Post on 26-Jan-2020
Larissa Borba Santos
EFEITOS DA MITOMICINA C E QUINONAS NATURAIS �-LAPACHONA E LAPACHOL NA INATIVAÇÃO DE CELULAS HUMANAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)
Orientadora: Claudia de Alencar Santos Lage
Rio de Janeiro
2010
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Santos, Larissa Borba Efeitos da mitomicina C e quinonas naturais �-lapachona e
lapachol na inativação de células humanas./Larissa Borba Santos. - Rio de Janeiro: UFRJ/Centro de Ciências da Saúde/Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.
xii, 90 f. : il. ; 31 cm. Orientador: Cláudia de Alencar Santos Lage
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.
Referências bibliográficas: f. 85-96 1. Quinonas – uso terapêutico. 2. Mitomicina C – toxicidade. 3. Naftoquinonas – uso terapêutico. 4. Reparo do DNA – efeitos de drogas. 5. Anemia de Fanconi. 6. Xeroderma Pigmentoso. 7. Espécies Reativas de Oxigênio. 8. Biofísica-Tese. I. Lage, Claudia de Alencar Santos. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título.
Dedico esta dissertação de mestrado à minha família, amigos
e a todos que aproveitam da melhor forma o presente VIDA.
AGRADECIMENTOS
A Deus, a quem devo todas as minhas conquistas.
À minha familia e amigos e a todos que cultivam por mim um sentimento de amor sincero e leal, pois contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho, através do seu carinho, tempo e dedicação. OBRIGADA DE TODO MEU CORAÇÃO!
Ao Dr. Alvaro da Costa Leitão, pelas ótimas sugestões e por todo o apoio material.
À Dra. Claudia de Alencar Santos Lage, pela confiança depositada em mim e pela orientação na execução do projeto.
Ao Dr. Januário Bispo Cabral Neto por sempre ter se disposto a tirar minhas dúvidas, a ajudar no planejamento dos experimentos e ter se empenhado em conseguir um local de trabalho ideal para a realização dos mesmos.
Ao Dr. Carlos Frederico Martins Menck, por ceder a maioria das linhagens celulares humanas utilizadas neste trabalho, assim como por suas sugestões sobre meus experimentos.
Ao Prof. Dr. Antonio Ventura Pinto, por ter se interessado sobre o nosso trabalho e por ceder as quinonas lapachol e �-lapachona utilizadas neste trabalho.
Ao Dr. Héctor Seuánez Abreu e a todos que compõem a Divisão de Genética do Centro de Pesquisa do Instituto Nacional do Câncer (INCa), em especial aos técnicos Claudio e Leila, por todo o apoio material e pela amizade.
À Dra. Rosa Estela Caseira Cabral que me ensinou muito, e com todo o seu carinho e paciência quase maternais, acolheu minhas dúvidas em muitos momentos durante boa parte do mestrado. Serei eternamente grata!
À Dra. Izabel de Lorena Paula Claudio, com quem compartilhei momentos de angústia e de alegria, e até mesmo material para experimento. Muito obrigada pelo carinho e amizade!
À Msc. Érika Carvalho e ao Msc. Maurício Caetano do INCa, que sempre estiveram dispostos a me auxiliar pacientemente com os experimentos de citometria de fluxo, cedendo protocolos e compartilhando suas idéias e impressões.
Ao Dr. Pedro Cabello do Laboratório de Genética Humana da Fiocruz, que foi muito gentil e prestativo ao me auxiliar nas análises estatísticas.
À FAPERJ e à CAPES, pelo apoio financeiro.
A todos os amigos do laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF, que torceram e me apoiaram sempre, com palavras de conforto e alegria. Muito obrigada mesmo!
Se um dia tiver que escolher entre o mundo e o amor... Lembre-se: se escolher
o mundo ficará sem o amor, mas se escolher o amor com ele você conquistará
o mundo.
Albert Einstein
RESUMO
SANTOS, Larissa Borba. Efeitos da mitomicina C e quinonas naturais �-lapachona e lapachol na inativação de células humanas. Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas - Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
As quinonas fazem parte de uma ampla e variada família de metabólitos, cuja enorme distribuição na natureza possivelmente implica em funções biológicas múltiplas, com participação em diversos ciclos bioquímicos. Ultimamente, o interesse nestas substâncias cresceu devido a sua importância nos ciclos bioquímicos vitais e também ao seu destaque em variados estudos farmacológicos. O ciclo redox das quinonas tem sido um bom modelo para estudos teóricos de quimioterapia baseada em sistemas racionais de fármacos. As quinonas estudadas neste trabalho foram a mitomicina C (MMC), o lapachol e a �-lapachona. O modo de ação das quinonas depende da estrutura química da molécula de quinona e das condições internas da célula como, por exemplo, a presença de enzimas oxidorredutases, dentre outras. Após a ativação intracelular da molécula de quinona por redução enzimática, a célula pode sofrer desde danos provocados por estresse oxidativo até adutos em biomoléculas como DNA e proteínas, e danos decorrentes destes adutos. A MMC é amplamente utilizada no tratamento contra vários tipos de câncer, sozinha ou em combinação com outros quimioterápicos, sendo uma das poucas drogas efetivas contra o câncer cólon-retal. Em nível molecular, há evidência que a sua citotoxicidade se deve, primariamente, à formação de adutos do que aos radicais de oxigênio, em particular, os crosslinks. Entretanto, quanto ao potencial anti-tumoral e ao modo de atuação do lapachol e da �-lapachona, ainda há muito a ser esclarecido. Além disso, a ocorrência de resistência a quimioterápicos por parte das células tumorais devido à indução de mecanismos de reparo de DNA tem sido um estímulo na busca de novos compostos químicos. Neste contexto, foram realizados ensaios in vitro para comparar a viabilidade e o ciclo celular de linhagens celulares humanas estabelecidas, proficientes e deficientes em reparo de DNA, após tratamento com diferentes concentrações de MMC, lapachol e �-lapachona. Foram obtidas para cada linhagem, curvas de inativação celular pelos métodos de redução de sal tetrazolium (MTT) e incorporação do corante vital vermelho neutro, e o ciclo celular foi analisado através da marcação do conteúdo total de DNA com iodeto de propídeo (PI). Os resultados finais foram obtidos pela média de três ensaios e submetidos a testes estatísticos. Como conclusão, observa-se que a MMC provoca lesões que requerem proficiência em reparo de DNA, as quais parecem interferir no ciclo celular, enquanto que, para as concentrações utilizadas de lapachol, não se observa citotoxicidade significativa nem necessidade de proficiência em reparo de DNA, e para as concentrações utilizadas de �-lapachona, observa-se citotoxicidade significativa, porém parece não haver necessidade de proficiência em reparo de DNA, sendo a MMC a única que apresentou genotoxicidade.
QUINONAS, MITOMICINA C, LAPACHOL, �-LAPACHONA, REPARO DE DNA, ADUTOS, CROSSLINKS, QUIMIOTERÁPICOS, ANTINEOPLÁSICOS FITOGÊNICOS
ABSTRACT
SANTOS, Larissa Borba. Effects of MMC and natural quinones lapachol and �-lapachone in inactivation of human cells. Rio de Janeiro, 2010. Dissertation (Master in Biological Sciences - Biophysics) - Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
Quinones are part of a broad and diverse family of metabolites, whose enormous distribution in nature possibly involves multiple biological functions, participating in various biochemical cycles. Lately, interest in these substances has grown due to their importance in vital biochemical cycles and also to its significance in various pharmacological studies. The redox cycling of quinones has been a good model for theoretical studies of chemotherapy based on rational systems of medicines. Quinones studied in this work were mitomycin C (MMC), lapachol and �-lapachone. The mode of action of quinones depends on the chemical structure of the quinone molecule and the internal conditions of the cell, eg, the presence of oxidoreductase enzymes, among others. Upon intracellular activation of the molecule of quinone by enzymatic reduction, the cell may suffer from damages caused by oxidative stress until adducts in biomolecules such as DNA and proteins, and also damages resulting from these adducts. The MMC is widely used in the treatment against several types of cancer, alone or in combination with other chemotherapeutic agents, being one of the few drugs effective against colorectal cancer. At the molecular level, there is evidence that its cytotoxicity is due primarily to the formation of adducts than to oxygen radicals, particularly the crosslink. However, regarding potential anti-tumor and mode of action of lapachol and �-lapachone, much remains to be clarified. Furthermore, the occurrence of resistance to chemotherapeutic agents by tumor cells due to induction of DNA repair mechanisms has been a stimulus in the search for new chemical compounds. In this context, in vitro tests were performed to compare the viability and cell cycle of human cell lines, proficient and deficient in DNA repair after treatment with different concentrations of MMC, lapachol and �-lapachone. For each strain were obtained curves for cell inactivation by the methods of reduction of tetrazolium salt (MTT) and incorporation of the neutral red vital dye, and cell cycle was analyzed by marking the content of total DNA with propidium iodide (PI). Final results were obtained by averaging three trials and subjected to statistical tests. In conclusion, we observe that MMC causes lesions that require proficiency in DNA repair, which seem to interfere with cell cycle, whereas at the concentrations of lapachol, it is not observed significant cytotoxicity neither the requirement for proficiency in DNA repair, and for the concentrations of �-lapachone, there was significant cytotoxicity, but it seems not to require proficiency in DNA repair, being MMC the only among them that appears to be genotoxic.
QUINONES, MITOMYCIN C, LAPACHOL, �-LAPACHONE, REPAIR OF DNA, ADDUCTS, CROSSLINKS, CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS, ANTINEOPLASTIC AGENTS
LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS
1INTRODUÇÃO.........................................................................................................13 FIGURA 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população...........................................................................................15 FIGURA 2. Formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) após redução de um substrato quinoídico.............................................................................................22 FIGURA 3. Estrutura química da molécula da mitomicina C (MMC).........................24 FIGURA 4. Adutos formados entre a MMC e os sítios N2 em guaninas no DNA: (A) monoaduto (B) biaduto inter-hélice (crosslink) e (C) biaduto intra-hélice..................25 FIGURA 5. A cascata redutora de ativação da MMC e sua ligação às guaninas do DNA............................................................................................................................27 FIGURA 6. Formação exclusiva de crosslink na seqüência 5’CG•CG3’ pelo monoaduto de MMC...................................................................................................28FIGURA 7. Estrutura química da molécula de lapachol.............................................29FIGURA 8. Estrutura química da molécula de �-lapachona......................................31
1.4 REPARO DE DNA................................................................................................35 FIGURA 9. Esquema ilustrativo do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e suas subdivisões, GGR (Reparo Global do Genoma) e TCR (Reparo Acoplado à Transcrição)................................................................................................................38 FIGURA 10. Esquema ilustrativo relacionando muitas proteínas que parecem participar no reparo de crosslinks...............................................................................43 FIGURA 11. Esquema representativo das possíveis vias de reparo de crosslinks...46
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................50 QUADRO 1. Linhagens celulares humanas utilizadas...............................................51
4RESULTADOS.........................................................................................................60 FIGURA 12. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................62 FIGURA 13. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................64 FIGURA 14. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................65 FIGURA 15. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)).......................................68 FIGURA 16. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................69 FIGURA 17. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................70 FIGURA 18. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (LIU) e da linhagem deficiente (NEO) no gene FANCC a A) MMC, B) lapachol e C) �-lapachona (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)).................................................72
FIGURA 19. Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para MMC (% de células versus concentração (µM)).................................................................75 FIGURA 20. Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para lapachol (% de células versus concentração (µM)).................................................................76 FIGURA 21: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para �-lapachona (% de células versus concentração (µM)).................................................................77
LISTAS DE ABREVIATURAS, UNIDADES E SÍMBOLOS
ATM – ataxia telangiectesia mutated protein ATR – ATM e Rad3 related proteinBRCA – breast cancer proteinCoQ - coenzima Q CS – Cockayne syndrome DDB – DNA damage-binding protein DMEM – Dulbecco's Modified Eagle MediumDMSO – dimetilsulfóxido DNA – ácido desoxirribonucleico EBV – Epstein-Barr virusEDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético FA – Fanconi anemiaFDA – Food and Drug Administration GGR – Reparo Global do Genoma MMC – mitomicina C MTT – 3-(4,5-Dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil brometo de tetrazolium NBS – Nijmegen breakage syndrome NER – Reparo por Excisão de Nucleotídeos NQO1 – NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1 PARP – poli (ADP ribose) polimerase PCNA – proliferating cell nuclear antigenPI – iodeto de propídeo PIKK – phosphoinositide 3 kinase-like kinase familyRFC – replication factor cRPA – replication protein A SV40 – Simian vacuolating virus 40 TCR – Reparo Acoplado à Transcrição XP – xeroderma pigmentosumoC – graus centígrados g – grama µg – micrograma L – litro mL – mililitro µL – microlitro M – molar mM – milimolar µM - micromolar � – delta � – épsilon � – eta
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.........................................................................................................................13
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS.............................................................................................13
1.2 CÂNCER: DEFINIÇÕES E ESTIMATIVAS........................................................................13
1.3 TRATAMENTO DO CANCER COM QUIMIOTERAPIA: EMPREGO DE QUINONAS......15
1.3.1 QUINONAS: ORIGEM NATURAL E EXEMPLOS..........................................................18
1.3.2 MODO GERAL DE ATUAÇÃO DAS QUINONAS...........................................................19
1.3.2.1 MITOMICINA C............................................................................................................23
1.3.2.2 LAPACHOL..................................................................................................................28
1.3.2.3 �-LAPACHONA............................................................................................................31
1.4 REPARO DE DNA.............................................................................................................35
1.4.1CICLO CELULAR E INDUÇÃO DO REPARO DE DNA..................................................36
1.4.2 REPARO DE DNA POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS EM CÉLULAS DE
MAMÍFEROS...........................................................................................................................37
1.4.3 REPARO DE CROSSLINKS EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS......................................41
1.4.4 MECANISMOS DE REPARO DE DNA: ALVOS IMPORTANTES NAS
QUIMIOTERAPIAS ANTI-TUMORAIS.....................................................................................47
1.5 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA..............................................................................48
2 OBJETIVOS.........................................................................................................................49
2.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................49
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................................49
3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................50
3.1 LINHAGENS CELULARES................................................................................................50
3.2 ESTOCAGEM E MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES.................................52
3.3 QUINONAS E TRATAMENTO DAS CÉLULAS.................................................................53
3.4 EXPERIMENTOS DE VIABILIDADE CELULAR AS QUINONAS......................................54
3.4.1 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS....................................................................................54
3.4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS................................................................................56
3.5 EXPERIMENTOS DE CICLO E MORTE CELULAR AS QUINONAS...............................57
3.5.1 CITOMETRIA DE FLUXO...............................................................................................57
3.5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS................................................................................58
3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...............................................................................................59
4 RESULTADOS.....................................................................................................................60
4.1 VIABILIDADE CELULAR DAS LINHAGENS FIBROBLÁSTICAS DEFICIENTES NO
REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) AO TRATAMENTO COM
DIFERENTES QUINONAS......................................................................................................60
4.2 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM NORMAL (MRC5) AO TRATAMENTO COM
DIFERENTES QUINONAS E RECUPERAÇÃO EM MEIO DE CULTURA CONTENDO
1 mM DE CAFEÍNA...............................................................................................................66
4.3 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM LINFOBLÁSTICA DEFICIENTE EM REPARO
DE CROSSLINKS HSC536NEO (NEO) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES
QUINONAS...........................................................................................................................71
4.4 ANÁLISE DO CICLO E MORTE CELULAR DAS LINHAGENS NORMAL (MRC5) E
XP30RO (XP-V) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES QUINONAS...............................73
5 DISCUSSÃO......................................................................................................................78
5.1 RELEVÂNCIA DO REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) NA
VIABILIDADE DE CÉLULAS HUMANAS TRATADAS COM QUINONAS............................78
5.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO GENOTÓXICA DAS QUINONAS ATRAVÉS DA INCUBAÇÃO
COM CAFEÍNA......................................................................................................................80
5.3 INVESTIGAÇÃO SOBRE A FORMAÇÃO DE CROSSLINKS PELAS QUINONAS........80
5.4 INFLUÊNCIA DAS QUINONAS SOBRE O CICLO CELULAR........................................81
CONCLUSÕES.....................................................................................................................83
PERSPECTIVAS...................................................................................................................84
REFERÊNCIAS.....................................................................................................................85
APENDICE............................................................................................................................97
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
O DNA é um alvo permanente de agentes físicos, como as radiações, e
químicos, como os aditivos alimentícios, drogas e produtos gerados no metabolismo
celular, que causam lesões na sua estrutura. Uma parte dessas lesões pode ser
evitada pela ação de barreiras químicas como filtros solares ou substâncias
antioxidantes, ou restauradas por mecanismos enzimáticos de reparo. Se não
devidamente reparadas, elas podem levar a consequências degenerativas para o
organismo. Na ausência ou falha de tais mecanismos, a mutagênese é intensificada
com o aumento da probabilidade de desenvolvimento de diversos tipos de câncer,
malformações congênitas, envelhecimento e morte celular (SANTOS, 2006).
