também está inserida em várias vias de sinalização
implicadas na regulação negativa da inflamação, agindo, por exemplo, através da inibição do
fator nuclear kappa B (NF-ƙB) e da ativação da serina/treonina quinase AKT [24].
1.3 O agonista – considerações mecanísticas e terapêuticas
A modulação positiva da AMPK em uma série de modelos experimentais de lesão
renal tanto aguda quanto crônica abre uma perspectiva de interferir na sua via de sinalização
para reduzir a progressão e a severidade de diversas nefropatias. Essa perspectiva é
particularmente promissora uma vez que se dispõe de uma droga amplamente comercializada,
e de segurança comprovada em seres humanos, que tem como mecanismo de ação a
estimulação da fosforilação da AMPK – trata-se da Met, atualmente indicada para controle
glicêmico no diabetes tipo II [25,26].
Por extensão, dispõe-se de inúmeras publicações acerca dos benefícios da Met na
nefropatia diabética, os quais foram recentemente sumarizados em uma revisão de Ravindran
et al. (2016), mas o seu potencial de aplicabilidade terapêutico é muito mais amplo. Isso
porque todos os insultos renais, independentemente de sua natureza, tendem a evoluir para o
estabelecimento de fibrose tecidual [27].
Em um estudo de Lu et al. (2015), evidenciou-se que a Met é capaz de inibir a
produção de colágeno mediada pelo fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) em
24
fibroblastos renais, de modo que ela agiria, dessa forma, interrompendo a via final comum a
diversos mecanismos de injúria renal [28].
Corroborando as evidências in vitro, Cavaglieri et al. (2015) demonstraram em um
modelo de obstrução ureteral unilateral que camundongos tratados apresentam menor
infiltrado inflamatório no rim obstruído, além de menor expressão de citocinas inflamatórias e
marcadores de fibrose [29].
1.4 As células – considerações fisiopatológicas
Os macrófagos representam uma das populações celulares mais comumente
identificadas em espécimes oriundos de tecido renal que sofreu agressão, seja ela imuno-
mediada ou não. Tem-se atribuído a eles tanto efeitos patogênicos, ao propiciar, em seu
fenótipo M1, um ambiente pró-inflamatório nas fases iniciais da doença renal, e ao estimular,
em seu fenótipo M2, a fibrogênese em fases mais tardias, quanto efeitos benéficos, ao
promover o clareamento de imunocomplexos e estimular a reparação do tecido lesado [30].
Apesar dessa abrangência de ações que poderiam, a princípio, serem caracterizadas
como díspares, sabe-se que a interação dos macrófagos com as células glomerulares e
tubulares epiteliais renais é mediada por citocinas e fatores de crescimento responsáveis por
regular os efeitos dos macrófagos na DRC, podendo estes, na dependência daqueles, assumir
um papel positivo ou negativo sobre o processo lesão-reparação [31].
De modo que, irrespectivamente da natureza inicial do insulto, ao sistema imune é
atribuído o papel central em manter ou sustar a injúria tecidual, estando claro que a
predominância de uma subpopulação de macrófagos, M1 ou M2, tem implicações decisivas
sobre a evolução da lesão renal [30,31].
Isto abre possíveis janelas de oportunidades terapêuticas quanto à interferência nesta
transição entre os polos M1 e M2, impedindo que a subpopulação implicada no ciclo
repetitivo inflamação-fibrose perpetue o processo. Na DRC, ao mesmo tempo em que o
fenótipo M2 está envolvido na regeneração da membrana tubular basal e na secreção de
fatores antiinflamatórios, também a ele se imputa o recrutamento de miofibroblastos e o
estímulo à síntese de colágeno. Assim, o próprio controle fino dos papéis exercidos por um
mesmo fenótipo é campo a ser desbravado no interesse de se encontrar novos alvos
terapêuticos [32].
Em contrapartida, a presença de LT CD4+ no infiltrado celular de um rim
cronicamente lesado se relaciona com a diminuição da função renal e com a extensão da
25
fibrose. A fibrose intersticial e atrofia tubular são similarmente achados não específicos
compatíveis com uma multiplicidade de causas, incluindo lesão renal isquêmica, hipertensão e
toxicidade crônica por medicamentos [33].
A fibrose intersticial é caracterizada por um acúmulo de tecido conjuntivo, que inclui
colágenos tipo I e III, fibronectina e vários proteoglicanos, levando a uma desorganização na
arquitetura do rim [34]. O seu aparecimento é uma sequela de inflamação ou lesão, durante as
quais fatores humorais são liberados por células infiltrantes ou residentes, que estimulam o
parênquima renal a aumentar a produção de componentes da matriz extracelular, como o
colágeno, sendo a intensidade de fibrose intersticial o processo mais fortemente relacionado
com a deterioração da função do enxerto renal no pós-transplante [35]. Especificamente na
rejeição crônica do enxerto mediada por células, ocorre ativação de LT, fibrose intersticial e
atrofia tubular, sem evidência de alguma etiologia específica [36].
Figura 2 - Representação esquemática dos mecanismos celulares envolvidos na
progressão da doença renal crônica.
Independentemente do fator causal da lesão, o processo que leva à cronificação da doença renal envolve uma
interação viciosa entre as células do sistema imune e as células tubulares epiteliais: macrófagos e linfócitos T
secretam citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, mantêm o influxo constante de células infiltrantes no
tecido, amplificando o sinal; ao mesmo tempo, fatores de crescimento, a exemplo do fator transformador do
crescimento beta (TGF-β), são liberados e induzem transição epitélio-mesenquimal, convertendo pericitos e
miofibroblastos produtores de matriz extracelular (ECM), o que agrava ainda mais a destruição da arquitetura
tubular, que acaba por ser substituída por fibrose. Fonte: Lee et al (2017) [37].
Os LT CD4+ sintetizam e secretam fator transformador do crescimento beta (TGF-β),
molécula com importante função fibrogênica. O TGF-β estimula a produção de moléculas
como colágeno e fibronectina pelos fibroblastos. Estudos mostraram que, durante a DRC em
26
camundongos, há uma massiva infiltração de LT CD4+ e secreção de citocinas tais como
IFN-γ e IL-1β [38].
Ainda, a transferência para camundongos saudáveis de LT CD4+ provenientes de
camundongos submetidos à isquemia e reperfusão renal em uma fase tardia, com significante
presença de fibrose e inflamação, rapidamente induziu aumento de albuminúria nos receptores
[39]. Esses dados indicam que uma alteração no metabolismo dessas células é capaz de
induzir alterações significativas nas funções renais.
1.5 O modelo – considerações fisio e histopatológicas
Em mamíferos, a adenina (Ad) é um produto endógeno da via da poliamina e é
captada pela adenina-fosforibosiltransferase (APRT). Quando a APRT funcional está ausente,
a Ad passa a ser um substrato significante para a xantina-desidrogenase (XDH), que a oxida
em 2,8-diidroxiadenina (DHA) [40].
Como a 2,8-DHA é extremamente insolúvel, sua excreção pelo rim pode levar à
formação de cálculos urinários. Os cristais de 2,8-DHA exercem efeitos tóxicos diretos nas
células tubulares e intersticiais renais, eventualmente levando à falência renal de estágio final
[41,42].
Os mecanismos envolvidos na toxicidade tubular não são bem compreendidos.
Estudos experimentais com camundongos deficientes de APRT apresentam nefrolitíase com
extensa dilatação tubular, inflamação, necrose e fibrose [43]. Além disso, a Ad é uma base
purínica, sendo, portanto, precursora do ácido úrico (AU) na via da xantina oxidase. O AU,
por seu turno, é reconhecidamente um importante deflagrador de estresse oxidativo, podendo,
por si só, resultar em DRC [44].
Do ponto de vista histopatológico, secções de tecido renal de ratos ou camundongos
com lesão renal mediada por Ad revelam predominantemente uma desestruturação da
arquitetura tubular, sendo o glomérulo relativamente poupado. Assim, o uso de ração
enriquecida com Ad para induzir DRC experimental constitui um interessante modelo de
nefrite tubulointersticial (NTI) crônica [45].
A NTI, em humanos, é definida microscopicamente por fibrose intersticial e atrofia
tubular com variado infiltrado inflamatório de linfócitos, macrófagos e outras células, desde
que a lesão intersticial esteja fora de proporção para qualquer doença glomerular. Fibrose
periglomerular é comum e algumas obsolescências glomerulares podem ser encontradas nas
áreas afetadas [46].
27
1.6 Justificativa
O acúmulo de evidências sobre a importância do papel da AMPK no metabolismo
celular, cuja função não é restrita ao equilíbrio energético, mas também se relaciona à
resposta inflamatória e à fibrose tecidual, vem estimulando o estudo desta molécula como
alvo terapêutico potencial em uma série de doenças [47,48].
Por sua vez, a Met, um agonista reconhecido da AMPK, é capaz de reduzir a
expressão de TGF-β em fibroblastos renais de camundongos, o que, por sua vez, resulta em
menor produção de colágeno por essas células [28,49].
A relevância de tal constatação é significante uma vez que se sabe que a fibrose e a
produção desregulada de colágeno constituem o ponto crucial no remodelamento tecidual
verificado na DRC. A possibilidade de se intervir sobre essa etapa do processo patológico,
para o qual no momento não se dispõe ainda de uma droga modificadora da história natural da
doença, abre um campo de oportunidades para o desenvolvimento de fármacos voltados para
a modulação do AMPK e de outros componentes que com ele interagem na cascata [50].
Isso nos motivou a elaborar o presente estudo, que visa avaliar os efeitos da AMPK
sobre o curso da DRC, presumindo-se que sua ativação module os dois principais tipos
celulares presumivelmente envolvidos na lesão, os macrófagos e linfócitos T CD4+, a
apresentar um fenótipo menos pró-inflamatório.
2 OBJETIVOS
29
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel exercido pela ativação da AMPK em macrófagos, LT CD4+ e células
tubulares renais, sobre os mecanismos de lesão renal crônica.
2.2 Objetivos Específicos
Inicialmente, valendo-se de um modelo de NTI em animais selvagens, intencionamos avaliar
o efeito da ativação de AMPK através da administração de Met sobre:
(i) os parâmetros funcionais e morfológicos da lesão;
(ii) o perfil inflamatório das células infiltrantes;
(iii) os marcadores de fibrose renal no tecido renal; e
(iv) as principais vias moleculares envolvidas.
Uma vez tendo demonstrado que a via da AMPK está envolvida no desenvolvimento da NTI
experimental, e que a ativação dessa quinase tem impacto positivo sobre a disfunção renal,
objetivamos estudar em qual população celular a ativação da AMPK é mais relevante para
impedir a progressão da doença. Tendo por base o mesmo modelo de NTI, intencionamos:
(v) Observar o efeito de sua deleção seletiva em macrófagos ou LT CD4+ sobre o
desenvolvimento de lesão renal crônica; e
(vi) Analisar o efeito da deleção seletiva no perfil inflamatório induzido pela NTI.
Ainda, buscando identificar se a ativação da AMPK é relevante para as células tubulares
renais se tornarem resistentes ao processo de fibrogênese de que são alvo, intencionamos:
(vii) Induzir transição epitélio-mesênquima em uma cultura de células tubulares
renais, e averiguar qual o efeito da adição de Met ao meio; e
(viii) Avaliar quais as alterações metabólicas proporcionadas pela Met nessas células.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
31
3.1 Experimentos in vivo
Os experimentos abaixo descritos receberam o aval da Comissão de Ética em Uso
Animal (CEUA) do ICB em 16 de março de 2016, sob o número de protocolo 10/2016, com
posterior adendo em 30 de novembro de 2016, sob a forma da Declaração 128/2016.
3.1.1 Modelo de NTI em camundongos selvagens tratados com metformina
O modelo adotado consistiu em provocar NTI em camundongos selvagens através do
acesso livre e irrestrito (ad libitum) a uma dieta consistindo de ração suplementada com
0,25% de adenina (Rhoster Indústria e Comércio Ltda, Araçoiaba da Serra, São Paulo, Brasil).
Os animais foram mantidos em microisoladores contendo até cinco camundongos por gaiola,
à temperatura ambiente constante de 22 oC, com ciclos artificiais de claro-escuro de 12 horas.
No primeiro experimento, ao todo 20 camundongos C57BL/6, machos, datando entre
seis e oito semanas, e pesando entre 20 e 25 g, foram alocados aleatoriamente em um entre
quatro grupos: (1) grupo controle (Ctrl), tendo por alimentação uma ração convencional (RC),
e sendo gavado com PBS; (2) grupo metformina (Met), tendo por alimentação RC, e sendo
gavado com metformina; (3) grupo adenina (Ad), tendo por alimentação a ração enriquecida
com adenina (REA), e sendo gavado com PBS; e (4) grupo adenina mais metformina
(Ad+Met), tendo por alimentação REA, e sendo gavado com metformina.
Os camundongos receberam Met (Medley, Campinas, São Paulo, Brasil), na dose de
200 mg/kg/dia. A preparação da Met se deu da seguinte forma: um comprimido de 850 mg foi
triturado e diluído em 21,25 mL de PBS, de modo que a solução contivesse a droga na dose
de 40 mg/mL. A solução foi então armazenada em geladeira, a 4 oC. O dia zero do
experimento foi considerado como aquele em que se iniciaram a alimentação com REA e o
procedimento da gavagem. Os camundongos, bem como a ração consumida, foram pesados
diariamente no começo da manhã. O dia do sacrifício foi estabelecido como aquele
subsequente à décima dose de Met.
Ao fim do experimento, os animais foram anestesiados com Quetamina-Xilazina e
eutanasiados por exsanguinação. O sangue foi coletado por punção cardíaca para subsequente
dosagem de ureia e creatinina séricas. Os rins foram removidos, descapsulados e pesados. O
peso do rim foi normalizado pelo peso corporal total dos camundongos no dia zero do
experimento para permitir a comparação entre os grupos.
32
Figura 3 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com
metformina.
Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais
metformina, Ur – ureia, Cr – creatinina. Fonte: autoria própria.
Parte do tecido renal foi criopreservada em nitrogênio líquido para realização posterior
de western blotting (WB) e reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa (RT-PCR).
Outra parte foi mantida em solução de colagenase IV a 2% em PBS como parte do preparo
para execução da citometria de fluxo. A parte remanescente foi conservada em formaldeído
4% para preparação de cortes histológicos. O experimento foi repetido mais duas vezes para
confirmar a consistência e a reprodutibilidade dos resultados (Figura 3).
3.1.2 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em macrófagos
Para se obter camundongos em que a AMPK estivesse condicionalmente ausente em
macrófagos, procedeu-se ao cruzamento de animais contendo a sequência Cre, que codifica
para uma enzima DNA recombinase, sob o controle do promotor do gene lisosima M (LyzM),
expresso predominantemente em monócitos e macrófagos, com animais contendo o gene
Prkaa1, que codifica a AMPK, ladeado pela sequência flox, que é reconhecida por Cre como a
parte a ser excisada.
Ao se valer da técnica cre-lox, não se tem o inconveniente potencial apresentado por
agonistas ou antagonistas farmacológicos, cuja dose administrada pode não ser a adequada
33
para ativar ou inibir a molécula na célula alvo, ou que podem ainda estar exercendo efeito off-
target.
Os animais foram cruzados até atingirem homozigosidade em ambos os genes, a qual
foi comprovada através de genotipagem usando o protocolo recomendado pela The Jackson
Laboratory (JAX, Bar Harbor, ME, USA). Os genes mutados foram amplificados usando a
seguinte sequência de primers recomendada pela JAX: LyzM – mutante: 5’ CCC AGA AAT
GCC AGA TTA CG 3’, selvagem: 5’ TTA CAG TCG GCC AGG CTG AC 3’, comum: 5’
CTT GGG CTG CCA GAA TTT CTC 3’; Prkaa – forward: 5’ CCC ACC ATC ACT CCA
TCT CT 3’, reverse: 5’ AGC CTG CTT GGC ACA CTT AT 3’ (Figura 4).
Figura 4 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para LyzM.
Em (A), reação para o gene LyzM mutante (peso molecular: 700 kDa), isto é, acrescido da sequência que
codifica para a enzima cre. Em (B), reação para o gene LyzM selvagem (peso molecular: 350 kDa), isto é,
desprovido da sequência cre. B – branco, CP – controle positivo, CN – controle negativo. Fonte: autoria própria.
