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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PESCA
KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS M ARINHAS
DO LITORAL CEARENSE
FORTALEZA
2012
2
KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS MARINHAS DO
LITORAL CEARENSE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Engenharia de Pesca. Área de concentração: Biotecnologia de Recursos Aquáticos.
Orientadora: Profa Silvana Saker Sampaio.
FORTALEZA
2012
KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS MARINHAS DO
LITORAL CEARENSE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Engenharia de Pesca. Área de concentração: Biotecnologia de Recursos Aquáticos.
Aprovada em: 05/10/2012
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________ Profa Silvana Saker Sampaio, Ph.D. (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________ Prof. Alexandre Holanda Sampaio, Ph.D.
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________ Prof. Francisco Arnaldo Viana, D.Sc.
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN)
______________________________________ Prof. Paulo Henrique Machado de Sousa, D.Sc.
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________ Profa Valéria Laneuville Teixeira, D.Sc.
Universidade Federal Fluminense (UFF)
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Ao meu marido, Cleber, pelo amor, apoio e
cumplicidade.
Aos meus pais, Ocelo e Maria José, por me
amarem incondicionalmente e pelo incentivo e
apoio em todas as etapas de minha vida.
Às minhas irmãs, Kelly e Kelry pela amizade e
carinho.
Dedico este trabalho.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, que me deu o dom da vida, e por sua presença constante em todos os
momentos de minha vida.
Ao meu marido, Cleber Pereira Cavalcante, pois sempre que eu quis fraquejar me
encorajou a continuar, pelo amor e carinho demonstrados nesses últimos anos e pelos
domingos que abriu mão para me ajudar em minhas pesquisas.
Aos meus pais, José Ocelo Pires e Maria José dos Santos Pires, as minhas irmãs,
Kelly Christine Pires e Kelry Nayara Pires e ao meu tio Aderson Maximiano pelo incentivo,
motivação, compreensão e por estarem sempre presentes em minha vida.
Aos meus sogros Francisco Rodrigues Cavalcante e Maria Raimunda Pereira
Cavalcante e aos meus cunhados Dejane Cavalcante de Oliveira e George Luís de Oliveira
pelo apoio, motivação e torcida nessa nova conquista.
A Profa Dra Silvana Saker Sampaio por ter acreditado em meu potencial, pela
valiosa orientação e conhecimentos passados durante a execução deste trabalho, pelo carinho
e amizade, confiança e principalmente pelos exemplos de ser humano e profissionalismo.
Ao Prof. Dr. Alexandre Holanda Sampaio, pelo apoio durante a realização deste
experimento, sempre procurando proporcionar boas condições de trabalho e pelas valiosas
sugestões.
Aos membros da banca, Prof. Dr. Francisco Arnaldo Viana, Prof. Dr. Paulo
Henrique Machado de Sousa e Profa Dra Valéria Laneuville Teixeira, por terem tão
gentilmente aceito o convite e por suas valiosas sugestões.
Ao Prof. Dr. Celso Shiniti Nagano, Coordenador do Programa de Pós-Graduação
em Engenharia de Pesca, pela troca de experiência, empréstimo de equipamentos e pelas
palavras de incentivo durante a execução do trabalho.
Aos Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada e Profa Dra Kyria Santiago Nascimento, do
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL), por terem aberto as portas do
laboratório para que eu pudesse terminar as análises, quando pensei que não pudesse mais
concluí-las.
Ao Prof. Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias do Laboratório de Bioquímica
Marinha (BIOMAR) por ter sido muito prestativo sempre que o solicitei.
Ao amigo Daniel Barroso de Alencar pela amizade e companheirismo, pelo
incentivo, pelo apoio incondicional desde a época do Mestrado, por escutar meus desabafos e
me fazer acreditar na minha capacidade.
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À amiga Márcia Barbosa de Sousa pelos seus ensinamentos de vida, por sempre
me mostrar que podemos ser um ser humano melhor.
Às minhas queridas amigas de laboratório Mirela Gouveia e Rebeca Larangeira de
Lima pela ajuda na execução dos experimentos.
Ao meu amigo do laboratório BIOMAR José de Sousa Júnior por ter sempre me
ajudado nas instalações e consertos de equipamentos, pela ajuda nas coletas e pelos valiosos
momentos de descontração.
Aos amigos do BIOMOL, Rafael Simões e Suzete Roberta, pelo suporte e ajuda
durante minha estada no laboratório, em um momento crucial da minha pesquisa e ao
Jefferson Pablo de Sousa Saboya pela ajuda na parte de informática, pelo apoio e amizade.
A minha ex-professora do Curso de Graduação e hoje amiga de doutorado
Alessandra Cristina da Silva pelas experiências trocadas, pelas palavras de incentivo e pela
análise estatística do meu trabalho.
Ao Sr. Antônio Ferreira de Lima pelo suprimento diário de água destilada e pelo
carinho.
À minha amiga Durvânia Andrade por se preocupar sempre com meu bem estar e
pela compreensão por minha ausência.
À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP) e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por terem concedido a bolsa de
doutorado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo financiamento do projeto de pesquisa.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação que contribuíram para a
minha formação profissional.
À secretária do Programa de Pós-Graduação, Rogéria Setúbal que sempre prestou
seus serviços com zelo.
A todos, os meus sinceros agradecimentos.
5
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito. Não
sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não
sou o que era antes”.
(Marthin Luther King)
6
RESUMO
As macroalgas marinhas são fontes de compostos com atividade antioxidante como
compostos fenólicos, pigmentos carotenóides e vitamina E. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a atividade antioxidante in vitro de extratos metanólicos (50%) de macroalgas
cearenses, através da capacidade de sequestrar o DPPH, habilidade de quelação do íon ferroso
(FIC), poder de redução do ferro (FRAP) e degradação do β-caroteno. Além disso, também
foi determinado o conteúdo de compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteu, seguido
de uma prospecção fitoquímica para indicar possivelmente as principais classes de compostos.
Os teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δ-tocoferol foram quantificados por cromatografia
líquida de alta eficiência. De um modo geral, capacidade de sequestrar o DPPH, FRAP e
conteúdo de compostos fenólicos foram maiores nos extratos das algas pardas, seguidos dos
das algas verdes e vermelhas. FIC mais elevada foi observada nos extratos das algas
vermelhas, seguidas das pardas e verdes. No sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico as
maiores atividades foram determinadas nas clorófitas e rodófitas, tendo variado de 64,8% a
95,3%, nas ocrófitas, inferiores a 40,5%, com exceção de Padina gymnospora com cerca de
92%. Os extratos algáceos analisados apresentaram atividades antioxidantes semelhantes ou
superiores aos controles positivos (quercetina, BHA, BHT, ácido ascórbico, α-tocoferol, β-
caroteno e EDTA). Fenóis foram detectados apenas em algas pardas; antocianinas,
antocianidinas, chaconas, auronas e leucoantocianidinas foram observadas apenas em algumas
espécies do Filo Rhodophyta; as demais classes de compostos fenólicos investigadas foram
observadas em pelo menos uma espécie dentro de cada Filo, com exceção de flavanonóis que
não foram encontrados nos extratos de algas verdes. O conteúdo de compostos fenólicos foi o
principal responsável pelas atividades de sequestro do DPPH, FRAP e FIC nas algas verdes e
vermelhas. Nas pardas esses compostos só influenciaram no FRAP. β-Caroteno e luteína
foram quantificados em todos os extratos de algas verdes, vermelhas e pardas, sendo a luteína
o carotenóide majoritário nas clorófitas e rodófitas. Com exceção das algas pardas que
naturalmente não possuem α-caroteno, apenas os extratos de cinco espécies de clorófitas e
rodófitas não apresentaram esse composto. Todos os extratos analisados apresentaram α-
tocoferol, menos Ulva fasciata e U. lactuca. Extratos de onze espécies apresentaram δ-
tocoferol. As atividades antioxidantes e os teores de compostos detectados nos extratos
algáceos foram distintos, mas todos eles apresentaram potencial antioxidante.
Palavras-chave: Macroalgas. Atividade antioxidante. Compostos fenólicos. Carotenóides.
Vitamina E.
7
ABSTRACT
Seaweeds are sources of a wide variety of beneficial compounds for human. Many of these
compounds have antioxidant activity, such as phenolic compounds, carotenoids, and vitamin
E. The aim of this research was to evaluate the in vitro antioxidant activity of 50% methanolic
extracts from seaweed collected in the coastline of Ceará State, Brazil. The methods used
were: DPPH radical scavenging, ferrous ion chelation (FIC), ferric reducing antioxidant
power (FRAP), and β-carotene bleaching. In addition to in vitro antioxidant activity, the total
phenolic content (TPC) was measured by the Folin-Ciocalteu method, followed by a
phytochemical prospecting to point out which are the main classes of compounds present in
the algal extracts. The quantification of carotenoids (α- and β-carotene, and lutein) and
vitamin E (α- and δ-tocopherol) was carried out by HPLC. In general, the extracts of brown
algae showed the highest ability to scavenger the DPPH radical, the largest FRAP and the
highest TPC, followed by extracts of green and red algae. The greatest FIC was observed in
red alga extracts, followed by brown and green alga extracts. The high antioxidant activity in
β-carotene/linoleic acid model system of green and red alga extracts ranged from 65% to
95%, however it represented less than 40% in brown alga extracts, exception to Padina
gymnospora extract which presented activity up to 92%. The majority of the algal extracts
analyzed in this study presented activity similar to or even greater than those observed in
positive controls (quercetin, BHA, BHT, ascorbic acid, α-tocopherol, β-carotene and EDTA).
Fenols were detected in brown algae only; anthocyanins, anthocyanidins, chacons, aurons and
leucoanthocyanins were observed in some species of Rhodophyta Phylum. All the other
classes of phenolic compounds were found in at least one species within each Phylum,
exception to flavononols which have not been detected in green alga extracts. TPC was the
main responsible for the ability to scavenger the DPPH radical, FIC and FRAP in green and
red algae. On the other hand, in brown algae TCP was influenced only by FRAP. All extracts
of green, red and brown algae exhibited the presence of β-carotene and lutein. The latter was
the major carotenoid within Chlorophyta and Rhodophyta. Naturally absent in brown algae, α-
carotene was not detected in five species of Chlorophyta and Rhodophyta algae. α-Tocopherol
was determined in all species, except Ulva fasciata and U. lactuca extracts. The isomer δ-
tocopherol was quantified in eleven out of twenty-three alga species. Antioxidant activity and
levels of compounds in the algal extracts were different, but all of them showed antioxidant
potential.
Keywords: Seaweeds. Antioxidant activity. Phenolic compounds. Carotenoids. Vitamin E.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Estruturas fenólicas dos antioxidantes sintéticos............................................ 23
Figura 2 - Estrutura genérica de uma molécula de flavonóide........................................ 28
Figura 3 - Estrutura química dos principais ácidos benzóicos......................................... 28
Figura 4 - Estrutura química dos principais ácidos cinâmicos........................................ 28
Figura 5 - Ciclização do ácido o-cumárico em cumarina................................................ 28
Figura 6 - Estruturas químicas dos carotenóides de ocorrência mais comum nas algas. 32
Figura 7 - Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis........................................... 34
Figura 8 - Capacidade de sequestrar o radical livre DPPH. (A) Chlorophyta, (B)
Rhodophyta e (C) Ochrophyta........................................................................ 50
Figura 9 - Habilidade de quelação do íon ferroso. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta
e (C) Ochrophyta........................................................................................... 57
Figura 10 - Poder de redução do ferro. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C)
Ochrophyta.................................................................................................... 62
Figura 11 - Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico. (A)
Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.......................................... 69
Figura 12 - Curva padrão de ácido gálico, com concentração de 1 a 250 mg L-1............ 74
Figura 13 - Conteúdo fenólico total nos extratos algáceos. (A) Chlorophyta, (B)
Rhodophyta e (C) Ochrophyta...................................................................... 75
Figura 14 - Curvas padrão de carotenóides submetidos à saponificação e partição. (A)
β-caroteno e (B) luteína................................................................................. 85
Figura 15 - Curvas padrão de tocoferóis submetidos à saponificação e partição. (A) α-
tocoferol e (B) δ-tocoferol............................................................................. 86
Figura 16 - Cromatograma típico de β-caroteno (Sigma) e luteína (Duane Reade)
submetidos à saponificação e partição.......................................................... 87
Figura 17 - Teores de carotenóides nos extratos de Chrolorophyta. (A) α-caroteno, (B)
β-caroteno e (C) luteína................................................................................. 89
Figura 18 - Teores de carotenóides nos extratos de Rhodophyta. (A) α-caroteno, (B)
β-caroteno e (C) luteína................................................................................. 91
Figura 19 - Teores de carotenóides nos extratos de Ochrohyta. (A) β-caroteno e (B)
luteína............................................................................................................ 95
9
Figura 20 - Cromatograma típico de α- e δ-tocoferol (Sigma) submetidos à
saponificação e partição................................................................................
97
Figura 21 - Teores de tocoferóis nos extratos de Chlorophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-
tocoferol........................................................................................................ 99
Figura 22 - Teores de tocoferóis nos extratos de Rhodophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-
tocoferol........................................................................................................ 101
Figura 23 - Teores de tocoferóis nos extratos de Ochrophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-
tocoferol........................................................................................................ 102
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Provas fitoquímicas das classes de antocianinas, antocianidinas e
flavonóides....................................................................................................... 44
Tabela 2 - Provas fitoquímicas das classes de leucoantocianidinas, catequinas e
flavonas............................................................................................................ 44
Tabela 3 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta para
sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...................... 51
Tabela 4 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta para
sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...................... 53
Tabela 5 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta para
sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...................... 55
Tabela 6 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Chlorophyta quanto à
habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).................................................... 59
Tabela 7 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Rhodophyta quanto à
habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).................................................... 59
Tabela 8 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Ochrophyta quanto à
habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).................................................... 59
Tabela 9 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta
quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).................................................. 63
Tabela 10 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta
quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).................................................. 65
Tabela 11 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta
quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).................................................. 67
Tabela 12 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta
quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido
linoléico............................................................................................................ 70
Tabela 13 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta
quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido
linoléico............................................................................................................ 71
Tabela 14 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta
quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido
linoléico............................................................................................................ 73
11
Tabela 15 - Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos
presentes nos extratos algáceos........................................................................
78
Tabela 16 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) para o conteúdo fenólico total
(CFT) e ensaios antioxidantes in vitro............................................................. 82
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 19
2.1 Radicais livres............................................................................................................. 19
2.2 Antioxidantes.............................................................................................................. 21
2.3 Potencial antioxidante das macroalgas marinhas.................................................... 24
2.3.1 Compostos fenólicos.................................................................................................... 27
2.3.2 Carotenóides................................................................................................................ 30
2.3.3 Tocoferóis..................................................................................................................... 33
2.4 Ensaios antioxidantes in vitro..................................................................................... 35
2.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)....... 36
2.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).............................................................. 37
2.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP).............................................................................. 37
2.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico...................... 37
2.4.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)......................................................... 38
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 39
3.1 Coleta das macroalgas e Preparação do material................................................... 39
3.2 Reagentes..................................................................................................................... 39
3.3 Preparação dos extratos para os ensaios antioxidantes in vitro............................. 40
3.4 Ensaios antioxidantes in vitro.................................................................................... 40
3.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...... 41
3.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).............................................................. 41
3.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP).............................................................................. 41
3.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico..................... 42
3.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)..................................................... 42
3.6 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos................. 43
3.6.1 Teste para fenóis e taninos.......................................................................................... 43
3.6.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides............................................. 43
3.6.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas............................................. 44
3.6.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavanonóis e xantonas........................................ 44
3.6.5 Teste para confirmação de catequinas....................................................................... 44
13
3.7 Extração, Identificação e Quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e
luteína) e tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)........................................................................