O papel fundamental desses sistemas de reparo de DNA verifica-se quando,
por exemplo, pacientes com xeroderma pigmentosum, síndrome de Cockayne,
anemia de Fanconi, etc., são diagnosticados como portadores de suas disfunções,
caracterizando deficiência em reparação de lesões (SANTOS, 2006).
1.2 CÂNCER: DEFINIÇÕES E ESTIMATIVAS
Câncer é o nome genérico dado a um conjunto de mais de cem doenças que
têm em comum a multiplicação desordenada de células, invadindo tecidos
saudáveis. Suas causas são variadas e inter-relacionadas, podendo ser externas ou
internas ao organismo. As externas provem da exposição a agentes genotóxicos do
meio ambiente e hábitos insalubres. As causas internas são, na maioria das vezes,
geneticamente pré-determinadas, e estão ligadas à incapacidade do organismo de
se defender das agressões externas. Os fatores genéticos, tais como mutações
14
espontâneas, herança de genes codificando proteínas com diferentes eficiências no
controle da proliferação celular, apoptose e/ou sistemas de reparo do DNA, ou ainda
alterações da sua expressão agem em conjunto com os fatores ambientais criando a
susceptibilidade para o desenvolvimento do câncer. Os tumores malignos são,
assim, denominados neoplasias, distintos dos tumores benignos, normalmente
existindo como uma massa localizada de células que se multiplica vagarosamente e
guarda semelhança com o tecido original (INCa, 2010).
Importante causa de doença e morte no Brasil desde 2003, as neoplasias
malignas constituem-se a segunda causa de morte na população, representando
quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no Sistema de
Informações sobre Mortalidade (INCa, 2010). A incidência do câncer mais que
dobrou em 30 anos e o contínuo crescimento e envelhecimento populacional farão
incrementar de forma significativa o impacto do câncer no mundo (INCa, 2010).
Em homens, a neoplasia mais comum é a de próstata, seguido por pulmão,
estômago, cólon e reto. Nas mulheres, a mais frequente é a de mama, seguido do
colo do útero, cólon e reto, estômago e pulmão (INCa, 2010). No Brasil, as
estimativas para o ano de 2010 serão válidas também para o ano de 2011, e
apontam para a ocorrência de quase 500 mil casos novos de câncer. Os tipos mais
incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres
de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do
útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada
para a América Latina (Figura 1) (INCa, 2010).
15
Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira. (adaptado de http://www.inca.gov.br/estimativa/2010/index.asp?link=conteudo_view.asp&ID=2)
1.3 TRATAMENTO DO CÂNCER COM QUIMIOTERAPIA: EMPREGO DE QUINONAS
Embora grandes avanços tenham ocorrido na pesquisa de novos alvos celulares
para agentes anti-câncer, a interferência na replicação de células tumorais ainda
constitui-se como o principal mecanismo dos agentes clinicamente mais importantes.
A alquilação de DNA é um dos métodos mais simples. Isto ocorre pela ação de um
agente alquilante, possuidor de regiões eletrofílicas, que são atraídas para os sítios
nucleofílicos no DNA. Para muitos agentes alquilantes simples, a posição altamente
nucleofílica N7 da guanina é o sítio preferencial de alquilação dentre todas as bases
16
do DNA. Contudo, nos casos de agentes mais complexos, os sítios de alquilação
dependem de interações não-covalentes com o DNA (HARGREAVES et al., 2000).
A monoalquilação simples de DNA, ou seja, o agente alquilante ligado apenas
a uma hélice de DNA, pode resultar em várias consequências, incluindo o
desemparelhamento de bases, a formação de sítios apurínicos e a formação de
quebras simples em hélice. A bialquilação da hélice de DNA pode levar a biadutos
intra-hélice, inter-hélice e adutos de DNA-proteína (HARGREAVES et al., 2000). Os
crosslinks (biadutos inter-hélice) representam uma importante classe de danos
químicos ao DNA, uma vez que eles evitam a separação das hélices, bloqueando,
dessa forma, a sua replicação e a transcrição de RNA (LARMINAT et al., 1998).
Além disso, são muito tóxicos para as células em divisão por induzirem mutações e
rearranjos cromossômicos, podendo levar à morte celular (DRONKERT e KANAAR,
2001). Ocorrem em seqüências específicas que resultarão em mínima distorção do
DNA, sendo que a razão dessa preferência é a de ser requerida mínima energia
para conversão de monoadutos em crosslinks (HOPKINS et al., 1991). Foi estimado
que aproximadamente 40 crosslinks podem matar células de mamíferos deficientes
em reparo (DRONKERT e KANAAR, 2001). Uma vez que se atribui aos crosslinks a
citotoxicidade resultante desses agentes, um grande número de agentes alquilantes
bifuncionais, como a mitomicina C (MMC), tem sido usado para eliminação de
tumores malignos (MIYAGAWA, 2008).
Embora o impedimento da replicação e transcrição seja um mecanismo pelo
qual sejam eleitos agentes como as quinonas para serem utilizadas em tratamentos
de quimioterapia, o conceito da ativação biorredutiva de substâncias em células em
hipóxia tem sido estudado (DENNY e WILSON, 1986, OLIVEIRA e ALVES, 2002,
BUSTAMANTE et al., 2009), pois muitas das substâncias citotóxicas mais potentes
17
atuam em fases específicas do ciclo celular e, consequentemente, só exercem a sua
atividade contra células que se encontram em processo de divisão, como as
tumorais. Além disso, a maioria dos fármacos é altamente tóxica para o paciente e
deve ser administrada com muito cuidado. As células em hipóxia, apesar de se
dividirem, apresentam ciclo celular prolongado e permanecem indefinidamente em
repouso, sendo interessante utilizar um fármaco capaz de agir por outros
mecanismos além da alquilação (BUSTAMANTE et al., 2009).
As células em hipóxia podem apresentar maior capacidade de redução do
que as células normalmente oxigenadas e esta característica poderia ser explorada
no desenvolvimento de agentes antineoplásicos, os quais só se tornariam citotóxicos
após ativação metabólica pelas nitroredutases celulares (GU et al., 2009). Estes
agentes biorredutíveis são pró-fármacos que, in vivo, sofrem metabolização,
geralmente pelo sistema redox celular, dando origem ao fármaco. A solubilidade e
difusibilidade adequadas, a redução a espécies reativas somente nas regiões de
células em hipóxia e a atividade apenas das espécies reduzidas são propriedades
fundamentais para o sucesso da atividade dos agentes antineoplásicos seletivos
para células em hipóxia (DENNY e WILSON, 1986). Um dos fatores que explica a
resistência de tumores sólidos à quimioterapia é a dificuldade do fármaco em
alcançar as células em hipóxia (BUSTAMANTE et al., 2009).
18
1.3.1. QUINONAS: ORIGEM NATURAL E EXEMPLOS
O interesse a cerca destas substâncias tem aumentado nos últimos anos,
tanto devido à sua importância nos processos bioquímicos vitais, como também pelo
destaque cada vez maior em variados estudos farmacológicos. As quinonas são
muito difundidas na natureza (SILVA et al., 2003), estando envolvidas em etapas
importantes do ciclo de vida de seres vivos, como as ubiquinonas e as
plastoquinonas, que são intermediários da cadeia respiratória e fotossíntese,
respectivamente (SILVA et al., 2003), e as naftoquinonas, como as vitaminas do tipo
K, que possuem ação controladora da coagulação sanguínea. As quinonas naturais
mais representativas são vitais para vegetais superiores, artrópodes, fungos,
líquens, bactérias, algas e vírus, o que sugere relevância em diversas funções
biológicas (SILVA et al., 2003).
Em decorrência de diferentes arranjos quinonoídicos, com um mesmo tipo de
anel pode-se ter diferentes quinonas, dependendo das disposições relativas das
carbonilas. Essas configurações influenciam as propriedades físicas, químicas e a
atuação biológica da quinona (SILVA et al., 2003).
Vários estudos farmacológicos mostram que as quinonas são capazes de
apresentar propriedades microbicidas, tripanossomicidas, virucidas, antitumorais e
inibidoras de sistemas reparadores celulares. Destaca-se o estresse oxidativo que
provocam, ao induzirem a explosão endógena de Espécies Reativas de Oxigênio
(ERO: HO•, O2•- e H2O2). Outra atividade marcante dessas substâncias é a inibição
do complexo das topoisomerases, ação que desencadeia a apoptose celular. A
interferência das quinonas na apoptose constitui-se hoje em pesquisa interdisciplinar
de fronteira na química medicinal, existindo grande expectativa quanto à delineação
19
de estratégias racionais visando o combate de neoplasias, principalmente as
relacionadas ao câncer de próstata (DONG et al., 2009).
Exemplos de quinonas muito utilizadas em tratamentos contra o câncer são
as quinonas antibióticas provenientes de fungos do gênero Streptomyces, como a
daunorubicina isolada de S. peucenticus que possui efeito terapêutico contra
leucemia humana e a adriamicina isolada de S. coeruleorubidus, utilizada na
quimioterapia de tumores sólidos, ambas sendo também ativas contra o sarcoma
180, o carcinoma ascítico de Ehrlich e outros tipos de carcinomas (SILVA et al.,
2003). A mitomicina C (MMC), isolada de S. caespitosus, utilizada na quimioterapia
de tumores sólidos, é a uma das únicas drogas efetivas contra o câncer cólon-retal
(SCHWARTZ et al., 1995; YAO et al., 1996; TOMASZ e PALOM, 1997; MARTIN et
al., 2002). Outros exemplos de quinonas são o lapachol e a �-lapachona, ambas de
origem vegetal, que ultimamente têm sido bastante estudadas quanto a seus
potenciais terapêuticos contra o câncer (HUSSEIN et al., 2007, ALMEIDA, 2009).