Em um primeiro experimento, visando comparar a gravidade da NTI induzida por Ad
entre os camundongos AMPK+/+
e AMPK-/-
, os animais, com idade entre 8 e 10 semanas,
foram distribuídos em quatro grupos: Ctrl AMPK+/+
(N=4, 4♀), Ad AMPK+/+
(N=11, 8♀,
3♂), Ctrl AMPK-/-
(N=8, 8♀), Ad AMPK-/-
(N=13, 10♀, 2♂).
Em um segundo experimento, visando comprovar que o efeito benéfico da Met é
exercido por ativação da AMPK, os animais, com idade entre 8 e 10 semanas, foram
distribuídos em seis grupos: Ctrl AMPK-/-
(N=11, 3♂ e 8♀), Ad AMPK-/-
(N=20, 15♂ e 5♀),
Ad+Met AMPK-/-
(N=18, 14♂ e 4♀), Ctrl AMPK+/+
(N=8, 8♀), Ad AMPK+/+
(N=6, 4♂ e
2♀), e Ad+Met AMPK+/+
(N=5, 4♂ e 1♀). O desenho experimental seguiu o mesmo molde
daquele dos camundongos C57BL/6, já detalhado no subitem 1.1.
A B
34
3.1.3 Modelo de NTI em camundongos selvagens depletados de macrófagos
A administração intraperitoneal (IP) de clodronato encapsulado por lipossoma (CEL) é
uma técnica reconhecidamente eficaz para depletar macrófagos: estes engolfam as vesículas,
as quais promovem a morte dos fagócitos por apoptose [51]. Visou-se observar se o efeito do
CEL sobre a progressão da NTI induzida por adenina era comparável à administração de Met.
Figura 5 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com
clodronato e/ou metformina.
As seringas representam os dias em que foi administrado clodronato encapsulado por lipossoma (CEL) ou
lipossoma branco (LB), por via intraperitoneal (IP), nos camundongos. A metformina, ou seu veículo, o PBS, foi
administrada diariamente, na dose de 200 mg/kg, através de gavagem, até o 7o dia do experimento. No 8
o dia,
procedeu-se ao sacrifício, representado pela cruz. Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo
adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina,
metformina e clodronato. Fonte: autoria própria.
Com esse intuito, produziu-se, em colaboração com a Profa. Dra. Katia Regina Perez,
da Universidade Federal de São Paulo, e a Profa. Dra. Iolanda Midea Cuccovia, do Instituto
de Química da Universidade de São Paulo, vesículas lipossomais contendo clodronato,
seguindo o protocolo tradicionalmente descrito na literatura [52]. Para descartar qualquer
35
influência que os lipossomas pudessem ter sobre os macrófagos, produziram-se também
lipossomas brancos (LB), i.e., sem a droga, para serem administrados ao grupo controle.
Estabeleceu-se um esquema de administração em quatro doses de 50 mg/kg: a
primeira, aplicada dois dias antes de se introduzir a REA, e as outras três, em intervalos de
três dias (Figura 5).
De forma que se trabalhou, nesse segundo momento, com cinco grupos experimentais,
cada qual com cinco camundongos C57BL/6 machos, datando oito semanas, e pesando entre
20 e 25 g: (1) grupo controle (Ctrl), alimentado com RC, gavado diariamente com PBS, e
recebendo LB por via IP, (2) grupo adenina (Ad), alimentado com REA, gavado diariamente
com PBS, e recebendo LB por via IP, (3) grupo adenina mais metformina (Ad+Met),
alimentado com REA, gavado diariamente com metformina, e recebendo LB por via IP, (4)
grupo adenina mais clodronato (Ad+Clo), alimentado com REA, gavado diariamente com
PBS, e recebendo CEL por via IP, e (5) grupo adenina mais metformina e clodronato
(Ad+Met+Clo), alimentado com REA, gavado diariamente com metformina, e recebendo
CEL por via IP.
No dia do sacrifício, os animais foram anestesiados com Quetamina-Xilazina e
eutanasiados por exsanguinação. Foram coletados sangue para dosagem de ureia e creatinina
séricas, e tecido renal para realização posterior de WB e RT-PCR.
3.1.4 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em linfócitos T CD4
Para se trabalhar com camundongos em que a AMPK estivesse deletada
especificamente nos linfócitos T CD4, procedeu-se ao cruzamento de animais contendo a
sequência Cre sob o controle do promotor do gene do cluster de diferenciação 4 (CD4), com
animais contendo o gene Prkaa1 ladeado pela sequência flox.
Os cruzamentos foram efetuados até se conseguir homozigosidade. Os animais foram
genotipados conforme protocolo recomendado pela The Jackson Laboratory (JAX, Bar
Harbor, ME, USA). Os genes mutados foram amplificados usando a seguinte sequência de
primers recomendada pela JAX: cre genérico – forward: 5’ GCG GTC TGG CAG TAA AAA
CTA TC 3’, reverse: 5’ GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT 3’; Prkaa – forward: 5’
CCC ACC ATC ACT CCA TCT CT 3’, reverse: 5’ AGC CTG CTT GGC ACA CTT AT 3’
(Figura 6).
Desenvolveu-se um experimento com vinte e três camundongos CD4-cre
AMPKflox/flox
, dez machos e treze fêmeas, datando de oito semanas, e pesando entre 20 e 25g.
36
Distribuíram-se os animais em dois grupos, um recebendo REA (grupo Ad, N=14, dos quais 6
AMPK-/-
e 8 AMPK+/+
), e outro, RC (grupo Ctrl, N=9, dos quais quais 6 AMPK-/-
e 3
AMPK+/+
).
Figura 6 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para Prkaa.
O gene mutante tem peso molecular de 450 kDa, enquanto o selvagem, de 334kDa. B – branco, Mut – controle
para o gene mutado, WT – controle para o gene selvagem. Fonte: autoria própria.
O experimento teve duração de dez dias, sendo marcado como dia zero aquele em que
se iniciou a alimentação com REA. Os camundongos tiveram seu peso aferido em dias
alternados. No décimo dia, os animais foram anestesiados com quetamina-xilazina e
eutanasiados por exsanguinação. Foram coletados sangue para dosagem de ureia e creatinina
séricas, e linfonodos renais para citometria de fluxo.
3.1.5 Avaliação da função renal através da quantificação de creatinina e ureia no soro
As dosagens de ureia e creatinina séricas foram efetuadas por método colorimétrico
(Labtest, São Paulo, Brasil), seguindo protocolo fornecido pelo fabricante. O sangue dos
camundongos foi centrifugado por 10 min a 10 mil rpm para separar o soro da fase sólida. Na
sequência, o soro foi desproteinizado através de uma solução de 40 μL de ácido sulfúrico
1,84% + 40 μL de tungstato de sódio 10% + 80 μL de água destilada, totalizando 160 μL da
solução a ser acrescida para cada 40 μL de amostra. A mistura soro mais solução
desproteinizante foi centrifugada por 10 min a 12 mil rpm e, então, o conteúdo
desproteinizado foi separado em um eppendorf para cada amostra.
37
Para a dosagem de creatinina, acrescentou-se uma solução de 40 μL de ácido pícrico
mais 10 μL de hidróxido de sódio (NaOH) para cada 100 μL de soro desproteinizado.
Utilizou-se como controle positivo uma amostra padrão cuja concentração de creatinina era
previamente conhecida (5,0 mg/mL). O padrão sofreu diluições seriadas, originando uma
curva de concentração nos valores de 5,0 mg/mL; 2,5 mg/mL; 1,25 mg/mL; 0,675 mg/mL;
0,33 mg/mL; e 0,16 mg/mL. Utilizou-se como controle negativo água destilada. Da mesma
forma que nas amostras, aos controles foi acrescentada a solução de ácido pícrico mais
NaOH.
A seguir, o conteúdo foi transferido a uma placa de Elisa de fundo chato. A
absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 520 nm, foi registrada através do
aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) acoplado ao software Gen5™
(BioTek, VT, USA). As concentrações de creatinina sérica (Cr) foram estabelecidas através
da equação obtida ao se calcular o coeficiente de determinação R2 da curva de diluição do
padrão.
Para a dosagem de ureia, acrescentou-se, para cada 25 μL de soro desproteinizado,
uma solução composta de 500 μL de urease tamponada. Aqueceu-se a mistura em banho-
maria, a 37OC, por 5 min. Na sequência, adicionaram-se 500 μL de oxidante de uso a cada
amostra, e foram novamente aquecidas em banho-maria, a 37OC, por 5 min.
Transferiram-se 200 μL do conteúdo por poço de placa de Elisa de fundo chato.
Utilizou-se como controle positivo uma amostra padrão de ureia cuja concentração era
previamente conhecida (70 mg/mL), e como controle negativo água destilada. A absorbância
das amostras, medida no comprimento de onda 620 nm, foi registrada através do aparelho
Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) acoplado ao software Gen5™
(BioTek, VT, USA). O cálculo das concentrações de ureia sérica (Ur) foi realizado em
comparação ao padrão, seguindo a fórmula Ur = absorbância da amostra x 70/absorbância do
padrão.
3.1.6 Avaliação histológica do parênquima renal
Fragmentos de parênquima renal foram fixados em formaldeído 4% logo a seguir da
sua extração. O material foi enviado ao Laboratório de Histotecnologia do Instituto de
Ciências Biomédicas IV, o qual processou as amostras, dando origem a cortes histológicos
para os seguintes propósitos: (I) coloração com hematoxilina-eosina (H&E), (II) coloração
38
com Picrosirius Red, e (III) coloração imunoistoquímica (IHQ) tendo como anticorpo
primário a anti-actina alfa do músculo liso (αSMA, 1:600 abcam, MA, USA).
A avaliação do escore de severidade da lesão tubular, efetuada pela Profa. Dra. Denise
Malheiros se embasou nas lâminas coradas com H&E. Aquelas coradas com Picrosirius, por
sua vez, se prestaram para avaliar o grau de fibrose.
No que concerne à IHQ, seguiu-se o seguinte protocolo: inicialmente, procedeu-se à
desparafinização e reidratação dos tecidos. Na sequência, pré-trataram-se os tecidos para a
recuperação antigênica. Para tal, aqueceram-se as amostras em banho-maria por 30 min, a
96oC. Elas foram então colocadas em câmara escura com o tampão de recuperação
Tris/EDTA pH 9,0 (Dako, Glostrup, Dinamarca), deixando-se resfriar em temperatura
ambiente por 20 min. Lavou-se, em seguida, com água destilada.
Realizou-se então o bloqueio da peroxidase endógena. Preparou-se peróxido de
hidrogênio (H2O2) 10 volumes (3%), acrescentando-se 10 mL de H2O2 a 90 mL de água
destilada. Incubaram-se as amostras com H2O2 3% por 15 min, em temperatura ambiente.
Lavou-se, em seguida, com água destilada. Depois, as amostras ficaram mergulhadas no
tampão de lavagem Tris-Buffered Saline (TBS) pH 7,6 (Dako, Glostrup, Dinamarca), por
5min, ao fim dos quais removeu-se o excesso do tampão.
Procedeu-se então ao bloqueio de ligações inespecíficas. Gotejou-se o reagente Protein
Block (Dako, Glostrup, Dinamarca) sobre os cortes histológicos, e deixou-se em câmara
escura em temperatura ambiente, por 20 min, ao término dos quais removeu-se o excesso.
Acrescentou-se então o anticorpo primário, deixando-se as amostras incubadas em
temperatura ambiente, em câmara escura, por 1h, após o que se lavaram as lâminas com TBS
pH 7,6 (Dako, Glostrup, Dinamarca). A seguir, removeu-se o excesso de tampão e aplicou-se
o reagente polímero sobre as amostras, incubando-se em temperatura ambiente, em câmara
escura, por 30 min, ao término dos quais se lavaram as lâminas com TBS pH 7,6 (Dako,
Glostrup, Dinamarca).
Para revelar a reação, incubaram-se as amostras com Liquid DAB+ (Dako, Glostrup,
Dinamarca) por 5 min, em temperatura ambiente, lavando-se em seguida com água corrente.
As lâminas foram contracoradas com hematoxilina e lavadas em água corrente. Acrescentou-
se água amoniacal e lavaram-se novamente as lâminas em água corrente. Por fim, estas foram
desidratadas através de passagem por bateria de alcoóis e xilois.
39
3.1.7 Avaliação de expressão gênica em tecido renal por RT-PCR
Obteve-se RNA de fragmentos de parênquima renal, adotando-se o seguinte protocolo
de extração: triturou-se, com o auxílio de beads de óxido de zircônio (Bertin Corp, Rockville,
MD, USA), o tecido renal acrescido de 500 μL de TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, USA), no homogeneizador Precellys™ (Bertin Corp, Rockville, MD, USA).
À solução resultante adicionaram-se 400 μL de clorofórmio, centrifugando-se a seguir
a 13 mil rpm por 15min. O sobrenadante, de aspecto cristalino, foi coletado, e a ele se
adicionou 500 μL de isopropanol. Procedeu-se à centrifugação a 13 mil rpm por 10 min.
Descartou-se o sobrenadante, e realizaram-se três lavagens do pellet resultante com álcool
75%. Aguardou-se o pellet secar em temperatura ambiente, e diluiu-se o produto resultante
em 80 μL de água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1%.
Na sequência, sintetizou-se cDNA a partir do RNA, obedecendo os passos descritos:
calculou-se o volume por amostra para se alcançar uma concentração alvo de 1500 ng/μL de
RNA. A este, adicionou-se água ultrapura DEPC até se atingir o volume final de 21,5 μL.
Acrescentaram-se então 2,5 μL de RNase-free DNase buffer 10x (Promega, Madison,
WI, USA) e 1,0 μL de RNase-free DNase (Promega, Madison, WI, USA). Selecionou-se, no
termociclador (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), o programa padronizado para favorecer a
lise de DNA. A seguir, adicionou-se 1,0 μL de oligo(dT), um primer específico para mRNA,
e selecionou-se no termociclador o programa padronizado para o anelamento.
Por fim, acrescentou-se a cada amostra uma mistura composta de 1μL de BSA (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2μL de M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison,
WI, USA), 10 μL de M-MLV 5x buffer (Promega, Madison, WI, USA), e 10 μL de dNTP mix
(Promega, Madison, WI, USA), a qual foi deixada incubando a 42 oC por 60 min, seguidos de
70 oC por 10 min.
Uma vez de posse do cDNA, efetuaram-se as reações em cadeia da polimerase em
tempo real no aparelho QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher
Scientific Inc., Waltham, MA, USA), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.
Os primers para os genes testados foram: beta-actina (5’ AA AAC GCA GCT CAG TAA
CAG TC), Havcr/KIM-1 (Mm00506686_M1), TNF-α (5’ TGG GAG TAG ACA AGG TAC
AAC CC 3’), IL-6 (5’ AG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CCT 3’), TGF-β (5’AA CTA
TTG CTT CAG CTC CAC AGA GA 3’), e colágeno I (5’ TGG CCA AGA AGA CAT CCC
TGA AGT 3’). A quantificação relativa dos genes foi determinada através do método de
40
comparação do limiar cíclico (deltaCT ou 2-ΔΔCT
), e expressa graficamente em escala
logarítmica para permitir que fossem agrupados valores dos diferentes experimentos
efetuados em repetição.
3.1.8 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por western blotting
A avaliação da expressão de proteínas no parênquima renal, por método de western
blotting, seguiu o protocolo detalhado adiante: aproximadamente 50 μg de proteína total
foram diluídas em tampão de amostra (BioRad Laboratories, CA, USA), contendo 20 mg/mL
de 2-β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, MO, USA). As proteínas foram desnaturadas por
aquecimento de 5 minutos a 95 °C, sendo a seguir separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida 10%. Posteriormente, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose, sendo esta bloqueada durante 1 hora com leite 5% dissolvido em TBS-T e, a
seguir, incubada com o anticorpo primário diluído em TBS-T.
Os anticorpos primários utilizados foram contra pAMPK e αSMA (1:1.000 Cell
Signaling Technology, MA, USA) e β-actina (1:10.000 Sigma-Aldrich, MO, USA). Na
sequência, a membrana foi lavada com TBS-T e incubada por 1 hora com o anticorpo
secundário biotinilado: anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) para pAMPK, e
anti-mouse (Cell Signaling Technology, MA, USA) para beta-actina e αSMA. A massa
molecular das proteínas foi determinada por comparação com a migração das proteínas
padrão Rainbow (BioRad Laboratories, CA, USA).