45
3.7.1 Preparação dos extratos, Saponificação e Partição.................................................... 45
3.7.2 Soluções-padrão de β-caroteno, luteína, α- e δδδδ-tocoferol........................................... 45
3.7.3 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa......................................... 46
3.7.4 Cálculo dos teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δδδδ-tocoferol............................... 46
3.8 Análises estatísticas..................................................................................................... 47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 48
4.1 Ensaios antioxidantes in vitro.................................................................................... 48
4.1.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)..... 48
4.1.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).............................................................. 56
4.1.3 Poder de redução do ferro (FRAP).............................................................................. 61
4.1.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico..................... 68
4.2 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)...................................................... 74
4.3 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos................. 77
4.4 Correlação entre o conteúdo fenólico total (CFT) e os ensaios antioxidantes in
vitro................................................................................................................................ 81
4.5 Extração, identificação e quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e
luteína) e tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)........................................................................ 84
4.5.1 Curvas padrão de carotenóides e tocoferóis................................................................ 84
4.5.2 Carotenóides (α- e β-caroteno e luteína)..................................................................... 86
4.5.3 Tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)......................................................................................... 97
5 CONCLUSÃO............................................................................................................. 106
REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 107
16
1 INTRODUÇÃO
As algas pertencem a um diversificado grupo de organismos fotossintéticos
abrangendo desde células únicas e microscópicas a estruturas complexas, como as macroalgas
marinhas que podem atingir muitos metros de comprimento. Crescem tanto em água doce
como em ambiente marinho, sendo encontradas também em ambientes terrestres úmidos.
Como organismos fotossintéticos, são os maiores produtores de oxigênio e matéria orgânica
nos ambientes aquáticos, sendo responsáveis por 30% a 50% da fotossíntese da Terra (EL
GAMAL, 2010; SZE, 1997; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).
As macroalgas marinhas bentônicas são encontradas ao longo dos costões
rochosos e dos recifes de maré, onde estão distribuídas em faixas bem definidas, visíveis em
relação aos níveis de marés. A complexidade estrutural das macroalgas reflete sua capacidade
de sobrevivência na zona de marés, onde duas vezes por dia estão sujeitas a flutuações
expressivas de umidade, temperatura, salinidade e luz.
As macroalgas são classificadas em quatro filos: Cyanobacteria (algas azuis),
Chlorophyta (algas verdes), Rhodophyta (algas vermelhas) e Ochrophyta (algas pardas), com
base em uma grande variedade de aspectos como captação de luz para a fotossíntese,
polissacarídeos de reserva, organização celular, filogenia molecular, ciclo de vida, morfologia
e ecologia (ALGAEBASE, 2012; SZE, 1997; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).
As macroalgas marinhas são fontes de uma grande variedade de compostos
benéficos para o homem, apresentando diversas aplicações em nutrição (CORNISH;
GARBARY, 2010), na agricultura (MOREIRA et al., 2011), na indústria de alimentos e em
outras áreas biotecnológicas (DELATTRE; FENORADOSOA; MICHAUD, 2011).
Na alimentação humana, elas têm sido usadas por vários séculos principalmente
nos países da Ásia como China, Japão, Coreia e Filipinas. Mais de 10% da dieta dos
japoneses é composta por algas marinhas, razão pela qual são considerados os principais
consumidores mundiais, cujo consumo anual per capita equivale a 5,5 kg de alga seca. Na
China e no Japão, além de serem utilizadas como alimento, elas são empregadas no
tratamento da deficiência de iodo (bócio e hipertireoidismo), em desordens intestinais e
também como agente hipocolesterolêmico e hipoglicêmico (CORNISH; GARBARY, 2010;
EL GAMAL, 2010; MCHUGH, 2003; PANGESTUTI; KIM, 2011). Do ponto de vista
nutricional, as algas são fontes de proteínas, carboidratos, fibras, vitaminas, minerais, além de
possuírem baixo conteúdo de lipídios (GUPTA; ABU-GHANNAM, 2011; MOHAMED;
HASHIM; RAHMAN, 2012).
17
Nos países ocidentais, elas são utilizadas principalmente como matéria-prima para
a obtenção de ficocolóides como alginato, extraído de algas pardas, ágar e carragenana,
ambos extraídos de algas vermelhas (KADAM; PRABHASANKAR, 2010; PLAZA;
CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008).
As macroalgas marinhas, assim como os outros vegetais fotossintetizantes,
permanecem expostas a uma combinação de luz e oxigênio que conduz à formação de radicais
livres e outros agentes oxidantes. Entretanto, é possível que a ausência de danos oxidativos
dos componentes estruturais das algas esteja associada a algum sistema de defesa capaz de
proteger suas células, uma vez que a sobrevivência das algas depende de uma resposta
eficiente aos estresses oxidativos. Muitos compostos encontrados nestes organismos possuem
atividade antioxidante (PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008; ROCHA et al., 2007), dentre
os quais se destacam os compostos fenólicos, os carotenóides e a vitamina E (tococromanóis)
(MATANJUN et al., 2008; PIRES-CAVALCANTE et al., 2011; SOUSA et al., 2008).
Os antioxidantes possuem um efeito benéfico na saúde humana, pois protegem o
organismo contra as espécies reativas que atacam macromoléculas, por exemplo, lipídios das
membranas celulares, proteínas e DNA, desencadeando patologias como diabetes, câncer e
doenças degenerativas e inflamatórias (NGO et al., 2011).
Nas últimas décadas, a comunidade científica tem demonstrado interesse
crescente pelo estudo de compostos antioxidantes naturais, como carotenóides, vitaminas
lipossolúveis e hidrossolúveis e compostos fenólicos, que podem estar associados à prevenção
e/ou redução de doenças cardiovasculares e degenerativas (ALOTHMAN; BHAT; KARIM,
2009; CORNISH; GARBARY, 2010; MOHAMED; HASHIM; RAHMAN, 2012).
Embora a região costeira brasileira compreendida entre o Ceará e o norte do Rio
de Janeiro abrigue uma flora algal com muitos táxons, as informações sobre o potencial
antioxidante das algas brasileiras são ainda escassas. A investigação de novos compostos com
atividade biológica pode resultar em importantes descobertas, tendo em vista a existência
dessa grande diversidade taxonômica das algas (PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008;
ROCHA et al., 2007; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).
Diante de tudo que foi exposto e da riqueza algal do litoral cearense a seguinte
hipótese foi formulada: “As macroalgas marinhas do litoral cearense possuem atividade
antioxidante”.
Para nortear as discussões e buscar elementos que possibilitem comprovar a
hipótese levantada, o objetivo geral da pesquisa foi avaliar o potencial antioxidante in vitro de
extratos metanólicos (50%) de macroalgas marinhas do litoral cearense.
18
A partir do objetivo principal, os objetivos específicos listados a seguir foram
propostos para a avaliação desse potencial: determinação da capacidade de sequestrar o
radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila; determinação da habilidade de quelação do íon ferroso;
determinação do poder de redução do ferro; determinação da degradação do β-caroteno;
determinação do conteúdo fenólico total; prospecção fitoquímica das principais classes de
compostos fenólicos; correlação do CFT com as atividades antioxidantes in vitro; e extração e
quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e tocoferóis (α- e δ-tocoferol).
19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Radicais livres
O termo radical livre é utilizado para definir átomos e moléculas (orgânicas e
inorgânicas) que apresentam um ou mais elétrons desemparelhados, ou seja, que possuem
número ímpar de elétrons na última camada eletrônica. Esta configuração lhes confere
elevada instabilidade fazendo com que eles se tornem altamente reativos. Estes radicais são
resultantes de reações de óxido-redução, isto é, ou se oxidam por cederem o elétron livre, ou
se reduzem por receberem outro elétron. Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma,
nas mitocôndrias ou nas membranas celulares e desempenham importante papel em processos
fisiopatológicos afetando inúmeras moléculas biológicas como lipídios, proteínas,
carboidratos e DNA, dependendo do seu sítio de formação (CAVALCANTE; BRUIN, 2009,
JENSEN, 2003; LEITE; SARNI, 2003; STAVRIDIS, 2008).
Entretanto, o termo radical livre não é adequado para designar todos os agentes
reativos patológicos, tendo em vista que alguns desses agentes não apresentam configuração
com elétrons desemparelhados na última camada eletrônica, como o peróxido de hidrogênio
( 22OH ) e o oxigênio singlete ( 21O ), designados como espécies reativas de oxigênio (EROs).
Dessa forma, o termo EROs é utilizado para todos os agentes reativos patológicos
provenientes do metabolismo do oxigênio molecular, os quais são: radical hidroxil ( •OH ),
radical superóxido ( −2O ), radical hidroperoxil ( •
2HO ), peróxido de hidrogênio ( 22OH ) e
oxigênio singlete ( 21O ) (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI; ANTUNES,
1999; CAVALCANTE; BRUIN, 2009; FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Apesar de poderem ser mediadoras de patologias, a formação de EROs nem
sempre é prejudicial. Por exemplo, o radical superóxido é vital para as células de defesa e sem
ele o organismo está desprotegido contra infecções causadas por vírus, bactéria e fungos. Na
defesa contra infecção, a bactéria estimula os neutrófilos a produzirem EROs com a finalidade
de destruir o micro-organismo. O radical superóxido, capaz de inativar proteínas ferro-
sulfurosas das bactérias, é considerado um bactericida fraco. Entretanto, sua formação
propicia o aparecimento de alguns produtos com forte atividade antimicrobiana, como ácido
hipocloroso, peróxido de hidrogênio e peroxinitrito, principais responsáveis pelo combate a
corpos estranhos (BALCH, 2006; BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; STAVRIDIS,
2008).
20
Todos os compostos celulares são suscetíveis à ação de EROs, porém a membrana
celular é um dos sítios mais atingidos devido à lipoperoxidação, que consiste na incorporação
de oxigênio molecular a um ácido graxo, resultando na degradação oxidativa e alteração na
estrutura e permeabilidade, o que interfere nos transportes ativo e passivo normais. A
oxidação dos lipídios no sangue agride as paredes das artérias e veias, facilitando o acúmulo
desses lipídios, com consequente arteriosclerose, podendo causar trombose, infarto e acidente
vascular cerebral (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; CAVALCANTE; BRUIN, 2009;
NOTA; KOUTROUBAKIS; KOUROUMALIS, 2006).
Além de EROs, é importante salientar a existência das espécies reativas de
nitrogênio (ERNs), que são originadas quando o elétron desemparelhado se encontra centrado
no átomo de nitrogênio. As principais ERNs são: óxido nítrico ( •NO ), óxido nitroso ( 32ON ),
ácido nitroso ( 2HNO ), nitritos ( −2NO ), nitratos ( −
3NO ) e peroxinitritos ( −ONOO )
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; CAVALCANTE; BRUIN, 2009).
EROs e ERNs são naturalmente formadas nos tecidos celulares como resultado de
processos metabólicos, mas também podem surgir como resultado de processos patológicos
devido a alguma disfunção biológica. A formação destas espécies reativas é propiciada por
fatores endógenos, como respiração aeróbica, inflamações, peroxissomos e enzimas do
citocromo P450, e pela exposição a fatores exógenos, como ozônio, radiações gama e
ultravioleta, medicamentos, dieta e cigarro (ARUOMA, 1999; BARREIROS; DAVID;
DAVID, 2006; BIANCHI; ANTUNES, 1999).
No organismo, EROs e ERNs encontram-se envolvidas na produção de energia,
fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias
biológicas importantes, como hormônios e enzimas. Porém, a produção excessiva de EROs e
ERNs acarreta efeito deletério às células e aos tecidos pela sua relação com o envelhecimento
e inúmeras patologias como artrite, aterosclerose, diabetes, catarata, esclerose múltipla,
inflamações crônicas, disfunção cognitiva, cardiopatias, choque hemorrágico, enfisema,
câncer e doenças do sistema imune (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI;
ANTUNES, 1999; CAVALCANTE; BRUIN, 2009).
Os danos causados por radicais livres ao DNA parecem ter importância no
processo inicial da carcinogênese. O radical hidroxil altera as bases do DNA celular iniciando
o desenvolvimento do tumor. Algumas hipóteses propõem que a oxidação das lipoproteínas
de baixa densidade (LDL) consiste em fator preponderante nos processos arterioscleróticos.
21
Há suposições também sobre a lipoperoxidação atuando como fator na degeneração da
mielina em certas doenças neurológicas (GÁLVEZ, 2010; JACOB, 1995).
Além dos danos que estas espécies reativas podem causar aos componentes
celulares, elas também causam a degradação de óleos e gorduras presentes nos alimentos. Esta
alteração é responsável pelo aparecimento de odores e sabores próprios de ranço, implicando
no decréscimo da qualidade e segurança nutricionais, causado pela formação de produtos
secundários, potencialmente tóxicos (ANDREO; JORGE, 2006; OLIVEIRA et al., 2009).
No organismo, o excesso de EROs e ERNs é combatido por antioxidantes
produzidos pelo próprio organismo ou absorvidos através da dieta. Na indústria alimentícia, o
principal mecanismo de proteção contra a ação de radicais livres é a utilização de
antioxidantes sintéticos ou naturais (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI;
ANTUNES, 1999; CHORILLI; LEONARDI; SALGADO, 2007; YOSHIHARA;
FUJIWARA; SUZUKI, 2010).
2.2 Antioxidantes
O termo antioxidante tem natureza multiconceitual, sendo utilizado em diversas
áreas biotecnológicas, porém difícil de ser claramente definido. Por exemplo, para a indústria
alimentícia, antioxidante é qualquer substância capaz de inibir a peroxidação dos lipídios e
consequentemente a rancificação das gorduras dos alimentos (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2006; OLIVEIRA et al., 2009; RAMALHO; JORGE, 2006).
Uma definição mais ampla desse termo é: “qualquer substância que mesmo
estando presente em concentrações relativamente baixas quando comparada àquela do
substrato oxidável, o qual inclui quase todas as moléculas encontradas in vivo, atrasa ou inibe
a oxidação desse substrato de maneira eficaz” (HALLIWELL et al., 1995; OLIVEIRA et al.,
2009; SIES; STHAL, 1995). Entretanto, devido aos diversos usos e a aplicabilidade do termo
antioxidante, Halliwell e Gutteridge (2006) resolveram simplificá-lo para: “qualquer
substância que retarda, previne ou remove os danos oxidativos das células alvo”.
Uma ampla variedade de compostos de origem endógena e exógena compõe o
mecanismo antioxidante do organismo humano (JACOB, 1995; YOSHIHARA; FUJIWARA;
SUZUKI, 2010). Entretanto, existem antioxidantes apropriados para cada tipo de radical livre
e a atuação desses compostos depende da espécie reativa gerada, como e onde foi gerada e
qual o alvo do dano. Dessa forma, é perfeitamente possível que um antioxidante proteja um
sistema, mas falhe na proteção ou até mesmos cause danos em outros sistemas. Por exemplo,
22
um antioxidante inibidor da peroxidação lipídica pode não proteger outros alvos tais como
proteínas e DNA, que é o caso do butil-hidroxianisol (BHA), um poderoso inibidor da
peroxidação lipídica, utilizado na conservação de alimentos, mas que pode induzir o câncer.
Este fato está relacionado com os possíveis danos oxidativos que este composto pode causar à
molécula de DNA (BIANCHI; ANTUNES, 1999; CHORILLI; LEONARDI; SALGADO,
2007; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010; HALLIWELL et al., 1995).
Os antioxidantes sintetizados endogenamente na célula ou no líquido extracelular
agem tanto enzimaticamente, a exemplo da superóxido dismutase, catalase e glutationa
peroxidase, quanto não enzimaticamente, a exemplo da glutationa reduzida, transferrina e
ferritina (proteínas ligadas ao ferro). Nos alimentos, principalmente naqueles de origem
vegetal, uma grande variedade de compostos antioxidantes é encontrada, por exemplo, α-
tocoferol, β-caroteno, ácido ascórbico e flavonóides (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;
BIANCHI; ANTUNES, 1999; GÁLVEZ, 2010).
Além dos antioxidantes naturais encontrados nos alimentos, antioxidantes
sintéticos como BHA, butil-hidroxitolueno (BHT), terc-butil hidroquinona (TBHQ) e propil
galato (PG) (Figura 1) têm importante papel na indústria alimentícia e podem ser adicionados
intencionalmente para retardar o aparecimento dos fenômenos de oxidação, mantendo intactas
as características sensoriais do alimento. Esses antioxidantes não devem causar efeitos
fisiológicos negativos ou produzir cores, odores e/ou sabores indesejáveis. Eles devem ser
lipossolúveis, resistentes aos tratamentos a que o alimento seja submetido, ativos em baixas
temperaturas e viáveis economicamente (ANDREO; JORGE, 2006; CHORILLI;
LEONARDI; SALGADO, 2007; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010).
Os compostos com atividade antioxidante podem atuar de diferentes maneiras
para a proteção do organismo contra os radicais livres. Um dos mecanismos de defesa
consiste em impedir a sua formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia com
ferro e cobre. Outro é baseado na interceptação dos radicais livres gerados pelo metabolismo
celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre as células alvo. Mais um
mecanismo, relacionado com a capacidade de reparar lesões causadas por esses radicais
através da remoção de danos na molécula de DNA e da reconstituição das membranas
celulares danificadas, tem sido relatado. O aumento da síntese de enzimas antioxidantes em
resposta a geração de radicais livres também é um mecanismo de defesa do organismo
(BIANCHI; ANTUNES, 1999; GÁLVEZ, 2010; HALLIWELL et al., 1995).