1.3.2 MODO GERAL DE ATUAÇÃO DAS QUINONAS
A citotoxicidade das quinonas leva a crer que existe uma propriedade química
intrínseca na unidade quinonoídica, associada com outros fatores estruturais, que
são responsáveis pela intensidade das atividades antitumorais. Foi observado que
muitas quinonas podem ser ativadas por redução das carbonilas quinonoídicas,
gerando intermediários alquilantes através da ação de flavoenzimas celulares
(SILVA et al., 2003). Estudos sobre seu mecanismo de atuação biológica destacam
a importância do grupo quinonoídico como o grupo indispensável para a
20
biorreatividade no nível das enzimas do tipo redutases, formando ERO pró-
apoptóticas (BARREIRO e FRAGA, 2001).
Um aspecto notável quanto à ação das quinonas é que elas podem ser
citotóxicas por vários mecanismos, com consequências benéficas ou deletérias,
como por alteração no ciclo redox, arilação de substratos, intercalação na dupla
hélice do DNA, geração de sítios radicalares específicos e interferência na
respiração mitocondrial por inibição enzimática (MONKS et al., 1992; MONKS e
JONES, 2002). São consideradas venenos respiratórios por competirem com a
coenzima Q (CoQ), localizada no complexo citocrômico bc1, ou ainda, através de
sua redução à hidroquinona, que por sua vez, pode promover alquilação de enzimas
requeridas pela CoQ, no caso da mitomicina C (MMC) (OTT et al., 2007). Em ambos
há inibição do processo respiratório mitocondrial pelo bloqueio do mecanismo de
transferência de elétrons de NADH ou FADH2 para o oxigênio molecular (DON e
HOGG, 2004; CHENG et al., 2007).
Do ponto de vista toxicológico, as quinonas possuem reatividade em sistemas
biológicos por serem oxidantes e eletrofílicas. No meio biológico, a redução pode ser
monoeletrônica, catalisada por enzimas como NAPH:citocromo P450 redutase
microssômica, NADPH:citocromo b5 redutase microssômica e NADPH:ubiquinona
oxidoredutase mitocondrial. O sistema enzimático propício à redução bieletrônica é o
NAD(P)H:quinona oxidoredutase (DE MOURA, 2008). A cinética desta redução
depende de vários fatores, incluindo o potencial de redução da quinona (SILVA et
al., 2003).
A completa redução de uma quinona à hidroquinona requer dois elétrons e
dois prótons. Quinonas são espécies que experimentam reações de protonação com
dificuldade. No entanto, após a protonação, são oxidantes mais fortes do que a
21
forma não protonada. Semiquinonas (Q•-) são geradas pela redução envolvendo um
elétron e não são suficientemente básicas para serem protonadas.
Consequentemente, muitas semiquinonas existem como ânions radicais em pH
fisiológico. Por causa da doação parcial de elétrons à quinona, um ânion-radical
semiquinônico é um oxidante muito mais fraco do que a quinona original. Assim, a
química redox das quinonas, semiquinonas e hidroquinonas está ligada à sua
química ácido-base e a formação de quinonas e hidroquinonas a partir de
semiquinonas é frequente. (DE MOURA, 2008).
A redução de um elétron pela ação de redutases de um substrato
quinonoídico (Q) resulta na formação do ânion semiquinona (Q•-) (Equação 1), que
pode reagir com o oxigênio molecular formando o ânion-radical superóxido (O2•-)
(Equação 2), que subsequentemente se transforma, tanto espontaneamente
(Equação 3) quanto após catálise enzimática pela superóxido dismutase (SOD)
(Equação 4), em peróxido de hidrogênio (H2O2). O ânion-radical superóxido também
pode reduzir Fe+3 a Fe+2. O H2O2 então reage com o Fe+2 para gerar o radical
hidroxila (HO•) (Reação de Fenton) que, provavelmente, é a espécie reativa
responsável pelo dano oxidativo, pois não há enzima presente no meio celular que a
capture (DE MOURA, 2008). O ânion-radical superóxido também pode gerar HO•
pela reação com H2O2. Embora o H2O2 não seja um radical livre, é uma substância
bastante reativa, podendo promover também a oxidação de algumas biomoléculas.
Em resumo, HO• e H2O2 são as principais espécies responsáveis pelo estresse
oxidativo celular (SILVA et al., 2003).
As células desencadeiam mecanismos de desintoxicação através dos agentes
antioxidantes intracelulares na tentativa de eliminar estas espécies oxidantes. Em
sistemas onde ocorre persistência do desequilíbrio redox ou na falta de mecanismos
22
de proteção, há aumento intracelular dos oxidantes O2•- e H2O2, danificando
componentes celulares vitais como membranas, através da peroxidação dos lipídios
e da diminuição da capacidade antioxidante celular. A atuação destas espécies
oxidantes leva a consequências adversas, por alteração do sinal da transcrição na
expressão de genes, mutagenicidade e/ou por ativação de fatores responsáveis pela
indução da apoptose (SILVA et al., 2003).
(red.) Q + e- � Q•- (Equação 1)
Q•- + O2 � O2•- (Equação 2)
2H+
O2•- + e- � H2O2 (Equação 3)
(SOD) 2 O2
•- + 2H+ � H2O2+O2 (Equação 4)
Figura 2: Formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) após redução de um substrato quinoídico.
Embora muito complexo, com etapas ainda desconhecidas, a influência das
quinonas sobre o ciclo redox tem sido o foco de estudos, pois a indução da apoptose
e os danos provocados pelo estresse oxidativo estão entre os principais efeitos que
as quinonas provocam em sistemas biológicos. Isto é importante, já que as espécies
O2•- e H2O2 estão sendo consideradas como dois importantes sinais reguladores de
condições intracelulares. Acredita-se que o aumento de suas concentrações
favoreça a apoptose (SILVA et al., 2003).
23
1.3.2.1 MITOMICINA C
As mitomicinas são um grupo de potentes antibióticos que foram descobertos
nos anos 50 por microbiologistas japoneses em culturas de fermentação de
Streptomyces, em particular, Streptomyces caespitosus, sendo, por esse motivo,
denominadas de antibióticos antitumorais naturais (HATA et al., 1956). Quatro
mitomicinas de origem natural são antibióticos efetivos contra bactérias Gram
positivas e Gram negativas, mas somente a mitomicina C (MMC) e a porfiromicina
apresentam atividade antitumoral. A MMC (Figura 3), por sua vez, é a mais
conhecida de todas as aziridilquinonas e, atualmente, é a mais relevante
clinicamente. Essencialmente, essa droga tem três grupamentos químicos
potencialmente ativos, que são uma quinona, uma aziridina não-usual (C1) e um
grupo carbamato (C10). Muitos estudos têm mostrado que os três grupamentos
funcionais são importantes na ação citotóxica da MMC, e os mecanismos de
ativação têm sido alvo de grande debate no meio científico (HARGREAVES et al.,
2000).
Aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) como droga anti-câncer
em 1974, a MMC foi, e continua sendo, usada amplamente no tratamento contra
câncer de cabeça e pescoço, bexiga, estômago, pâncreas, pulmão e próstata, sendo
também uma das poucas drogas efetivas contra câncer cólon-retal (SCHWARTZ et
al., 1995; YAO et al., 1996; TOMASZ e PALOM, 1997; MARTIN et al., 2002). Além
de sua atividade antitumoral, a MMC apresenta uma variedade de efeitos biológicos
específicos em células de mamíferos ou microorganismos, incluindo a inibição
seletiva da síntese de DNA, recombinação, indução de aberrações e quebras
cromossômicas, trocas entre cromátides-irmãs, e indução do reparo de DNA
24
(resposta SOS) em bactérias, além de ser utilizada para diagnóstico de anemia de
Fanconi (IYER e SZYBALSKI, 1964; CARRANO et al., 1979; BAKSHI et al., 1998).
Figura 3: Estrutura química da molécula da mitomicina C (MMC) (TOMASZ e PALOM, 1997).
Em nível molecular, a MMC age como um agente alquilante, produzindo
espécies reativas capazes de gerar radicais de oxigênio através de um ciclo redox,
assim como biadutos inter-hélice (crosslinks) e uma variedade de monoadutos na
curvatura menor do DNA. Há evidência que a sua citotoxicidade se deve,
primariamente, à formação de adutos do que aos radicais de oxigênio, em particular,
os obstrutivos crosslinks (PALOM et al., 2002). In vivo, a atividade da MMC para
formar crosslinks no DNA foi primeiramente descoberta por Iyer e Szybalski (1963)
em bactérias, usando a curva de renaturação do DNA e técnicas de sedimentação
para detectar DNA contendo crosslinks. Um único crosslink por genoma é suficiente
para causar a morte de uma célula bacteriana sensível (IYER e SZYBALSKI, 1964),
além do crosslink ser muito mais tóxico do que uma alquilação monofuncional
(BRENDEL e RUHLAND, 1984; PRATT et al., 1994).
Para que as moléculas de MMC formem adutos no DNA, elas precisam ser
enzimaticamente reduzidas dentro da célula. O grupamento quinona deve passar
por uma redução, sendo a droga transformada em um alquilante altamente reativo, o
25
que foi primeiramente descrito por Iyer e Szybalski (1964). O átomo do anel
aziridínico C1 e o átomo C10 ligado à função carbamato são posições que reagem
com a posição N2 da guanina do DNA. O deslocamento subseqüente por dois
nucleófilos no DNA resulta em um crosslink MMC-DNA. Essa hipótese mostrou ser
extremamente útil, iniciando investigações experimentais do mecanismo de ação da
MMC, que continuam até hoje.
O biaduto intra-hélice de MMC foi descoberto por Bizanek e colaboradores
(1992). As estruturas dos principais adutos MMC-DNA estão representadas nas
figuras 4A, 4B e 4C.
(A) Monoaduto Guanina
(B) Biaduto inter-hélice
Guaninas
26
(C) Biaduto intra-hélice
Guaninas
Figura 4: Adutos formados entre a MMC e os sítios N2 em guaninas no DNA: (A) monoaduto (B) biaduto inter-hélice (crosslink) e (C) biaduto intra-hélice (TOMASZ e PALOM, 1997).
Como mostrado a seguir na figura 5, inicialmente, com a redução da quinona,
a MMC se liga covalentemente por C1 (originalmente parte do anel aziridínico) ao
DNA, formando o monoaduto MMC-DNA na posição N2 da guanina (Figura 4A). Se
duas guaninas estão adequadamente próximas em um DNA duplex, servindo como
substratos para ambas funções ativas de uma molécula de MMC, o átomo C10
portando a função carbamato termina por liga-se ao DNA e forma um biaduto intra-
hélice ou inter-hélice MMC-DNA, na posição N2 dessa outra guanina (Figura 4C).
Não havendo a condição de proximidade espacial necessária para a conversão do
monoaduto em biadutos, o grupamento carbamato em C10 reage com a água
(BOROWY-BOROWSKI et al., 1990b), gerando um monoaduto MMC-DNA de
decarbamoil-mitomicina C, na posição N2 da guanina. Há ainda monoadutos não
diretamente formados pela MMC ativada. Ao invés disso, são produtos de alquilação
feitos pelo metabólito da MMC, 2,7-diaminomitoseno, que é formado in situ agindo
por ele próprio como um alquilante monofuncional de DNA (PALOM et al., 2002).
27
Figura 5: A cascata redutora de ativação da MMC e sua ligação às guaninas do DNA (adaptado de TOMASZ, 1995).
Além da alta seletividade por N2 de guaninas, as monoalquilações do DNA
promovidas pela MMC ocorrem em média de 5 a 10 vezes mais na sequência 5'
CpG que nas outras três seqüências dinucleotídicas 5'NpG (TOMASZ e PALOM,
1997). Revelou-se que não é o resíduo 5'C que aumenta a reatividade da guanina
adjacente com a MMC, mas sim o resíduo de guanina na hélice oposta. Foi proposto
que o grupo 2-amino da guanina da fita oposta forma uma ligação de hidrogênio
específica com o anel da função carbamato em C10 da MMC ativada e que essa
interação promove a ligação covalente com o grupo 2-amino da guanina alvo
(TOMASZ e PALOM, 1997).
Entretanto, na segunda alquilação, para formação de crosslinks (Figura 3B), a
especificidade é absoluta à sequência duplex de DNA 5' CpG•CpG 3' (TENG et al.,
28
1989; BOROWY-BOROWSKI et al., 1990a). A restrição para formação de crosslink
aumentada para sequências 5' CpG•CpG 3' em relação à restrição para as
monoalquilações se dá por um alinhamento específico do monoaduto de guanina na
curvatura menor do DNA, não tendo a ver com a seqüência contexto (TOMASZ e
PALOM, 1997). Isto dependeria da orientação em que o monoaduto se ligaria, de
forma a se adequar na curvatura menor do DNA (Figura 6).
Figura 6: Formação exclusiva de crosslink na seqüência 5’CG•CG3’ pelo monoaduto de MMC (TOMASZ e PALOM, 1997).