3.1.9 Análise do infiltrado inflamatório e ativação celular no rim por citometria de fluxo
Fragmentos de tecido renal foram imersos em solução de colagenase IV (Sigma-
Aldrich, MO, USA), 2 mg/ml em PBS, e aquecidos a 37 oC por 30 min. O homogenato
resultante foi filtrado em cell strainers (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)
com poros de 100 μm, e a solução foi submetida a gradiente de Percoll® (Sigma-Aldrich,
MO, USA) para purificação dos leucócitos.
As células foram marcadas com anticorpos monoclonais para análise da marcação das
moléculas de superfície de linfócitos (CD45, CD3, CD4, CD8, CD69), de macrófagos (CD45,
CD11b, CD11c, F4/80, CD86, CD206), de células dendríticas (MHC classe II), e de
viabilidade celular (Live&Dead) (1:200, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). As
41
amostras foram processadas no aparelho FACSCanto, utilizando-se o software FACSDIVA
(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), e analisadas com o software FlowJo (Tree Star,
San Carlo, CA).
3.2 Experimento in vitro
3.2.1 Cultura de células tubulares renais
Cultivou-se uma linhagem epitelial de túbulo proximal renal murino, MM55.K
(American Type Culture Collection - ATCC, Manassas, VA, USA), em meio DMEM high
glucose (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), acrescido de PBS 10% e
penicilina-estreptomicina 1%. As células foram deixadas em estufa, com oferta contínua de
gás carbônico a 5%, e temperatura estável em 37 C.
Após constatados o crescimento e adesão das colônias de células em garrafas de
cultura de 75 cm2, procedeu-se à sua tripsinização, contagem em câmara de Neubauer, e
transferência de cerca de 500 mil células por poço para placas de 6, 12 e 24 wells.
3.2.2 Ensaio de viabilidade celular
Em placas de seis wells, as células, após atingirem plena confluência, foram
estimuladas por Met 20 mM (Merck Millipore Corporation, Darmstadt, Alemanha), ou pela
molécula inibitória de AMPK composto C 10 μM (Merck Millipore Corporation, Darmstadt,
Alemanha), por 2 horas, durante as quais a placa foi mantida em estufa a 37 C.
Em seguida, realizou-se um ensaio de viabilidade para verificar se as drogas, na
concentração administrada, induziam significativamente morte celular. Utilizaram-se células
não estimuladas como controle.
O ensaio realizado foi o MTT assay (Sigma-Aldrich, MO, USA), no qual o marcador
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, na concentração de 5mg/mL,
foi adicionado aos poços e, duas horas após incubação, verificou-se a mudança de coloração
de amarelo para roxo.
A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 570 nm, foi registrada
através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) e calculada através
do software Gen5™ (BioTek, VT, USA).
42
3.2.3 Avaliação da indução de AMPK por metformina
Visando identificar o intervalo de tempo após o qual a expressão da molécula de
AMPK ativada (fosforilada) era máxima após a adição de Met ao meio, as células foram
incubadas com Met 20 mM por 2, 4, 6 e 24 horas.
Ao fim do período de incubação, as células foram lisadas com o tampão de extração de
proteínas RIPA (Sigma-Aldrich, MO, USA), e realizou-se o WB. Aproximadamente 30 μg de
proteína total foram diluídas em tampão de amostra (BioRad Laboratories, CA, USA),
contendo 20 mg/mL de 2-β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, MO, USA).
As proteínas foram desnaturadas por aquecimento de 5 minutos a 95 °C, sendo a
seguir separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 10%. Posteriormente, as proteínas
foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, sendo esta bloqueada durante 1 hora
com leite 5% dissolvido em TBS-T e, a seguir, incubada com o anticorpo primário diluído em
TBS-T.
Utilizaram-se como anticorpos primários p-AMPK (1:1.000 Cell Signaling
Technology, MA, USA) e β-actina (1:10.000 Sigma-Aldrich, MO, USA), e como anticorpos
secundários anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) para pAMPK, e anti-mouse
(Cell Signaling Technology, MA, USA) para beta-actina. A massa molecular das proteínas foi
determinada por comparação com a migração das proteínas padrão Rainbow (BioRad
Laboratories, CA, USA).
3.2.4 Avaliação da influência da AMPK sobre a captação de glicose
Em placas de 24 wells, as células, após atingirem plena confluência, foram
estimuladas por Met 20 mM, ou por composto C 10 μM, por 2 horas. A seguir, adicionou-se
TGF-beta 10 ng/mL, deixando-o agir por 24h. Ao fim desse período, substituiu-se o meio
DMEM high glucose por um meio composto por PBS, vitaminas 1%, aminoácidos não
essenciais 1%, piruvato 1%, e L-glutamina 1%, deixando, pois, as células em jejum.
Após meia hora, acrescentou-se 2-nitro-benzoxa-diazol-deóxiglicose (2-nbdg) 50μM
conjugada ao fluoróforo FITC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
Aguardou-se que as células, ávidas por glicose após o período de deprivação, internalizassem
a glicose marcada por 30 min. Logo a seguir, fez-se a leitura no citômetro FACSCanto,
utilizando-se o software FACSDIVA (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Os
resultados foram analisados com o software FlowJo (Tree Star, San Carlo, CA).
43
3.2.5 Avaliação da influência da AMPK sobre a transição epitélio-mesênquima
Em placas de 12 wells, as células, após atingirem plena confluência, foram
estimuladas pela molécula ativadora de AMPK Met 20 mM, ou pela molécula inibitória de
AMPK composto C 2 mM/mL, por 2 horas. A seguir, adicionou-se TGF-β 10 ng/mL,
deixando-o agir por 24 horas. Durante todo o tempo as placas permaneceram em estufa a 37
C com CO2 5% (Figura 7).
Figura 7 - Esquema representativo do cultivo de células tubulares epiteliais renais
murinas, linhagem MM55.K.
As células foram plaqueadas em poços de 12 wells e estimuladas com metformina 20 mM (Met), composto C 10
μM (CompC), e/ou TGF-beta 10 ng/mL (TGFβ) por 24h. Células não estimuladas (NS) foram utilizadas como
controle. Fonte: autoria própria.
Ao fim do período de incubação, as células foram lisadas com o tampão de extração de
proteínas RIPA (Sigma-Aldrich, M , USA) e conservadas a -80 C para posterior realização
de WB. Neste, utilizou-se como anticorpo primário a actina do músculo liso α (αSMA, 1:2000
abcam, MA, USA), e o transportador de glicose 2 (Glut2, 1:2000 abcam, MA, USA), e como
anticorpo secundário anti-mouse (Cell Signaling Technology, MA, USA). A massa molecular
das proteínas de interesse foi determinada por comparação com a migração das proteínas
padrão Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (ThermoFisher Scientific, MA,
USA).
44
3.2.6 Avaliação da via glicolítica pela dosagem de glicose e lactato
O sobrenadante dos poços contendo as células do experimento do subitem 3.2.5 foi
armazenado em eppendorf e congelado a -80 C, para subsequente mensuração dos níveis de
glicose e lactato.
Para a dosagem de glicose, acrescentaram-se 500 μL do reagente Glicose Liquiform
(Labtest, São Paulo, Brasil) a 5 μL de cada amostra, bem como a 5 μL de amostra padrão
(controle positivo), e a 5 μL de água destilada (controle negativo), deixando-se em banho-
maria a 37 C por 10 min.
A seguir, 100 μL de cada solução foram transferidos para poços de placa de Elisa de
fundo chato. A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 505 nm, foi
registrada através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA)
acoplado ao software Gen5™ (BioTek, VT, USA). cálculo das concentrações de glicose
(G) seguiu a fórmula G = absorbância da amostra x 100 / absorbância do padrão.
Para a dosagem de lactato, acrescentaram-se 400 μL do reagente Lactato Liquiform
(Labtest, São Paulo, Brasil) a 5 μL de cada amostra, bem como a 5 μL de amostra padrão
(controle positivo), e a 5 μL de água destilada (controle negativo), deixando-se em banho-
maria a 37 C por 5 min.
A seguir, 100 μL de cada solução foram transferidos para poços de placa de Elisa de
fundo chato. A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 550 nm, foi
registrada através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA)
acoplado ao software Gen5™ (BioTek, VT, USA). cálculo das concentrações de lactato (L)
seguiu a fórmula L = absorbância da amostra x 40 / absorbância do padrão.
3.3 Processamento de dados e análise estatística
Todas as variáveis numéricas foram tabuladas no software Microsoft Excel 2007. As
imagens de histologia e WB foram processadas para análise quantitativa através do software
ImageJ (Bethesda, MD, USA). Os dados foram apresentados em gráficos, mostrando média e
desvio padrão (DP), produzidos através do software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software,
CA, USA). Os testes t e ANOVA foram usados para comparar os dados. A análise estatística
foi realizada estabelecendo-se um intervalo de confiança de 95%, com p<0,05.
4 RESULTADOS
46
4.1 A metformina protege camundongos selvagens da NTI induzida por adenina
4.1.1 Parâmetros clínico-laboratoriais
Figura 8 - Parâmetros clínico-laboratoriais dos camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060
70
80
90
100
110
Ctrl
Met
Ad
Ad+Met
*
Peso
l (%
D0)
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
0
10
20
30
40
***
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D0-D
10 (
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Met A
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3
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400
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)
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1
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3
4
5
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8
9
10
***
Ure
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Ctrl
Met A
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1
2
3***
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2
3
4
***
Cre
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vers
us C
trl)
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
-1
0
1
2
3
4*
log
(2-
CTK
IM-1
)
Em (A variação percentual de peso em relação ao dia inicial do experimento (D0). Em (B), consumo diário de
ração. Em (C), ureia sérica, em valores absolutos e relativos ao controle. Em (D), creatinina sérica, em valores
absolutose relativos ao controle. Em (E), expressão gênica da kidney injury molecule 1 (KIM-1) em tecido renal.
A B
D
C
E
47
Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais
metformina, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Para avaliarmos a gravidade da lesão renal induzida por Ad em camundongos
C57BL/6, adotamos como parâmetros a perda de peso diário e os níveis séricos de ureia (Ur)
e creatinina (Cr) ao fim do experimento.
Os camundongos tratados com Met apresentaram menor perda ponderal do que os
não tratados (Figura 8A). A diferença da variação de peso entre os grupos Ad e Ad+Met
tornou-se pronunciada a partir do sexto dia do experimento (D6). Ao se calcular a variação de
peso entre o primeiro e o último dia do experimento (D0 e D10, respectivamente),
evidenciou-se que, enquanto o grupo Ad perdeu em média 31,4% do peso inicial, o grupo
Ad+Met perdeu somente cerca de 24,6% do peso inicial (p<0,0001).
Figura 9 - Peso renal e histologia dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por
adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et0
2
4
6
8
10***
Peso
do
rim
(m
g)
/
Peso
co
rpo
ral (g
)
Em (A), peso do rim normalizado pelo peso corporal total. Em (B), número de cristais (gráfico à esquerda) e de
granulomas (gráfico àdireita) por campo de grande aumento (high power field - HPF). Em (C), fotomicrografias
de tecido renal (aumento de 100x). A imagem é uma sobreposição das fotos tiradas sob luz clara e sob luz
polarizada, para evidenciar os cristais de adenina (estruturas arredondadas refringentes). Ctrl – grupo controle,
Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05,
***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
C
B A
Ctrl Met Ad Ad+Met0
2
4
6
8 *
Cri
sta
is/H
PF
Ctrl Met Ad Ad+Met0
1
2*
Gra
nu
lom
as/H
PF
Ad Ad+Met
48
A menor perda de peso observada no grupo Ad+Met não foi resultado de diferença
na quantidade de ração ingerida em relação ao grupo Ad (Figura 8B), o que vem a reforçar a
suposição de que a droga esteja agindo de modo a atenuar o processo inflamatório e a
liberação de citocinas com efeito catabólico, responsáveis pela caquexia.
A função renal do grupo tratado, ao término do experimento, encontrava-se também
marcadamente menos deteriorada do que aquela do grupo não tratado, como pode ser
constatado pelo nível sérico de escórias nitrogenadas (Figuras 8C-D). A KIM-1 se mostrou
expressivamente aumentada nos rins dos grupos Ad e Ad+Met em relação ao Ctrl; esse
aumento, contudo, foi menor no Ad+Met comparativamente ao Ad (p<0,05, Figura 8E).
4.1.2 Parâmetros histomorfológicos
Verificou-se, de forma consistente nos três experimentos efetuados, que os rins do
grupo Ad+Met eram maiores que os de todos os demais grupos. A pesagem confirmou a
avaliação visual, e a normalização do peso dos rins pelo peso corporal total permitiu
estabelecer o fato categoricamente (Figura 9A). Esse aumento foi atribuído ao maior número
de cristais no grupo tratado (Figura 9B). Ainda, os rins do grupo Ad+Met se mostraram com
menor distorção arquitetural e dilatação tubular do que os do grupo Ad (Figura 9C).
Empregamos o marcador imunoistoquímico da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS), associada a MØ de perfil M1 [53], para caracterizar os MØ envolvidos na formação
dos granulomas (Figura 10). Nos cortes de tecido renal do grupo Ad+Met, houve apenas
coloração difusa nas células tubulares, que também expressam a enzima em resposta ao stress
inflamatório [54,55].
Já nos cortes do grupo Ad, foi perceptível uma intensa coloração marcando os MØ
em proximidade com os cristais no interstício, representando granulomas incipientes, ainda
em organização (setas brancas, Figura 10A). Por outro lado, os granulomas bem formados, já
maduros, apresentavam marcação mais pontual, restrita tão somente às células posicionadas
no entorno dos cristais (seta preta, Figura 10A).
Esta avaliação preliminar conferida pela histologia apresenta, no entanto, importantes
limitações: a coloração imunoistoquímica de que dispomos só permite visualizar um único
marcador de polarização por corte de tecido, inviabilizando a avaliação simultânea de
marcadores para M1 e M2 no mesmo corte; e a intensidade do marcador só oferece uma
informação semi-quantitativa da frequência do antígeno a que ele se liga [56-58]. Por estas
49
razões, recorreu-se à citometria de fluxo para uma apreciação mais pormenorizada dos tipos
celulares infiltrando os rins doentes.
Figura 10 - Marcação imunoistoquímica para iNOS nos rins dos camundongos C57BL/6
com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Em (A), fotomicrografia (aumento de 400x) de tecido renal do grupo Ad. A coloração intensa em marrom-escuro
corresponde às células marcadas para a enzima óxido nítrico sintetase induzida (iNOS). As pontas de seta ( )
apontam para os cristais de adenina dispersos no interstício. As setas brancas ( ) apontam para granulomas
em formação. A seta preta ( ) aponta para um granuloma maduro. Em (B), fotomicrografia (aumento de
400x) de tecido renal do grupo Ad+Met. Repare a existência apenas de coloração difusa nas células tubulares,
ressaltando a escassez de células fagocitando ativamente os cristais, sinalizados pelas pontas de seta seta ( ).
Em (C), controle negativo. Fonte: autoria própria.
C
A
B
50
4.1.3 Caracterização do infiltrado inflamatório
Uma vez estabelecido que a administração de Met confere benefício clínico na NTI,
buscou-se descrever os tipos celulares predominantemente envolvidos na lesão. Procuramos
detectar se a Met gerava diferenças no padrão de expressão de moléculas de superfície nos
MØ que apontassem para diferentes fenótipos, bem como se outras células da resposta
inflamatória local, a exemplo das células dendríticas ou dos LT, poderiam sofrer influência
dela (Figura 11).
Figura 11 - Estratégia de gating para caracterização do infiltrado leucocitário nos rins
dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Para se caracterizar as populações constituintes do infiltrado inflamatório no rim, a princípio se delimitaram os
singlets. Abriu-se então uma nova janela, e nesta se demarcou uma população que, pelo tamanho e
granulosidade, era composta preponderantemente de células, excluindo-se os debris. Para melhor se assegurar da
ausência de células mortas nas populações estudadas, utilizou-se o marcador Live&Dead conjugado com o
fluoróforo AmCyan, e só as células não coradas, e portanto, vivas, foram incluídas na análise. Fonte: autoria
própria.
Figura 12 - Frequência de células CD45+ nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina.
As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
0
20
40
60
80
****
CD
45 (
%)
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
51
Figura 13 - Caracterização da população de monócitos nos rins dos camundongos
C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl Met Ad Ad+Met0
10
20
30
40 **
ns
F4/8
0h
igh C
D11b
hig
h (
%)
Ctrl Met Ad Ad+Met0
5
10
15 *** ***
F4/8
0lo
w C
D11b
hig
h (
%)
As figuras e gráficos são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, **p<0,001, *** p<0,0001, ns – não
significativo. Fonte: autoria própria.