23 Figura 1 - Estruturas fenólicas dos antioxidantes sintéticos.
OH
C(CH3)3
OCH3
OH
C(CH3)3
CH3
(CH3)3C
OH
OH
COOC3H7
HO
OH
C(CH3)3
OH
Butil-hidroxianisol (BHA) Butil-hidroxitolueno (BHT)
Propil galato (PG) Terc-butil hidroquinona (TBHQ) Fonte: RAMALHO; JORGE (2006).
De acordo com a revisão realizada por Ramalho e Jorge (2006), os antioxidantes
podem ser classificados em primários, sinergistas, removedores de oxigênio, biológicos,
agentes quelantes e mistos.
Os antioxidantes primários incluem aqueles compostos que promovem a remoção
ou inativação dos radicais livres formados durante o processo de iniciação, através da doação
de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia. O átomo de
hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos radicais livres com maior facilidade que os
hidrogênios alílicos das moléculas insaturadas. Os principais antioxidantes primários são os
sintéticos, BHA, BHT, PG e TBHQ, e os naturais, tocoferóis.
Os antioxidantes sinergistas são substâncias com pouca ou nenhuma atividade
antioxidante, que podem aumentar a atividade dos antioxidantes primários quando usados em
combinação adequada com eles. Os removedores de oxigênio, como ácido ascórbico, seus
isômeros e derivados, são compostos que atuam capturando-o, por estar presente no meio,
através de reações químicas estáveis tornando-o indisponível para atuar como propagador da
auto-oxidação. Na classe dos antioxidantes biológicos estão incluídas várias enzimas, dentre
elas superóxido dismutase e catalase. Os agentes quelantes, como ácido cítrico e seus
derivados, são compostos que complexam íons metálicos, principalmente cobre e ferro, os
quais catalisam a oxidação lipídica. A presença de um par de elétrons não compartilhado na
24
estrutura molecular desses compostos é o que determina sua atuação como agente quelante.
Finalmente, a classe dos antioxidantes mistos compreende compostos de origem vegetal e
animal, por exemplo, várias proteínas hidrolisadas, flavonóides e derivados de ácido cinâmico
(ácido caféico), que têm sido amplamente estudados como antioxidante em alimentos.
Os antioxidantes sintéticos, BHA, BHT, TBHQ e PG, apresentam uma estrutura
fenólica que permite a doação de hidrogênio a um radical livre, regenerando a molécula de
acilglicerol e interrompendo o mecanismo de oxidação por radicais livres. Entretanto, os
derivados fenólicos transformam-se em radicais livres podendo se estabilizar ou promover
reações de oxidação. Dessa forma, tais compostos representam riscos à saúde, normalmente
associados ao seu consumo excessivo. Estudos toxicológicos com cobaias têm demonstrado a
possibilidade de esses compostos apresentarem efeito carcinogênico. Por exemplo, o TBHQ
pode provocar a redução do nível de hemoglobina e a hiperplasia de células basais, e o BHA
pode induzir a hiperplasia gastrintestinal e a formação de papiloma e carcinoma (ANDREO;
JORGE, 2006; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010; RAMALHO; JORGE, 2006).
A utilização de antioxidantes sintéticos é limitada. Nos últimos anos, o Joint
Expert Committee on Food Additives (JECFA) da Organização das Nações Unidas para a
Agricultura e a Alimentação (FAO) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) modificaram a
ingestão diária aceitável destes compostos. O uso de TBHQ é proibido no Canadá e na
Comunidade Econômica Europeia (SOARES, 2002; RAMALHO; JORGE, 2006). No Brasil,
o uso de antioxidantes é regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) que dispõe de resoluções e/ou portarias sobre limites máximos permitidos de
acordo com a categoria do alimento. De um modo geral, os teores máximos de BHT ou PG
são 0,01% e de BHA ou TBHQ, 0,02%, calculados sobre o teor de gordura (ANVISA, 2012).
Devido aos efeitos tóxicos e carcinogênicos causados pelos compostos sintéticos,
na última década, a busca por antioxidantes naturais ganhou considerável atenção. As
pesquisas têm explorado os organismos marinhos por serem fontes promissoras de compostos
bioativos com valioso potencial nutracêutico e farmacêutico, incluindo as algas que consistem
em uma das fontes mais ricas de antioxidantes naturais (DOLATABADI; KASHANIAN,
2010; NGO et al., 2011; RAMALHO; JORGE, 2006).
2.3 Potencial antioxidante das macroalgas marinhas
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície da Terra, e as espécies marinhas
representam aproximadamente metade da biodiversidade do globo. Dentre os organismos
25
marinhos se destacam as macroalgas que ainda são consideradas um recurso subexplorado,
embora sejam utilizadas há muito tempo na dieta e na medicina tradicional oriental
(PANGESTUTI; KIM, 2011).
As algas compreendem um grupo com aproximadamente 34.500 espécies de
organismos fotossintetizantes, das quais aproximadamente 3.300 pertencem ao Império
Procarionte, Reino Bacteria (classificadas junto com as eubactérias). Cerca de 90% (30.174
espécies) pertencem ao Império Eucarionte, distribuídas em quatro reinos Plantae, Chromista,
Fungi e Protozoa. São capazes de habitar os mais variados ambientes da superfície terrestre
desde que haja luz suficiente para que ocorra a fotossíntese. Nestes habitats, as algas são
submetidas a condições extremas com mudanças acentuadas de salinidade, temperatura,
nutrientes e luminosidade e, para sobreviverem, precisam se adaptar rapidamente às novas
condições ambientais, produzindo assim uma grande variedade de metabólitos secundários,
alguns exclusivos das algas, que muitas vezes não são encontrados em outros organismos
(ALGAEBASE, 2012; EL GAMAL, 2010; PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008;).
Estes compostos produzidos pelas algas durante o processo adaptativo podem
expressar diversas atividades em outros sistemas com potencial antibacteriano, antifúngico,
antiviral, antienvelhecimento, anti-inflamatório, anticoagulante, antimutagênico, antitumoral,
anticancerígeno e antioxidante (CORNISH; GARBARY, 2010; EL GAMAL, 2010).
De acordo com Rocha et al. (2007), o interesse inicial pelo estudo de substâncias
antioxidantes em algas surgiu no Japão em 1980 com o trabalho de Fujimoto e Kaneda, que
buscavam novos aditivos alimentares em substituição àqueles antioxidantes sintéticos (BHA e
BHT). Nestas três décadas, apesar de o mecanismo de ação dos antioxidantes das algas
marinhas ainda não estar inteiramente compreendido, já foram publicados trabalhos que
abordam a atividade antioxidante das macroalgas marinhas.
Duan et al. (2006) compararam as propriedades antioxidantes dos extratos e
frações obtidos da rodofícea Polysiphonia urceolata com os antioxidantes sintéticos BHT,
ácido gálico e ácido ascórbico. Todas as concentrações testadas (0,4 – 50 µg mL-1) do extrato
bruto e da fração solúvel em acetato de etila apresentaram maior poder de sequestro do radical
DPPH do que o BHT. Já no ensaio com o sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, o
extrato bruto e a fração solúvel em acetato de etila apresentaram atividade semelhante ou, na
maioria dos casos, maior que aquela obtida para os ácidos gálico e ascórbico nas
concentrações de 10 a 200 µg mL-1.
Matanjun et al. (2008) estudaram a atividade antioxidante de oito espécies de
algas marinhas e constataram que as algas verdes Caulerpa lentillifera e C. racemosa e a
26
parda Sargassum polycystum são fontes potenciais de antioxidantes naturais devido ao seu
elevado poder de sequestrar radicais livres e teor de compostos fenólicos.
Devi et al. (2008) estudaram a atividade antioxidante de dez espécies de algas
marinhas da Índia, tendo encontrado que os extratos da rodófita Gelidiella acerosa
apresentaram elevada atividade antioxidante, útil na prevenção e retardamento de várias
desordens relacionadas ao estresse oxidativo. Testes in vitro da atividade antioxidante dos
extratos e das frações semipurificadas de outra alga vermelha, Rhodomela confervoides,
revelaram que ela pode ser utilizada no tratamento de doenças relacionadas com o estresse
oxidativo (WANG et al., 2009).
O extrato metanólico da rodófita Polysiphonia morrowii exibiu elevada atividade
antioxidante com relação ao sequestro dos radicais DPPH, hidroxil e peróxido de hidrogênio,
ao poder de redução e à quelação do íon ferroso. A atividade desse extrato se mostrou similar
e/ou superior àquela determinada para os antioxidantes sintéticos BHA e BHT. Além disso, o
extrato também apresentou habilidade para inibir danos oxidativos no DNA (JE et al., 2009).
El-Baky, El-Baz e El-Baroty (2009) estudaram a atividade antioxidante da
macroalga marinha verde Ulva lactuca. Neste estudo foram determinados 34 diferentes
compostos com predominância de clorofilas, carotenóides e compostos fenólicos nesta ordem.
O extrato algáceo apresentou atividade antioxidante de sequestro de DPPH comparável aos
antioxidantes sintéticos α-tocoferol, BHA e BHT.
Muitos compostos isolados de algas marinhas desempenham atividade
antioxidante. Dentre eles estão: fucoxantina, pirofeofitina a (um metabólito da clorofila a),
meroditerpenos (compostos análogos aos tocoferóis), florotaninos, fosfolipídios
(fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositíseo), clorofila a e seus metabólitos, tocoferóis,
polissacarídeos hidrossolúveis (alginato, sulfato de alginato, sulfato de
propilenoglucolalginato, sulfato de propilenoglucolmanuronato, oligossacarídeos de
quitosana, N,O-carboximetilquitosana e hidropropilquitosano), polissacarídeos lipossolúveis
(hexanoilquitosano e N-benzoilhexanoilquitosana), tetrapreniltoluquinóis, ácidos fenólicos
(trans-cinâmico, p-cumárico e ferúlico) e polissacarídeos sulfatados de baixo peso molecular
(NGO et al., 2011; ROCHA et al., 2007; STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011). Boa parte
desses compostos está distribuída em três grandes categorias: compostos fenólicos,
carotenóides e tocoferóis.
27
2.3.1 Compostos fenólicos
Nos vegetais, os compostos fenólicos são metabólitos secundários provenientes
das vias pentoses fosfato, chiquimato e fenilpropanóides, podendo ser encontrados na forma
livre ou ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas. Constituem um dos grupos de
fitoquímicos de maior ocorrência, abrangendo desde moléculas simples até outras de alto grau
de polimerização. Possuem considerável importância fisiológica e morfológica,
desempenhando um importante papel no crescimento e reprodução, além de prover proteção
contra patógenos e predadores. Nas frutas e legumes, estes compostos são responsáveis por
características sensoriais como cor, sabor (adstringência) e aroma (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006; BERNAL et al., 2011; SOARES, 2002).
Do ponto de vista estrutural, os compostos fenólicos são constituídos de pelo
menos um anel aromático ligado a um ou mais substituintes hidroxila, estando divididos em
dois grupos majoritários: flavonóides e não flavonóides (BERNAL et al., 20011; IGNAT;
VOLF; POPA, 2011). Os flavonóides correspondem a mais da metade dos oito mil compostos
fenólicos naturais encontrados nos vegetais e apresentam estrutura química C6−C3−C6
(diarilpropano) (BERNAL et al., 20011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004; IGNAT;
VOLF; POPA, 2011; SOARES, 2002). Essa estrutura, ilustrada na Figura 2, consiste em dois
anéis aromáticos (A e B) unidos por uma ponte de três carbonos na forma de um anel
heterocíclico (C). Variações no anel C resultam em flavonóis, flavonas, flavononas, flavanóis
(catequinas), isoflavonas, flavanonóis e antocianidinas. Alterações como oxigenação,
alquilação, glicosilação e sulfatação nos anéis A e B geram diferentes compostos dentro de
cada grupo de flavonóides (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006; IGNAT;
VOLF; POPA, 2011). Eles atuam como antioxidantes tanto no compartimento celular
lipofílico quanto no hidrofílico (BIANCHI; ANTUNES, 1999), e esta atividade é resultante
dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes localizados em várias posições dos
anéis A, B e C, das duplas ligações dos anéis benzênicos e da dupla ligação da função oxo
(−C=O) de alguns flavonóides (SILVA et al., 2010).
Os compostos fenólicos não flavonóides são formados principalmente pelos
ácidos fenólicos e taninos. Os ácidos fenólicos se dividem em dois grupos. O primeiro,
derivado da estrutura C6−C1, é constituído pelos ácidos benzóicos, por exemplo, ácido
hidroxibenzóico, ácido gálico e ácido elágico, que são os mais simples encontrados na
natureza (Figura 3). O segundo grupo é formado pelos ácidos cinâmicos, por exemplo, ácido
caféico e ácido p-cumárico, derivados da estrutura C6−C3 (Figura 4). A ciclização da cadeia
28
lateral do ácido o-cumárico forma as cumarinas que são fenólicos simples derivados do ácido
cinâmico (Figura 5) (BERNAL et al., 2011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004;
SOARES, 2002).
Figura 2 - Estrutura genérica de uma molécula de flavonóide.
O
A
B
C
3'4'
5'
2'
6'1'
23
45
6
78
Fonte: BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN (2006).
Figura 3 - Estrutura química dos principais ácidos benzóicos.
R1 = OH � ácido salicílico R1 = R4 = OH � ácido gentísico R3 = OH � ácido p-hidroxibenzóico R2 = R3 = OH � ácido protocatequínico R2 = OCH3, R3 = OH � ácido vanílico R2 = R3 = R4 = OH � ácido gálico R2 = R4 = OCH3, R3 = OH � ácido siríngico
Fonte: SOARES (2002).
Figura 4 - Estrutura química dos principais ácidos cinâmicos.
R1 = R2 = R 3 = R 4= H � ácido cinâmico R1 = OH � ácido o-cumárico R2 = OH � ácido m-cumárico R3 = OH � ácido p-cumárico R2 = R3 = OH � ácido caféico R2 = OCH3, R3 = OH � ácido ferúlico R2 = R4 = OCH3, R3 = OH � ácido sinápico
Fonte: SOARES (2002).
Figura 5 – Ciclização do ácido o-cumárico em cumarina.
OH
CH CH COOH CH
CH
CO
O
Ácido o-cumárico Cumarina Fonte: SOARES (2002).
COOHR3
R4
R1R2
R3
R4
R1R2
CH CH COOH
29
Os taninos constituem o terceiro grupo de compostos fenólicos mais importantes,
podendo ser subdivididos em taninos hidrolisáveis, condensados (proantocianidinas) ou
florotaninos. Os taninos hidrolisáveis são derivados do ácido gálico, o qual é esterificado e/ou
oxidado para formar as complexas moléculas de tanino hidrolisáveis. Os taninos condensados
são poliméricos de flavonóides, mas as etapas de condensação e polimerização envolvidas em
sua formação ainda não foram completamente elucidadas. Os florotaninos são compostos
fenólicos altamente hidrofílicos formados pela polimerização do floroglucinol, que têm sido
isolados de vários gêneros de algas pardas (IGNAT; VOLF; POPA, 2011; NGO et al., 2011).
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos não flavonóides está associada
com a posição das hidroxilas e com a proximidade do grupo carboxila (–COOH) em relação
ao grupo fenil. Quanto mais próximo o –COOH estiver do fenil maior será a capacidade
antioxidante do grupo hidroxila na posição meta (SILVA et al., 2010).
Além da atividade antioxidante, os compostos fenólicos apresentam outros efeitos
bioquímicos e farmacológicos, dentre os quais se destacam a capacidade de reduzir o açúcar
do sangue, emagrecimento e as ações anti-inflamatória, antimicrobiana, antiplaquetária,
antialergênica e antitrombótica (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006;
BERNAL et al., 2011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004).
Os antioxidantes fenólicos atuam como sequestradores de radicais livres, doadores
de átomos de hidrogênio ou elétrons e, algumas vezes, como quelantes de metais, agindo nas
etapas de iniciação e propagação do processo oxidativo. Devido à ressonância do anel
aromático presente nos antioxidantes fenólicos naturais, os produtos intermediários formados
pela ação desses antioxidantes são relativamente estáveis ao contrário daqueles produzidos
pela ação de compostos fenólicos sintéticos (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN,
2006; BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; SOARES, 2002).
Os compostos fenólicos estão presentes em praticamente todos os grupos de algas.