1.3.2.2 LAPACHOL
Dentre as naftoquinonas naturais destaca-se o lapachol, 2-hidroxi-3(3-metil-2-
butenil)-1,4-naftoquinona (Figura 7), que pode ser considerado um dos principais
representantes do grupo de quinonas. Tem sido encontrado como constituinte de
várias plantas das famílias Bignoniaceae, Verbenaceae, Proteaceae, Leguminosae,
29
Sapotaceae, Scrophulariaceae e Malvaceae. Entretanto, sua ocorrência é maior na
família Bignoniaceae, no gênero Tabebuia SP (HUSSAIN et al., 2007)
Figura 7: Estrutura química da molécula de lapachol (HUSSAIN et al., 2007).
O lapachol é de fácil extração da serragem da madeira de várias espécies de
ipê, plantas do Brasil e da fronteira com a Argentina (SILVA et al., 2003).
Uma avaliação dos efeitos terapêuticos do lapachol começou no final dos
anos 60 (RAO, McBRIDE e OLESON,1968). Depois deste estudo, muitos outros
confirmaram a eficácia desta naftoquinona como um agente antineoplásico.
Entretanto, as concentrações elevadas necessárias para que esta droga atue como
um agente quimioterápico eficaz no câncer humano resultaram em efeitos
secundários muito tóxicos, sendo interrompidos novos estudos sobre a ação do
lapachol como um agente antineoplásico. Nenhum destes estudos considerou os
efeitos do lapachol em nível molecular (SILVA et al., 2003).
No Brasil, em 1952, o professor Osvaldo Gonçalves de Lima (UFPE) e
colaboradores estudaram o efeito anti-tumoral do lapachol, que demonstrou
atividade significante contra tumores em ratos e pacientes humanos. Estudos iniciais
30
conduzidos no Departamento de Antibióticos da UFPE em 1973 demonstraram forte
ação contra bactérias Gram-positivas (ALMEIDA, 2009). O Prof. B. Gilbert da UFRJ,
começou seus estudos a partir da década de 70 e, desde então, vários outros
pesquisadores, como o Prof. A.V. Pinto, do NPPN-UFRJ e o grupo da Profa. M.O.F.
Goulart (UFAl) dedicam-se ao estudo destas quinonas (SILVA et al., 2003).
O principal interesse no lapachol está na sua capacidade de induzir o
estresse oxidativo através da formação intracelular de ERO, como H2O2, O2•- e HO•,
os quais podem danificar componentes celulares importantes, tanto de células
normais como de malignas (SILVA et al., 2003, ALMEIDA, 2009). Esta interferência
altera o balanço natural de sinais que interferem nos checkpoints ou pontos de
checagem da divisão celular. A alteração da normalidade pode induzir a apoptose
como alternativa, caso a célula não consiga se recuperar do estresse oxidativo
(SILVA et al., 2003, ALMEIDA, 2009).
Apesar de possuir estágios de atuação biológica não muito conhecidos, o
lapachol deve atuar por diferentes mecanismos. Em relação à quimioterapia, o
lapachol age no fenômeno da apoptose sobre células do câncer, as quais possuem
crescimento desordenado (MAKIN e DIVE, 2001; HICKMAN, 2002). Acredita-se que
a atividade antitumoral do lapachol pode ser devida à sua interação com ácidos
nucléicos (ALMEIDA, 2009). Adicionalmente tem sido proposto que ocorreria a
interação do lapachol entre pares de base da hélice do DNA com inibição posterior
de replicação do DNA e de síntese do RNA (HUSSAIN et al., 2007).
31
1.3.2.3 �-LAPACHONA
O lapachol foi matéria prima para as sínteses de muitas outras substâncias de
distintas biodinamicidades. Uma das mais ativas foi a �-lapachona (3,4-dihidro-2,2-
dimetil-2H-naftol(1,2-b)pirano-5,6-diona) (Figura 8). Esta orto-piranonaftoquinona
também é encontrada em pequenas quantidades in natura, e pode ser obtida
através de uma semi-síntese a partir do lapachol através de ação controlada do calor
(D’ALBUQUERQUE, 1968). Tal qual o lapachol, mostra uma diversificada ação
farmacológica envolvendo principalmente desequilíbrio do ciclo redox.
Figura 8: Estrutura química da molécula de �-lapachona (HUSSAIN et al., 2007).
Em 1966, Gonçalves de Lima observou que havia a progressiva diminuição
de atividade antibiótica à medida que aumentava o grau de pureza do lapachol,
obtido do cerne do ipê roxo, chegando a isolar um dos componentes responsáveis
pela maior atividade do lapachol bruto, a �-lapachona, dando início a várias
pesquisas sobre essa nova descoberta. Mais tarde foi evidenciado que após a
absorção gastrintestinal, por administração oral em ratos, o lapachol é rapidamente
32
metabolizado e grande parte transformado em �-lapachona, o que impulsionou ainda
mais as pesquisas direcionadas para este novo fitofármaco (NAYAK et al., 1968).
A �-lapachona exibe variados tipos de atividade contra diferentes linhagens
de células in vitro, principalmente células humanas malignas de pulmão, mama,
cólon e reto, próstata, epitélio e sangue. Entretanto, ainda há muito para se
esclarecer em relação ao exato mecanismo de ação da �-lapachona e seu alvo
intracelular. O que se observa é que dependendo do tipo de célula e da
concentração utilizada de �-lapachona, o grau do seu efeito inibitório é diferente e a
atuação ocorre sobre moléculas e por mecanismos diferentes. No que diz respeito à
pesquisa sobre o uso da �-lapachona em tratamentos contra câncer, há muita
indefinição nestes quesitos. Provavelmente, sua atuação deve ser diversificada
(SILVA et al., 2003).
Em pesquisas in vitro com T. cruzi verificou-se que células tratadas com �-
lapachona apresentavam-se com a cromatina arranjada de forma anormal,
alterações das membranas citoplasmáticas, nuclear e mitocondrial, com inchaço nas
mitocôndrias, sugerindo a redução na taxa respiratória e inibição da oxidação da
glicose e do piruvato (DOCAMPO et al., 1977). Em células infectadas com T. cruzi
foi observado que a �-lapachona possui capacidade de gerar oxi-radicais, induzindo
a liberação de O2•- e H2O2 (DOCAMPO et al.,1978). Além disso, foi visto que
dependendo da concentração utilizada, a �-lapachona possui capacidade de
desarranjar as cromátides do T. cruzi, provocando degradações de DNA, RNA e
proteínas, irreversíveis ou não (GOIJMAN e STOPPANI, 1985).
Na área da virologia, é sabido que a �-lapachona bloqueia a transcrição do
vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), através de um mecanismo que bloqueia
seletivamente a expressão gênica da repetição longa terminal viral (LTR) (LI et al.,
33
1993). Da mesma forma, é um potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos
vírus mieloblastose aviária (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV). A ação
inibitória sobre estas enzimas revelou-se específica se comparada com a de outros
inibidores conhecidos (SILVA et al., 2003)
A combinação da �-lapachona com outras substâncias que atuam em
diferentes mecanismos celulares pode ser uma boa alternativa quimioterápica.
Boothman e colaboradores em 1987 observaram um sinergismo entre a �-lapachona
e radiosensibilizadores halogenados de pirimidina em células de carcinoma
epidermóide de laringe humano (HEP-2), por inibição do reparo de DNA aumentando
assim a letalidade das células. Há relatos que a �-lapachona combinada com o
taxol, base do fármaco antineoplásico Taxotere de uso clínico, constitui-se em uma
associação muito efetiva contra tumores humanos do ovário e da próstata,
implantados em ratos imunossuprimidos, sugerindo uma possível quimioterapia em
humanos baseada na combinação destas duas drogas (SILVA et al., 2003).
Também foi verificado um aumento de sensibilidade de células neoplásicas aos raios
X, semelhante ao que acontece com a camptotecina, que é um inibidor específico da
topoisomerase I (BOOTHMAN, TRASK e PARDEE, 1989).
A indução da apoptose pela �-lapachona parece ser independente da
expressão de p53 e p21 e da super expressão ectópica da proteína bcl-2, um
mecanismo diferente da radiação ionizante e quimioterapia convencional, o que
pode significar maior dificuldade para que as células tumorais desenvolvam
resistência ao tratamento com �-lapachona (LI et al., 1995).
Existem evidências que indicam a participação da enzima NQO1
(NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1) no processo de ativação da �-lapachona na
apoptose, aumentando a citotoxicidade. Esta enzima é mais expressa em vários
34
tipos de tumores, incluindo os de mama, pulmão e cólon-retal, do que em tecidos
normais, podendo se constituir em uma nova estratégia para a quimioterapia de
alguns tipos de câncer, como o de próstata (SILVA et al., 2003).
A �-lapachona parece ter induzido danos aos cromossomos de células do
ovário de hamsters chineses (CHO), sugerindo interação com a enzima poli (ADP
ribose) polimerase (PARP) (SILVA et al., 2003). Tipicamente, PARP-1 facilita o
reparo de DNA pela religação de quebras de fita simples (HUSSAIN et al., 2007).
A �-lapachona também age como inibidora das topoisomerases I e II. Há
aumento do efeito inibitório pela incubação direta desta substância com a
topoisomerase I antes da adição de DNA como substrato, o que sugere a interação
direta da �- lapachona com a topoisomerase I. Observou-se que esta ação depende
da presença de NQO1-redutase. Este modo de atuação é diferente em relação ao
de outras substâncias inibidoras das topoisomerases, como a camptotecina e o
topotecan. (SILVA et al., 2003).
Para um efeito citotóxico sinergístico ambas as enzimas topoisomerases
devem ser inibidas. Observou-se que na redução eletroquímica da �- lapachona na
presença dsDNA e ssDNA não houve danos diretamente no DNA, indicando que a
sua atuação é direta nas DNA toposisomerases (SILVA et al., 2003).
Em sua ação natural, as topoisomerases ligam-se na estrutura do DNA por
uma supertorção topológica, e quando fazem cortes permitem que as funções de
transcrição, reparação, replicação e estruturação do cromossomo ocorram
normalmente. Após estes processos, as células se dividem seguindo uma série de
etapas do ciclo celular (G1, S, G2 e M). Qualquer alteração no balanço entre estas
enzimas é suficiente para induzir a apoptose (SILVA et al., 2003).
35
A possibilidade de uma ação direta da �-lapachona no ciclo catalítico das
enzimas da topoisomerase I e II e a geração endógena de O2•- e H2O2 são decisivos
para o desencadeamento da apoptose. Entretanto, não se deve considerar a
toxicidade elevada desta quinona como um fator limitante ao uso clínico. Há
expectativas de que estudos futuros da relação atividade biológica versus estrutura
química possam levar à diminuição da toxicidade (SILVA et al., 2003).
1.4 REPARO DE DNA
Ao longo da vida de um organismo são produzidas células alteradas, mas os
mecanismos de defesa possibilitam a interrupção desse processo, com sua
eliminação subsequente. As alterações que permanecem no DNA são denominadas
mutações. Elas podem ser resultado tanto de erros durante a duplicação do DNA, na
divisão celular, quanto de danos causados por agentes externos diretamente no
DNA. Ocorrem em todos os seres vivos, sendo fundamentais para a evolução e
diversificação das espécies (RIBEIRO et al., 2003).
Somente quando ocorrem em genes específicos as alterações podem evoluir
para um crescimento celular desordenado. Genes específicos são aqueles que
estão relacionados com a estimulação e inibição da proliferação celular. Somente
quando há um determinado número de alterações nesses genes, é que surgem as
células neoplásicas, já que os danos no DNA além de irreversíveis são cumulativos.
Os agentes mutagênicos podem acelerar ou aumentar o aparecimento de mutações
que se associam ao surgimento de neoplasias (RIBEIRO et al., 2003).
36
1.4.1 CICLO CELULAR E A INDUÇÃO DO REPARO DE DNA
As células possuem redes complexas de sinalização celular que monitoram
cuidadosamente a integridade do genoma durante as fases do ciclo celular, para que
somente células sadias entrem em mitose. Embora seja somente parte da
maquinaria celular que reconhece e responde aos danos no DNA, a cascata de
sinalização que regula especificamente a parada do ciclo celular após o dano no
DNA pode ser considerada como uma rede complexa de caminhos interconectados
que consistem em três componentes principais: sensores, transdutores de sinal, e
efetores. Eles formam o que se chama de checkpoints ou pontos de checagem
(O’DRISCOLL e JEGGO, 2006).
Os danos no DNA provocam o recrutamento de complexos multiprotéicos
(sensores) que então ativam os transdutores ATM (ataxia telangiectesia mutated
protein) e ATR (ATM e Rad3 related protein), os quais pertencem à família PIKK
(phosphoinositide 3 kinase-like kinase family). Em geral é aceito que a ativação de
ATR seja conduzida por quebras simples no DNA formadas em consequência de
forquilhas de replicação paradas, enquanto ATM é o iniciador principal da resposta
às quebras duplas no DNA resultantes da radiação ionizante e de outros tipos de
dano de DNA. Uma vez ativadas, ATM e ATR fosforilam substratos, iniciando uma
cascata que resulta na parada do ciclo celular e reparo de DNA. (O’DRISCOLL e
JEGGO, 2006).