Figura 14 - Frequência da população CD45+ F4/80
high CD11b
high CD86+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
0
20
40
60
80
***
CD
45 F
4/8
0h
igh C
D11b
hig
h C
D86 (
%)
As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Percebeu-se um incremento na frequência de células positivas para CD45 no grupo
Ad, apontando para um maior aporte de leucócitos nos rins lesionados, frequência esta
significativamente menor no grupo Ad+Met (Figura 12).
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
52
Em relação aos monócitos, identificaram-se duas populações distintas: uma CD45+
F4/80high
CD11b high
, e outra CD45+ F4/80
low CD11b
high (Figura 13). A população CD45
+
F4/80high
CD11b high
estava proporcionalmente reduzida nos grupos Ad e Ad+Met em relação
ao Ctrl, enquanto que a população CD45+ F4/80
low CD11b
high apresentou significativo
aumento em Ad, em comparação tanto a Ad+Met quanto ao Ctrl.
Figura 15 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD206+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
0
20
40
60
80***
CD
45 F
4/8
0h
igh C
D11b
hig
h C
D206 (
%)
As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Figura 16 - Expressão gênica das citocinas IL-6, TNF-α e TGF-β nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
-2
-1
0
1
2
3 ***
ns
log
(2-
CTIL
-6)
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
-2
-1
0
1
2
3
*
log
(2-
CTT
NF
- )
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
*
ns
log
(2-
CTT
GF
- )
Em (A), expressão de IL-6. Em (B), expressão de TNF-α. Em (C), expressão de TGF-β. Ctrl – grupo controle,
Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, ns – não
significativo, *p<0,05, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
A frequência da população F4/80
high CD11b
high marcada com CD86 (também
conhecido por B7.2) foi significativamente mais elevada no grupo Ad+Met (Figura 14). Já a
frequência da população positiva para CD206 foi maior no grupo Ad (Figura 15).
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
A B C
53
Corroborando o achado da citometria de mais MØ M2 nos rins do grupo Ad,
observou-se que a expressão da citocina pró-fibrótica TGF-β estava mais elevada no grupo
Ad em relação ao Ctrl, aumento este não expressivo, contudo, no grupo Ad+Met (Figura
16C). As citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α, por sua vez, se encontraram elevadas no
grupo Ad em relação ao Ctrl, mas não no grupo Ad+Met em relação ao Ctrl (Figuras 16A-B)
Figura 17 - Frequência das populações CD45+ CD4+ e CD45+ CD8+ nos rins dos
camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et0
10
20
30
CD
45 C
D4 (
%)
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et0
5
10
15
CD
45 C
D8 (
%)
Em (A), LT CD4. Em (B), LT CD8. As figuras e gráficos são representativos de três experimentos Ctrl – grupo
controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Fonte:
autoria própria.
Investigamos se os efeitos da Met se estendiam a outras populações celulares, como
os LT e as células dendríticas. No que se refere ao infiltrado linfocitário, não se observou
aumento de células CD45+ CD4+ ou CD45+ CD8+ nos rins de camundongos que receberam
Ad em relação ao Ctrl (Figura 17). Constatou-se, por outro lado, uma frequência aumentada
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
Ctrl Met
Ad Ad+Met
Não marcado
A
B
54
de células CD45+ CD11c+ MHC classe II+ no grupo Ad em comparação ao Ad+Met (Figura
18).
Figura 18 - Frequência da população CD45+ CD11c MHCII nos rins dos camundongos
C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl
Ad
Ad+M
et0
10
20
30
40 *** *
CD
45 C
D11c M
HC
II (
%)
As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina,
Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.
4.1.4 Análise de marcadores de fibrose
Finalizada a caracterização da inflamação ocorrida no parênquima renal em nosso
modelo de DRC, partimos para a análise do estágio que a sucede, a fibrose. Para tal, utilizou-
se da coloração IHQ para αSMA, valendo-se do princípio de que esta isoforma de actina é
expressa principalmente (embora não exclusivamente) por miofibroblastos.
Apesar de também poder ser identificada em células musculares lisas endoteliais, das
quais deriva seu nome, e em pericitos (ambos tipos celulares de origem mesenquimal), a
marcação positiva para αSMA permanece ainda como o método mais amplamente empregado
e mais bem validado para detectar miofibroblastos em cortes histológicos [59,60].
O percentual de área corada no grupo Ad foi de aproximadamente 8%,
significativamente maior do que os 0,65% no grupo Ad+Met (p<0,0001), que apresentou
frequência equivalente ao grupo Ctrl, com 0,69%. O western blot corroborou esses dados
(Figura 19).
Ctrl
Ad Ad+Met
Não marcado
55
Figura 19 - Avaliação da transição epitélio-mesenquimal, através da expressão de
αSMA, nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina.
Ctrl Met Ad Ad+Met
0
2
4
6
8
10
***
S
MA
(%
áre
a c
ora
da)
Ctrl Met Ad Ad+Met0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
***
S
MA
/ acti
na
Em (A), fotomicrografias de tecido renal (aumento de 200x). Para fins de cálculo, foram tiradas três fotos cada
de três lâminas por grupo. Em (B), western blotting para αSMA. Ctrl – grupo controle, Met – grupo
metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, ***p<0,0001. Fonte: autoria
própria.
A
B
β-actina
α-SMA
()
Controle negativo
Ctrl Met Ad Ad+Met
(42kDa)
() (42kDa)
()
56
Figura 20 - Expressão de colágeno nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl Met Ad Ad+Met0
20
40
60
***
% Á
rea c
ora
da
Ctrl
Met A
d
Ad+M
et
-1
0
1
2
3
*
log
(2-
CTco
lág
en
o I
) ***
Em (A), fotomicrografias de tecido renal (aumento de 200x); foi feita uma sobreposição das imagens adquiridas
sob luz branca e sob luz polarizada. Em (B), representação gráfica do percentual de área corada por Picrosirius
red. Para fins de cálculo, foram tiradas três fotos cada de três lâminas por grupo. Em (C), gráfico da expressão de
colágeno I no tecido renal, avaliada por técnica de RT-PCR. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Com o objetivo de comparar quantitativamente o grau de fibrose entre os grupos,
lançou-se mão da coloração por Picrosirius red, que marca as fibras de colágeno presentes no
tecido. Sob luz branca, o colágeno aparece com coloração avermelhada, enquanto que, sob luz
polarizada, ele é visualizado nas cores vermelho, amarelo e verde [61,62].
Observamos que, enquanto os grupos Ctrl e Met apresentaram uma área corada de
apenas cerca de 13%, o grupo Ad apresentou aproximadamente 50% da área de cada corte
corada, significativamente maior que aquela do grupo Ad+Met, com 28% (p<0,0001, Figura
20A-B). A expressão de colágeno I nas células renais, avaliada por método de RT-PCR,
também demonstrou aumento inequívoco no grupo Ad, tendo sido, de outra parte,
notavelmente menor no grupo Ad+Met (Figura 20C).
A
B C
Ad Ad+Met
Ctrl Met
57
Visando-se comprovar que a Met exercia seus efeitos benéficos na NTI através da
ativação da via da AMPK, compararam-se as densidades da banda da molécula fosforilada
(pAMPK) entre os grupos (Figura 21). Observa-se claramente que a Met induz a fosforilação
da quinase no tecido renal, ao se comparar os grupos Ctrl e Met. A lesão causada por Ad leva
à sua redução, e o tratamento com Met restabelece para níveis similares ao grupo controle.
Figura 21 - Expressão de pAMPK em tecido renal de camundongos C57BL/6 com NTI
induzida por adenina, e tratados com metformina.
Ctrl Met Ad Ad+Met0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
***
**
pA
MP
K/
acti
na
As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,
Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria
própria.
Figura 22 - Gravidade clínica da NTI em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060
70
80
90
100
110
Ctrl AMPK+/+
Ad AMPK+/+
Ctrl AMPK-/-
Ad AMPK-/-
Dia
Peso
(%
D1)
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
Cre
ati
nin
a (
mg
/dL
)
ns
******
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
100
200
300
Ure
ia (
mg
/dL
)
******
ns
Em (A), curva da variação percentual de peso diária. Em (B), creatinina sérica. Em (C), ureia sérica. Ctrl - grupo
controle, Ad - grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-
-
camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte:
autoria própria.
β-actina
pAMPK
Ctrl Met Ad Ad+Met
(42kDa)
()
(62kDa)
()
A B C
58
4.2 O efeito da metformina sobre a polarização dos MØ é dependente de AMPK
O western blot tem o inconveniente de demonstrar o panorama geral do que ocorre
com a AMPK no tecido renal como um todo, não especificando as alterações ocorridas na
expressão da quinase em cada uma das populações celulares relacionadas com a
fisiopatogenia da NTI. Assim, com vistas a esmiuçar o seu papel nos macrófagos, que se
destacaram, no experimento anterior, como o principal alvo da ação nefroprotetora da Met,
aplicamos o mesmo desenho experimental em camundongos com deleção seletiva de AMPK
em macrófagos, isto é, LyzM-cre AMPKflox/flox
.
Figura 23 - Caracterização dos M de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
Em (A), western blot para AMPK1 em macrófagos intraperitoneais de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
.
Em (B), estratégia de gating no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI. Inicialmente,
restringiu-se o gate com vistas a excluir possíveis debris. A seguir, selecionou-se apenas a população positiva
para CD45. Dentro desta, abriu-se um gate com os marcadores F4/80 e CD11b. Dentro da população CD45+
F4/80low
CD11bhigh
, marcou-se a subpopulação positiva para Ly6c, enquanto a população CD45+
F4/80high
CD11b high
foi caracterizada com os marcadores CD86 e CD206. Fonte: autoria própria.
Em um primeiro momento, comparamos a intensidade da lesão renal entre os
camundongos AMPK+/+
e AMPK-/-
. Como pode ser verificado na Figura 22, não houve
qualquer diferença aparente nos parâmetros clínicos analisados. No intento de detectar
diferenças sutis no padrão de resposta dos macrófagos à lesão renal, realizamos ainda
citometria de fluxo (Figura 23).
A
B
AMPK-/-AMPK+/+
AMPKα1(62kDa)
β-actina(42kDa)
59
Figura 24 - Frequência da população CD45+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre
AMPKflox/flox
com NTI.
Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK
+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não
significativo. Fonte: autoria própria.
Houve um aumento na frequência de células positivas para CD45, indicando maior
aporte de leucócitos nos grupos adenina em relação aos controles, sem distinção, contudo,
entre os grupos AMPK+/+
e AMPK-/-
(Figura 24). Mimetizando o já verificado nos
camundongos C57BL/6, duas populações foram identificadas com os marcadores F4/80 e
CD11b: uma CD45+
F4/80high
CD11b high
, e outra CD45+ F4/80
low CD11b
high (Figura 25).
Figura 25 - Distribuição das células CD45+ F4/80 CD11b no tecido renal de
camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK
+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001,
***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.
60
Figura 26 - Frequência da população CD45+ F4/80low
CD11bhigh
Ly6C+ no tecido renal
de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK
+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001, ns – não
significativo. Fonte: autoria própria.
Figura 27 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD86+ no tecido renal
de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK
+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, ns – não significativo.
Fonte: autoria própria.
A população duplo-positiva se encontrava reduzida uniformemente em ambos os
grupos Ad, independentemente da presença ou ausência de AMPK, enquanto a CD11bhigh
se
mostrou enriquecida. Para corroborar nossa suposição, previamente discutida, de que essa
61
segunda população possivelmente representasse os monócitos infiltrantes, aplicamos o
marcador Ly6c dentro do gate (Figura 26). Houve um incremento, nos grupos Ad, da
população CD45+ F4/80
low CD11b
high Ly6C
high em relação ao controle, sem diferença entre os
grupos AMPK+/+
e AMPK-/-
.
O marcador de M1 CD86 e o marcador de M2 CD206 foram utilizados para
caracterizar a população duplo-positiva (Figuras 27 e 28). A frequência de ambos se mostrou
aumentada nos grupos Ad em comparação aos Ctrl, mas, mais uma vez, sem distinção entre
os camundongos AMPK+/+
e AMPK-/-
.
Figura 28 - Frequência da população CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD206+ no tecido renal
de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK
+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não
significativo. Fonte: autoria própria.
À semelhança do verificado nos camundongos C57BL/6, notamos um aumento do
marcador de miofibroblasto αSMA no tecido renal em relação aos controles (Figura 29A), o
que veio acompanhado, conforme previsto, de maior deposição de matriz colágena, avaliada
por meio da coloração histológica com Picrosirius red (Figura 29B).
Correlacionamos a acentuação da fibrose com a maior expansão intersticial e dilatação
tubular observadas nos camundongos AMPK-/-
(Figura 30). De forma notável, o número e o
tamanho dos granulomas desse grupo se mostraram superiores aos dos camundongos
AMPK+/+
. A marcação imunoistoquímica para CD11b ratificou que o tipo celular
predominando em sua composição foram os macrófagos (Figura 31).
62
Ctrl
Ad A
MPK
+/+
Ad A
MPK-/-
0
5
10
15
20
25
30
Sir
ius
re
d (%
áre
a c
ora
da
) **
Figura 29 - Fibrose renal em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2 ****
***
S
MA
/ acti
na
Em (A), expressão de αSMA em rim, quantificada por western blotting e imunoistoquímica (fotomicrografias
com aumento de 100x). Em (B), marcação de colágeno com Picrosirius red. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo
adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-
- camundongos com AMPK
seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
A
B Ad AMPK+/+
Ad AMPK-/-
Ctrl
Ad AMPK+/+
Ad AMPK-/-
Ctrl
63
Figura 30 - Histologia dos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI.
Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado com hematoxilina-eosina, dos grupos (A) controle -
Ctrl, (B) adenina nos camundongos com AMPK mantida nos macrófagos - Ad AMPK+/+
e (C) adenina nos
camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos - Ad AMPK-/-
. As pontas de seta brancas ( )
apontam para cristais de adenina no interstício. As setas brancas ( ) apontam para granulomas gigantes no
córtex renal. As pontas de seta pretas ( ) apontam cristais de adenina dentro do granuloma. Em (D),
quantificação de cristais e granulomas por campo de grande aumento (HPF – 400x). Fonte: autoria própria.
A B
C
Ad AMPK+/+
Ad AMPK-/-
Ctrl
Ctrl A
MPK
+/+ +/
+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
20
40
60
Cri
sta
is/H
PF
D
64
Figura 31 - Coloração imunoistoquímica para CD11b nos rins de camundongos LyzM-
cre AMPKflox/flox
com NTI.
A ausência de AMPK, embora tenha resultado em piora histológica, não se traduziu
em piora clínica. Empregamos, então, mais uma vez a Met para ativar a via da quinase. Não
se percebeu melhora nos camundongos AMPK-/-
(Figura 32), enquanto que os AMPK+/+
se
comportaram como os C57BL/6, apresentando menor deterioração da função renal e perda de
peso menos pronunciada (Figura 33).
A histologia correspondeu aos achados clínicos: os rins dos camundongos AMPK-/-
tratados com Met se mostraram com estrutura bem mais deteriorada do que aqueles dos
camundongos AMPK+/+
que também receberam a droga (Figura 34). Para averiguar quais
mudanças nos Mϕ que proporcionaram esses resultados, realizamos citometria de fluxo com o
mesmo delineamento já especificado na figura 23.
O marcador de M1 CD86 se encontrava elevado em ambos os grupos Ad tratados com
Met relativamente aos não tratados. Esse aumento foi, contudo, notavelmente superior nos
AMPK+/+
AMPK-/-
Con
trole
A
den
ina
Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal marcado com o anticorpo contra monócitos anti-CD11b.
Repare que, nos grupos adenina, os monócitos ficam agregados ao redor dos cristais de adenina, formando
granulomas. Fonte: autoria própria.
65
camundongos AMPK-/-
. Por outro lado, o marcador de M2 CD206 se elevou
significativamente nos camundongos AMPK+/+
tratados, o mesmo não se verificando nos
AMPK-/-
(Figura 35).
Figura 32 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK-/-
tratados com
metformina.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1065
75
85
95
105
Ctrl AMPK-/-
Ad AMPK-/-
Ad+Met AMPK-/-
Dia
Peso
(%
D1)
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
-/-
Ad+M
et A
MPK
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5***
ns
Cre
ati
nin
a (
mg
/dL
)
Em (A), evolução da perda diária de peso, em termos percentuais do primeiro dia do experimento. Em (B),
creatinina sérica. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente
deletada nos macrófagos, **p<0,001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.