Os bromofenóis são detectados principalmente em algas vermelhas pertencentes às ordens
Ceramiales (Laurencia spp.), Gelidiales e Corallineales, mas também ocorrem nas algas
verdes e pardas. Nas algas pardas, os principais compostos fenólicos são os florotaninos,
como fucóis, floretóis, eckóis e carmalóis, que, aliás, são encontrados unicamente nas feófitas.
Na ordem Fucales, por exemplo, eles podem representar mais de 20% do peso úmido
(STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011).
Queirós, Lage-Yusty e López-Hernández (2010) reportaram a ocorrência de
catequina na macroalga vermelha Porphyra spp. e de ácido gálico nas algas pardas Undaria
pinnatifida, Himanthalia elongata e na vermelha Palmaria spp.
30
Na macroalga vermelha Bryothamnion triquetrum, os ácidos fenólicos p-cumárico,
furúlico e trans-cinâmico foram capazes de inibir a lipoperoxidação espontânea (NOVOA et
al., 2001). A atividade neuroprotetora contra os efeitos oxidativos deletérios do peróxido de
hidrogênio e do cloreto de metilmercúrio foi relacionada com elevada concentração de
substâncias fenólicas nesta espécie (FALLARERO et al., 2003).
2.3.2 Carotenóides
Outra importante classe de antioxidantes encontrada nos vegetais consiste nos
carotenóides, um grupo de pigmentos naturais com mais de setecentos diferentes compostos já
caracterizados (HORNERO-MÉNDEZ; BRITTON, 2002; TAKAICHI, 2011), dos quais entre
cinquenta e sessenta têm atividade de vitamina A, sendo o β-caroteno o de maior destaque
(MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2004; OLSON; KRINSKY, 1995).
São compostos terpenóides responsáveis pela coloração vermelha, laranja e
amarela das folhas, frutas e flores das plantas, de alguns insetos, pássaros, peixes e crustáceos,
que os incorporam através de suas dietas, tendo em vista que somente as plantas superiores,
bactérias, fungos e algas são capazes de sintetizar os pigmentos carotenóides (BERNAL et al.,
2011; BHOSALE; BERNSTEIN, 2007; NGO et al., 2011; RAO; RAO, 2007; TAKAICHI,
2011). São produzidos predominantemente nos tecidos fotossintéticos de plantas superiores e
algas (BRITTON; LIAAEN-JENSEN; PFANDER, 1995; SILVA et al., 2010).
Nos vegetais, os carotenóides são encontrados nos plastídios formando um
complexo pigmento-proteína e atuam como pigmentos acessórios da fotossíntese e na
proteção contra a foto-oxidação (PANGESTUTI; KIM, 2011; SILVA et al., 2010;
TAKAICHI, 2011; TANAKA; SASAKI; OHMIYA, 2008).
Os terpenóides são formados pela condensação de oito unidades de isopreno
(BARTLEY; SCOLNIK, 1995) e originam um esqueleto carbônico constituído de quarenta
átomos que é sintetizado pela ligação cauda-a-cauda de duas moléculas de geranil que
possuem vinte átomos de carbono cada. As extremidades das moléculas dos carotenóides
podem ser lineares ou apresentar grupamentos cíclicos, como ciclohexanos ou ciclopentanos
(OLIVER; PALOU, 2000; SILVA et al., 2010). Quando a cadeia central apresenta um
grupamento final cíclico, este pode ser substituído por grupos funcionais contendo oxigênio
(BHOSALE; BERNSTEIN, 2007; SILVA et al., 2010; STAHL; SIES, 2005; TAPIERO;
TOWNSEND; TEW, 2004). Estão divididos em duas classes: carotenos, compostos apenas de
carbono e hidrogênio, sendo o α-caroteno, β-caroteno e licopeno os principais constituintes
31
deste grupo; e xantofilas, derivados oxigenados dos carotenos que contêm pelo menos uma
função hidroxi, ceto, epóxi, metoxi ou ácido carboxílico, sendo zeaxantina, luteína, α-
criptoxantina, β-criptoxantina e cantaxantina, as mais importantes (BERNAL et al., 2011;
SILVA et al., 2010; STAHL; SIES, 2005).
A estrutura básica da molécula dos carotenóides inclui um sistema de duplas
ligações conjugadas (polieno), ilustrada na Figura 6, que influencia suas propriedades
químicas, físicas e bioquímicas, conferindo à molécula capacidade de absorver luz no
espectro visível (400 a 700 nm), grande susceptibilidade à degradação oxidativa e
isomerização geométrica ocasionada pela luz, calor e ácidos (AMBRÓSIO; CAMPOS;
FARO, 2006; BRITTON; LIAAEN-JENSEN; PFANDER, 1995; SILVA et al., 2010).
A estrutura única dos carotenóides propicia um notável potencial biológico
antioxidante na proteção dos tecidos contra os danos oxidativos e foto-oxidativos através da
extinção de radicais livres e EROs, que são resultantes de processos metabólicos e
patológicos, e essa atividade depende principalmente do número de duplas ligações
conjugadas, do grupo terminal e da natureza dos substituintes em carotenóides que possuem
grupos terminais cíclicos (BRITTON, 1995; DEMBINSKA-KIEC, 2005; NGO et al., 2011).
São benéficos à saúde humana, particularmente contra os males relacionados ao
envelhecimento, algumas doenças degenerativas, certos tipos de câncer, doenças
cardiovasculares e catarata (BERNAL et al., 2011; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO;
HEREDIA, 2004).
Os carotenóides possuem atividade anticancerígena específica, por exemplo,
luteína, zeaxantina e β-caroteno atuam contra o câncer de mama; criptoxantina e α-caroteno,
contra câncer cervical, e o licopeno combate o câncer de próstata, do trato digestivo e de
estômago. Entretanto, independentemente dessa atividade, todos os carotenóides exibem
atividade antioxidante (STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011). Além de atuar como
anticancerígeno e antioxidante, a luteína, juntamente com a zeaxantina, são os dois pigmentos
majoritários da retina, os quais inibem a degeneração macular relacionada com a idade e
reduzem a formação de catarata (TANAKA; SHNIMIZU; MORIWAKI, 2012).
Os carotenóides, agindo como antioxidantes, reduzem os produtos de oxidação de
modo mais eficiente em meios onde os níveis de oxigênio são baixos; níveis elevados causam
sua destruição. Na maioria dos tecidos biológicos, o nível de oxigênio é baixo, de modo que
os carotenóides adquirem importância como antioxidante (BARREIROS; DAVID; DAVID,
2006; SILVA et al., 2010). In vivo, os carotenóides agem como desativadores do 21O .
32 Figura 6 - Estruturas químicas dos carotenóides de ocorrência mais comum nas algas.
β-caroteno
α-caroteno
HO
OH
luteína
OCOCH3HO
fucoxantina
O
HO
O
OH
astaxantina
HO
OH
zeaxantina
O
OC
Fonte: TAKAICHI (2011).
Este processo pode ocorrer de duas formas: 95% através da transferência física de
energia de excitação do 21O para o carotenóide e apenas 5% pela reação química do
carotenóide com o 21O . Além de agirem como desativadores, os carotenóides atuam como
sequestradores de radicais peroxil, os quais se adicionam à dupla ligação 5−6, 5’−6’ ou
33
15−15’ da molécula do caroteno (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; FERREIRA;
MATSUBARA, 1997; SILVA et al., 2010).
Os carotenóides totais e os ésteres de astaxantina extraídos da microalga verde
Haematococcus pluvialis foram administrados em ratos por via oral e apresentaram efeitos
gastroprotetores (KAMATH et al., 2008). A elevada atividade antioxidante exibida pelo
extrato da macroalga parda Cystoseira hakodatensis em vários ensaios foi atribuída, em parte,
ao conteúdo de fucoxantina presente nessa espécie (AIRANTHI; HOSOKAWA;
MIYASHITA, 2011).
2.3.3 Tocoferóis
Outro composto com atividade antioxidante encontrado na natureza é a vitamina
E, que consiste em um termo genérico que engloba um grupo de oito substâncias com
diferentes graus de atividade vitamínica, pertencentes a duas séries: tocoferóis e tocotrienóis,
cada uma com quatro formas diferentes (α-, β-, δ- e γ-). Ambas as séries são conhecidas pela
atividade antioxidante. Os tocoferóis são encontrados nas folhas e sementes da maioria dos
vegetais, enquanto os tocotrienóis, menos abundantes, estão presentes principalmente em óleo
de palma e grãos de arroz. Todavia, dentre todas as isoformas, o α-tocoferol é mais facilmente
encontrado em fontes naturais (BERNAL et al., 2011; LING et al., 2012; MACHLIN, 1991).
A vitamina E é sintetizada apenas pelos vegetais e outros organismos
fotossintetizantes, incluindo as algas (BRAMLEY et al., 2000; DELLAPENNA, 2005;
DELLAPENNA; POGSON, 2006; MAEDA; DELLAPENNA, 2007). Nos vegetais, sua
função é proteger o aparato fotossintético contra a toxicidade do oxigênio e a peroxidação dos
lipídios (BRAMLEY et al., 2000; MUNNÉ-BOSCH; ALEGRE, 2002).
Ela é encontrada predominantemente na bicamada lipídica das membranas
celulares e na monocamada lipídica das lipoproteínas plasmáticas (ATKINSON; EPAND;
EPAND, 2008; MARZZOCO; TORRES, 2007), sendo vital para a manutenção da integridade
das membranas e para o funcionamento dos plastídios (DELLAPENNA, 2005; MUNNÉ-
BOSCH; ALEGRE, 2002).
A vitamina E também desempenha importante papel na imunocompetência,
estando associada à inibição da carcinogênese (BRAMLEY et al., 2000; RIGOTTI, 2007;
SILUK et al., 2007; SILVA; NAVES, 2001; TRABER; ATKINSON, 2007). O α-tocoferol é
também a forma mais amplamente distribuída nos tecidos e plasma, ajudando o organismo a
34
CH3
R1
R2
OCH3
HO
CH3 CH3
CH3
CH3
Tocoferol
CH3
R1
R2
OCH3
HO
CH3 CH3
CH3
CH3
Tocotrienol
1
23
4567
8
1
23
4567
8
3'4'
5'6'
7'8'
9'10'
11'2'
1'
3'4'
5'6'
7'8'
9'10'
11'2'
1'
9
9
manter sua defesa normal contra doenças e injúrias ambientais, por proteger as membranas
celulares contra os danos causados por radicais livres.
Todos os compostos com atividade de vitamina E têm em sua estrutura um anel
6-cromanol e uma cadeia lateral (LING et al., 2012; MACHLIN, 1991; REITER; JIANG;
CHRISTEN, 2007). O anel cromanol possui um radical hidroxil, importante para a função
biológica desempenhada pela vitamina (LING et al., 2012; SALDEEN; SALDEEN, 2005).
Os tocoferóis têm uma cadeia lateral saturada, enquanto os tocotrienóis têm uma estrutura
similar, entretanto insaturada, com duplas ligações nas posições 3’, 7’ e 11’ da cadeia lateral
(MACHLIN, 1991; SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010). Todos os isômeros tocóis
(tocoferóis e tocotrienóis) são diferenciados pelo número e posição do grupo metil no anel
cromanol (Figura 7) (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; SEPPANEN; SONG;
CSALLANY, 2010).
Figura 7 - Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis.
Tocoferol / tocotrienol R1 R2 α- CH3 CH3 β- H CH3 γ- CH3 H δ- H H
Fonte: CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO (2007).
As atividades antioxidantes dos tocoferóis e tocotrienóis são decorrentes da
capacidade que essas moléculas têm de doar o hidrogênio do grupo hidroxil do anel cromanol.
Entretanto, a diferença estrutural no anel cromanol pode ser responsável pela diferença na
capacidade antioxidante de cada tococromanol. As isoformas α- são trimetiladas nas posições
5, 7 e 8 do anel cromanol, já as β- e γ- são dimetiladas nas posições 5 e 8 e 7 e 8 do anel
cromanol, respectivamente, enquanto que as δ- são monometiladas na posição 8 do anel
cromonol. As posições orto (5 e 7) do grupo metil no anel cromanol aumentam a capacidade
antioxidante dos tococromanóis. Assim, espera-se que o α-tocoferol com dois grupos orto-
35
metil tenha maior capacidade de doador hidrogênio do que β- e γ-tocoferol que possuem um
grupo orto-metil e do que o δ-tocoferol que não possui grupamento orto-metil (AGGARWAL
et al., 2010; SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010; SMOLAREK; SUH, 2011).
Assim, acreditava-se, originalmente, que a habilidade dos tococromanóis de doar
hidrogênio apresentava uma gradação: α- > β- ≅ γ- > δ-, entretanto, atualmente essa afirmativa
é controversa devido aos diferentes sistemas lipídicos usados como modelo, variações nas
condições oxidativas e inúmeros métodos de determinação da atividade antioxidante relativa
de todos os isômeros de tocoferóis e tocotrienóis (SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010).
Além da capacidade de doar hidrogênio, o que interrompe a propagação da reação
em cadeia da lipoperoxidação, a vitamina E atua como quelante dos oxidantes produzidos
durante a lipoperoxidação. A vitamina E, ao contrário do β-caroteno, se mostra mais eficiente
quando as tensões de oxigênio no meio são elevadas (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;
FERREIRA; MATSUBARA, 1997; RAMALHO; JORGE, 2006).
Os tocoferóis têm sido extraídos e quantificados em diversas espécies de
macroalgas marinhas (LE TUTOUR et al., 1998; MIYASHITA; TAKAGI, 1987; PIRES-
CAVALCANTE et al., 2011; SÁNCHEZ-MACHADO; LÓPEZ-HERNANDÉZ; PASEIRO-
LOSADA, 2002). Algumas vezes, o conteúdo de α-tocoferol nas macroalgas é tão elevado
que uma porção de apenas 11 g da clorófita Caulerpa sertularioides pode fornecer metade da
quantidade de vitamina E recomendada diariamente para um homem adulto (PIRES-
CAVALCANTE et al., 2011).
2.4 Ensaios antioxidantes in vitro
Para a extração de compostos bioativos de macroalgas marinhas existem
diferentes protocolos que utilizam solventes com graus de polaridade variados, isoladamente
ou a mistura desses, e que podem ou não incluir o uso de calor (GANESAN; KUMAR; RAO,
2011; KUMAR et al., 2011b; ZUBIA et al., 2009). Algumas metodologias são mais
vantajosas que outras, mas a maioria dos trabalhos reporta uma relação direta entre o
rendimento de extração e a maior polaridade do solvente. Isso decorre do fato de que os
solventes polares extraem eficientemente uma série de compostos polares como polifenóis
ligados a açúcares ou proteínas, taninos, sais, saponinas, glicosídeos e ácidos orgânicos (CHO
et al., 2007). Por exemplo, Matanjun et al. (2008) observaram que a extração com metanol
apresentou rendimento até oito vezes superior ao daquela realizada com éter dietílico.
36
A maioria das pesquisas relacionadas com a determinação de atividade
antioxidante em organismos marinhos utiliza o extrato bruto, sem isolar ou quantificar os
componentes responsáveis por essa atividade. Somente poucos pesquisadores purificaram e
caracterizaram tais compostos (NGO et al., 2011). De fato a atividade biológica pode ser
resultante da presença, mesmo que em quantidades traço, de compostos com elevado
potencial antioxidante. Entretanto, de acordo com Stengel, Connan e Popper (2011), algumas
vezes essa atividade é derivada do efeito sinérgico entre diferentes compostos presentes no
extrato bruto podendo ser perdida durante os processos de separação e purificação.
A atividade antioxidante é sistema-dependente e está sujeita ao método de análise
adotado e aos sistemas-modelo (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008). Diversos testes são
usados para avaliar a atividade antioxidante in vitro de substâncias biologicamente ativas,
abrangendo desde ensaios químicos simples até métodos mais complexos que envolvem
diferentes técnicas instrumentais. Esses testes têm se tornado ferramentas usuais e relevantes
na seleção de espécies biológicas de onde se possam extrair substâncias com potencial
farmacológico. Tendo em vista os diferentes tipos de radicais livres e as variadas formas de
atuação nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual
a atividade antioxidante possa ser precisamente mensurada (ALVES et al., 2010).
Os ensaios mais utilizados são determinação da capacidade de sequestrar o radical
livre DPPH, habilidade de quelação do íon ferroso, poder de redução do ferro e degradação do
β-caroteno. Outra metodologia de análise muito empregada consiste na determinação do
conteúdo fenólico total.