37
1.4.2 REPARO DE DNA POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS EM CÉLULAS DE
MAMÍFEROS
A reparação por excisão de nucleotídeos consiste em uma série de reações
enzimáticas requeridas para remover virtualmente qualquer lesão do DNA, incluindo
a maioria, senão todas, as removíveis pela reparação por excisão de bases. Os
nucleotídeos lesados são excisados como fragmentos de tamanho fixo,
independentemente da natureza da lesão. O mecanismo é constituído de 5 etapas
gerais: reconhecimento da lesão, abertura local da dupla-fita de DNA, dupla incisão,
síntese de reparo e ligação. (LEITÃO et al., 2005).
O sistema é constituído de dois subcaminhos denominados Reparo Global do
Genoma (GGR) e Reparo Acoplado à Transcrição (TCR), diferindo apenas nos
passos iniciais do reconhecimento do dano de DNA. O GGR remove lesões de
partes do genoma que não estão sendo transcritas. O TCR promove a remoção de
danos nos genes ativamente transcritos, sendo o molde transcrito reparado mais
rapidamente que o não transcrito. Além disto, em humanos, o TCR ocorre somente
nos genes transcritos pela RNA polimerase II (Figura 9). (LEITÃO et al., 2005)
38
Figura 9: Esquema ilustrativo do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e suas subdivisões, GGR (Reparo Global do Genoma) e TCR (Reparo Acoplado à Transcrição). (Adaptado de http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR03_DNADamageResponse.aspx)
Reconhecimento da lesão
Abertura local
Dupla incisão
Síntese de DNA
Ligação
39
Existem genes implicados em NER, XP-A, B, C, D, E, F e G, cuja deficiência
provoca a doença xeroderma pigmentosum, e a deficiência em XP-V, uma forma
variante, provoca uma apresentação clínica similar à de pessoas que portam
xeroderma pigmentosum, mas que é causada por defeitos na DNA polimerase �
(eta) envolvida em síntese translesão. A DNA polimerase � é uma polimerase
especializada em sintetizar frente a uma lesão instalada na fita de DNA molde,
evitando que a replicação seja interrompida e uma lacuna seja gerada, pois as DNA
polimerases de extensão � (delta) e � (épsilon), não são capazes de reconhecer a
lesão e sintetizar sobre ela (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010 ).
GGR requer a proteína XP-C para o reconhecimento da distorção provocada
pela lesão, enquanto TCR é iniciado quando a RNA polimerase II pára em uma lesão
no DNA, pois este evento serve como um sinal para reconhecimento de dano. Os
passos seguintes são realizados da mesma forma, com a entrada de XP-A, TFIIH
(fator de transcrição humana II), RPA, assim como as nucleases ERCC1-XPF e XPG
para a incisão da lesão (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
No GGR, o complexo XP-C-HHR23B se liga ao DNA simples-fita numa
extensão de 30 nucleotídeos em torno da lesão e sua afinidade por DNA danificado
é consideravelmente maior que para DNA não-danificado. A proteína XP-A também
tem habilidade em se ligar ao DNA, mas não parece participar exatamente no
primeiro passo de reconhecimento do dano de DNA. Entretanto, é essencial para a
formação do complexo de pré-incisão no sítio danificado na preparação para a
reação de dupla-incisão. XP-A se liga parcialmente com considerável eficiência ao
duplex de DNA a substratos de fita simples do mesmo tamanho (LEITÃO et al.,
2005, MUNIANDY et al., 2010).
40
A proteína RPA (Replication Protein A) é composta por três subunidades
(RPA1, 2 e 3), liga-se à fita simples de DNA e é também um componente essencial à
formação do complexo de pré-incisão do DNA danificado. RPA interage com muitos
fatores NER, incluindo XP-A, e é provável que seja parte da holoenzima DNA
polimerase que sintetiza nas lacunas de excisão para completar o processo NER
(LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
O TFIIH possui atividade DNA helicase (dependente de ATP), necessária
para produzir complexos abertos de DNA durante a iniciação da transcrição pela
RNA polimerase II e para NER. Ele consiste de 10 subunidades, dentre elas XP-B e
XP-D. Ambas proteínas são ATPases dependentes de DNA e possuem atividade
helicase (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
ERCC1 e XPF formam um complexo heterodimérico. Possuem atividade
nuclease estrutura-específica, e cortam junções de DNA entre um duplex e uma fita
simples no lado 5’ da lesão, uma vez que a dupla-hélice tenha sido aberta no sítio da
lesão. A proteína XPG corta muitos tipos de estruturas de DNA contendo junções
entre DNA não pareado e duplex, no lado 3’ da lesão. Desta forma, ocorre a dupla-
incisão, onde é gerado um fragmento de DNA de 27 a 30 nucleotídeos contendo a
lesão, que será retirado da dupla-hélice. Após a dupla-incisão, algumas subunidades
permanecem no complexo pós-incisão, de tal maneira que não haja uma lacuna em
fita simples como intermediário e só serão retiradas pelas proteínas de síntese de
reparo (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
Para finalizar o reparo, DNA polimerases realizam a síntese de reparo que
consiste em sintetizar na lacuna gerada pelas incisões, um novo fragmento de DNA.
Esse processo requer RPA, DNA polimerase � (delta) e � (épsilon), PCNA
(Proliferating Cell Nuclear Antigen) e RFC (Replication Factor C). O fator RFC atua
41
como casamenteiro para PCNA, conduzindo-o ao DNA e então conferindo
processividade às DNA polimerases. RFC/PCNA parecem dissociar o complexo pré-
incisão e formar um local de entrada para a síntese de reparo, possivelmente de
maneira análoga à replicação. A lacuna é fechada de maneira precisa pela DNA
ligase I (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
No TCR, como já foi mencionado, somente o início da reparação é diferente.
Duas proteínas são necessárias para fazer a ligação transcrição-reparo, CS-A e CS-
B. A deficiência em uma dessas proteínas provoca a síndrome de Cockayne. A
proteína CS-B, mas não a CS-A, interage diretamente com a RNA polimerase II.
Quando a DNA polimerase II é bloqueada no sítio da lesão, CS-A e CS-B ativam
TCR. Após a iniciação do TCR, todo o restante do reparo ocorre da mesma forma
que em GGR (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).
1.4.3 REPARO DE CROSSLINKS EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Crosslinks, se não removidos, podem provocar quebra cromossômica,
rearranjos ou morte celular. Seu acúmulo contribui para a instabilidade genômica e
envelhecimento de tecidos e órgãos. Por causa da sua toxicidade aumentada em
células proliferativas em comparação a agentes formadores de monoadutos, drogas
que promovem crosslinks têm recebido aplicação extensiva como drogas anti-
câncer. Por serem lesões que acoplam ambas as fitas da dupla-hélice, múltiplas vias
de reparo estão envolvidas, e o reparo é mais complexo que para monoadutos
(MUNIANDY et al., 2010).
42
A hipersensibilidade a agentes formadores de crosslinks é um aspecto
comum de células derivadas de indivíduos com desordens de instabilidade genômica
como anemia de Fanconi. (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006)
A anemia de Fanconi pode ser dividida pelo menos em 12 grupos de
complementação (A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, e M), e 11 dos 12 genes
responsáveis pela doença foram identificados (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006). As
proteínas codificadas por esses genes (proteínas FA) incluem uma ubiquitina ligase
(FANC-L/PHF9/POG), uma proteína monoubiquitinada (FANC-D2), uma helicase
(FANC-J/BACH1/BRIP1), uma proteína com motivos de helicase e um motivo de
nuclease (FANC-M), e uma conhecida proteína de susceptibilidade aos cânceres de
mama e de ovário (FANC-D1/BRCA2). As proteínas FA (que incluem BRCA2) e
outra conhecida proteína de susceptibilidade aos cânceres de mama e de ovário,
BRCA1, cooperam em um processo comum de reparo de crosslinks no DNA,
parecendo existir uma rede anemia de Fanconi-BRCA. Além disso, a interação
molecular e funcional de proteínas FA com proteínas responsáveis para outras
síndromes genéticas raras da instabilidade cromossômica na resposta de dano do
DNA está mais bem entendida (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006).
Consequentemente, a via FA parece atuar na regulação do reparo de DNA (Figura
10).
43
Figura 10: Esquema ilustrativo relacionando muitas proteínas que parecem participar no reparo de crosslinks (adaptado de TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006).
Cromatina
crosslink
44
O reconhecimento de um crosslink ligado ao DNA pode ocorrer de diferentes
formas, dependendo da fase do ciclo celular em que a célula se encontra, e do local
do genoma onde se formou (MUNIANDY et al., 2010)
Como mostrado na a seguir na figura 11, no contexto de um DNA que não
está se replicando, a distorção da estrutura helicoidal do DNA causada pela lesão
atrai as proteínas envolvidas na fiscalização global de dano do DNA. Este processo
envolve proteínas da via GGR, com XP-C conduzindo o reconhecimento inicial. A
parada da RNA polimerase no local da lesão durante a transcrição pode igualmente
servir como meio do reconhecimento de crosslink no DNA que não está se
replicando, envolvendo proteínas da via TCR. Após a formação do complexo de pré-
incisão, ocorre a incisão nos dois lados da lesão em uma das fitas da dupla-hélice
pelo complexo XPF-ERCC1 e por XP-G (não mostrado na figura), gerando uma
estrutura aberta onde polimerases especializadas podem realizar síntese translesão
a partir do molde contendo lesão. A estrutura que compreende uma das fitas ligada
pelo monoaduto gerado ao fragmento de DNA incisado, pode ser reconhecida por
DDB (DNA damage-binding protein) e talvez igualmente por glicosilases tais como
MPG ou Neil1 (MUNIANDY et al., 2010). Novamente, haverá processamento por
NER, que removerá o aduto restante na fita oposta.
Um crosslink também pode impedir a progressão de uma forquilha de
replicação simples ou dupla, o que é um atrativo às proteínas da via da anemia de
Fanconi, dentre outras. O reconhecimento inicial provavelmente é mediado pelo
complexo FANCM-FAAP24, que se torna parte do complexo FA. O complexo FA é
necessário para recrutar as proteínas de FANCD2 e de FANCI que são modificadas
através de ubiquitinação e de fosforilação. O crosslink é incisado por XPF-ERCC1 e
por Mus81-EME1 na fita principal, gerando uma quebra de fita dupla na forquilha. No
45
caso das forquilhas convergentes, o primeiro ciclo da incisão pode ocorrer em
qualquer uma das fitas. A estrutura aberta será preenchida por polimerases de
síntese translesão. Quando uma forquilha simples é interrompida, as polimerases
estenderão uma fita parental para preencher a abertura. Quando duas forquilhas
convergem em um crosslink, a fita-filha líder será estendida para contornar a lesão.
Após remoção do aduto restante na fita oposta pela via NER, a forquilha quebrada
será reconstruída por recombinação (MUNIANDY et al., 2010).
46
Figura 11: Esquema representativo das possíveis vias de reparo de crosslinks (adaptado de MUNIANDY et al., 2010).
Crosslink
Duplex de DNA Transcrição Replicação Convergência da forquilha de replicação
47
1.4.4 MECANISMOS DE REPARO DE DNA: ALVOS IMPORTANTES NAS QUIMIOTERAPIAS ANTI-TUMORAIS
A habilidade das células de reparar crosslinks é uma causa crítica
determinante da sensibilidade e os estudos clínicos recentes indicam que a
capacidade do reparo do DNA está implicada fortemente na sensibilidade inerente
do tumor e na resistência adquirida à drogas. Uma compreensão detalhada dos
mecanismos celulares que atuam para eliminar estas lesões críticas do DNA é
claramente importante. Sabe-se que desde bactérias, leveduras até células de
mamíferos, os crosslinks são eliminados pela ação coordenada de diversos
caminhos do reparo de DNA. Este conhecimento pode permitir o desenvolvimento de
alternativas para a resposta do tumor a agentes intercalantes e deve igualmente
ajudar no desenho de agentes mais eficazes que evadem o reparo de DNA. Além
disso, as proteínas que medeiam as reações do reparo representam potenciais alvos
para a intervenção terapêutica (McHUGH et al., 2001).
48
1.5 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
Mesmo que a atividade pró-oxidativa da mitomicina C tenha sido considerada
menos importante para a geração de sua citotoxicidade, essa propriedade comum às
quinonas pode ter sido uma das causas da morte rápida de pacientes com câncer de
pulmão no Hospital Pedro Ernesto/UERJ, após aplicação de quimioterapia com
MMC (comunicação pessoal feita pelo Dr. Marcos Paschoal, HUCFF/UFRJ, abril de
2006). Esta hipótese tem por base a grande perfusão de oxigênio do tecido
pulmonar, que teria aumentado a formação de radicais de oxigênio após a ativação
enzimática da MMC, gerando um quadro grave de estresse oxidativo em todo o
pulmão.
O lapachol e a �-lapachona são grandes promessas no que diz respeito a
novas abordagens quimioterápicas no tratamento contra o câncer. Muitos estudos
têm mostrado que ambas podem agir de várias formas após reduzidas
enzimaticamente dentro das células. Entretanto, sua capacidade de induzir estresse
oxidativo limita sua utilização (SILVA et al, 2003).
Por outro lado, a possibilidade da resistência de tumores à quimioterapia pela
ação de mecanismos de reparo de DNA, nos leva a buscar maior entendimento
desses mecanismos, o que futuramente, pode auxiliar na criação de novos
protocolos para tratamentos quimioterápicos (COMEN e ROBSON, 2010).