Figura 33 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK+/+
tratados com
metformina.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060
70
80
90
100
110
Ctrl AMPK+/+
Ad AMPK+/+
Ad+Met AMPK+/+
*
Dia
Peso
(%
D1)
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK+/+
Ad+M
et A
MPK+/
+
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
*****
ns
Cre
ati
nin
e (
mg
/dL
)
Em (A), evolução da perda diária de peso, em termos percentuais do primeiro dia do experimento. Em (B),
creatinina sérica. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos
macrófagos,***p<0,0001, **p<0,001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.
A B
A B
66
Figura 34 - Histologia dos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI
tratados com metformina.
Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado com hematoxilina-eosina. AMPK+/+
- camundongos
com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-
camundongos com AMPK seletivamente deletada nos
macrófagos. As pontas de seta brancas ( ) apontam para cristais de adenina no interstício. As setas brancas
( ) apontam para granulomas gigantes no córtex renal. Fonte: autoria própria.
A Met foi capaz de reduzir a expressão de αSMA em ambos o grupos tratados
(Figura 36). Isso nos motivou a investigar outros alvos celulares da droga. Utilizamos o CEL
para minimizar a influência da participação dos MØ no estabelecimento da lesão.
AMPK+/+
AMPK-/-
Con
trole
A
den
ina
Ad
enin
a+
Met
form
ina
67
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
+/+
Ad+M
et A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
-/-
Ad+M
et A
MPK
0
5
10
15
20
25
30
***
*****
ns
F4/8
0h
ighC
D11b
hig
hC
D86 (
%)
Figura 35 - Frequência das populações CD45+ F4/80high
CD11bhigh
CD86+ e CD45+
F4/80high
CD11bhigh
CD206+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com NTI tratados com metformina.
Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, Ad+Met - grupo adenina tratado com metformina, AMPK+/+
-
camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente
deletada nos macrófagos, *p<0,05, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.
4.3 A metformina atua, também via AMPK, nas células tubulares renais
Conjecturamos que o CEL, ao reduzir substancialmente o número de monócitos
fagocitando os cristais de Ad depositados no parênquima renal e produzindo citocinas pró-
inflamatórias e pró-fibróticas, iria resultar em um benefício clínico semelhante ao da Met, e
que, ao se associar as drogas, a melhoria na função renal seria ainda mais pronunciada.
AMPK-/- AMPK+/+C
TRL
AD
AD
+MET
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
+/+
Ad+M
et A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
-/-
Ad+M
et A
MPK
0
5
10
15
20
25
30*** ns
F4/8
0h
igh C
D11b
hig
h C
D206 (
%)
68
Figura 36 - Expressão de αSMA nos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
com
NTI tratados com metformina.
Em (A), fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado imunoistoquimicamente com anticorpo anti-
αSMA. Em (B), western blot para αSMA. AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,
AMPK-/-
camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos. Fonte: autoria própria.
AMPK+/+
AMPK-/-
Con
trole
A
den
ina
Ad
enin
a+
Met
form
ina
69
Figura 37 - Marcadores de função e lesão renal nos camundongos C57BL/6 tratados
com metformina e/ou clodronato.
Em (A), ureia sérica. Em (B), creatinina sérica. Em (C), expressão gênica de KIM-1 no tecido renal. Ctrl –
grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo adenina mais
clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato.*p<0,05, ***p<0,0001, ns – não
significativo. Fonte: autoria própria.
Figura 38 - Variação do peso dos camundongos C57BL/6 tratados com metformina e/ou
clodronato.
0 1 2 3 4 5 6 7 865
75
85
95
105Ctrl
Ad
Ad+Met
Ad+Clo
Ad+Met+Clo
*
Dia
% P
eso
in
icia
l
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo
adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, *p<0,05 versus todos os
demais grupos adenina. Fonte: autoria própria.
A função renal do grupo Ad+Clo se equiparou àquela do grupo Ad+Met (Figura 37A-
B). Apesar de os níveis de ureia e creatinina não apresentarem diferença estatisticamente
apreciável entre os três grupos tratados, observou-se que a expressão de KIM-1 encontrava-se
particularmente reduzida no grupo Ad+Met+Clo (Figura 37C), e que este grupo também foi o
que apresentou menor variação de peso (Figura 38).
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0
100
200
300
400
500
ns
***
Ure
ia (
mg
/dL
)
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
ns
***
Cre
ati
nin
a (
mg
/dL
)
A B
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0
500
1000
1500**
*2-
CT K
IM-1
C
70
Figura 39 - Expressão gênica de IL-6 e TNF-α no tecido renal de camundongos C57BL/6
tratados com metformina e/ou clodronato.
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0
5
10
15
***
2-
CT I
L-6
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0
10
20
30
40
***
2-
CTT
NF
-
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo
adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, ***p<0,0001 versus todos os
demais grupos. Fonte: autoria própria.
Figura 40 - Expressão proteica de αSMA em tecido renal de camundongos C57BL/6
tratados com metformina ou clodronato.
Ctrl
Ad
Ad+M
et
Ad+C
lo
Ad+M
et+C
lo
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
**
S
MA
/ acti
na
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo
adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, **p<0,001 versus todos os
demais grupos. Fonte: autoria própria.
A menor deterioração renal propiciada pelo CEL, em monoterapia ou em associação,
foi reflexo da atenuação do processo inflamatório, como se infere da menor expressão das
citocinas IL-6 e TNF-α (Figura 39), o que, por sua vez, se traduziu em menor substituição do
parênquima normal por miofibroblastos produtores de MEC, representados pela expressão de
αSMA (Figura 40).
(42kDa)
()
(42kDa)
()
71
Figura 41 - Parâmetros clínicos dos camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
com NTI.
0 3 4 5 6 7 1060
70
80
90
100
110
Ctrl AMPK-/-
Ctrl AMPK+/+ Ad AMPK
+/+
Ad AMPK-/-
Dia
P
eso
(%
D0)
-/-
Ctrl A
MPK -/-
Ad AMPK
+/+
Ctrl A
MPK+/+
Ad AMPK
0
100
200
300
400
Ure
ia (
mg
/dL
)
*** **
ns
-/-
Ctrl A
MPK -/-
Ad AMPK
+/+
Ctrl A
MPK+/+
Ad AMPK
0.0
0.5
1.0
1.5
*
***
ns
Cre
ati
nin
a (
mg
/dL
)
Em (A), curva evolutiva da variação de peso, em termos percentuais do dia zero (D0), ao longo do experimento.
(B), ureia sérica. Em (C), creatinina sérica. Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos
com AMPK mantida nos linfócitos T CD4, AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos
linfócitos T CD4, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.
Figura 42 - Estratégia de gating nas células do parênquima renal de camundongos CD4-
cre AMPKflox/flox
.
Para se caracterizar as populações constituintes do infiltrado inflamatório no rim, a princípio se delimitou os
singlets. Abriu-se então uma nova janela contendo apenas o singlets, e nesta se demarcou uma população que,
pelo tamanho e granulosidade, era compatível com linfócitos. Desta população, foram selecionadas apenas as
células com marcação positiva para CD45. Para se assegurar de que não havia porventura monócitos
contaminando, selecionou-se, dentro da população CD45 positiva, apenas as células F4/80 negativas. Na
sequência, abriu-se uma janela em que se selecionaram apenas as células que expressavam fortemente a
molécula de superfície CD3. Dentro deste gate, designaram-se as células CD45+ F4/80- CD3+ CD4+ como
linfócitos T CD4, e as células CD45+ F4/80- CD3+ CD8+ como linfócitos T CD8. Fonte: autoria própria.
A B C
72
Figura 43 - Caracterização dos LT CD4+ infiltrando o parênquima renal de
camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
.
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
10
20
30
40
50
CD
45
CD
3 C
D4
(%
)
Em (A), imagens representativas da citometria. Em (B), gráfico com as frequências computadas em cada grupo.
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos linfócitos T CD4,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos linfócitos T CD4. Fonte: autoria própria.
Figura 44 - Estratégia de gating nas células do linfonodo renal de camundongos CD4-cre
AMPKflox/flox
.
Para se caracterizar os linfócitos presentes no linfonodo renal, a princípio se delimitou os singlets. Abriu-se
então uma nova janela contendo apenas o singlets, e nesta se demarcou uma população que, pelo tamanho e
granulosidade, era compatível com linfócitos. Desta população, foram selecionadas apenas as células com
marcação positiva para CD45. Na sequência, abriu-se uma janela em que se selecionaram apenas as células que
expressavam fortemente a molécula de superfície CD3. Dentre estas, foram delimitadas, na janela subsequente,
as que expressavam CD4. Por fim, dentro da população de células CD45+ CD3+ CD4+, a partir de então
designadas como linfócitos T CD4, foram definidas aquelas que expressavam IFN-gamma. Fonte: autoria
própria.
Não marcado
AMPK-/-
Ad
AMPK+/+
Ctr
l
A B
73
Figura 45 - Frequência da população de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos
CD4-cre AMPKflox/flox
.
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
20
40
60
80
CD
45 C
D3 C
D4 (
%)
Em (A), imagens representativas da citometria. Em (B), gráfico com as frequências computadas em cada grupo.
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos linfócitos T CD4,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos linfócitos T CD4. Fonte: autoria própria.
Figura 46 - Ativação de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-cre
AMPKflox/flox
.
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
10
20
30
CD
45 C
D3 C
D4 C
D69 (
%)
Em (A), imagens representativas da citometria. Em (B), gráfico com as frequências computadas em cada grupo.
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos linfócitos T CD4,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos linfócitos T CD4. Fonte: autoria própria.
Procurou-se estabelecer se a Met estaria contribuindo para redução da fibrose ao
modular os LT. Procedeu-se ao knockout de AMPK apenas em células T CD4+ (AMPK-/-
),
com a hipótese de que os camundongos em que essa molécula estivesse ausente apresentariam
uma doença mais grave.
Ad
C
trl
A B
Não marcado
AMPK-/-
AMPK+/+
A B
Não marcado
Ad
C
trl
AMPK-/-
AMPK+/+
74
Figura 47 - Caracterização da expressão de IFN-γ por linfócitos T CD4 no linfonodo
renal de camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
.
+/+
Ctrl A
MPK
+/+
Ad A
MPK
-/-
Ctrl A
MPK
-/-
Ad A
MPK
0
2
4
6
8
CD
45 C
D3 C
D4 IF
N (
%)
Em (A), imagens representativas da citometria. Em (B), gráfico com as frequências computadas em cada grupo.
Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+
- camundongos com AMPK mantida nos linfócitos T CD4,
AMPK-/-
- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos linfócitos T CD4. Fonte: autoria própria.
Nossa hipótese, no entanto, não se confirmou: os camundongos perderam peso na
mesma proporção, e não foi detectada qualquer diferença nos níveis seja de ureia, seja de
creatinina, entre os grupos Ad AMPK-/-
e AMPK+/+
(Figura 41). Ao se analisar a proporção de
LT CD4+ infiltrando o rim, mais uma vez não se obteve qualquer diferença entre os grupos
(Figuras 42 e 43).
Figura 48 - Ensaio de viabilidade das CTERM cultivadas na presença de metformina 20
mM ou de composto C 10 μM por 24h.
NE Met 20mM CompC 10M 0
20
40
60
80
100
% c
élu
las v
iáveis
CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, NE – células cultivadas em meio
DMEM high, sem estímulo, Met – células cultivadas em meio DMEM high acrescido de metformina 20 mM,
CompC – células cultivadas em meio DMEM high acrescido composto C 10 μM. Fonte: autoria própria.
Em uma análise mais pormenorizada, buscou-se evidenciar se, a despeito de a
frequência de LT CD4+ infiltrantes no rim permanecer inalterada, haveria alguma diferença
A B
Não marcado Ad
C
trl
AMPK-/-
AMPK+/+
75
na ativação desses linfócitos no órgão linfoide secundário em maior proximidade com a lesão,
neste caso, o linfonodo renal (Figura 44).
Figura 49 - Expressão de AMPK fosforilado nas CTERM após estímulo com
metformina 20 mM.
Ctrl M2 M4 M6 M240
1
2
3*
pA
MP
K/
acti
na
CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, C – células cultivadas em meio
DMEM high, sem estímulo, M2 – células incubadas com metformina 20 mM por 2 horas, M4 – células
incubadas com metformina 20 mM por 4 horas, M6 – células incubadas com metformina 20 mM por 6 horas,
M24 – células incubadas com metformina 20 mM por 24 horas, *p<0,05. Fonte: autoria própria.
Figura 50 - Expressão de αSMA por CTERM submetidas à TEM e tratadas com Met 20
mM e/ou CompC 10 μM.
0.0
0.5
1.0
1.5
**
-S
MA
/ -t
ub
uli
na
TGF- 10ng/dLMet 20mM
CompC 10M
- - + + + +- + - - + +- - - + - +
CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, TEM – transição epitélio-
mesenquimal induzida com TGF- 10 ng/dL, Met – células incubadas com metformina 20 mM por 24 horas,
CompC – células incubadas com composto C 10 μM por 24 horas, **p<0,001. Fonte: autoria própria.
Contudo, de forma idêntica ao observado no parênquima renal, não se notou aumento
de LT CD4+ no linfonodo drenante (Figura 45). Além disso, os linfócitos dos grupos Ad não
- - + + + +- + - - + +
- - - + - +
TGF-β10ng/dL
Met 20mM
CompC 10µM
pAMPK
AMPK total
β-actina
C C M2 M2 M4 M4 M6 M6 M24 M24
(62kDa)
(62kDa)
(42kDa)
76
0
50
100
150
200
*** * ***
TGF- 10ng/mLMet 20mM
CompC 10M
- - - + + +- + - - + -- - + - - +
Lacta
to (
mg
/dL
)
se mostraram mais ativados do que aqueles dos grupos Ctrl, como apontado pela inexistência
de expressão diferencial da molécula de superfície CD69 (Figura 46) ou da citocina
interferon-gamma (IFN-γ, Figura 47).
Figura 51 - Concentração de glicose e lactato no sobrenadante das CTERM cultivadas
com Met 20 mM ou CompC 10 μM.
0
100
200
300
400
500**
**
TGF- 10ng/mLMet 20mM
CompC 10M
- - - + + +- + - - + -- - + - - +
Glico
se (
mg
/dL
)
Em (A), concentração de glicose no sobrenadante. Em (B), concentração de lactato no sobrenadante. CTERM –
células tubulares epiteliais murinas, estimuladas por 24 horas com metformina (Met) 20 mM ou composto C
(CompC) 10 μM, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.
Figura 52 - Captação de 2-nbdg pelas CTERM cultivadas com Met 20 mM ou CompC
10 μM.
Em (A), captação de 2-nbdg nas células estimuladas com metformina (Met 20 mM) ou composto C (CompC 10
μM) por 24 horas. Em (B), captação de 2-dg nas células em que se induziu transição epitélio-mesenquimal com
TGF-β 10 ng/mL, incubadas com metformina (TEM+Met 20 mM) ou composto C (TEM+CompC 10 μM) por
24 horas. CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, **p<0,001, ***p<0,0001.
Fonte: autoria própria.
Em virtude desses dados, investigou-se, na sequência, se a Met estaria agindo nas
células lesionadas pelos macrófagos no contexto da DRC – as próprias células tubulares. Para
esse propósito, utilizou-se de um modelo in vitro que mimetiza uma condição de fibrose renal:
A B
A B
Met
20m
M M
Com
pC 1
0
0
20
40
60
80 ***
Cap
tação
de 2
-nb
dg
(%
)
TEM+M
et 2
0mM M
TEM+C
ompC
10
0
20
40
60
80
**
Cap
tação
de 2
-nb
dg
(%
)
77
induziu-se a transição epitélio-mesênquima (TEM) em células tubulares epiteliais renais
murinas (CTERM, linhagem MM55.K), e observou-se que efeito tinha a adição de Met sobre
a evolução desse processo. Ainda, buscou-se identificar se a ativação e a inibição da AMPK,
pela Met e pelo composto C (CompC), respectivamente, ocasionava alterações metabólicas
nessas células.
Antes, porém, foi necessário se certificar de que as doses aplicadas ao meio de
cultura não detinham efeito tóxico sobre as células. Fez-se então um ensaio de viabilidade
celular, que demonstrou que as drogas, na concentração escolhida, não implicavam na morte
das células cultivadas (Figura 48).