2.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)
O ensaio do sequestro do radical DPPH tem sido amplamente utilizado na
investigação da atividade antioxidante, pois além de ser um método fácil, preciso e com
resultados altamente reproduzíveis, viabiliza a análise de muitas amostras em pouco tempo e é
suficientemente sensível para detectar a atividade de compostos em baixas concentrações
(GANESAN; KUMAR; RAO, 2011; SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
O DPPH é um radical livre estável devido ao deslocamento do elétron
desemparelhado por toda a molécula. Esta conformação estrutural lhe confere em solução
alcoólica uma coloração violeta intensa cuja absorbância máxima ocorre em torno de 520 nm.
Quando misturada com compostos capazes de doar átomos de hidrogênio, o DPPH é reduzido
a hidrazina. Esta reação provoca uma diminuição na absorbância do radical DPPH,
37
visivelmente percebida pela mudança de cor de violeta para amarelo (ALVES et al., 2010;
GANESAN; KUMAR; RAO, 2011; MOLYNEUX, 2004; SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
2.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC)
A capacidade de quelar metais é muito importante uma vez que os metais de
transição catalisam a peroxidação dos lipídios formando assim compostos indesejáveis que
atacam vários tipos de molécula (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008).
A ligação de compostos antioxidantes com íons metálicos pode ser avaliada
através do ensaio de quelação do íon ferroso. Um extrato com elevada habilidade de ligação
com íons metálicos poderá prevenir ou inibir várias reações capazes de produzir radicais
hidroxil reativos (CHEW et al., 2008).
A ferrozine, usada nesta metodologia, é um composto que reage com o ferro
divalente para formar um complexo estável de coloração róseo que possui máxima
absorbância em 562 nm. Na presença de amostras que possuem atividade de quelação a
formação do complexo é interrompida, de modo que, medindo-se a taxa de descoloração,
pode-se estimar o poder de quelação da amostra (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011;
STOOKEY, 1970; VINAYAK; SUDHA; CHATTERJI, 2011).
2.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP)
No ensaio do poder de redução do ferro, a atividade antioxidante é determinada
com base na habilidade dos compostos antioxidantes, presentes nas amostras, reduzirem ferro
férrico (III) a ferro ferroso (II), em uma reação colorimétrica de oxirredução que envolve
simplesmente a transferência de elétrons (CHEW et al., 2008). A presença de agentes
redutores em solução causa a redução do complexo Fe3+/ferrocianeto à forma ferrosa (Fe2+)
que pode ser mensurada na absorbância de 700 nm (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011).
Quanto maior a absorbância da mistura, maior a atividade antioxidante de redução do ferro
(KUMAR et al., 2011a; SOLTANI et al., 2011).
2.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico
A oxidação dos ácidos graxos insaturados presentes nas membranas biológicas
conduz à formação de radicais livres lipídicos e destruição da membrana lipídica. Os
38
antioxidantes podem interromper a reação em cadeia através da doação de átomos de
hidrogênio (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007).
Nos últimos 30 anos a comunidade científica tem reportado que o β-caroteno
exibe alta reatividade com eletrófilos e oxidantes. Desta forma, muitos estudos têm
demonstrado que ele inibe a auto-oxidação lipídica em tecidos biológicos e produtos
alimentícios (ALVES et al., 2010).
Dentre as técnicas utilizadas para avaliar a atividade antioxidante in vitro destaca-
se o sistema de co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico. Este método é simples e sensível e
possibilita a avaliação da capacidade de uma determinada substância neutralizar o radical
livre gerado durante a oxidação do ácido linoléico, prevenindo assim a degradação do β-
caroteno. Por não utilizar temperaturas elevadas, é possível determinar substâncias sensíveis
ao calor (ALVES et al., 2010; CHEW et al., 2008).
2.4.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)
De um modo geral, o CFT pode ser determinado pelo método espectrofotométrico
de Folin-Ciocalteu que se baseia na reação de oxirredução dos compostos fenólicos com íons
metálicos. Nesse método, em meio alcalino, os fenóis reduzem o ânion fosfomolibdato-
fosfotungstato de coloração amarela a molibdênio de cor azul. Para a quantificação de CFT é
necessária a utilização de uma curva de calibração em que o ácido gálico é o padrão mais
utilizado. Os resultados são expressos em miligrama de ácido gálico equivalente (AGE) por
grama de amostra ou extrato (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006; SILVA et al., 2010).
39
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta das macroalgas e Preparação do material
Vinte e três espécies de macroalgas marinhas, seleciondas pela abundância,
pertencentes aos filos Chlorophyta (Caulerpa cupressoides, C. prolifera, C. sertularioides, C.
racemosa, Codium isthmocladum, Ulva fasciata e U. lactuca), Rhodophyta (Amansia
multifida, Botryocladia occidentalis, Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum, Cryptonemia
crenulata, C. luxurians, Gracilaria domingensis, G. ferox, Hypnea musciformis e Pterocladia
americana) e Ochrophyta (Dictyota dichotoma, D. mertensii, Lobophora variegata, Padina
gymnospora, Sargassum vulgare e Spatoglossum schroederi) foram coletadas em fevereiro de
2010, durante a maré baixa na Praia de Paracuru, São Gonçalo do Amarante-CE, com a
permissão do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Nacionais Renováveis
(SISBIO no 33913-1).
As algas coletadas foram lavadas em água destilada para remoção de impurezas e
epífitas macroscópicas sendo, em seguida, colocadas sobre papel absorvente para drenar o
excesso de água e congeladas a –24ºC para, então, serem liofilizadas. O material liofilizado
foi armazenado em recipientes hermeticamente fechados e protegidos da luz até o momento
da preparação dos extratos.
As espécies foram identificadas pelo Prof. Dr. Alexandre Holanda Sampaio, do
Departamento de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará (UFC), as exsicatas
de cada amostra coletada foram depositadas no Herbário Professor Prisco Bezerra (UFC), sob
os números 51056 a 51078.
3.2 Reagentes
Os reagentes, metanol, ácido linoléico, cloreto de ferro III, ferrocianeto de
potássio, carbonato de sódio anidro, ácido tricloroacético, clorofórmio, fosfato de potássio
monobásico anidro e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), utilizados na determinação
da atividade antioxidante, assim como o éter de petróleo utilizado nas análises
cromatográficas foram grau P.A. e adquiridos da Vetec, Brasil. Ácido gálico (G7384), cloreto
de ferro II (37,287-0), o reagente fenólico Folin-Ciocalteu (F9252), o emulsificante Tween 40
(P1504), o indicador de ferro ferrozine (P9762), o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
(D913-2), os antioxidantes sintéticos butil-hidroxianisol (B1253) e butil-hidroxitolueno
40
(47168), bem como os padrões comerciais, L-ácido ascórbico aproximadamente 99%
(A5960), quercetina hidratada aproximadamente 95% (33,795-1), β-caroteno tipo I
aproximadamente 95% (C-9750), (±)-α-tocoferol aproximadamente 95% (T3251) e (+)-δ-
tocoferol aproximadamente 90% (T2028) foram obtidos da Sigma, Estados Unidos.
Devido ao elevado custo da luteína comercial produzida pela Sigma, a luteína da
marca Duane Reade, Nova York, comercializada como suplemento alimentar em cápsulas de
20 mg, foi utilizada como padrão.
Metanol, n-hexano e tetrahidrofurano, usados nas análises cromatográficas, foram
grau HPLC, obtidos da J. T. Baker, Estados Unidos, e o hidróxido de potássio foi obtido da
Merck, Alemanha.
Todas as soluções foram preparadas utilizando-se água ultrapura, obtida através
do sistema Milli-Q (Millipore, Estados Unidos).
3.3 Preparação dos extratos para os ensaios antioxidantes in vitro
Os extratos foram preparados de acordo com Chew et al. (2008). O material
liofilizado foi macerado em um triturador doméstico (Cadence, modelo MDR301) até a
obtenção de um pó fino. Porções de 1 g desse pó foram suspensas em 50 mL de metanol
(50%) e homogeneizadas continuamente em um agitador orbital (Cientec, modelo CT-712),
por 1 h a 25°C, protegidas da luz. Após este período, os extratos foram filtrados em papel de
60 µm e, os resíduos submetidos a mais duas re-extrações. Os extratos, preparados em
triplicata, foram armazenados em frasco âmbar a –24°C até o momento das análises.
3.4 Ensaios antioxidantes in vitro
Os ensaios antioxidantes in vitro foram realizados, em triplicata, nos extratos
metanólicos (50%), a partir da determinação da capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-
difenil-1-picril-hidrazila, da quelação do íon ferroso, do poder de redução e da degradação do
β-caroteno no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.
Quercetina, butil-hidroxianisol (BHA), butil-hidroxitolueno (BHT), ácido
ascórbico, α–tocoferol e β-caroteno foram utilizados como controle positivo em todas as
metodologias, com exceção da determinação da habilidade de quelação do íon ferroso na qual
foi utilizado apenas EDTA. Os controles positivos, nas concentrações de 5, 10 e 20 µg mL-1,
41
foram submetidos aos mesmos procedimentos dos extratos. Todas as determinações foram
realizadas em espectrofotômetro Amersham Biosciences, modelo Ultrospec 2100 pro.
3.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)
A capacidade de sequestrar o radical livre DPPH foi determinada de acordo com
Duan et al. (2006). Em tubos de ensaio, denominados amostra, branco e controle, foram
colocados, respectivamente, 2 mL de extrato + 2 mL da solução de DPPH 0,16 mM, 4 mL de
extrato e 4 mL de DPPH 0,16 mM. Os tubos foram agitados em vortex e incubados no escuro
por 30 min à temperatura ambiente. Decorrido este tempo, a absorbância foi lida em 517 nm.
A fórmula abaixo foi utilizada para calcular o percentual de sequestro do DPPH:
( )%100
AbsAbsAbs
1(%)DPPHradicaldosequestrodeCapacidadecontrole
brancoamostra ×
−−=
3.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC)
Na determinação da habilidade de quelação do íon ferroso, uma alíquota de 1 mL
do extrato foi misturada a 1,35 mL de água destilada, 50 µL de cloreto de ferro II (2 mM) e
100 µL de ferrozine (5 mM). A mistura foi agitada e incubada por 10 min à temperatura
ambiente. Após a incubação, sua absorbância foi lida em 562 nm. Volumes de 1 mL e 100 µL
de água destilada foram utilizados em substituição ao extrato e ao ferrozine, respectivamente,
na preparação do controle e do branco (WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009). As
determinações foram feitas em triplicata, e os resultados expressos em percentual de
habilidade de quelação, usando a seguinte fórmula:
( )[ ]100%
AbsAbsAbsAbs
(%)ferrosoíondoquelaçãodeHabilidadecontrole
brancoamostracontole ×−−
=
3.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP)
O poder de redução foi determinado, em triplicata, de acordo com a metodologia
descrita por Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008).
42
Uma alíquota de 1 mL do extrato foi misturada com 2,5 mL de tampão fosfato a
0,2 M (pH 6,6) e 2,5 mL de ferrocianeto de potássio a 1%. A mistura foi incubada por 20 min
em banho-maria (Thermomix BM, modelo 18 BU, B. Braun Biotech International) a 50ºC.
Após a incubação, foram adicionados 2,5 mL ácido tricloroacético a 10%. Desta mistura foi
tomada uma alíquota de 2,5 mL e adicionada a 2,5 mL de água destilada e 0,5 mL de cloreto
de ferro III a 0,1%. Em seguida, a absorbância foi lida em 700 nm. Quanto maior a
absorbância, maior o poder de redução das amostras.
3.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico
O teste de degradação do β-caroteno foi realizado de acordo com Chew et al.
(2008). Neste ensaio, 3 mL de solução de β-caroteno em clorofórmio (100 µg mL-1) foram
adicionados a 40 mg de ácido linoléico e 400 mg do emulsificante Tween 40. O clorofórmio
da mistura foi evaporado em evaporador rotativo (Fisaton) a 55ºC e, ao resíduo foram
adicionados 100 mL de água ultrapura saturada de oxigênio.
A emulsão β-caroteno/ácido linoléico foi vigorosamente agitada, e uma alíquota
de 3 mL dessa emulsão foi adicionada a 1 mL de extrato. A absorbância foi lida em 470 nm.
Após a leitura, a mistura foi incubada por 1 h em banho-maria a 50ºC. Decorrido este tempo,
a absorbância foi novamente lida em 470 nm, e a atividade antioxidante foi calculada pela
fórmula:
100%Abs
Abs(%)teantioxidanAtividade
inicial
h 1 ×
=
3.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)
O conteúdo fenólico total (CFT) no extrato metanólico (50%) foi determinado, em
triplicata, de acordo com Kumar, Ganesan e Rao (2008).
Em um tubo de ensaio, foram adicionados 1 mL de extrato, 7 mL de água destilada,
0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu e 1,5 mL de carbonato de sódio a 20%. A mistura foi
agitada e incubada no escuro por 30 min à temperatura ambiente. Decorrido este tempo, a
absorbância foi lida em 760 nm. Um tubo branco, no qual água destilada foi utilizada em
substituição ao extrato, também foi preparado.
43
O CFT dos extratos foi calculado com base na curva padrão de ácido gálico, e os
resultados expressos em µg de ácido gálico equivalente (AGE) g-1 alga seca. Para a
elaboração da curva, em tubos de ensaio contendo 1 mL de ácido gálico, com concentrações
variando de 1 mg L-1 a 250 mg L-1, foram adicionados 7 mL de água destilada, 0,5 mL do
reagente de Folin e 1,5 mL de carbonato de sódio a 20%. Os tubos foram agitados e
incubados, no escuro, por 30 min à temperatura ambiente, e a absorbância lida em 760 nm.
3.6 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos
As metodologias empregadas na prospecção química dos extratos metanólicos
(50%) das algas foram aquelas recomendadas por Matos (2009), que estão descritas nos itens
subsequentes.
3.6.1 Teste para fenóis e taninos
Em uma alíquota de 3 mL do extrato foram adicionadas três gotas de solução
alcoólica de cloreto de ferro III. Após agitação vigorosa, observou-se qualquer variação de cor
e/ou formação de precipitado escuro e abundante, comparando-se com um branco preparado
com água destilada em vez de extrato. A presença de fenóis foi indicada pelo aparecimento de
coloração entre o azul e o vermelho. A formação de precipitado escuro revelava a presença de
taninos. Precipitado de tonalidade azul indicava a presença de taninos pirogálicos
(hidrolisáveis) e de verde, a presença de taninos flobabênicos (condensados ou catéquicos).
3.6.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides
Três alíquotas de 3 mL do extrato foram transferidas para diferentes tubos de
ensaio. No primeiro o meio foi acidificado para pH 3, enquanto nos outros dois, eles foram
alcalinizados para pH 8,5 e 11. As presenças de antocianinas, antocianidinas e flavonóides
foram determinadas de acordo com o aparecimento de colorações, que variavam com o pH,
como indicado na Tabela 1.
44 Tabela 1 – Provas fitoquímicas das classes de antocianinas, antocianidinas e flavonóides.
Constituintes Coloração em pH
3,0 8,5 11,0 Antocianinas e antocianidinas Vermelha Lilás Azul-púrpura Flavonas, flavonóis e xantonas - - Amarela Chaconas e auronas Vermelha - Vermelho-púrpura Flavonóis - - Vermelho-laranja
3.6.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas
Duas alíquotas de 3 mL do extrato foram transferidas para dois tubos de ensaio. O
primeiro foi acidificado por adição de ácido clorídrico até pH 3, e o segundo foi alcalinizado a
pH 11 com hidróxido de sódio. Os tubos foram aquecidos em banho-maria por 10 min a 60ºC.
As alterações na coloração do extrato foram observadas quanto à presença de
leucoantocianidinas, catequinas e flavonas de acordo com a Tabela 2.
Tabela 2 – Provas fitoquímicas das classes de leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.
Constituintes Coloração em pH
3,0 11,0 Leucoantocianidinas Vermelha - Catequinas Pardo-amarelada - Flavononas - Vermelho-laranja
3.6.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavanonóis e xantonas
A um tubo contendo 3 mL do extrato foram adicionados alguns centigramas de
magnésio granulado e 0,5 mL de ácido clorídrico concentrado. Após o término da reação,
indicada pelo fim da efervescência, observou-se a mudança da coloração. O aparecimento ou
intensificação da cor vermelha era indicativo da presença de flavonóis, flavononas,
flavanonóis e/ou xantonas, livres ou seus heterosídeos.