Ao comparar os efeitos entre essas naftoquinonas com os efeitos da MMC, no
ciclo e na viabilidade celular de linhagens estabelecidas de células humanas
deficientes e proficientes em genes de reparo de DNA, poderemos ter uma noção da
citotoxicidade relativa entre elas e se, como a MMC, são genotóxicas.
.
49
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a forma de atuação das quinonas �-lapachona e lapachol em
linhagens estabelecidas de células humanas normais e deficientes em mecanismos
de reparo de DNA, através da comparação com a atuação da quinona MMC.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a possibilidade das quinonas �-lapachona e lapachol agirem de
forma genótoxica.
Comparar as quinonas em estudo quanto à sua citotoxicidade.
50
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 LINHAGENS CELULARES
Foram utilizadas linhagens estabelecidas de fibroblastos humanos normais e
deficientes em genes que codificam proteínas atuantes no Reparo por Excisão de
Nucleotídeos (NER) em mamíferos: MRC5 (normal), XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-
C), XP6BE (XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A), e linfoblastos humanos
normais e deficientes no gene que codifica uma das proteínas atuantes na via de
reparo de crosslinks em mamíferos: HSC536 (normal) e HSC536NEO (FANC-C).
As linhagens de fibroblastos foram inicialmente cedidas pelo Dr. Alain Sarasin
(Laboratory of Genetic Instability and Cancer – Centre National de la Recherche
Scientifique – CNRS – France) e então repassadas pelo Dr. Carlos Frederico Martins
Menck (Laboratório de Reparo de DNA – Departamento de Microbiologia – Instituto
de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo – USP). As linhagens de
linfoblastos foram cedidas pelo Dr. Felippo Rosselli (Laboratory of Genetic Instability
and Cancer – Centre National de la Recherche Scientifique – CNRS – France).
51
QUADRO 1 - Linhagens celulares humanas utilizadas
Linhagem Fenótipo Origem
MRC5 normal fibroblasto
XP12RO XP-A fibroblasto
XP4PA XP-C fibroblasto
XP6BE XP-D fibroblasto
XP30RO XP-V fibroblasto
CS3BES3G1 CS-A fibroblasto
HSC536 (LIU) normal linfoblasto
HSC536NEO (NEO) FANC-C linfoblasto
As linhagens de fibroblastos foram imortalizadas por transformação com SV40
(Simian vacuolating virus 40 ou Simian virus 40). A linhagem de fibroblasto normal
(MRC5) é originária de tecido pulmonar normal, enquanto as linhagens deficientes
XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-D) e XP30RO (XP-V) são originárias
da pele de indivíduos com a doença xeroderma pigmentosum e CS3BES3G1 (CS-A)
da pele de indivíduos com a doença síndrome de Cockayne.
As linhagens linfoblastóides foram imortalizadas por transformação com EBV
(Epstein-Barr Virus). Ambas as linhagens, normal HSC536 e deficiente
HSC536NEO, são originárias do sangue de indivíduo com a doença anemia de
Fanconi, sendo que a linhagem normal foi transformada com cDNA contendo o gene
que codifica a proteína FANCC e a deficiente, com cDNA vazio.
52
3.2 ESTOCAGEM E MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES
As linhagens de fibroblastos e linfoblastos eram estocadas na concentração
de 106 a 107 células/mL de meio de congelamento (90% de soro fetal bovino
(Cultilab) e 10% de DMSO (Sigma)). As suspensões de células em meio de
congelamento eram colocadas em criotubos e mantidas congeladas em tanque de
nitrogênio líquido. Depois de serem descongeladas, as linhagens eram mantidas em
meios de cultura específicos de acordo com suas exigências, em estufa na
temperatura de 37º.C, com 95% de umidade e 5% de CO2.
Os fibroblastos eram cultivados em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s
Medium - Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina
(58,4g/L) e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina), até formarem uma
monocamada em estágio de semi-confluência, ou seja, até ocuparem cerca de 80%
da superfície da garrafa de cultura, momento em que podem ser utilizadas para
experimento. Os repiques de manutenção dessas culturas eram realizados a cada 3
dias, sendo feito primeiro uma lavagem das células com solução salina (Sigma),
para retirar o excesso de meio de cultura, depois a retirada das células da superfície
da garrafa pela adição de solução de tripsina/ EDTA (2,5 g/L tripsina e 1 g/L EDTA)
aquecida a 37ºC, e então as células eram ressuspensas em DMEM. Dessa
suspensão de células era retirada a alíquota a ser repicada. As culturas de
fibroblastos eram mantidas na diluição de 1/10 (1 mL de células para 10 mL de
cultura). Depois de descongelados, os fibroblastos eram mantidos em cultura até a
oitava repicagem, sendo então descartados e descongelado outro criotubo.
Os linfoblastos eram cultivados em RPMI 1640 (Sigma) com 12% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina), e os repiques eram feitos
em dias alternados por contagem em câmara de Neubauer através de microscópio
53
invertido das células não-coradas (viáveis) presentes na cultura pelo corante azul de
Trypan (método de exclusão) (Equação 5). Com o intuito de manter as células na
concentração final de 4X105 células/mL, era adicionado à cultura o volume de RPMI
1640 necessário (Equação 6). Os linfoblastos eram mantidos em culturas por até 3
meses.
(5)
Equação 5: Fórmula utilizada para a contagem de células viáveis em câmara de Neubauer,
possibilitando conhecer sua concentração na cultura (Ci).
(6)
Equação 6: Fórmula utilizada para calcular o volume de meio a ser adicionado à garrafa (V final = V
inicial da cultura + V a ser adicionado) e também para calcular o volume de cultura a ser retirado da
garrafa (Vi), quando do momento do plaqueamento.
3.3 QUINONAS E TRATAMENTO DAS CÉLULAS
O lapachol (PM 242,26 g/mol) e a �-lapachona (PM 242,27g/mol) foram
fornecidos pelo Prof. Dr. Antonio Ventura Pinto, do Núcleo de Pesquisas de Produtos
Naturais – UFRJ. Ambos foram diluídos em DMSO absoluto para uma concentração
final de 5 mg/mL. A mitomicina C (PM 334,33 g/mol – Sigma) foi diluída em água
destilada estéril, para uma concentração final de 1 mg/mL, e depois a solução foi
esterilizada com membrana de 0,22�m (Millipore). As alíquotas das soluções-
54
estoque foram guardadas a uma temperatura de -20ºC, sendo descongeladas
apenas no momento da utilização.
O tratamento das células com as quinonas era realizado a partir da diluição
das soluções-estoque em meio de cultura sem soro nas concentrações de 0,5, 1, 2, 4
e 8 µM para mitomicina C e �-lapachona, e 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 µM para lapachol. O
tempo de incubação das células com mitomicina C era de 1 hora e com �-lapachona
e lapachol era de 4 horas. As concentrações e o tempo de incubação com as
quinonas foram escolhidas de acordo com a literatura (DIATLOFF-ZITO et al., 1986;
PARK et al., 2005)
3.4 EXPERIMENTOS DE VIABILIDADE CELULAR ÀS QUINONAS
3.4.1 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
Os ensaios de viabilidade celular ao tratamento com quinonas foram
realizados com dois tipos de métodos colorimétricos em placas de 96 poços: os
testes da redução do sal de tetrazólio (MTT) e da incorporação do corante vital
vermelho neutro. O primeiro avalia a atividade celular em nível mitocondrial, pois
após a sua absorção, o MTT (3-(4,5-Dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de
tetrazolium) de cor amarela é reduzido pela enzima succinil-desidrogenase presente
nas mitocôndrias, uma enzima que é somente ativa nas células com um
metabolismo e cadeia respiratória intactos, a um produto chamado formazan de cor
púrpura, permitindo quantificar a porcentagem de células vivas (MOSMMANN,
1983). O outro avalia a viabilidade celular em nível lisossomal. Somente as células
viáveis são capazes de reter o corante, pois possuem lisossomos funcionais. O
vermelho neutro é um corante catiônico fraco que se acumula nos lisossomos das
55
células viáveis porque se liga a sítios aniônicos na matriz lisossomal (pH lisossomal
< pH citoplasmático). As mudanças da superfície da célula ou da membrana
lisossomal causadas pela ação do do xenobióticos resultam em uma diminuição da
entrada e da ligação do vermelho neutro (BORENFREUND e PUERNER, 1985).
No caso dos ensaios com os fibroblastos foi possível realizar os dois testes,
pela característica da aderência sobre superfícies. Como as quinonas sofrem
redução intracelular ao se ativarem, poderia haver uma alteração do metabolismo
mitocondrial, o que influenciaria nas respostas obtidas com o método MTT, sendo
estes resultados confrontados com os resultados obtidos com o método da
incorporação do corante vital vermelho neutro. No caso dos linfoblastos, que
crescem em suspensão, foi realizado somente o método do MTT. A solução-estoque
de MTT (5 mg/mL) e de vermelho neutro (1 mg/mL) foram feitas em tampão PBS
estéril, filtradas em membrana de 0,22 �m (Millipore) e mantidas em geladeira
protegidas da luz.
O protocolo de MTT consistia em colocar 30 µL nos poços com fibroblastos e
10 µL nos poços com linfoblastos de solução diluída de MTT (0,5 mg/mL), deixar as
placas protegidas da luz em estufa a 37ºC durante 3 horas e diluir o formazan com
100 µL de DMSO.
O protocolo de vermelho neutro consistia em colocar 30 µL de solução diluída
de vermelho neutro (0,05 mg/mL) nos poços com fibroblastos, deixar as placas
protegidas da luz em estufa a 37ºC durante 3 horas, retirar a solução de vermelho
neutro dos poços, retirar o excesso do corante por lavagem com tampão PBS e
então romper as células e diluir o corante internalizado com 100 µL de solução
solubilizadora (50% de metanol, 1% de ácido acético e água destilada).
56
A leitura das absorvâncias eram realizadas em leitor espectrofotométrico de
microplacas (SoftMax Pro 4.3LS – Espectra Max 190) a 490nm. A partir das leituras
de absorvância foram calculadas as porcentagens de viabilidade celular. Estes
dados foram representados em gráfico em função da concentração de quinona,
tendo como padrão 100% um controle de células na mesma microplaca (Equação 7).
(7)
Equação 7: Cálculo da porcentagem de células viáveis a cada concentração de tratamento.
3.4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
Nas placas de 96 poços, eram plaqueados em triplicata, 100 µL de cultura por
poço na concentração de 104 células/mL. Após 24 horas, eram realizados os
tratamentos. Após o tratamento com as quinonas, as células eram mantidas em
recuperação com DMEM fresco por 72 horas em estufa a 37ºC, seguindo-se então
os protocolos de MTT ou vermelho neutro e posterior leitura de absorvâncias em
leitor espectrofotométrico de microplacas.
Em alguns ensaios em que somente a linhagem normal (MRC5) foi utilizada, a
recuperação era feita em DMEM fresco contendo 1 mM de cafeína (PM 194,09
g/mol). A solução-estoque de cafeína (77 mM) foi feita em água destilada estéril,
esterilizada com membrana de 0,22 �m (Millipore) e armazenada à temperatura
ambiente.
No caso das linhagens linfoblastóides, o experimento era realizado em placas
de 6 poços. Eram plaqueados em duplicata, 2 mL de cultura na concentração de
4X105 células/mL. Como estas células crescem em suspensão, o tratamento era
57
realizado no mesmo dia. Após o tratamento, a droga era retirada e as células eram
incubadas em 2 mL de RPMI fresco em placa de 6 poços para as 72 horas de
recuperação. Para ser realizada a leitura das absorvâncias em leitor de microplacas,
de cada poço da placa eram retiradas três alíquotas de 100 µL para triplicata em
placa de 96 poços, onde então era realizado o protocolo de MTT.
Cada gráfico de viabilidade celular foi obtido a partir da média de três
experimentos distintos e os desvios-padrão calculados utilizando o programa
Microsoft Office Excel 2007. Nos gráficos, a porcentagem de células viáveis às
quinonas em cada concentração de tratamento foi obtida em função da viabilidade
dos controles negativos (meio de cultura puro ou com DMSO � 0,1%). No eixo das
ordenadas (eixo y) estão as porcentagens de células viáveis e no eixo das abscissas
(eixo x), a concentração das quinonas (µM).
3.5 EXPERIMENTOS DE CICLO CELULAR E MORTE CELULAR ÀS QUINONAS
3.5.1 CITOMETRIA DE FLUXO
Esta técnica rápida e objetiva é utilizada para se determinar diferentes
características das partículas biológicas. O citômetro de fluxo mede as propriedades
de células em suspensão, orientadas num fluxo laminar e interceptadas uma a uma
por um feixe de laser. O princípio da citometria de fluxo se baseia no fato de que,
quando a luz da fonte de excitação incide nas partículas em movimento, a luz é
desviada e ocorre emissão de fluorescência que é detectada por filtros de detecção
adequados para determinados comprimentos de onda, o que permite identificar as
células pelo seu tamanho (FSC – Forward Scatter) e granulosidade interna (SSC –
Side Scatter). Os fótons gerados, ao atingirem detectores específicos, são
58
convertidos em impulsos elétricos proporcionais ao número de fótons recebidos, os
quais são convertidos em sinais digitais podendo oferecer os resultados em
diferentes formas de análise tais com histogramas, dot-plot, tabelas, entre outros. O
citômetro tem capacidade de processar milhares de eventos individuais em questão
de segundos, o que torna a citometria de fluxo uma ferramenta das mais importantes
Os ensaios deste estudo se basearam no uso de iodeto de propídio (PI),
composto que se liga ao DNA. Este composto emite alta fluorescência vermelha
somente quando excitado pelo laser de argônio (488nm) e ligado ao DNA. A
intensidade de fluorescência emitida é diretamente proporcional a quantidade de
DNA existente na célula, permitindo assim diferenciar o DNA celular nas diferentes
fases do ciclo celular, G1, S e G2, do DNA fragmentado, pertencente a células que
já não estão se dividindo, ou seja, estão mortas (geralmente chamadas de células
em sub-G0 ou sub-G1). A fragmentação de DNA produz pedaços menores desse
material que irão apresentar baixa fluorescência quando comparados ao DNA
íntegro das células controle.