O próximo passo foi identificar em qual timepoint a Met exercia seu efeito máximo
ativando o AMPK nas células tubulares. Para isso, deixaram-se as células incubando com a
droga durante 2, 4, 6 e 24h. A análise revelou que a ativação da quinase ocorria com maior
intensidade 4 horas após a adição da droga ao meio (Figura 49).
Figura 53 - Expressão do transportador de glicose Glut2 nas células tubulares renais
tratadas com Met 20 mM ou CompC 10 μM.
0.0
0.5
1.0
1.5 *
TGF- 10ng/mL
CompC 10M
- - + +- + - +
Glu
t2/β
-acti
na
0.0
0.5
1.0
1.5
TGF- 10ng/mL
CompC 10M
- - + +- + - +
Glu
t2/
-acti
na
*
Em (A), expressão de Glut2 nas células tubulares renais estimuladas com metformina (Met) 20 mM TGF-β 10
ng/mL por 24 horas. Em (B), expressão de Glut2 nas células tubulares renais estimuladas com composto C
(CompC) 10 μM TGF-β 10 ng/mL por 24 horas. ***p<0,0001, **p<0,001. Fonte: autoria própria.
--
TGF-β 10ng/dL
Glut2(57kDa)
Met 20mM
-+
+-
++
β-actina(42kDa)
A B
--
TGF-β 10ng/dL
Glut2(57kDa)
CompC10μM
-+
+-
++
β-actina(42kDa)
78
Na sequência, verificou-se o efeito da Met sobre a TEM das CTERM estimuladas
com TGF-β 10 ng/L por 24h. As células que receberam apenas TGF-β superexpressaram
αSMA, enquanto aquelas pré-tratadas com Met 20 mM apresentaram quantidade irrisória
deste marcador de TEM.
Para comprovar que este era um efeito dependente de AMPK, induzimos a TEM na
presença do antagonista de AMPK CompC 10 μM. A coadministração de ambas as drogas no
meio de cultura resultou em expressão de αSMA similar àquela das células que sofreram
TEM na ausência de Met (Figura 50).
Constatou-se que células incubadas com Met tiveram a glicose do meio de cultura
consumida, e concomitantemente produziram mais lactato, sugerindo aumento da glicólise em
relação ao basal (Figura 51). A seguir, procurou-se elucidar se a isto se associava uma maior
captação da glicose presente no meio. Com esse intuito, utilizou-se de glicose marcada com
um fluoróforo e submeteram-se as células à citometria, que revelou mais glicose adentrar as
células tratadas com Met (Figura 52).
Por fim, para averiguar se a maior captação de glicose estava relacionada à maior
expressão do seu transportador, procedeu-se à avaliação da expressão deste por western
blotting. Nos túbulos renais são expressas duas isoformas desse transportador, Glut1 e Glut2,
sendo esta última a responsável pela reabsorção da maior parte da glicose filtrada pelos rins
[63]. A expressão de Glut2 se mostrou reduzida nas células que sofreram TEM (Figura 53).
5 DISCUSSÃO
80
Lançada há exatas seis décadas, a Met se consolidou como o hipoglicemiante de
escolha no manejo do diabetes mellitus tipo 2. A despeito disso, aconselha-se cautela ao
prescrever a droga para pacientes com clearance de creatinina (ClCr) entre 45 e 30 mL/min
(DRC estágio 3b), e ela é formalmente contraindicada para pacientes com ClCr abaixo de 30
mL/min (DRC estágios 4 e 5). Esta recomendação se baseia no risco diminuto, porém real, de
acidose lática com o declínio da função renal, estimado em cerca de 3 casos por 100.000
pacientes-ano [64,65].
As alterações metabólicas provocadas pela Met, embora tradicionalmente encaradas
como obstáculos em potencial ao seu uso no contexto da DRC, podem, contudo, consistir em
um mecanismo de ação importante a ser explorado para conter a progressão da doença.
Evidências, a partir de estudos in vitro, apontam a ativação da AMPK como uma via
importante a ser modulada com a intenção de modificar o curso da fibrose tecidual [28,66].
Nosso estudo tece novas conexões entre os campos da nefrologia e do
imunometabolismo, ao oferecer um modelo in vivo que corrobora e aprofunda a compreensão
sobre a influência da Met na TEM, e sugerir que ela tenha um papel importante enquanto
reguladora da função do sistema imune. Propomos, assim, que a Met possa impactar
positivamente na evolução da DRC, e esperamos que estudos subsequentes permitam ampliar
e diversificar as indicações da droga.
O primeiro parâmetro avaliado para acompanhar a evolução da NTI induzida por Ad,
o modelo que adotamos de DRC, foi a perda de peso. Sabe-se que o ambiente inflamatório
associado à DRC leva ao consumo progressivo da massa corpórea [67,68]. O abrandamento
da inflamação se manifestaria, pois, com atenuação da caquexia.
No que concerne à influência da técnica adotada sobre a variação do peso corporal,
duas considerações se impõem: (1) o procedimento de gavagem pode se associar à perda
ponderal quando o animal é manipulado inadequadamente, e (2) a REA, por ser pouco
palatável, se associa a uma menor ingestão alimentar que pode se refletir como perda de peso
não atribuível à lesão renal em si.
A variação de peso resultante do estresse promovido pelas gavagens repetidas é
provavelmente insignificante, já que o método foi otimizado para causar o mínimo
desconforto aos animais, obedecendo-se ao limite de administração diária de 5mL/kg, o qual
está associado a menor distensão gástrica e melhor aceitabilidade do conteúdo gavado pelos
roedores, conforme Turner et al., 2011 [69].
81
De fato, observa-se que, mesmo no grupo controle, há uma discreta perda de 4% do
peso inicial nos dois primeiros dias, sendo que, já no terceiro dia, com a habituação dos
camundongos à manipulação, o peso retorna aos valores iniciais e estabiliza.
Quanto à diminuição do consumo de ração atribuída à sua impalatabilidade, sabe-se
que, no primeiro dia do experimento, tanto o grupo Ad quanto o Ad+Met apresentaram uma
redução de aproximadamente 28% do seu consumo basal e, a partir do segundo dia, essa
redução se acentuou para cerca de 70%, tendo assim permanecido até o fim do experimento.
Acredita-se que o declínio inicialmente verificado corresponda exclusivamente à
recusa alimentar devido à insipidez da dieta, já que, neste primeiro dia, ainda não houve
tempo hábil para o estabelecimento de lesão renal grave o suficiente para desencadear
manifestações sistêmicas. A partir do segundo dia, entretanto, a maior redução do consumo já
pode ser associada à síndrome de caquexia.
O segundo parâmetro clínico avaliado foi o nível séricos de escórias nitrogenadas. A
Ur aumenta à medida que declina a taxa de filtração glomerular (TFG), a taxa empregada para
definir e classificar a DRC [70]. Em camundongos saudáveis de oito semanas, o valor de
referência varia entre 38 e 47 mg/dL [71].
No grupo Ad, a Ur atingiu valores médios de 315 mg/dL (ou 7,5x o valor médio do
controle), já no grupo Ad+Met, apesar de elevada em comparação ao controle, ela apresentou-
se proporcionalmente menor, com valores médios de 223 mg/dL (ou 4,9x o valor médio do
controle; p<0,001).
Por apresentar interferências não relacionadas à TFG, a Ur, apesar de bastante
sensível, é pouco específica enquanto indicador de função renal. Assim, a Cr é o exame
bioquímico padrão para acompanhar a progressão da DRC [72]. Em camundongos saudáveis
de oito semanas, o valor da normalidade é entre 0,36 e 0,55 mg/dL [71].
Assim como ocorreu com a Ur, a Cr do grupo Ad+Met, ainda que alterada em
relação ao controle, mostrou-se significativamente reduzida se comparada ao grupo Ad (1,27
mg/dL versus 1,99mg/dL, respectivamente, ou 1,8x o controle versus 2,7x o controle;
p<0,0001).
Ressalta-se que, como confirmado por valores equivalentes de Ur e Cr ao do grupo
Ctrl, o grupo Met não apresentou alteração de função renal, o que implica que a dose de Met
administrada não detém qualquer efeito nefrotóxico mensurável durante o período de
execução do experimento.
Além dos parâmetros mais tradicionais de função renal, avaliou-se também a
expressão gênica de um marcador de lesão, a kidney injury molecule 1 (KIM-1), que vem
82
recebendo grande projeção na última década por se mostrar um indicador precoce e altamente
sensível de dano tecidual [73]. A KIM-1 é uma molécula sintetizada no túbulo renal proximal
quando este é submetido a situações de estresse, e sua mensuração em biópsias de tecido renal
e em urina, tanto de roedores como de humanos, revelou que ela se eleva muito antes que
alterações de ureia e creatinina sejam identificáveis [74].
Seu acompanhamento no curso de um insulto renal, qualquer que seja sua natureza,
ou aguda ou crônica, é de particular valia por ser dotado de valor prognóstico [75]. A
expressão de KIM-1 nos rins dos camundongos foi um espelho dos marcadores de função
renal, se elevando no grupo Ad consideravelmente em relação ao Ctrl, e se reduzindo no
Ad+Met em comparação ao Ad.
O último parâmetro clínico analisado foi o peso renal. É descrito que tanto
camundongos quanto ratos submetidos ao modelo de Ad apresentam peso do rim aumentado
em relação ao controle, o que se justifica pela deposição de cristais de Ad no interstício renal
[76,77]. Por outro lado, a substituição do parênquima por fibrose pode levar à atrofia renal
[78].
A importância da mensuração dos rins é tal que, na avaliação diagnóstica de DRC em
seres humanos, a redução do volume renal, avaliado por ultrassonografia, representa um fator
que favorece fortemente a suspeição de cronicidade da lesão [79].
Diante dos nossos resultados, postulamos que a Met age retardando o curso natural
da NTI: o grupo Ad não exibiu peso renal diferente do grupo Ctrl possivelmente em razão de
o órgão ter sofrido atrofia, o que compensou o aumento causado pela inclusão de cristais no
interstício. Já o grupo Ad+Met estaria num grau menos avançado da evolução da lesão, com
maior preservação do parênquima renal, daí resultando em rins aumentados de volume.
A histologia veio a comprovar essa hipótese. Um dado curioso foi que o número de
cristais de Ad no grupo tratado foi consideravelmente maior do que no não tratado, em
contraponto com o estudo de Yang et al. (2016), que, em um modelo de litíase renal por
etilenoglicol, demonstrou ser a Met, administrada pelas mesmas rota e dose adotadas em
nosso trabalho, capaz de reduzir a deposição de cristais de oxalato nos rins [80].
Verificamos, contudo, que o número de granulomas no grupo Ad foi maior do que no
Ad+Met. Assim, conjuntamente, esses dados apontam que a Met resultou em menor
fagocitose dos cristais, em benefício da função renal do grupo tratado.
Há evidências na literatura reportando que o modelo da Ad tem dois mecanismos
fisiopatológicos básicos: o primeiro seria puramente mecânico, representando pela obstrução
83
proporcionada pelos cristais nos túbulos, e o segundo teria um componente essencialmente
inflamatório, representando pela resposta do sistema imune aos cristais [81,82].
Nossos dados indicam que o componente inflamatório da lesão seria o fator causal
preponderante na perda da função renal, já que a maior quantidade de cristais no grupo
Ad+Met não implicou em piora dos marcadores avaliados. Isto nos motivou a investigar as
alterações desencadeadas pela Met nos MØ, o principal tipo celular envolvido na formação
dos granulomas, e que já havia sido anteriormente culpabilizado como o grande responsável
em nosso modelo de NTI [83].
A partir da análise IHQ para iNOS, acredita-se que, em uma fase inicial, os MØ M1
constituam o maior componente dos granulomas em formação, enquanto que, em uma fase
mais tardia, os principais constituintes dos granulomas maduros sejam os MØ M2. Nestes, os
MØ M1 ocupariam a posição mais central, circundando os cristais, e os MØ M2, a periferia.
Isso está de acordo com o já descrito para outras doenças granulomatosas, como a tuberculose
[84].
Os resultados da citometria de fluxo sugerem que a população CD45+ F4/80
high
CD11bhigh
possa representar os MØ teciduais, enquanto que a CD45+ F4/80
low CD11b
high
possa se tratar de monócitos infiltrantes, o que explicaria um maior aporte dessas células nos
rins lesionados, e uma redução de sua frequência relativa no grupo Ad+Met.
A Met teve um efeito quantitativo sobre os monócitos infiltrantes, mas não sobre os
residentes, que representam a população mais abundante. Fomos então tentar detectar efeitos
qualitativos da droga nessa outra população, caracterizando-a com os marcadores de
superfície CD86, mais comumente expresso em MØ classicamente ativados, e CD206,
expresso principalmente em MØ alternativamente ativados [85].
O CD86 é comumente expresso em situações nas quais o MØ é desafiado por
patógenos intracelulares, a exemplo do Toxoplasma gondii [86]. Em um contexto não
infeccioso, ele foi demonstrado em MØ alveolares de pacientes com sarcoidose [87] ou com
asma [88].
Por sua vez, o CD206 é expresso em MØ com tendências pró-fibróticas, sendo
induzido em ambientes ricos em IL-4 e TGF-β [89]. Uma situação na qual ele se encontra
particularmente elevado é a doença pulmonar obstrutiva crônica, condição em que o
parênquima pulmonar é gradativamente substituído por traves fibrosas, perdendo sua função
de troca gasosa [90].
A maior frequência de um marcador para M1 parece, a princípio, paradoxal face à
melhora clínica verificada no grupo Ad+Met. O fato de não ter havido diferença entre os
84
grupos Ctrl e Ad+Met quanto à expressão gênica nos rins das citocinas inflamatórias IL-6 e
TNF-α reforça ainda mais a noção de que a Met é capaz de atenuar a inflamação. A elevação
dessas citocinas foi inclusive demonstrada em diversos outros modelos experimentais de
DRC, tendo-se inclusive proposto, mais recentemente, que elas poderiam ser biomarcadores
úteis para avaliar a gravidade da insuficiência renal em humanos [91,92].
No que diz respeito à relação entre AMPK e inflamação, em um experimento in vitro
com MØ derivados da medula óssea (MDMO), Li et al. (2015), observaram que, ao tratarem
essas células com o soro de ratos urêmicos, elas passaram a expressar fortemente TNF-α e IL-
6, o que era simultaneamente acompanhado de profunda redução dos níveis da forma ativa da
AMPK (pAMPK). Ao terem esses níveis restaurados a valores fisiológicos, através da
administração do agonista AICAR ao meio de cultura, notou-se, por outro lado, diminuição
significativa da produção dessas citocinas [93].
Logo, a observação de que a população F4/80high
CD11bhigh
do grupo Ad expressa
mais CD206, enquanto que a do grupo Ad+Met, mais CD86, implica que esses grupos estão
em diferentes estágios evolutivos da lesão – a Met agiria retardando a progressão da doença.
Daí que, no mesmo timepoint em que os rins do grupo Ad já perderam sua função e estão
tomados por MØ M2, favoráveis à fibrogênese, os rins do Ad+Met ainda estariam com sua
função relativamente preservada, com uma inflamação mais branda em curso, por isso a maior
frequência dos MØ M1.
O TGF-β é a principal citocina envolvida no processo de perda da polaridade celular e
reorganização do citoesqueleto que, em conjunto, levam as células tubulares epiteliais e
adquirir características mesenquimais [94]. Tendo sido demonstrado que, dentre as células do
sistema imune, aquela que mais sofreu alterações pelo tratamento com Met foi o MØ, e que a
principal modificação observada foi um aumento da frequência de MØ M1, em detrimento de
MØ M2, acompanhado de diminuição da expressão de TGF-β, nosso próximo passo foi
investigar se a redução de estímulo pró-fibrótico implicaria em diminuição proporcional da
TEM.
Para tal, utilizamos o marcador de miofibroblasto αSMA, que se revelou bastante
reduzido no grupo Ad+Met relativamente ao Ad. Nosso resultado está em concordância com
o trabalho de Dong et al. (2017), que observou menor expressão de αSMA em rins
senescentes de ratos tratados com Met, na dose de 300 mg/kg/dia, por oito semanas [95].
A fibrose intersticial é o marco histológico da DRC. Uma vez que o tratamento com
Met redundaram em menos TEM, era de se esperar que isso viesse acompanhado de menor
produção de matriz extracelular (MEC). Foi exatamente isso o que verificamos, tanto através
85
de cortes de tecido renal corados com Picrosirius red, quanto pela expressão gênica de
colágeno I.