3.6.5 Teste para confirmação de catequinas
Um palito de madeira foi introduzido em um tubo contendo o extrato algáceo,
retirado e deixado secar. Uma das faces do palito foi umedecida com ácido clorídrico
concentrado e, em seguida, o palito foi aquecido em uma chama de álcool por 3 min. O
45
aparecimento de cor vermelha ou pardo-avermelhada na face acidificada confirmava a
presença de catequinas, previamente identificadas através do teste descrito no item 3.6.3.
3.7 Extração, Identificação e Quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e
tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)
3.7.1 Preparação dos extratos, Saponificação e Partição
Os extratos foram preparados em triplicata a partir de três porções de 0,5 g de alga
liofilizada em 10 mL de metanol (90%) contendo 5% de hidróxido de potássio e
saponificados por 30 min em banho-maria a 70°C.
Depois de resfriados à temperatura ambiente, os extratos foram centrifugados por
5 min a 2.000 x g. Após a centrifugação, 5 mL dos extratos saponificados, 3 mL de água
Milli-Q e 5 mL de n-hexano:éter de petróleo (2:3, v/v) foram transferidos para tubos Pyrex de
tampa rosqueada, os quais foram misturados em uma plataforma misturadora por 10 min. Este
procedimento, a partição, permitiu a migração dos carotenóides não saponificáveis e dos
tocoferóis presentes no extrato algáceo do metanol para o n-hexano:éter de petróleo.
A separação das fases, metanol-hexano:éter de petróleo, foi facilitada pela
centrifugação por 5 min a 2.000 x g. Um volume correspondente a 2 mL da fase hexano:éter
de petróleo foi transferido para tubos de ensaio e evaporado completamente. O resíduo foi
então suspenso em 1 mL da fase móvel e filtrado em membrana de 0,45 µm no momento da
análise por cromatografia líquida de alta eficiência.
3.7.2 Soluções-padrão de β-caroteno, luteína, α- e δδδδ-tocoferol
Diariamente, soluções-padrão de β-caroteno e luteína em tetrahidrofurano (1 mg
mL-1) foram preparadas e diluídas com metanol para 10 µg mL-1 de modo que 0,2 µg de β-
caroteno e luteína fossem injetados na coluna. As concentrações das soluções-padrão de β-
caroteno e de luteína foram determinadas a partir de sua absorbância em 450 nm e 444 nm,
respectivamente, sendo a capacidade de absorção de luz do β-caroteno igual a 0,2245 µg-1
mL-1 e a da luteína igual a 0,2629 µg-1 mL-1 (CRAFT; SOARES-JR, 1992). Da mesma forma,
soluções-padrão de α- e δ-tocoferol (1 mg mL-1) foram preparadas diariamente e diluídas em
metanol, de modo que 2 µg de α- e δ-tocoferol fossem injetados na coluna.
46
Uma solução-padrão de trabalho composta por β-caroteno e luteína na
concentração de 10 µg mL-1 e por α- e δ-tocoferol na concentração de 100 µg mL-1 foi
saponificada e submetida à partição separadamente e em combinação com 0,5 g de alga
liofilizada. Este procedimento assegurou a detecção dos compostos supracitados onde eles
foram adicionados intencionalmente.
3.7.3 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
O sistema cromatográfico consistiu em uma coluna Atlantis Waters Spherisorb S5
ODS 2 (4,6 x 250 mm) e uma fase móvel constituída de metanol:tetrahidrofurano (90:10,
v/v), com fluxo de 1,5 mL min-1, usando uma bomba (AKTAbasic 10, modelo P-900,
Amersham). Alíquotas de 100 µL do resíduo suspenso na fase móvel foram injetadas
manualmente usando um injetor de amostras Rheodyne 7210 (Hamilton Co.). O monitor
(AKTAbasic UV-900) foi ajustado em 450 nm para a detecção de α- e β-caroteno, em 444 nm
para a detecção de luteína e em 292 nm para a detecção de α- e δ-tocoferol. Os
cromatogramas foram registrados através do sistema de controle UnicornTM, versão 5.0.
3.7.4 Cálculo dos teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δδδδ-tocoferol
As concentrações de α- e β-caroteno e luteína nos extratos algáceos foram
calculadas com base nos padrões de 10 µg de β-caroteno e de luteína submetidos à
saponificação e à partição. Os cálculos foram procedidos usando-se a área dos picos obtidos
para as soluções-padrão de β-caroteno e luteína e as áreas dos picos referentes ao α-caroteno,
β-caroteno e luteína nos extratos de alga. O uso do β-caroteno como padrão para a
quantificação de α-caroteno foi considerado válido porque as áreas dos picos correspondentes
a 10 µg de α-caroteno e a 10 µg β-caroteno não apresentaram diferença estatisticamente
significativa (p ≥ 0,05) (SAKER-SAMPAIO, 1997).
As concentrações de α- e δ-tocoferol nos extratos de alga foi calculadas com base
nos padrões de 100 µg de α- e δ-tocoferol processados. Os cálculos foram procedidos usando-
se as áreas dos picos obtidos para as soluções-padrão de tocoferóis e as áreas dos picos
referentes ao α- e δ-tocoferol presentes nos extratos algáceos.
A fórmula abaixo foi utilizada para os cálculos dos teores de α- e β-caroteno,
luteína e α- e δ-tocoferol nos extratos de alga liofilizada.
47
algag
g1colunanapadrãoµg
padrãoárea
amostraáreagµg 1 ××=−
3.8 Análises estatísticas
Todos os resultados referentes às atividades antioxidantes e os teores de
compostos fenólicos totais (CFT), carotenóides e tocoferóis foram organizados em matrizes
considerando as espécies como tratamentos e o número de extrações como repetições.
Os dados da capacidade de sequestro do radical DPPH, da quelação do íon ferroso
(FIC) e no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, expressos em valores percentuais
(proporções), foram inicialmente transformados através da equação: proporçãoarcsenX = .
Os dados do poder de redução do ferro (FRAP), CFT, α-caroteno, β-caroteno, luteína, α-
tocoferol e δ-tocoferol foram quantificados em escala contínua.
Os resultados de DPPH, FIC, degradação do β-caroteno e FRAP foram analisados
através da análise de variância (α = 0,05). Em caso de rejeição da hipótese de nulidade (p <
0,05), as comparações das médias entre as espécies de cada Filo (Chlorophyta, Rhodophyta e
Ochrophyta) foram realizadas pelo teste de Tukey, e entre cada espécie de alga e cada
controle positivo, pelo teste de Dunnet.
Por sua vez, os teores de CFT, α-caroteno, β-caroteno, luteína, α-tocoferol e
δ-tocoferol nas espécies de algas verdes, vermelhas e pardas, não comparados com os
controles positivos, foram submetidos à análise de variância (α = 0,05), seguida pelo teste de
Tukey para comparação das médias, em caso de rejeição da hipótese de nulidade (p < 0,05).
Os pressupostos da análise de variância foram avaliados, através de gráficos de
probabilidade normal para diagnosticar se a distribuição dos dados observados era semelhante
a uma distribuição normal (normalidade) e pelo teste de Cochran para verificar a
homogeneidade das variâncias (homocedasticidade). Os resultados indicaram que os dados
não violaram nenhum desses pressupostos.
Para investigar a existência de correlação entre CFT e as atividades antioxidantes
dos extratos algáceos foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson, em que o CFT foi
considerado a variável independente (x) e cada metodologia antioxidante in vitro, a
dependente (y).
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Ensaios antioxidantes in vitro
No presente estudo, o processo de extração foi conduzido de forma a extrair
principalmente compostos fenólicos, embora, provavelmente, uma grande variedade de outros
componentes polares estivesse presente nos extratos. Todos os ensaios antioxidantes in vitro
foram realizados no extrato bruto preparado com metanol (50%). A escolha desta
concentração foi baseada no trabalho de Chew et al. (2008), que testaram a eficiência de
extração em diferentes concentrações e constataram que este era o melhor resultado.
4.1.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)
Todos os extratos das 23 espécies de macroalgas analisadas no presente trabalho
exibiram capacidade de sequetrar o radical DPPH. De um modo geral, a maior atividade foi
observada em Ochrophyta, seguida de Chlorophyta e, mais baixa, em Rhodophyta (Figura 8).
Este mesmo padrão foi encontrado por Wang, Jónsdóttir e Ólafsdóttir (2009), mas não por
Kumar et al. (2011b), que verificaram nas espécies de algas verdes uma atividade maior ou
igual à das pardas que, por sua vez, foi superior àquela das vermelhas. Esta divergência pode
estar relacionada aos diferentes métodos de extração utilizados nos trabalhos supracitados.
Dentre as sete espécies de Chlorophyta, as maiores capacidades de sequestro do
DPPH foram observadas nos extratos das algas pertencentes aos gêneros Caulerpa e Codium
que variaram de 69,7 ± 2,1% a 95,1 ± 0,6%. No primeiro gênero, destaque para Caulerpa
sertularioides (95,1 ± 0,6%) e C. racemosa (91,6 ± 1,8%), que apresentaram as maiores
atividades, enquanto nos extratos das duas espécies de Ulva foram observadas as menores, em
torno de 54% (Figura 8A).
Das algas verdes analisadas por Kumar et al. (2011b), o extrato metanólico de C.
racemosa exibiu a maior atividade de sequestro do radical DPPH (77%), inferior aos
resultados encontrados no gênero Caulerpa, com exceção de C. prolifera, cuja atividade foi
menor (71,7%), mas superior aos observados no gênero Ulva.
Na comparação com os controles positivos, a capacidade de sequestro do radical
DPPH dos extratos de C. sertularioides e C. racemosa foi superior àquelas exibidas pela
quercetina (5 µg mL-1), BHA, ácido ascórbico e β-caroteno (5 e 10 µg mL-1) e BHT e α-
tocoferol (5, 10 e 20 µg mL-1). No extrato de C. cupressoides a atividade foi superior à de
49
BHT e α-tocoferol (5 e 10 µg mL-1) e ácido ascórbico e β-caroteno (5 µg mL-1). No caso dos
extratos de C. prolifera e Codium isthmocladum as atividades também foram superiores às de
BHT e α-tocoferol, porém apenas na concentração 5 µg mL-1. Os extratos das duas espécies
de Ulva apresentaram capacidades de sequestrar o DPPH inferiores às exibidas pelos padrões
comerciais nas três concentrações testadas, com exceção de BHT e α-tocoferol (5 µg mL-1),
que foram semelhantes (Tabela 3).
Kumar et al. (2011a), analisando somente algas do gênero Caulerpa, encontraram
elevadas atividades de sequestro do DPPH em C. racemosa (87%), C. scalpelliformis (67%) e
C. veravelensis (66%), semelhantes ou superiores às observadas com os padrões comerciais,
BHA (67%) e BHT (78%), da mesma forma que os resultados obtidos no presente trabalho.
As atividades de Caulerpa sertularioides e C. racemosa foram maiores que a do
extrato etanólico de C. lentillifera que apresentou baixa capacidade para sequestrar o radical
DPPH, inclusive nas concentrações mais elevadas (80 e 100 ppm), cujos valores não
ultrapassaram 20%. Estas atividades foram mais de quatro vezes inferiores àquelas exibidas
pelo ácido ascórbico nas mesmas concentrações (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011).
Os extratos de C. sertularioides e C. racemosa exibiram atividade semelhante à
observada na fração clorofórmica do extrato etanólico da clorófita Enteromorpha prolifera
(0,25 e 0,5 mg mL-1) analisada por Cho et al. (2011), que por sua vez apresentou atividade
comparável àquela exibida pelo BHA, nas mesmas concentrações. No presente estudo o
percentual sequestrante das duas espécies foi superior ao do BHA (5 e 10 µg mL-1).
Assim como no presente trabalho, dentre as cinco clorófitas analisadas por
Vinayak, Sudha e Chatterji (2011), os extratos (1 mg mL-1) das espécies pertencentes ao
gênero Caulerpa foram as que apresentaram a maior capacidade para sequestrar o DPPH.
Entretanto, essa atividade foi inferior a 50%, enquanto que a do ácido ascórbico foi próxima a
100%. No presente estudo, o percentual sequestrante de C. sertularioides e C. racemosa foi
superior ao do ácido ascórbico na concentração de até 10 µg mL-1.
Os extratos de Caulerpa e Codium apresentaram atividade de sequestro do DPPH
mais elevadas que as exibidas pelos extratos metanólicos de três espécies de clorófitas do
gênero Enteromorpha analisadas por Ganesan, Kumar e Rao (2011), cujos valores variaram
de 46% a 62%. E. linza e E. tubulosa (nas concentrações de 0,5 a 3,0 mg mL-1) exibiram
percentuais próximos a 46%, sendo inferiores aos extratos Ulva do presente trabalho. Dentre
todos os solventes de extração avaliados (metanol, acetato de etila, propanol, acetona e água),
o extrato metanólico foi o que demonstrou maior atividade sequestrante.
50 Figura 8 - Capacidade de sequestrar o radical livre DPPH. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.
--
--
--
--
--
--
--
0 20 40 60 80 100
54,0 d
54,3 d
69,7 c
71,7 c
80,0 b
91,6 a
95,1 a
U. lactuca
U. fasciata
C. isthmocladum
C. prolifera
C. cupressoides
C. racemosa
C. sertularioides
% de sequestro do radical DPPH
--
--
--
--
--
--
--
--
--
--
--
0 20 40 60 80 100
34,5 g
34,7 fg
36,5 ef
37,0 e
38,0 e
40,6 d
40,7 d
46,6 c
50,2 b
75,4 a
C. crenulata
G. ferox
G. domingensis
C. luxurians
P. americana
B. occidentalis
H. musciformis
B. triquetrum
B. seaforthii
A. multifida
% de sequestro do radical DPPH
--
--
--
--
--
--
0 20 40 60 80 100
97,7 b
100,0 a
100,0 a
100,0 a
100,0 a
100,0 a
S. schroederi
S. vulgare
P. gymnospora
L. variegata
D. mertensii
D. dichotoma
% de sequestro do radical DPPH
Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
51 Tabela 3 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).
FCaulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva
(%) cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca
Quercetina 5 µg mL-1 121,8 86,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 161,9 97,5 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 161,7 97,1 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
BHA 5 µg mL-1 120,6 83,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 142,7 93,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 162,4 96,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
BHT 5 µg mL-1 131,8 58,1 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 122,3 65,2 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 116,5 75,9 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 120,8 66,8 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 115,2 82,4 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 171,3 97,7 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
α-tocoferol 5 µg mL-1 132,6 57,5 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 120,2 67,8 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 123,2 85,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
β-caroteno 5 µg mL-1 124,6 63,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
10 µg mL-1 117,9 79,4 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
20 µg mL-1 226,8 100,0 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0
DPPH (%) nas espéciesControle positivo
p < 0,01ACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
51
52
Valentão et al. (2010) verificaram que capacidade de sequestro no extrato de
Codium tomentosum foi inferior a 15% em todas as concentrações testadas. Estes resultados
foram considerados surpreendentes para os autores, uma vez que esta espécie habita áreas do
litoral sujeitas a condições de estresse em função das elevadas radiação, temperatura e
dessecação, causadas pela variação das marés. O percentual de sequestro em Codium
isthmocladum encontrado no presente trabalho foi pelo menos cinco vezes superior.
A capacidade de sequestro do DPPH da Ulva lactuca (74%) cultivada sob
diferentes condições por El-Baky, El-Baz e El-Batory (2009) foi superior à apresentada pela
U. lactuca analisada no presente trabalho (54%). Assim como no presente trabalho, os
controles positivos BHA, BHT e α-tocoferol também apresentaram atividades superiores.
As dez espécies de Rhodophyta analisadas no presente trabalho apresentaram as
menores capacidades para sequestrar o radical DPPH. Os extratos de Amansia multifida,
Bryothamnion seaforthii e B. triquetrum exibiram as maiores atividades, respectivamente,
75,4 ± 0,1%, 50,2 ± 1,1% e 46,6 ± 0,3%. Nos extratos das demais espécies os valores
permaneceram aproximadamente entre 35% e 40% (Figura 8B).
De acordo com os resultados da Tabela 4, todos os extratos das rodófitas
apresentaram percentuais de sequestro inferiores aos observados nos controles positivos em
todas as concentrações testadas, exceção feita ao de A. multifida, cuja atividade foi
semelhante a da quercetina (5 µg mL-1) e do BHT (20 µg mL-1), mas superior a do BHT e α-
tocoferol (5 e 10 µg mL-1) e a do ácido ascórbico e β-caroteno apenas na menor concentração.
Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008) observaram que a atividade de sequestro do
DPPH dos extratos metanólicos das algas vermelhas Eucheuma kappaphycus, Gracilaria
edulis e Acanthophora spicifera foi menor que a do α-tocoferol (1 mg). Outra referência com
resultados semelhantes foi feita ao extrato bruto e demais frações, exceto a de acetato de etila,
de Rhodomela confervoides na concentração 50 µg mL-1 que exibiram baixas atividades (18%
a 40%) muito inferiores àquelas determinadas para BHT, ácido gálico e ácido ascórbico que
ficaram entre 63% e 97% (WANG et al., 2009).
Com exceção de A. multifida analisada neste trabalho, os extratos metanólicos
(100 µg mL-1) de praticamente todas as rodófitas estudadas por Devi et al. (2008)
apresentaram capacidades de sequestro do DPPH inferiores a 50%. Estas atividades foram
menores que as exibidas pelo controle positivo BHT, em concentrações variando de 20 a 100
µg mL-1. O extrato de Gelidiella acerosa (72,5%) apresentou atividade ligeiramente superior
a do BHT (70%).
53 Tabela 4 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).
FAmansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia
(%) multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana
Quercetina 5 µg mL-1 1.563,9 86,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 2.162,1 97,5 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 2.578,2 97,1 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
BHA 5 µg mL-1 1.906,7 83,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 2.587,1 93,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 3.399,2 96,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
BHT 5 µg mL-1 1.028,6 58,1 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 1.133,4 65,2 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 1.446,7 75,9 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 1.172,2 66,8 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 1.204,6 82,4 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 3.503,1 97,7 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
α-tocoferol 5 µg mL-1 1.000,4 57,5 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 1.222,8 67,8 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 1.981,0 85,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
β-caroteno 5 µg mL-1 1.107,5 63,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
10 µg mL-1 1.704,3 79,4 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
20 µg mL-1 4.991,2 100,0 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0
Controle positivop < 0,01
DPPH (%) nas espéciesACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
53
54
Os dados de capacidade de sequestro do DPPH nos extratos metanólicos a 50%
das rodófitas analisadas no presente trabalho foram superiores aos dos extratos brutos de
Polysiphonia urceolata, preparados em metanol:clorofórmio nas concentrações de 0,4 a 10 µg
mL-1, cujas atividades não alcançaram 25% (DUAN et al., 2006). Je et al. (2009) encontraram
em outra espécie do mesmo gênero P. morrowii que as capacidades de sequestro dos extratos
metanólicos a 80% e a 90% foram iguais a 47,5% e 92%, respectivamente.
A atividade de sequestro de DPPH nos extratos metanólicos de Kappaphycus
alvarezii foi inferior a 20% nas concentrações mais baixas (0,5 a 2,5 mg mL-1) e não chegou a
60% nas mais elevadas (3 a 5 mg mL-1) (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008). No presente
trabalho, as atividades foram superiores àquelas reportadas nas menores concentrações e, da
mesma forma, as atividades nos extratos algáceos foram mais baixas do que as exibidas pelos
antioxidantes sintéticos, com exceção de A. multifida.
Ainda com relação às macroalgas vermelhas analisadas no presente trabalho, os
percentuais de sequestro do DPPH foram de seis a quatorze vezes superiores aos relatados por
Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008) para os extratos metanólicos (100 µg mL-1), com nenhuma
espécie apresentando resultado semelhante ao do α-tocoferol.
Os extratos metanólicos e etanólicos de Gracilaria birdiae e G. cornea (0,5 mg
mL-1) investigados por Souza et al. (2011) apresentaram atividades de sequestro do DPPH
entre 30% e 40%, semelhantes às observadas na maioria dos extratos de ródofitas analisadas
no presente trabalho (34% a 46%). Embora as atividades dos extratos algáceos tenham sido
inferiores a do BHT (50%), os autores as consideraram expressivas por serem derivadas de
uma fonte natural. Com base na consideração acima, a maioria dos extratos analisados no
presente trabalho apresentou atividade análoga, mesmo quando elas foram inferiores às
determinadas com os antioxidantes sintéticos usados como controles positivos.
Dentre todas as espécies analisadas no presente trabalho, o melhor potencial para
sequestrar o DPPH foi observado no Filo Ochrophyta. Todos os extratos exibiram atividade
igual a 100%, com exceção de Spatoglossum schroederi, que foi 97,7 ± 0,4% (Figura 8C).
Todas essas atividades foram superiores às exibidas pelos controles positivos em
todas as concentrações testadas, com exceção de quercetina (10 µg mL-1) e de ácido ascórbico
e β-caroteno (20 µg mL-1), que apresentaram a mesma atividade de S. schroederi (Tabela 5).
55 Tabela 5 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).
FDictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum
(%) dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare
Quercetina 5 µg mL-1 1.148,3 86,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 230,1 97,5 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 366,4 97,1 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
BHA 5 µg mL-1 3.023,5 83,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 1.045,0 93,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 849,4 96,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
BHT 5 µg mL-1 8.636,1 58,1 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 6.177,0 65,2 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 3.795,1 75,9 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 5.829,9 66,8 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 1.201,2 82,4 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 602,4 97,7 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
α-tocoferol 5 µg mL-1 8.315,3 57,5 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 5.943,0 67,8 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 2.290,5 85,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
β-caroteno 5 µg mL-1 6.936,2 63,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
10 µg mL-1 3.851,6 79,4 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
20 µg mL-1 418,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0
p < 0,01
DPPH (%) nas espéciesControle positivo
ACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
55
56
O’Sullivan et al. (2011) avaliaram a capacidade de sequestrar o DPPH nos
extratos de cinco espécies de algas pardas e na concentração de 5 mg mL-1 a atividade
antioxidante variou de 5,5% a 25,6%. Os extratos metanólicos (1 mg mL-1) das algas pardas
analisadas por Chandini, Ganesan e Bhaskar (2008) apresentaram poder de sequestrar o
DPPH de 11% em Sargassum marginatum, 14,78% em Padina tetrastomatica e 17,23% em
Turbinaria conoides. Em ambos os trabalhos, os resultados foram muito inferiores aos
determinados neste estudo.
Ao contrário dos dados obtidos no presente trabalho, os extratos metanólicos (100
µg mL-1) de Dictyota dichotoma, Padina gymnospora, Sargassum wightii e T. conoides
exibiram atividade sequestrante inferior a 40%, menor do que a do BHT nas concentrações 20
e 100 µg mL-1 (DEVI et al., 2008). Entretanto, a atividade reportada por Kuda et al. (2005) no
extrato metanólico (10 mg mL-1) da alga parda Scytosiphon lomentaria foi superior a 80%,
semelhante à apresentada pelos controles positivos, catequina e ácido ascórbico, na
concentração 1 mg mL-1.
Atividades parecidas com as exibidas pelos extratos de algas pardas do presente
trabalho (100%) também foram reportadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011), mas
unicamente nos extratos testados na maior concentração que foi 2 mg mL-1. Nas demais
concentrações as atividades variaram de aproximadamente 5% a quase 80%, inferiores àquela
observada com o ácido ascórbico.
4.1.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC)
No presente trabalho, com exceção do extrato da alga parda Spatoglossum
schroederi, todos os das demais espécies analisadas apresentaram habilidade de quelação do
íon ferroso. De um modo geral, as atividades exibidas pelos extratos das espécies vermelhas
foram maiores ou iguais as das pardas, que por sua vez, foram maiores que as das verdes
(Figura 9). Resultados semelhantes foram encontrados por Chew et al. (2008) em extratos
algáceos também preparados com metanol 50%, em que o percentual de quelação do íon
ferroso determinado em Padina gymnospora (parda) foi maior que em Caulerpa racemosa
(verde) que, por sua vez, exibiu atividade mais elevada do que Kappaphycus alvarezzi
(vermelha). A atividade de quelação dos extratos depende claramente da presença de
compostos quelantes nos extratos algáceos que podem variar entre espécies. Toth e Pavia
(2000) se referem aos florotaninos comumente presentes nas algas pardas como fortes
queladores de metais.
57 Figura 9 - Habilidade de quelação do íon ferroso. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.
U. fasciata
U. lactuca
C. cupressoides
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
0 20 40 60 80 100
7,6 e
8,2 e
12,1 d
12,5 d
20,3 c
31,8 b
43,1 a
U. fasciata
U. lactuca
C. cupressoides
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
Habilidade de quelação (%)
C. crenulata
G.domingensis
G. ferox
P. americana
C. luxurians
B. occidentalis
H. musciformis
A. multifida
B. seaforthii
B. triquetrum
--
0 20 40 60 80 100
12,8 g
13,4 fg
16,2 efg
17,0 efg
18,3 ef
20,2 e
30,2 d
37,2 c
45,2 b
C. crenulata
G. domingensis
G. ferox
P. americana
C. luxurians
B. occidentalis
H. musciformis
A. multifida
B. seaforthii
B. triquetrum 62,7 a
Habilidade de quelação (%)
L. variegata
D. mertensii
S. vulgare
D. dichotoma
P. gymnospora
0 20 40 60 80 100
15,5 e
22,4 d
29,0 c
43,5 b
49,6 a
L. variegata
D. mertensii
S. vulgare
D. dichotoma
P. gymnospora
Habilidade de quelação (%)
Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
58
Dentre as algas verdes, os extratos de Caulerpa sertularioides, C. prolifera e C.
racemosa apresentaram maior habilidade de quelação do íon ferroso com valores iguais a,
respectivamente, 43,1 ± 3,5%, 31,8 ± 2,4% e 20,3 ± 1,5%. Nas demais espécies, os
percentuais ficaram entre 7,6 ± 0,7% e 12,5 ± 0,8% (Figura 9A).
Especificamente neste ensaio de determinação da habilidade de quelação do íon
ferroso, apenas o EDTA foi utilizado como controle positivo, por ser reconhecidamente um
potente agente quelante.
A habilidade de quelação do íon ferroso do EDTA foi superior a quase todos os
extratos das algas verdes em todas as concentrações testadas, com exceção de C. prolifera e
C. sertularioides que apresentaram atividade superior a do EDTA na concentração 5 µg mL-1
e de C. racemosa e C. sertularioides cujas atividades foram semelhantes a do controle
positivo nas concentrações 5 e 10 µg mL-1, respectivamente (Tabela 6).
No presente estudo, os resultados de quelação do íon ferroso dos extratos de
praticamente todas as espécies do gênero Caulerpa foram mais elevados do que o encontrado
em extrato similar de C. racemosa, em todas as concentrações testadas, que foi inferior a 20%
(CHEW et al., 2008). Na comparação com Ganesan, Kumar e Rao (2011), a atividade de
quelação dos extratos de Caulerpa, aproximadamente 30% a 40%, foi semelhante à exibida
pelos extratos metanólicos (1 mg mL-1) das clorófitas do gênero Enteromorpha, porém
inferior a do EDTA (58,38%).
Ainda com respeito às atividades de quelação dos extratos de Caulerpa analisados
no presente trabalho, elas foram superiores a exibida pelo extrato de C. lentillifera que não
atingiu 10% (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011), mas semelhantes às determinadas nos extratos
de Caulerpa estudados por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011). Assim como nesta pesquisa,
em ambos os trabalhos supracitados, as atividades foram mais baixas do que aquelas
determinadas com o controle positivo (EDTA). O mesmo comportamento foi verificado com
o extrato da alga verde Cladophora glomerata cuja capacidade de quelação do ferro foi 54
vezes inferior à exibida pelo EDTA (SOLTANI et al., 2011).
Dentre as algas vermelhas, os extratos de Bryothamnion triquetrum e B. seaforthii
apresentaram as maiores habilidades para quelar o ferro, respectivamente, 62,7 ± 2,6% e
45,2 ± 1,2%. Nos extratos das outras espécies de rodófitas, estes valores variaram de
12,8 ± 1,1% a 37,2 ± 3,7% (Figura 9B).
59 Tabela 6 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Chlorophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).
FCaulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva
(%) cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca
EDTA 5 µg mL-1 194,9 20,1 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2
10 µg mL-1 268,1 39,7 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2
20 µg mL-1 486,4 66,3 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2
p < 0,01Controle positivo
FIC (%) nas espéciesACP*
Tabela 7 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Rhodophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).
FAmansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia
(%) multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana
EDTA 5 µg mL-1
167,7 20,1 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0
10 µg mL-1
178,8 39,7 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0
20 µg mL-1 255,6 66,3 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0
p < 0,01Controle positivo
FIC (%) nas espéciesACP*
Tabela 8 - Comparação entre o controlespositivo e os extratos de Ochrophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).
FDictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum
(%) dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare
EDTA 5 µg mL-1 561,4 20,1 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0
10 µg mL-1 671,8 39,7 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0
20 µg mL-1 829,8 66,3 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0
FIC (%) nas espécies
p < 0,01Controle positivo
ACP*
*ACP = atividade antioxidante do controle positivo.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
59
60
As comparações entre as habilidades de quelação do EDTA e dos extratos de
algas vermelhas estão apresentadas na Tabela 7. Os extratos de Amansia multifida,
Bryothamnion triquetrum, B. seaforthii, Hypnea musciformis, Botryocladia occidentalis,
Cryptomenia luxurians e Gracilaria ferox apresentaram habilidade de quelação superior
(quatro primeiras) ou semelhante (três últimas) à exibida pelo EDTA 5 µg mL-1. Na
comparação com o controle positivo na concentração 10 µg mL-1, o extrato de B. triquetrum
apresentou habilidade quase duas vezes superior, ao passo que nos de A. multifida e B.
seaforthii, as habilidades foram similares, assim como para o extrato de B. triquetrum ao ser
comparado com EDTA 20 µg mL-1.
O extrato metanólico (50%) da alga vermelha Kappaphycus alvarezii apresentou
habilidade de quelação inferior a 10% em todas as concentrações testadas (CHEW et al.,
2008), menor do que a encontrada no presente estudo (12,8%-62,7%). No extrato metanólico
(0,5-2,5 mg mL-1) da mesma espécie, Kumar, Ganesan e Rao (2008) determinaram atividade
inferior a 40%, tendo sido mais baixa que a determinada para o ácido ascórbico. Yuan, Bone e
Carrington (2005) não detectaram atividade de quelação de metais de transição no extrato da
alga vermelha Palmaria palmata.
Quanto às algas pardas, valores máximos da habilidade de quelação foram
verificados nos extratos de Padina gymnospora (49,6 ± 3,1%) e Dictyota dichotoma (43,5 ±
1,9%). Em Sargassum vulgare, Dictyota mertensii e Lobophora variegata, as atividades de
quelação foram de 29,0 ± 2,3%, 22,4 ± 1,1% e 15,5 ± 0,9%, respectivamente. Nenhuma
atividade foi perceptível em Spatoglossum schroederi (Figura 9C).
Habilidades de quelação superiores à do EDTA foram observadas nos extratos de
P. gymnospora nas concentrações 5 e 10 µg mL-1 e de D. dichotoma em 5 µg mL-1. Valores
semelhantes foram verificados nos extratos de S. vulgare e D. mertensii, considerando as duas
concentrações (Tabela 8).
Segundo Kuda et al. (2005), a atividade do extrato metanólico (10 mg mL-1) da
alga parda Scytosiphon lomentaria foi de 80%, inferior a encontrada com o EDTA (100%) em
concentração cem vezes menor (0,1 mg mL-1). No extrato aquoso de Petalonia binghamiae, a
habilidade de quelação foi de 40% (KUDA; HISHI; MAEKAWA, 2006), semelhante às
determinadas nos extratos de P. gymnospora e D. dichotoma analisadas no presente trabalho.
Em todos os extratos das algas pardas analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011), a
habilidade de quelação do íon ferroso foi inferior a 50% e, semelhantemente ao presente
trabalho, menor do que a do EDTA (100%), com exceção do extrato de Dictyopteris
delicatula na concentração 1 mg mL-1. Extratos de Sargassum siliquastrum apresentaram
61
habilidade abaixo de 30% (etanólico e aquoso) e 69% (clorofórmico), todas menores que a do
EDTA (100%) (CHO et al., 2007).
4.1.3 Poder de redução do ferro (FRAP)
O poder de redução do ferro nos extratos das algas verdes, vermelhas e pardas,
está apresentado na Figura 10, em que a observação simultânea dos três grupos permite
visualizar que a redução exibida pelos extratos de algas pardas foi mais efetiva que a das
verdes, os quais foram mais ou igualmente efetivos aos das vermelhas.
De acordo com Kelman et al. (2012) e Kumar et al. (2011b), o poder de redução
do ferro dos extratos metanólicos das espécies de algas pardas foi maior ou igual ao das
verdes, que também foi superior ao das vermelhas. No entanto, Matanjun et al. (2008)
observaram poder de redução dos extratos metanólicos, em ordem decrescente, nas algas
verdes, pardas e vermelhas.