3.5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
Os ensaios de citometria foram feitos com as linhagens de fibroblastos normal
(MRC5) e XP30RO (XP-V). Essas linhagens eram plaqueadas em placas de 60 mm
na concentração de 2,5X104 células/mL. No dia seguinte ao plaqueamento, eram
feitos os tratamentos seguidos do período de recuperação com meio fresco por 72
horas. Após a recuperação, as células eram retiradas das placas e resuspensas em
500 µL de uma solução de PI (20 µg/mL de PI, 200 µg/mL de RNAse A (Sigma),
0,1% v/v de Triton X-100 (Sigma) e PBS). As amostras eram colocadas em tubos de
citometria, protegidas da luz e eram analisadas por citometria de fluxo, sendo
59
adquiridos 10 mil eventos por amostra. Nestes ensaios as células eram
permeabilizadas pelo detergente presente no tampão (Triton X-100), permitindo a
entrada do PI e seu intercalamento entre os pares de bases do DNA.
As aquisições foram feitas num citômetro BD FACSCalibur™ e as análises no
BD CellQuest Pro software. Os histogramas de ciclo e morte celular (número de
células versus intensidade de fluorescência – FL2) obtidos através da marcação feita
com PI do conteúdo de DNA foram gerados pela fragmentação do DNA presente na
amostra (vide APÊNDICE). Para comparar mais facilmente as amostras controle
com as amostras teste, os dados de ciclo e morte celular foram plotados em gráficos
de colunas (% de células versus concentração (µM)).
3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados foram obtidos a partir da média entre três experimentos distintos e
foram calculados os desvios-padrão. Para as análises estatísticas foram aplicados o
teste de Kruskal-Wallis e ANOVA – 2 fatores através do programa SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences) v.12.0. Valores com nível de significância de 5%
(p� 0,05) foram considerados estatisticamente significativos.
60
4 RESULTADOS
4.1 VIABILIDADE CELULAR DAS LINHAGENS FIBROBLÁSTICAS DEFICIENTES
EM REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) AO TRATAMENTO COM
DIFERENTES QUINONAS
Como o objetivo era o de verificar se o lapachol e a �-lapachona provocam
lesões no DNA que exijam atividade de proteínas envolvidas em reparo de DNA,
buscamos realizar experimentos de viabilidade celular com linhagens de fibroblasto
deficientes em genes de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e no gene XP-V,
e comparamos estes resultados com os obtidos com a MMC, agente que promove
lesões covalentes no DNA, como crosslinks. Os experimentos foram feitos com MTT
e vermelho neutro, para observarmos se a ação oxidante das quinonas influenciaria
no resultado.
Primeiramente, não houve diferença entre os resultados obtidos nos
experimentos de viabilidade celular pelo método de redução do MTT e de
incorporação de corante vital vermelho neutro para nenhuma das quinonas (Figuras
12, 13 e 14).
Para a MMC, a maioria das linhagens deficientes em reparo de DNA
apresentou crescente inativação com o aumento da concentração de tratamento,
atingindo na concentração máxima de 8 µM de droga, mais de 60% de inativação
(Figuras 12A e12B). No experimento de viabilidade celular utilizando MTT (Figura
12A), a porcentagem de células viáveis para as linhagens XP12RO (XP-A), XP6BE
(XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) foram aproximadamente 28,5%,
21,6%, 33,3% e 28,9%, respectivamente, enquanto que para a linhagem normal
(MRC5) e XP4PA (XP-C), a porcentagens de viabilidade foram de aproximadamente
61
70,5% e 64,1%. No experimento de viabilidade celular utilizando vermelho neutro
(Figura 12B), as porcentagens de viabilidade para as linhagens XP12RO (XP-A),
XP6BE (XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) foram de aproximadamente
27,9%, 20,6%, 45,9% e 34,3%, respectivamente, enquanto que para a linhagem
normal (MRC5) e XP4PA (XP-C), as porcentagens de viabilidade foram de
aproximadamente 74% e 55,3%.
Através da comparação entre as curvas de inativação, observa-se que quanto
maior as concentrações de tratamento com MMC, maior a inativação das linhagens
deficientes em XP-A, XP-D, XP-V e CS-A em relação à linhagem normal (MRC5),
enquanto que a linhagem deficiente em XP-C não apresenta aumento de inativação
com o aumento da concentração de tratamento (p=0,0001).
62
12. A)
12. B)
Figura 12: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (p=0,0001).
63
Para a quinona lapachol, todas as linhagens de uma maneira geral, se
situaram acima da faixa de 60% de viabilidade, mesmo na concentração mais de
duas vezes maior (20 µM) em relação à máxima concentração utilizada para MMC
(8µM), não sendo observada inativação diferencial entre as linhagens, tanto no
experimento realizado com MTT (figura 13A) como o realizado com vermelho neutro
(figura 13B). A linhagem XP12RO (XPA) no experimento feito pelo método do
vermelho neutro apresentou cerca de 45% de viabilidade nas concentrações de 10 e
20 µM (figura 13B).
No caso da quinona �-lapachona, sendo utilizadas concentrações
equimolares às de MMC, observa-se crescente e similar inativação da linhagem
normal (MRC5) e das linhagens deficientes em reparo, de acordo com o aumento da
concentração de tratamento (Figura 14). Na concentração de 8 µM de �-lapachona,
no experimento feito com MTT (Figura 14A), a linhagem normal (MRC5) apresenta
28,3% de viabilidade e as linhagens XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-
D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) apresentam aproximadamente 32,8%,
31%, 31%, 31% e 27% de viabilidade, respectivamente. No experimento feito com
vermelho neutro (Figura 14B), a linhagem normal (MRC5) apresenta 36% de
viabilidade e as linhagens XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-D), XP30RO
(XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) apresentam aproximadamente 32%, 36%, 36%, 26%
e 41% de viabilidade, respectivamente.
64
13. A)
13. B)
Figura 13: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
65
14. A)
14. B)
Figura 14: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
66
4.2 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM NORMAL (MRC5) AO TRATAMENTO
COM DIFERENTES QUINONAS E RECUPERAÇÃO EM MEIO DE CULTURA
CONTENDO 1 mM DE CAFEÍNA
Relatos na literatura afirmam que a cafeína potencializa efeitos mutagênicos e
letais de agentes genotóxicos, entretanto não se conhece exatamente como ocorre
esse efeito sinérgico. Cortez e colaboradores (2003) sugerem que a cafeína atuaria
prevenindo a fosforilação e ativação das quinases ATM e ATR in vitro, que regulam
os pontos de checagem do ciclo celular pela fosforilação múltipla de substratos
incluindo as quinases CHK1 e CHK2 e p53, e acelerando as respostas de checagem
do ciclo celular in vivo.
Para observar se a �-lapachona e o lapachol podem promover lesões sobre o
DNA, a linhagem normal (MRC5) foi incubada em meio contendo cafeína na
concentração de 1 mM, após o tratamento com as três quinonas, concentração esta
que aparentemente promove inibição de ATM e ATR (SARKARIA et al., 1999). Ou
seja, se houver maior sensibilidade da linhagem normal (MRC5) ao tratamento após
incubação com cafeína, provavelmente, o agente em questão danifica o DNA.
A partir da análise dos gráficos de viabilidade celular para esses ensaios
(Figuras 15, 16 e 17), observa-se que apenas para a MMC, a linhagem normal
apresenta maior inativação com o aumento da concentração de tratamento, tanto no
experimento feito com MTT, quanto para o experimento feito com vermelho neutro.
Para a MMC, sem incubação com cafeína, a linhagem normal (MRC5)
apresenta cerca de 70,5% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 26,8%
de viabilidade no experimento feito com MTT (Figura 15A), enquanto no experimento
feito com vermelho neutro, apresenta cerca de 74% e 40,8% de viabilidade,
respectivamente (Figura 15B) (p=0,0001).
67
Para lapachol, a normal (MRC5) sem incubação com cafeína apresenta cerca
de 62% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 60% para o experimento
feito com MTT (Figura 16A). enquanto para o experimento feito com vermelho
neutro, sem cafeína, apresenta cerca de 69% de viabilidade, e com cafeína
apresenta cerca de 73% de viabilidade (Figura 16B).
Para �-lapachona, a linhagem normal (MRC5) sem incubação com cafeína
apresenta cerca de 28,3% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 26% de
viabilidade, no experimento feito com MTT(Figura 17A), enquanto no experimento
feito com vermelho neutro, apresenta cerca de 36% e 41% de viabilidade,
respectivamente (Figura 17B).
68
15. A)
15. B)
Figura 15: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (p=0,0001).
69
16.A)
16.B)
Figura 16: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
70
17. A)
17. B)
Figura 17: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
71
4.3 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM LINFOBLÁSTICA DEFICIENTE EM
REPARO DE CROSSLINKS HSC536NEO (NEO) AO TRATAMENTO COM
DIFERENTES QUINONAS
Para verificar a promoção especificamente de crosslinks no DNA pela �-
lapachona e pelo lapachol, foram feitos experimentos de viabilidade celular com uma
linhagem linfoblastóide deficiente no gene FANC-C (HSC536NEO (NEO)) e uma
linhagem normal (HSC536 (LIU)) para reparo de crosslinks.
Observa-se inativação crescente da linhagem sensível a crosslinks (NEO) à
MMC com o aumento da concentração de tratamento, apresentando na
concentração máxima de 2 µM, cerca de 28,4% de viabilidade, enquanto a linhagem
normal (LIU) apresenta cerca de 61,7% de viabilidade para a mesma concentração
(Figura 18A) (p=0,0001).
Para o lapachol até a concentração máxima de 20 µM e para a �-lapachona
até a concentração máxima de 2µM, parece não haver inativação considerável da
linhagem sensível a crosslinks (NEO), sendo obtido 78% e 94% de viabilidade ao
lapachol para LIU e NEO respectivamente (Figura 18B), e 77,6% e 79,8% de
viabilidade à �-lapachona para LIU e NEO, respectivamente (Figura 18C). Neste
caso, os experimentos foram feitos apenas com MTT pela característica de
crescimento em suspensão das linhagens inviabilizar a utilização do protocolo de
vermelho neutro.
72
18. A)
18. B)
18.C)
Figura 18: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (LIU) e da linhagem deficiente (NEO) no gene FANCC a A) MMC (p=0,0001), B) lapachol e C) �-lapachona (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
73
4.4 ANÁLISE DO CICLO E MORTE CELULAR DAS LINHAGENS NORMAL (MRC5) E XP30RO (XP-V) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES QUINONAS
Com intuito de observar comparativamente a ação das quinonas sobre o ciclo
celular foram feitos ensaios de citometria de fluxo por marcação do conteúdo total de
DNA com PI (iodeto de propídio), sendo também observada a morte celular, das
linhagens normal (MRC5) e XP30RO (XP-V), com concentrações equimolares de
cada quinona. Isto poderia indicar se as quinonas �-lapachona e lapachol promovem
lesões no DNA, através da observação de indução ou não de parada do ciclo
celular, e da taxa de morte celular após os tratamentos. Se houver lesões no DNA
que por algum motivo não foram reparadas, o DNA sofrerá fragmentação, e através
de histogramas obtidos pelo tamanho dos fragmentos, podemos saber a quantidade
de células vivas em cada fase do ciclo celular e de células mortas.
A linhagem normal (MRC5) foi escolhida, pois através da linhagem proficiente
em todos os genes de reparo, seria possível observar mudanças no ciclo celular,
como acúmulo de células em uma determinada fase para reparação de danos no
DNA, assim como a recuperação das lesões no DNA pela quantidade de células
viáveis e mortas após os tratamentos.
Com a linhagem XP30RO (XP-V), deficiente na DNA polimerase �, seria
possível observar se as quinonas lapachol e �-lapachona promovem ou não dano no
DNA, impedindo a continuação da síntese de DNA. Esta polimerase realiza síntese
translesão, sintetizando DNA frente uma fita-molde contendo lesão. Provavelmente,
na ausência dessa polimerase, se a droga provoca lesões no DNA, a linhagem
XP30RO (XP-V) apresentaria sensibilidade, já que não seria possível a ocorrência
da síntese translesão impedindo a formação de lacunas (MUNIANDY, et al., 2010,
CRUET-HENNERQUART et al., 2010).
74
Nas concentrações testadas, a MMC foi a única quinona que modificou o
ciclo celular das linhagens e provocou a morte celular (Figuras 19, 20 e 21).