Nossos dados encontram respaldo em outros modelos de DRC experimental. Em um
modelo de nefrectomia subtotal em ratos, Satriano et al. (2013) demonstraram que a gavagem
de Met, na dose de 250 mg/kg/dia, por trinta dias, resultou em menores glomeruloesclerose e
fibrose medular e cortical no rim remanescente, avaliados por meio da coloração tricromo de
Masson [96]. Tikoo et al. (2016) obtiveram resultado semelhante em um modelo de disfunção
renal associada à obesidade: ratos alimentados com dieta hiperlipídica por dezesseis semanas
e, a seguir, tratados com Met, 100 mg/kg/dia, por via oral, durante oito semanas, apresentaram
significativamente menos fibrose glomerular e intersticial [97].
Para nos assegurarmos que a AMPK, nos MØ, é uma via crucial no desenvolvimento
da NTI induzida por Ad, utilizamos camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
. Sumariamente,
nossos experimentos sugerem que, apesar de a citometria não ter revelado diferenças no perfil
de polarização dos MØ entre os grupos Ad, o que corresponde aos achados clínicos, os rins
dos camundongos AMPK-/-
apresentaram um grau mais acentuado de fibrose do que os dos
camundongos AMPK+/+
.
Histologicamente os rins desse último grupo se encontravam piores em razão de a
ausência da quinase se correlacionar com a formação mais pronunciada de granulomas,
levando à maior distorção arquitetural que, tem como consequência final, a substituição do
parênquima normal por tecido fibrótico.
Parece, todavia, contraditório a ausência de AMPK nos MØ também não vir
acompanhada de gravidade clínica mais acentuada da NTI. Como a ativação da via por um
método farmacológico resultou em menor intensidade da lesão renal, o naturalmente esperado
seria que, se a via fosse bloqueada por meio de deleção gênica na célula considerada como a
principal impulsionadora da progressão da doença, esta se manifestaria de forma mais
exacerbada. Não foi isso o que constatamos, entretanto.
Apesar de contraintuitivo, esses dados podem ser justificados ao se retomar a análise
do blot para a pAMPK. É bastante evidente que, no contexto da NTI, há redução da expressão
da forma ativa da AMPK. O WB sugere que, na doença, a molécula se encontra
constitutivamente menos expressa, o que torna compreensível a ausência de diferença entre os
grupos AMPK+/+
e AMPK-/-
. Assim, seria necessário que houvesse um estímulo à sua
ativação para se notarem diferenças apreciáveis no comportamento dos MØ.
Para testar essa hipótese, tratamos com Met os camundongos com a deleção
condicional. O resultado evidenciou o que supúnhamos, e a melhora clínica observada no
86
grupo Ad +Met AMPK+/+
se deveu à adoção de um fenótipo anti-inflamatório pelos Mϕ.
Desta forma, provamos que a Met realmente age no curso evolutivo da NTI através dos MØ,
por uma via dependente de AMPK.
Contudo, observamos que, nos camundongos AMPK-/-, a expressão proteica de αSMA
se encontrava reduzida no grupo tratado com Met, indicando que a droga ainda exercia um
efeito benéfico residual. No sentido de explorar os possíveis mecanismos de atuação
secundários, fomos identificar outros alvos celulares da droga.
Embora o experimento com camundongos selvagens tenha insinuado que o efeito
mais pronunciado da Met foi sobre a polarização dos MØ infiltrando os rins doentes, a droga
ainda foi capaz de reduzir o processo fibrótico em camundongos com deleção seletiva da
molécula de AMPK nestas células. Isto deu abertura a duas hipóteses: ou 1) a Met também
estaria agindo também por uma via independente de AMPK nos MØ, ou (2) a Met teria outros
alvos celulares que, uma vez sofrendo modulação em seu metabolismo, adotariam um
comportamento contrário à progressão da NTI.
Para fornecer respostas a esses questionamentos, propusemos um segundo
experimento em camundongos C57BL/6, em que comparamos a eficácia do agonista da
AMPK com uma droga utilizada para depletar MØ do organismo, o CEL. Queríamos testar a
hipótese de a Met agir, via AMPK, em outros atores do processo inflamatório que, apesar de
secundários, têm sua importância posta em evidência assim que o macrófago sai de cena.
Nossa suposição foi validada: os camundongos tratados com CEL apresentaram uma
melhora da função renal tão pronunciada quanto aqueles recebendo Met, o que sublinha a
função do MØ enquanto célula definidora do curso da NTI; e os animais que receberam
ambas as drogas se saíram ainda melhores, indicando que, de fato, a Met estaria agindo em
outras células envolvidas na doença.
No modelo com camundongos selvagens, as análises da citometria não revelaram
diferenças entre os grupos quanto à frequência de linfócitos T CD4+ infiltrando os rins. O
experimento com o CEL, porém, tornou imperativo que se considerasse a intervenção dessas
células no estabelecimento da lesão.
Há estudos demonstrando que o LT CD4+ pode exercer papel relevante sobre a
progressão da fibrose renal propriamente dita, irrespectivamente de ser ou não ele o principal
envolvido na injúria inicial que tenha causado a fibrose [98,99]. Assim, buscou-se, em um
segundo experimento, melhor averiguar se a AMPK teria influência no comportamento dos
LT CD4. Os experimentos com camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
revelaram, entretanto,
87
que a vantagem conferida pela ativação da AMPK não resultou do papel da quinase em LT
CD4+, já que a frequência desses sequer se elevou nos grupos Ad em relação aos Ctrl.
Uma vez que a base fisiopatológica da lesão se dá na interação do binômio sistema
imune – órgão-alvo, procurou-se evidenciar se os efeitos benéficos da Met nesse modelo de
DRC não poderiam ser atribuídos, ao menos parcialmente, à sua ação direta nas células
vítimas do processo inflamatório, isto é, nas células tubulares renais.
A Met foi capaz de inibir a TEM de modo dependente de AMPK em nosso modelo
in vitro. Isso está em conformidade com o observado por Thakur et al. (2015), que também
demonstraram diminuição deste marcador mesenquimal em células epiteliais renais humanas
e fibroblastos intersticiais de ratos pré-tratados com Met [100]. Banerjee et al. sugeriram que
o mecanismo de ação por trás disso seria a inibição da via da MAPK/ERK pela AMPK [66].
Em seguida, tentou-se estabelecer se a resistência, conferida pela Met, das CTERM à
TEM era acompanhada de mudanças no seu metabolismo. De fato, a Met ocasionou aumento
da captação de glicose e ativação da via glicolítica nessas células. Já foi descrito que o
tratamento de células neoplásicas com Met leva preferencialmente à ativação da via glicolítica
[99]. Em contraponto, Kang et al. (2015) demonstraram, em um trabalho a respeito de
defeitos no metabolismo de células tubulares durante a fibrose renal, que o TGF-β promove
redução de enzimas relacionadas ao metabolismo da glicose [101].
No nosso experimento, foi verificado que, ao se acrescentar ao meio de cultivo Met
previamente ao TGF-β, ocorreu um aumento expressivo do transportador de glicose Glut2,
cuja densidade de banda no WB foi restaurada a valores comparáveis ao grupo NS. Por outro
lado, a adição de CompC resultou em redução ainda mais acentuada da expressão do
transportador.
Esse resultado encontra eco no que já foi descrito acerca da ação da Met sobre a
expressão de transportadores de glicose em outros tecidos: no tecido adiposo, por exemplo,
tem-se estabelecido que ela é responsável por elevar os níveis de Glut4, a isoforma mais
abundante nos adipócitos [102,103].
6 CONCLUSÃO
89
O presente estudo permite concluir que:
(i) A Met apresenta papel protetor na NTI crônica induzida por Ad;
(ii) A preservação da função renal está associada ao aumento da fosforilação da
AMPK no tecido renal;
(iii) A principal célula modulada pela Met no contexto da lesão renal por Ad é o MØ;
(iv) O tratamento com Met resulta em redução do número de granulomas envolvendo
cristais de adenina nos rins, se associando a maior preservação arquitetural do tecido;
(v) marcador de miofibroblasto αSMA é fortemente expresso nos rins doentes, e a
Met leva à normalização para níveis verificados em rins saudáveis;
(vi) O colágeno I, principal componente da matriz extracelular na fibrose intersticial
que caracteriza a DRC, tem sua expressão diminuída pela Met;
(vii) Os camundongos com deleção seletiva de AMPK nos MØ não apresentam
diferenças na função renal quando comparados aos AMPK selvagem, o que pode ser
explicado por a fração ativa da quinase se encontrar menos expresa no contexto da doença;
(viii) A administração de Met aos camundongos LyzM-cre AMPK-/-
não exerce
influência sobre a gravidade da doença, enquanto que esta é amenizada de forma apreciável
naqueles LyzM-cre AMPK+/+
, comprovando que a modulação do MØ proporcionada pela
droga tem um mecanismo dependente de AMPK (Figura 54);
(ix) Ainda assim, os camundongos LyzM-cre AMPK-/-
expressam menos αSMA
nos rins, apontando que a ativação de AMPK em outras células também contribui para os
efeitos benéficos da Met;
(x) A associação de CEL, uma droga depletora de MØ, com a Met proporciona
melhora clínica ainda mais acentuada, ratificando a existência de outros alvos celulares do
agonista de AMPK;
(xi) O infiltrado linfocitário no rim e no linfonodo renal dos grupos Ad não apresenta
diferenças comparativamente aos grupos controles em camundongos CD4-cre AMPKflox/flox
,
excluindo os LT CD4 como células relevantes no estabelecimento da lesão;
(xii) O tratamento de CTERM com Metresulta em aumento da fosforilação da
AMPK e em resistência à TEM induzida por TGF-β; e
(xiii) A resistência verificada se associa a uma mudança do perfil metabólico dessas
células, que passam a captar mais glicose, expressar mais Glut2, e ativar a via glicolítica.
O mecanismo molecular e celular proposto para a ação da Met na NTI induzida por
Ad encontra-se sumarizado na Figura 55.
90
Figura 54 - Esquema representativo do mecanismo de ação da metformina na nefrite
tubulointersticial induzida por adenina em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox
.
Fonte: autoria própria.
91
Figura 55 - Sumário gráfico.
A adenina é convertida em cristais insolúveis de 2,8-diidroxiadenina pela xantina oxidase, os quais se depositam
no interstício renal. Nos camundongos selvagens não tratados (esquema à esquerda), ocorre ativação dos
macrófagos residentes e recrutamento de monócitos infiltrantes que, juntos produzem citocinas pró-
inflamatórias, como IL-6 e TNF-α. A lesão inflamatória, juntamente da obstrução mecânica promovida pelos
cristais, leva à destruição do epitélio tubular. Concomitantemente, células epiteliais, sob o estímulo de citocinas
92
pró-fibróticas, como o TGF-β, sofrem transição epitélio-mesenquimal, se transformando em miofibroblastos
produtores de matriz extracelular. Assim, progressivamente, o parênquima é substituído por tecido fibrótico. O
tratamento com metformina (esquema à direita) leva à fosforilação de AMPK em macrófagos e células tubulares
epiteliais. Nestas, ela induz aumento da expressão do transportador de glicose Glut2, ao que se associa maior
captação de glicose e ativação da via glicolítica, alterações metabólicas que tornam as células resistentes à TEM.
Naqueles, a ativação da AMPK inibe a inflamação, resultando em menor formação de granulomas e,
consequentemente, menor deterioração da arquitetura tubular. Os rins tratados com metformina, desta forma,
apresentam menos marcadores de fibrose (αSMA e colágeno) e têm sua função preservada. Fonte: autoria
própria.
REFERÊNCIAS
94
REFERÊNCIAS*
1. Sinclair L. Arrowsmith. New York: Signet Classics, 1925.
2. Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD Work Group. KDIGO 2012
Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease.
Kidney inter., Suppl. 2013; 3: 1-150.
3. Hill NR, Fatoba ST, Oke JL et al. Global Prevalence of Chronic Kidney Disease – A
Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One. 2016; 11(7): e0158765.
4. Fishbane S, Hazzan AD, Halinski C, Mathew AT. Challenges and opportunities in late-stage
chronic kidney disease. Clin Kidney J. 2015; 8 (1): 54-60.
5. Schieppati A, Remuzzi G. Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology,
social, and economic implications. Kidney Int Suppl. 2005 Sep;(98):S7-S10.
6. Schoolwerth AC, Engelgau MM, Rufo KH, et al. Chronic Kidney Disease: A Public Health
Problem That Needs a Public Health Action Plan. Preventing Chronic Disease.
2006;3(2):A57.
7. Perico N, Remuzzi G. Chronic kidney disease: a research and public health priority. Nephrol
Dial Transplant. 2012 Oct;27 Suppl 3:iii19-26.
8. Silverstein DM. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and
cardiovascular disease. Pediatr Nephrol. 2009 Aug;24(8):1445-52.
9. Akchurin OM, Kaskel F. Update on inflammation in chronic kidney disease. Blood Purif.
2015;39(1-3):84-92.
10. Ojo A. Addressing the Global Burden of Chronic Kidney Disease Through Clinical and
Translational Research. Trans Am Clin Climatol Assoc. 2014; 125: 229–246.
11. Norata GD, Caligiuri G, Chavakis T et al. The Cellular and Molecular Basis of Translational
Immunometabolism. Immunity. 2015 Sep 15;43(3):421-34.
12. Blagih J, Coulombe F, Vincent EE, et al. The Energy Sensor AMPK Regulates T Cell
Metabolic Adaptation and Effector Responses In Vivo. Immunity. 2015 Jan; 42:41–54.
13. Andris F, Leo O. AMPK in Lymphocyte Metabolism and Function. International Reviews of
Immunology. 2015; 34(1):67-81.
14. Dasgupta B, Chippa RR. Evolving Lessons on the Complex Role of AMPK in Normal
Physiology and Cancer. Trends Pharmacol Sci. 2016 Mar;37(3):192-206.
15. Fullerton MD1, Steinberg GR. "Presenting" an adaptive role for AMPK. J Leukoc Biol.
2013 Dec;94(6):1099-101. doi: 10.1189/jlb.0613335.
*De acordo com Estilo Vancouver.
95
16. Mayer A, Denanglaire S, Viollet B, et al. AMP-activated protein kinase regulates
lymphocyte responses to metabolic stress but is largely dispensable for immune cell
development and function. Eur. J. Immunol. 2008; 38:948–956.
17. Cham CM, Driessens G, ’Keefe JP, et al. Glucose deprivation inhibits multiple key gene
expression events and effector functions in CD8+ T cells. Eur. J. Immunol. 2008; 38:2438–
2450.
18. Le A, Lane AN, Hamaker M, et al. Glucose-independent glutamine metabolism via TCA
cycling for proliferation and survival in B cells. Cell Metab. 2012; 15:110–121.
19. Zadra G, Priolo C, Patnaik A, Loda M. New strategies in prostate cancer: targeting lipogenic
pathways and the energy sensor AMPK. Clin Cancer Res. 2010 Jul 1;16(13):3322-8. doi:
10.1158/1078-0432.CCR-09-1955.
20. Pearce EL, Poffenberger MC, Chang CH, et al. Fueling Immunity: Insights into Metabolism
and Lymphocyte Function. Science. 2013 Oct; 342(6155):1242-454.
21. Mounier R, Théret M, Arnold L et al. AMPKa1 Regulates Macrophage Skewing at the Time
of Resolution of Inflammation during Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism.
2013; 18:251–264.
22. Weng SY, Schuppan D. AMPK regulates macrophage polarization in adipose tissue
inflammation and NASH. Journal of Hepatology. 2013; 58:619–621.
23. Kelly B, ’Neill, LAJ. Metabolic reprogramming in macrophages and dendritic cells in
innate immunity. Cell Research. 2015; 25:771–784.
24. Sag D, Carling D, Stout RD, Suttles J. AMP-activated protein kinase promotes macrophage
polarization to an anti-inflammatory functional phenotype. J Immunol. 2008 December 15;
181(12): 8633–8641.
25. Zhou G, Myers R, Li Y et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of
metformin action. J Clin Invest. 2001 Oct 15; 108(8): 1167–1174.
26. Viollet B, Guigas B, Garcia NS et al. Cellular and molecular mechanisms of metformin: an
overview. Clin Sci (Lond). 2012 Mar; 122(6): 253–270.
27. Ravindran S, Kuruvilla V, Wilbur K, Munusamy S. Nephroprotective Effects of Metformin
in Diabetic Nephropathy. J Cell Physiol. 2017 Apr; 232(4):731-742.
28. Lu J, Shi J, Li M, Gui B, Fu R et al. Activation of AMPK by metformin inhibits TGF-β-
induced collagen production in mouse renal fibroblasts. Life Sci. 2015 Apr 15;127:59-65.
29. Cavaglieri RC, Day RT, Feliers D, Abboud HE. Metformin prevents renal interstitial
fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction. Mol Cell Endocrinol. 2015 Sep
5;412:116-22. doi: 10.1016/j.mce.2015.06.006.
96
30. Duffield JS. Macrophages and Kidney Disease: Macrophages and Immunological
Inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 2010 May; 30(3): 234–254.
doi:10.1016/j.semnephrol.2010.03.003.
31. Tian S, Chen SY. Macrophage polarization in kidney diseases. Macrophage 2015; 2: e679.
doi: 10.14800
32. Kinsey GR. Macrophage Dynamics in AKI to CKD Progression. Journal of the American
Society of Nephrology 2014; 25: 209-11.
33. Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal
allograft pathology. Kidney Int 1999; 55(2):713-23.
34. Muller GA, Schettler V, Muller CA, Strutz F. Prevention of progression of renal fibrosis:
how far are we? Kidney Int Suppl 1996; 54:S75-82.
35. Sund S, Reisaeter AV, Fauchald P et al. Living donor kidney transplants: a biopsy study 1
year after transplantation, compared with baseline changes and correlation to kidney
function at 1 and 3 years. Nephrol Dial Transplant 1999; 14(10):2445-54.
36. Solez K, Colvin RB, Racusen LC et al. Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of
chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN'). Am J
Transplant 2007; 7(3):518-26.
37. Lee SA, Noel S, Sadasivam M, Hamad ARA, Rabb H. Role of Immune Cells in Acute
Kidney Injury and Repair. Nephron. 2017 Jun 10. doi: 10.1159/000477181.
38. Burne-Taney MJ, Yokota N, Rabb H. Persistent renal and extrarenal immune changes after
severe ischemic injury. Kidney Int 2005; 67:1002–1009.
39. Burne-Taney MJ, Liu M, Ascon D et al. Transfer of lymphocytes from mice with renal
ischemia can induce albuminuria in naive mice: a possible mechanism linking early injury
and progressive renal disease? Am J Physiol Renal Physiol 2006; 291:F981–F986.
40. Stockelman MG, Lorenz JN et al. Chronic renal failure in a mouse model of human adenine
phosphoribosyltransferase deficiency. Am J Physiol, 1998; 275(1 Pt 2): F154-63.
41. Bouzidi H, Lacour B et al. 2,8-dihydroxyadenine nephrolithiasis: from diagnosis to therapy.
Ann Biol Clin, 2007; 65(6): 585-92.
42. Daudon M, Traxer O et al. Lithogenesis. Prog Urol, 2008; 18(12): 815-27.
43. Engle SJ, Stockelman MG, et al. Adenine phosphoribosyltransferase-deficient mice develop
2,8-dihydroxyadenine nephrolithiasis. Proc Natl Acad Sci 1996; 93(11): 5307-12.
44. Diwan V, Mistry A, Gobe G, Brown L. Adenine-induced chronic kidney and cardiovascular
damage in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 2013 Sep-Oct;68(2):197-207.
45. Jia T, Olauson H, Lindberg K et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial
nephropathy in mice. BMC Nephrol. 2013 May 30;14:116.
97
46. John R, Herzenberg AM. Renal toxicity of therapeutic drugs. J Clin Pathol. 2009; 62(6):
505-15.
47. Galic S, Fullerton MD, Schertzer JD et al. Hematopoietic AMPK β1 reduces mouse adipose
tissue macrophage inflammation and insulin resistance in obesity. J Clin Invest. 2011
Dec;121(12):4903-15.
48. Lim JY, Oh MA, Kim WH, et al. AMP-activated protein kinase inhibits TGF-beta-induced
fibrogenic responses of hepatic stellate cells by targeting transcriptional coactivator p300. J.
Cell. Physiol. 2012; 227:1081–1089.
49. Lee JH, Kim JH, Kim JS et al. AMP-activated protein kinase inhibits TGF-, angiotensin II-,
aldosterone-, high glucose-, and albumin-induced epithelial-mesenchymal transition. Am J
Physiol Renal Physiol 304: F686–F697, 2013.
50. Boor P, Šebeková K, stendorf T, Floege J. Treatment targets in renal fibrosis. Nephrol.
Dial. Transplant. 2007; 22 (12): 3391-3407.
51. Weissser SB, van Rooijen N, Sly LM. Depletion and Reconstitution of Macrophages in
Mice. J Vis Exp. 2012 Aug 1;(66):4105.
52. van Rooijen N, Hendrikx E. Liposomes for Specific Depletion of Macrophages from Organs
and Tissues. Methods Mol Biol. 2010; 605:189-203.
53. Pautz A, Art J, Hahn S, Nowag S, Voss C, Kleinert H. Regulation of the expression of
inducible nitric oxide synthase. Nitric Oxide. 2010; 23(2): 75-93. doi:
10.1016/j.niox.2010.04.007.
54. Poljakovic M, Karpman D, Svanborg C, Persson K. Human renal epithelial cells express
iNOS in response to cytokines but not bacteria. Kidney Int. 2002 Feb;61(2):444-55.
55. Kipari T, Cailhier J-F, Ferenbach D, et al. Nitric Oxide Is an Important Mediator of Renal
Tubular Epithelial Cell Death in Vitro and in Murine Experimental Hydronephrosis. The
American Journal of Pathology. 2006;169(2):388-399. doi:10.2353/ajpath.2006.050964.
56. Seidal T, Balaton AJ, Battifora H. Interpretation and quantification of immunostains. Am J
Surg Pathol. 2001 Sep;25(9):1204-7.
57. Walker RA. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods, utility
and semiquantitative assessment I. Histopathology. 2006 Oct;49(4):406-10.
58. Taylor CR, Levenson RM. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning
methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 2006 Oct;49(4):411-24.
59. Jensen EC. Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ.
Anat Rec (Hoboken). 2013 Mar;296(3):378-81.
60. Ina K, Kitamura H, Tatsukawa S, Fujikura Y. Significance of α-SMA in myofibroblasts
emerging in renal tubulointerstitial fibrosis. Histol Histopathol. 2011; 26: 855-866.
98
61. Strutz F, Zeisberg M. Renal Fibroblasts and Myofibroblasts in Chronic Kidney Disease. J
Am Soc Nephrol. 2006; 17: 2992–2998.
62. Vogel B, Siebert H, Hofmann U, Frantz S. Determination of collagen content within
picrosirius red stained paraffin-embedded tissue sections using fluorescence microscopy.
MethodsX. 2015 Feb 21;2:124-34.
63. Marks J, Carvou NJ, Debnam ES, Srai SK, Unwin RJ. Diabetes increases facilitative
glucose uptake and GLUT2 expression at the rat proximal tubule brush border membrane. J
Physiol. 2003;553(Pt 1):137–145.
64. Qaseem A, Barry MJ, Humphrey LL, Forciea MA. Oral Pharmacologic Treatment of Type 2
Diabetes Mellitus: A Clinical Practice Guideline Update From the American College of
Physicians. Ann Intern Med. 2017 Jan 03; 166(4): 279-290.
65. Lipska KJ, Bailey CJ, Inzucchi SE. Use of Metformin in the Setting of Mild-to-Moderate
Renal Insufficiency. Diabetes Care 2011 Jun; 34(6): 1431-1437.
66. Banerjee P, Surendran H, Chowdhury DR, Prabhakar K, Pal R. Metformin mediated reversal
of epithelial to mesenchymal transition is triggered by epigenetic changes in E-cadherin
promoter. J Mol Med. 2016; 94:1397–1409.
67. Mak RH, Ikizler AT, Kovesdy CP et al. Wasting in chronic kidney disease. J Cachexia
Sarcopenia Muscle. 2011 Mar; 2(1): 9–25.
68. Wang XH, Mitch WE. Mechanisms of muscle wasting in chronic kidney disease. Nat Rev
Nephrol. 2014 Sep; 10(9): 504–516.
69. Turner PV, Brabb T, Pekow C, Vasbinder MA. Administration of Substances to Laboratory
Animals: Routes of Administration and Factors to Consider. Journal of the American
Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 2011;50(5):600-613.
70. Lopez-Giacoman S, Madero M. Biomarkers in chronic kidney disease, from kidney function
to kidney damage. World Journal of Nephrology. 2015;4(1):57-73.
doi:10.5527/wjn.v4.i1.57.
71. Fernández I, Peña A, Teso ND, Pérez V, Rodríguez-Cuesta J. Clinical Biochemistry
Parameters in C57BL/6J Mice after Blood Collection from the Submandibular Vein and
Retroorbital Plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science :
JAALAS. 2010;49(2):202-206.
72. Gowda S, Desai PB, Kulkarni SS et al. Markers of renal function tests. N Am J Med Sci.
2010 Apr; 2(4): 170–173.
73. Waanders F, van Timmeren MM, Stegeman CA, Bakker SJ, van Goor H. Kidney injury
molecule-1 in renal disease. J Pathol. 2010 Jan;220(1):7-16.
74. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadhani R, Bonventre JV. Kidney Injury Molecule-1
(KIM-1): a novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney Int. 2002
Jul;62(1):237-44.
99
75. Bonventre JV. Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): a specific and sensitive biomarker of
kidney injury. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008;241:78-83.
76. Fong D, Ullah MM, Lal JG et al. Renal cellular hypoxia in adenine-induced chronic kidney
disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2016;43: 896–905. doi:10.1111/1440-1681.12621
77. Hayashi S, Oe Y, Fushima T et al. Protease-activated receptor 2 exacerbates adenine-
induced renal tubulointerstitial injury in mice. Biochem Biophys Res Commun.
2017;483(1):547-552.doi: 10.1016/j.bbrc.2016
78. Nogueira A, Pires MJ, Oliveira PA. Pathophysiological Mechanisms of Renal Fibrosis: A
Review of Animal Models and Therapeutic Strategies. In Vivo. 2017; 31(1): 1-22.
doi:10.21873/invivo.11019.
79. ’Neill WC. Renal Relevant Radiology: Use of Ultrasound in Kidney Disease and
Nephrology Procedures. Clinical Journal of the American Society of Nephrology : CJASN.
2014;9(2):373-381. doi:10.2215/CJN.03170313.
80. Yang X, Ding H, Qin Z, et al. Metformin Prevents Renal Stone Formation through an
Antioxidant Mechanism In Vitro and In Vivo. Oxidative Medicine and Cellular Longevity.
2016;2016:4156075. doi:10.1155/2016/4156075.
81. Tamura M, Aizawa R, Hori M, Ozaki H. Progressive renal dysfunction and macrophage
infiltration in interstitial fibrosis in an adenine-induced tubulointerstitial nephritis mouse
model. Histochem Cell Biol. 2009 Apr;131(4):483-90. doi: 10.1007/s00418-009-0557-5.
82. Okabe C, Borges RL, de Almeida DC et al. NF-κB activation mediates crystal translocation
and interstitial inflammation in adenine overload nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol.
2013 Jul 15;305(2):F155-63. doi: 10.1152/ajprenal.00491.2012.
83. Correa-Costa M, Braga TT, Felizardo RJ et al. Macrophage Trafficking as Key Mediator of
Adenine-Induced Kidney Injury. Mediators Inflamm. 2014;2014:291024.
84. Mattila JT, Ojo OO, Kepka-Lenhart D et al. Microenvironments in tuberculous granulomas
are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide
synthase and arginase isoforms. J Immunol. 2013 Jul 15;191(2):773-84. doi:
10.4049/jimmunol.1300113.
85. Jablonski KA, Amici SA, Webb LM et al. Novel Markers to Delineate Murine M1 and M2
Macrophages. PLoS One. 2015 Dec 23;10(12):e0145342.
86. Fischer HG1, Dörfler R, Schade B, Hadding U. Differential CD86/B7-2 expression and
cytokine secretion induced by Toxoplasma gondii in macrophages from resistant or
susceptible BALB H-2 congenic mice. Int Immunol. 1999 Mar;11(3):341-9.
87. Nicod LP, Isler P. Alveolar macrophages in sarcoidosis coexpress high levels of CD86
(B7.2), CD40, and CD30L. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997 Jul;17(1):91-6.
100
88. Rutkowski R, Moniuszko T, Stasiak-Barmuta A et al. CD80 and CD86 Expression on LPS-
Stimulated Monocytes and the Effect of CD80 and CD86 Blockade on IL-4 and IFN-γ
Production in Nonatopic Bronchial Asthma. Arch Immunol Ther Exp (Warsz).
2003;51(6):421-8.
89. Rőszer T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and
Effector Mechanisms. Mediators of Inflammation. 2015; Article ID 816460.
90. Kaku Y, Imaoka H, Morimatsu Y et al. M2 macrophage marker CD163, CD204 and CD206
expression on alveolar macrophages in the lung of patients with chronic obstructive
pulmonary. European Respiratory Journal Sep 2014, 44 (Suppl 58) P1481.
91. Pecoits-Filho R, Lindholm B, Axelsson J, Stenvinkel P. Update on interleukin-6 and its role
in chronic renal failure. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18: 1042–1045.
92. Lee BT, Ahmed FA, Hamm LL, et al. Association of C-reactive protein, tumor necrosis
factor-alpha, and interleukin-6 with chronic kidney disease. BMC Nephrology. 2015;16:77.
93. Li C, Ding XY, Xiang DM et al. Enhanced M1 and Impaired M2 Macrophage Polarization
and Reduced Mitochondrial Biogenesis via Inhibition of AMP Kinase in Chronic Kidney
Disease. Cell Physiol Biochem. 2015;36(1):358-72.
94. Burns WC, Kantharidis P, Thomas MC. The role of tubular epithelial-mesenchymal
transition in progressive kidney disease. Cells Tissues Organs. 2007;185(1-3):222-31.
95. Dong D, Cai GY, Ning YC. Alleviation of senescence and epithelial-mesenchymal
transition in aging kidney by short-term caloric restriction and caloric restriction mimetics
via modulation of AMPK/mTOR signaling. Oncotarget. 2017 Mar 7;8(10):16109-16121.
doi: 10.18632/oncotarget.14884.
96. Satriano J, Sharma K, Blantz RC, Deng A. Induction of AMPK activity corrects early
pathophysiological alterations in the subtotal nephrectomy model of chronic kidney disease.
Am J Physiol Renal Physiol. 2013; 305: F727–F733. doi:10.1152/ajprenal.00293.2013
97. Tikoo K, Sharma E, Amara VR, Pamulapati H, Dhawale VS. Metformin Improves
Metabolic Memory in High Fat Diet (HFD)-induced Renal Dysfunction. The Journal of
Biological Chemistry. 2016; 291(42):21848–21856.
98. Nikolic-Paterson DJ. CD4 + T cells: a potential player in renal fibrosis. Kidney Int. 2010
Aug;78(4):333-5.
99. Tapmeier TT, Fearn A, Brown K et al. Pivotal role of CD4 + T cells in renal fibrosis
following ureteric obstruction. Kidney Int. 2010 Aug;78(4):351-62.
100. Thakur S, Viswanadhapalli S, Kopp JB et al. Activation of AMP-Activated Protein Kinase
Prevents TGF-β1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and Myofibroblast
Activation. Am J Pathol. 2015 Aug;185(8):2168-80.
101. Andrzejewski S, Gravel S-P, Pollak M, St-Pierre J. Metformin directly acts on mitochondria
to alter cellular bioenergetics. Cancer & Metabolism. 2014;2:12.
101
102. Kang HM, Ahn SH1, Choi P et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial
cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 2015 Jan;21(1):37-46.
103. Grisouard J, Timper K, Radimerski TM, et al. Mechanisms of metformin action on glucose
transport and metabolism in human adipocytes. Biochem Pharmacol. 2010 Dec
1;80(11):1736-45.
104. Lee JO, Lee SK, Kim JH, et al. Metformin Regulates Glucose Transporter 4 (GLUT4)
Translocation through AMP-activated Protein Kinase (AMPK)-mediated Cbl/CAP Signaling
in 3T3-L1 Preadipocyte Cells. J Biol Chem. 2012 Dec 28;287(53):44121-9.