Na figura 19A podemos observar que para a MMC o ciclo celular da linhagem
normal (MRC5) em 1 µM sofre ligeira modificação em seu ciclo celular, com
diminuição da quantidade de células na fase G1 e maior acúmulo de células na fase
G2. Já em 2 µM, além da diminuição da quantidade de células na fase G1,
observamos acúmulo de células na fase S (G1, p=0,001; S, p=0,0001; G2, p=0,004).
Estas modificações não são observadas para as duas outras quinonas, lapachol
(Figura 20A) e �-lapachona (Figura 21A). Na figura 19A, observamos também que
para MMC a linhagem normal (MRC5) apresenta pequeno aumento da morte celular
com o aumento da concentração de tratamento, entretanto, não há aumento da
morte celular com o aumento da concentração de tratamento no caso do lapachol
(Figura 20A) e da �-lapachona (Figura 21A).
No caso da linhagem XP30RO (XP-V), observamos que também só houve
mudança no ciclo celular e morte celular quando esta foi tratada com MMC (Figuras
19B, 20B e 21B). Para a linhagem XP30RO (XP-V), houve acúmulo considerável de
células em relação à linhagem normal (MRC5) na fase S em 2 µM de MMC (G1,
p=0,0001; S, p=0,0001; G2, p=0,002) e aumento de morte celular com o aumento da
concentração de tratamento (p=0,0001). Na concentração de 2 µM de MMC, houve
cerca de 50 vezes mais morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) em relação ao
controle (Figura 19B), e cerca de 5 vezes mais morte celular em relação à linhagem
normal (MRC5) para a mesma concentração (Figura 19A).
75
19.A)
19.B)
Figura 19: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com MMC (% de células versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (MRC5 ciclo celular – G1, p=0,001; S, p=0,0001; G2, p=0,004/ XP-V ciclo celular – G1, p=0,0001; S, p=0,0001; G2, p=0,002/ XP-V morte celular – p=0,0001).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2
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S
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células mortas
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células mortas
células vivas
76
20.A)
20.B)
Figura 20: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com lapachol (% de células versusconcentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
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células mortas
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células mortas
células vivas
77
21.A)
21.B)
Figura 21: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com �-lapachona (% de células versusconcentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.
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células mortas
células vivas
78
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com os protocolos de redução de MTT e de
incorporação de vermelho neutro utilizados para verificação da viabilidade celular
foram semelhantes. Isto pode indicar que apesar das quinonas serem pró-oxidativas
e poderem desequilibrar a captação de elétrons na cadeia respiratória, os possíveis
efeitos sobre as membranas e sobre o metabolismo mitocondrial não influenciaram
no resultado obtido por tais métodos. Muitos trabalhos já utilizaram estes dois
métodos para medir a viabilidade celular à quinonas e não reportaram interferência
nos resultados (DIATLOFF-ZITO et al., 1986; HU, et. al., 2000, PARK et al., 2005,
PEREIRA, et al., 2006).
5.1 RELEVÂNCIA DO REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) NA VIABILIDADE DE CÉLULAS HUMANAS TRATADAS COM QUINONAS
De um modo geral, os resultados dos ensaios parecem indicar que entre as
três quinonas utilizadas neste estudo, a MMC deve ser a única capaz de promover
adutos com o DNA, dentre estes, os crosslinks.
Somente para a MMC foi observada a formação de um gradiente entre as
curvas de inativação das linhagens normal (MRC5) e as linhagens deficientes nos
genes de reparo por excisão de nucleotídeos, XP-A, XP-C, XP-D e CS-A, e a
linhagem XP-V, deficiente em DNA polimerase �. Este fenômeno não ocorre para a
�-lapachona e o lapachol. (Figuras 12,13 e 14).
A quinona lapachol, como já havia sido relatado por Silva e colaboradores
(2003), parece ser menos efetivo, sendo necessárias altas concentrações para
promover algum efeito citotóxico, pois mesmo nas concentrações mais altas
utilizadas (10 µM e 20 µM) não ocorreu inativação considerável de nenhuma
79
linhagem. Além disso, o lapachol não promoveu formação de um gradiente entre as
curvas de inativação das linhagens normal (MRC5), deficientes em reparo por
excisão de nucleotídeos (NER) e a linhagem deficiente XP-V, provavelmente por
também não promover um efeito genotóxico (Figura 13), fato este que contradiz a
literatura (HUSSAIN et al., 2007, ALMEIDA, 2009).
O que podemos observar a partir das curvas de inativação para o caso da �-
lapachona é que, ao contrário do que ocorre para o lapachol, esta quinona parece
ser altamente citotóxica. Isto devido ao fato de que assim como todas as outras
linhagens deficientes, a linhagem normal (MRC5) sofreu severa inativação, não
parecendo ser necessária proficiência em reparo de DNA ou em DNA polimerase �
(Figura 14).
A inativação similar das linhagens deficientes em reparo por excisão de
nucleotídeos (NER) XP-A, XP-D e a CS-A, linhagem deficiente no reconhecimento
pelo reparo por excisão de nucleotídeos acoplado à transcrição (TCR), e a
resistência da linhagem XP-C, deficiente no reconhecimento pelo reparo global do
genoma por excisão de nucleotídeos (GGR) à MMC em comparação com a
linhagem normal (MRC5), indicam a exigência de reparo pela via acoplada à
transcrição (TCR), o que é condizente com a presença de crosslinks, adutos que
promovem a interrupção da transcrição, por se intercalarem entre as fitas da dupla-
hélice de DNA, impedindo sua abertura. E ainda, a crescente inativação da linhagem
deficiente XP-V pode indicar que a DNA polimerase � deve atuar na síntese
translesão frente às lesões causadas pela MMC (Figura 12).
Em estudos realizados pelo nosso grupo (VIDAL et al., 2006) observamos que
a cepa deficiente no gene uvrB, que codifica a proteína UvrB em E. coli,
correspondente à XPD em mamíferos (BIENSTOCK et al., 2003), apresenta
80
hipersensibilidade à MMC. Neste trabalho observamos que a linhagem XP-D foi uma
das linhagens que apresentou maior sensibilidade à MMC, evidenciando que estas
proteínas possuem funções importantes na reparação das lesões causadas por esta
quinona.
5.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO GENOTÓXICA DAS QUINONAS ATRAVÉS DA INCUBAÇÃO COM CAFEÍNA
Nos ensaios de viabilidade celular realizados utilizando somente a linhagem
normal (MRC5) para verificar a ação da cafeína sobre o efeito da �-lapachona e do
lapachol em comparação com ação já esperada sobre o efeito da MMC, pois esta é
reconhecidamente genotóxica, observamos que houve ação sinergística apenas
sobre o efeito da MMC, o que parece indicar que a �-lapachona e o lapachol não
são genotóxicos. Mesmo em altas concentrações (10 e 20 µM) de lapachol, não foi
observada ação potencializadora de efeito pela cafeína (Figuras 15, 16 e 17).
5.3 INVESTIGAÇÃO SOBRE A FORMAÇÃO DE CROSSLINKS PELAS QUINONAS
Nos ensaios realizados a fim de observar se a �-lapachona e o lapachol
possuem capacidade de formação de crosslinks como a MMC, utilizamos
concentrações equimolares baixas (0,5, 1 e 2 µM), pois se estas promovem tais
adutos tão críticos para a viabilidade celular, em baixas concentrações já
poderíamos teoricamente observar inativação da linhagem sensível a crosslinks
utilizada (HSC536NEO-(NEO)). Esta linhagem é deficiente no gene FANC-C, que
codifica a proteína FANC-C participante do complexo FA de reconhecimento de
parada de forquilha de replicação por lesões obstrutivas na dupla-hélice de DNA. A
81
linhagem NEO, sensível a crosslinks, apresentou inativação apenas à MMC (Figura
18A), fenômeno já esperado, o que não ocorreu para o lapachol (Figura 18B) e a �-
lapachona (Figura 18C), indicando ser improvável a formação de crosslinks por
estas quinonas, o que de certa forma também poderia ser esperado já que pelos
resultados dos outros ensaios, estas quinonas não parecem ter efeito genotóxico.
5.4 INFLUÊNCIA DAS QUINONAS SOBRE O CICLO CELULAR
Quanto aos ensaios de ciclo celular e morte celular para MMC foi possível
observar uma alteração do ciclo celular da linhagem deficiente no gene XP-V, que
codifica a DNA polimerase �, de forma mais acentuada que a alteração observada
no ciclo celular da linhagem normal (MRC5), com acúmulo de células na fase S do
ciclo celular, principalmente na concentração de 2µM. Este fenômeno reflete a
indução de checagem do DNA, onde ocorrerá a possibilidade de reparo de DNA ou
de morte celular. Como a linhagem normal é proficiente em reparo de DNA, o
resultado foi como o esperado, em que ao ocorrer o processo de checagem, o DNA
é reparado e a viabilidade das células ainda permanece alta (Figura 19A).
Para a linhagem deficiente no gene XP-V, há acúmulo de células na fase S
em 2µM, e este é mais que o dobro do acúmulo que ocorre na linhagem normal para
a mesma concentração, sendo que a viabilidade diminui com o aumento da
concentração de tratamento (Figura 19B). Isto ocorre provavelmente pela deficiência
na DNA polimerase �, que promove síntese translesão, permitindo a continuação do
processo de replicação quando as polimerases não-especializadas ficam impedidas
de continuar a síntese pela existência de lesões, evitando a formação de lacunas no
DNA (MUNIANDY, et al., 2010, CRUET-HENNERQUART et al., 2010).
82
A parada do ciclo celular na fase S, provavelmente está relacionada à
formação de lesões obstrutivas na dupla-hélice que impedem a passagem da
forquilha de replicação. Sabendo-se que a MMC promove crosslinks no DNA, é
provável que sejam estes adutos os responsáveis pelo fenômeno de parada do ciclo
na fase S.
As outras duas quinonas �-lapachona e lapachol não promoveram
modificação no ciclo celular da linhagem normal (Figuras 20A e 21A) nem da
linhagem deficiente em DNA polimerase � (Figuras 20B e 21B). Também não há
morte celular acentuada da linhagem XP-V provocada por estas drogas. Este
resultado corrobora os resultados obtidos nos ensaios anteriores, onde parece não
haver ação genotóxica por parte da �-lapachona e do lapachol, indicando que �-
lapachona e o lapachol não devem promover lesão no DNA.
83
CONCLUSÕES
- A MMC apresenta-se como a melhor quinona para inativação celular,
especialmente marcante na ausência de XP-A, XP-D e XP-V.
- A �-lapachona tem um efeito tóxico geral indistinto para as diferentes linhagens
deficientes em reparo de DNA, indicando uma ação não-genotóxica, mas citotóxica.
Provavelmente seu efeito oxidativo geral prevaleça sobre algum possível mecanismo
de ligação ao DNA.
- O lapachol parece, como a �-lapachona, ter um efeito tóxico geral indistinto para as
diferentes linhagens deficientes em reparo de DNA, indicando uma ação não-
genotóxica. Além disso, parece também não agir eficientemente de forma citotóxica.
84
PERSPECTIVAS
- Havendo possibilidade de silenciar pelo menos um dos genes que parecem ser
relevantes para a remoção de lesões provocadas por MMC, XP-A, XP-D ou CS-A
em células tumorais, será possível criar um protocolo mais eficiente para
quimioterapia por MMC com doses gerais mais reduzidas e, portanto, menos tóxicas.
- Visto que a �-lapachona provavelmente tem seu efeito citotóxico geral prevalente
sobre algum possível mecanismo de ligação ao DNA, a principal perspectiva seria a
de trabalhar com mecanismos pró-oxidantes em terapêutica coadjuvante, uma vez
que essa quinona tem fácil e barata obtenção.
- O lapachol não parece ser eficiente em promover ação citotóxica nem genotóxica,
sendo uma quinona não muito promissora. Modificações em sua estrutura química
podem aumentar sua eficiência.
85
REFERÊNCIAS
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Open Nat. Prod. J., v.2, p.42-47, 2009.
AMARANTE-MENDES, G.P., GREEN, D.R. The regulation of apoptotic cell death.
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BHATAVDEKAR, J.M., PATEL, D.D., SHAH, P.M., RAWAL, U.M. Mitomycin C
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p.223-228, 1998.
BARREIRO, E.J., FRAGA, C.A.M.; Química Medicinal: As bases Moleculares da
Ação dos Fármacos. Porto Alegre: Artmed, 2001.
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structure of an intrastrand cross-link adduct of mitomycin C and DNA. Biochemistry,
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97
APENDICE
APÊNDICE A - Histogramas representativos do ciclo celular e da morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com mitomicina C. a) controle b) 1µM de mitomicina C c) 2µM de mitomicina C (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
98
APENDICE B - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com mitomicina C. a) controle b) 1µM de mitomicina C c) 2µM de mitomicina C (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
99
APENDICE C - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com �-lapachona. a) controle b) 1µM de �-lapachona c) 2µM de �-lapachona (histograma de ciclo celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
100
APENDICE D - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com �-lapachona. a) controle b) 1µM de �-lapachona c) 2µM de �-lapachona (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
101
APENDICE E - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com lapachol a) controle b) 1µM de lapachol c) 2µM de lapachol (histograma de ciclo celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
102
APENDICE F - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com lapachol. a) controle b) 1µM de lapachol c) 2µM de lapachol (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).
a)
b)
c)
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