Os extratos das quatro espécies de Caulerpa apresentaram maior poder para
reduzir Fe3+ a Fe2+ com absorbâncias ou densidades ópticas (DO) variando de 0,118 ± 0,003
(C. cupressoides) a 0,275 ± 0,019 (C. sertularioides). As menores DO foram observadas nos
extratos de Ulva lactuca (0,065 ± 0,011) e U. fasciata (0,057 ± 0,006) (Figura 10A).
As comparações do poder de redução entre os controles positivos e os extratos de
algas verdes estão apresentadas na Tabela 9. Com exceção do extrato de U. fasciata que
apresentou poder de redução semelhante à do β-caroteno na concentração 20 µg mL-1, todos
os demais extratos de algas verdes apresentaram atividade superior àquela observada com α-
tocoferol, até 39 vezes, e β-caroteno, até 27 vezes, em todas as concentrações testadas. Os
extratos de C. prolifera e C. sertularioides apresentaram poder de redução superior a
observada para quercetina, BHA, BHT e ácido ascórbico nas concentrações 5 e 10 µg mL-1.
C. sertularioides também apresentou atividade superior ao ácido ascórbico em 20 µg mL-1.
Os valores de DO dos extratos de Caulerpa sertularioides, C. prolifera e C.
racemosa foram superiores ao do extrato etanólico (95%) de C. lentillifera na concentração
100 ppm (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011), cujo valor foi aproximadamente 0,15, abaixo do
da vitamina C (cerca de 0,7), na mesma concentração. Entretanto, a atividade dos extratos
dessas espécies foi semelhante a dos extratos metanólicos (0,1 e 0,5 mg mL-1) das espécies do
gênero Caulerpa analisadas por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011), cujas DO ficaram em
torno de 0,2, sendo bem inferiores à observada no BHT que correspondeu a 1,2.
62 Figura 10 - Poder de redução do ferro. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.
U. fasciata
U. lactuca
C. isthmocladum
C. cupressoides
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0,057 e
0,065 e
0,096 d
0,118 d
0,169 c
0,205 b
0,275 a
U. fasciata
U. lactuca
C. isthmocladum
C. cupressoides
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
Atividade de redução (Abs700nm
)
C. crenulata
C. luxurians
P. americana
G. ferox
H. musciformis
G. domingensis
B. occidentalis
B. seaforthii
B. triquetrum
A. multifida
--
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0,055 d
0,059 cd
0,060 cd
0,061 cd
0,067 cd
0,070 c
0,071 c
0,089 b
0,089 b
0,119 a
C. crenulata
C. luxurians
P. americana
G. ferox
H. musciformis
G. domingensis
B. occidentalis
B. seaforthii
B. triquetrum
A. multifida
Atividade de redução (Abs700nm
)
D. dichotoma
P. gymnospora
L. variegata
D. mertensii
S. shoroederii
S.vulgare
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0,269 e
0,366 d
0,411 c
0,442 c
0,563 b
1,128 a
D. dichotoma
P. gymnospora
L. variegata
D. mertensii
S. schroederi
S. vulgare
Atividade de redução (Abs700nm
)
Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
63 Tabela 9 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).
F
Caulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva
Abs700nm cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca
Quercetina 5 µg mL-1 174,5 0,108 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 171,9 0,169 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 252,6 0,287 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
BHA 5 µg mL-1 172,0 0,108 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 168,7 0,171 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 249,0 0,283 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
BHT 5 µg mL-1 170,2 0,121 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 172,5 0,182 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 275,1 0,306 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 180,6 0,090 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 168,7 0,139 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 215,7 0,251 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
α-tocoferol 5 µg mL-1 227,1 0,007 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 222,8 0,008 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 239,8 0,007 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
β-caroteno 5 µg mL-1 237,2 0,010 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
10 µg mL-1 230,9 0,015 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
20 µg mL-1 197,9 0,039 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065
p < 0,01Controle positivo
FRAP (Abs700nm) das espéciesACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
63
64
Resultados semelhantes também foram observados por Kumar et al. (2011a) nos
extratos metanólicos de C. veravelensis, C. scalpelliformis e C. racemosa (0,5 e 1 mg mL-1)
que apresentaram atividade de redução superior a do BHA e BHT. Diferentemente do que foi
obtido neste trabalho, os extratos de Avrainvillea longicaulis (0,1 e 0,5 mg mL-1)
apresentaram poder de redução inferior aos exibidos pelo ácido ascórbico, BHA, BHT e
α-tocoferol (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007). O extrato metanólico de
Enteromorpha compressa também apresentou DO (0,05-0,15) menor que a do BHT (0,05-
2,50) (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011).
Dentre as algas vermelhas analisadas, o extrato de Amansia multifida apresentou o
maior poder de redução, ou seja, DO máxima de 0,119 ± 0,005, seguido dos extratos de
Bryothamnion triquetrum (0,089 ± 0,004) e B. seaforthii (0,089 ± 0,005). Nas demais espécies
de rodófitas os valores de DO ficaram entre 0,055 e 0,071 (Figura 10B).
Similarmente às clorófitas, todas as rodófitas apresentaram poder de redução do
ferro maior que os de α-tocoferol e β-caroteno nas concentrações 5, 10 e 20 µg mL-1. A
diferença entre a atividade dos controles positivos e dos extratos algáceos foi de até dezessete
vezes para o primeiro e doze vezez para o segundo. Comparados aos controles positivos na
concentração 5 µg mL-1, o extrato de A. multifida apresentou atividade superior a do ácido
ascórbico e semelhante a da quercetina, BHA e BHT. Os extratos de B. seaforthii e B.
triquetrum apresentaram atividade similar a do ácido ascórbico (Tabela 10).
O extrato metanólico da alga vermelha Kappaphycus alvarezii (0,5 e 1 mg mL-1)
exibiu DO abaixo de 0,1 (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008), compatível com a maioria dos
extratos das rodófitas do presente trabalho, sendo inferior à atividade do BHT nas mesmas
concentrações. Com exceção do extrato de Gelidiella acerosa, os demais extratos de rodófitas
analisados por Devi et al. (2008) apresentaram poder de redução do ferro muito inferior ao do
BHT. O mesmo foi observado com o extrato de Chondria baileyana para BHT, BHA, ácido
ascórbico e α-tocoferol (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007), e com a fração
metanólica (90%) de Polysiphonia morrowii (25 e 50 µg mL-1) para BHA e BHT, nas mesmas
concentrações (JE et al., 2009).
Com relação às algas pardas estudadas neste trabalho, o extrato de Sargassum
vulgare foi o que apresentou máxima DO (1,128 ± 0,036), conferindo-lhe pronunciado poder
de redução do ferro, duas a quatro vezes superior aos observados nas demais espécies, que
variaram de 0,269 ± 0,023 em Dictyota dichotoma a 0,563 ± 0,010 em Spatoglossum
schroederi (Figura 10C). Estes valores não foram muito diferentes dos observados nos
extratos metanólicos das ocrófitas (1 mg mL-1) analisadas por Kumar et al. (2011b).
65 Tabela 10 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).
F
Amansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia
Abs700nm multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana
Quercetina 5 µg mL-1 60,5 0,108 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 152,2 0,169 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 591,4 0,287 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
BHA 5 µg mL-1 58,2 0,108 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 146,6 0,171 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 575,8 0,283 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
BHT 5 µg mL-1 71,9 0,121 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 175,1 0,182 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 687,6 0,306 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 49,9 0,090 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 95,8 0,139 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 415,8 0,251 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
α-tocoferol 5 µg mL-1 86,0 0,007 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 81,2 0,008 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 101,0 0,007 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
β-caroteno 5 µg mL-1 96,9 0,010 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
10 µg mL-1 87,7 0,015 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
20 µg mL-1 51,3 0,039 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060
Controle positivop < 0,01
FRAP (Abs700nm) das espéciesACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
65
66
Ainda com referência às algas pardas analisadas por Chandini, Ganesan e Bhaskar
(2008), os extratos metanólicos (0,1 a 1 mg mL-1) apresentaram DO inferior a 1,0. Para Je et
al. (2009), extratos com DO abaixo de 0,2 apresentam fraca atividade de redução.
Considerando-se esta afirmação, os extratos de algas pardas analisadas no presente trabalho
apresentaram elevado poder de redução do ferro, ao passo que, as análises de Kuda, Hishi e
Maekawa (2006), com Petalonia binghamiae, mostraram DO inferior a 0,2 no extrato
etanólico, mas 0,8 no extrato aquoso. Os extratos das algas pardas (0,1 a 2 mg mL-1)
analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011) apresentaram DO variando de 0,2 a
aproximadamente 0,8.
Todos os extratos das algas pardas analisadas neste trabalho apresentaram poder
de redução superior aos controles positivos testados em todas as concentrações, com exceção
do extrato de S. schroederi que exibiu atividade semelhante às de quercetina, BHT e ácido
ascórbico na concentração 20 µg mL-1. As diferenças entre os extratos algáceos e os controles
positivos foram muito elevadas, chegando a 160 vezes (Tabela 11).
Ao contrário do presente trabalho, os extratos de algas pardas (0,1 a 2 mg mL-1)
analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011) apresentaram valores de DO inferiores ao
observado com o BHT.
Nos extratos de dez espécies de algas pardas analisadas por Zubia et al. (2009), o
poder de redução do ferro foi menor que o dos controles positivos BHA, BHT, ácido
ascórbico e α-tocoferol em todas as concentrações testadas, com exceção de Fucus serratus
(500 mg L-1), que apresentou atividade semelhante, e de Halidrys siliquosa (100 mg L-1), cuja
atividade foi semelhante a do α-tocoferol, na mesma concentração. Resultados parecidos
foram encontrados por Zubia, Robledo e Freile-Pelegrin (2007) com o extrato de Lobophora
variegata, que apresentou atividade de redução do ferro também inferior ao BHA, BHT, ácido
ascórbico e α-tocoferol. Cho et al. (2007) também relataram menor atividade de redução do
ferro nos extratos de Sargassum siliquastrum do que a exibida pelo ácido ascórbico.
A atividade de redução dos extratos das algas Turbinaria conoides (todas as
concentrações) e Padina tetrastomatica (500 µg mL-1), comparada com a do α-tocoferol,
mostrou-se superior (CHANDINI; GANESAN; BHASKAR, 2008).
67 Tabela 11 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).
F
Dictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum
Abs700nm dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare
Quercetina 5 µg mL-1 1.000,2 0,108 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 931,9 0,169 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 837,2 0,287 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
BHA 5 µg mL-1 995,0 0,108 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 923,5 0,171 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 840,2 0,283 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
BHT 5 µg mL-1 981,6 0,121 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 913,6 0,182 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 823,9 0,306 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 1.021,8 0,090 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 962,1 0,139 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 861,2 0,251 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
α-tocoferol 5 µg mL-1 1.108,1 0,007 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 1.100,8 0,008 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 1.129,7 0,007 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
β-caroteno 5 µg mL-1 1.126,1 0,010 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
10 µg mL-1 1.116,9 0,015 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
20 µg mL-1 1.061,9 0,039 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563
Controle positivop < 0,01
ACP*FRAP (Abs700nm) das espécies
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
67
68
4.1.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico
Os valores da atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico das
Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta analisadas no presente trabalho após 1 h de
incubação estão apresentados na Figura 11. De um modo geral as maiores atividades foram
observadas nos extratos das clorófitas seguidas das rodófitas e ocrófitas.
Nas clorófitas as maiores atividades foram observadas em Caulerpa racemosa
(95,3 ± 0,8%), C. cupressoides (92,7 ± 0,3%) e Codium isthmocladum (91,6 ± 0,2%); nas
demais espécies a variação ficou entre 70,3% em C. sertularioides e 86,0% em U. lactuca
(Figura 11A).
Em relação à comparação com os controles positivos, as atividades de todos os
extratos foram superiores a do ácido ascórbico nas três concentrações e a da quercetina com
exceção de C. sertularioides. C. racemosa apresentou atividade maior que BHA e α-tocoferol
nas concentrações 5 e 10 µg mL-1, enquanto C. sertularioides e C. isthmocladum apenas para
o último na menor concentração (Tabela 12).
No presente estudo, a atividade antioxidante do extrato de C. racemosa foi três
vezes mais eficaz do que a observada por Chew et al. (2008) no mesmo tipo de extrato e com
a mesma espécie, que permaneceu em torno de 30% na maior concentração testada,
praticamente a metade da exibida pela quercetina (60%). A atividade nos extratos de Ulva
determinada no presente trabalho foi superior a de U. lactuca observada por El-Baky, El-Baz
e El-Baroty (2009) após 2 h de incubação que, por sua vez, foi inferior a dos controles
positivos BHA e BHT. De acordo com Shanab, Shalaby e El-Fayoumy (2011), o extrato
etanólico de Enteromorpha compressa nas concentrações 100 e 200 µg mL-1 apresentaram
atividades antioxidantes de 65% e 67%, respectivamente, semelhantes à exibida pelo BHT,
nas mesmas concentrações (66% e 68%, respectivamente).
Os extratos de Rhodophyta apresentaram atividade antioxidante variando entre
64,8 ± 2,4% (Bryothamnion seaforthii) e 79,1 ± 3,6% (Hypnea musciformis) (Figura 11B).
Estes valores foram mais elevados do que os observados nos extratos de Gracilaria birdiae e
G. cornea, que variaram de 10% a 40%, em todas as concentrações (SOUZA et al., 2011).
Com exceção da atividade antioxidante exibida pelo extrato de H. musciformis
que foi superior a observada com a quercetina nas concentrações 5 e 10 µg mL-1 (68,1% e
66,3%), os demais extratos de algas vermelhas apresentaram atividade entre 64,8% e 72,3%.
Os extratos das rodófitas apresentaram atividade antioxidante superior à exibida pelo ácido
ascórbico nas três concentrações (35,2% a 44,7%) (Tabela 13).
69 Figura 11 - Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico. (A) Chlorophyta, (B)
Rhodophyta e (C) Ochrophyta.
C. sertularioides
U. fasciata
C. prolifera
U. lactuca
C. isthmocladum
C. cupressoides
C. racemosa
0 20 40 60 80 100
70,3 d
83,7 c
84,1 c
86,0 c
91,6 b
92,7 ab
95,3 a
C. sertularioides
U. fasciata
C. prolifera
U. lactuca
C. isthmocladum
C. cupressoides
C. racemosa
Atividade antioxidante (%)
B. seaforthii
B. triquetrum
G. domingensis
G. ferox
C. crenulata
P. americana
C. luxurians
A. multifida
B. occidentalis
H. musciformis
--
0 20 40 60 80 100
64,8 c
67,1 bc
67,3 bc
68,8 bc
69,6 bc
70,2 bc
70,5 bc
71,0 bc
72,3 b
79,1 a
B. seaforthii
B. triquetrum
G. domingensis
G. ferox
C. crenulata
P. americana
C. luxurians
A. multifida
B. occidentalis
H. musciformis
Atividade antioxidante (%)
L. variegata
D. mertensii
S. shoroederii
S.vulgare
D. dichotoma
P. gymnospora
0 20 40 60 80 100
34,3 d
37,9 bc
36,1 cd
37,9 bc
40,5 bc
91,9 a
L. variegata
D. mertensii
S. schroederi
S. vulgare
D. dichotoma
P. gymnospora
Atividade antioxidante (%)
Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
70 Tabela 12 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.
FCaulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva
(%) cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca
Quercetina 5 µg mL-1 109,7 68,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
10 µg mL-1 81,2 66,3 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
20 µg mL-1 91,8 73,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
BHA 5 µg mL-1 57,8 92,2 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
10 µg mL-1 86,9 92,3 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
20 µg mL-1 86,6 93,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
BHT 5 µg mL-1 87,0 94,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
10 µg mL-1 87,0 95,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
20 µg mL-1 96,3 95,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 236,7 44,7 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
10 µg mL-1 221,2 35,2 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
20 µg mL-1 315,8 35,6 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
α-tocoferol 5 µg mL-1 81,7 88,6 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
10 µg mL-1 79,7 90,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
20 µg mL-1 64,2 94,4 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0
p < 0,01Controle positivo
Atividade antioxidante (%) das espéciesACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
70
71 Tabela 13 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.
FAmansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia
(%) multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana
Quercetina 5 µg mL-1
7,0 68,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
10 µg mL-1 6,1 66,3 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
20 µg mL-1 7,4 73,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
BHA 5 µg mL-1 33,3 92,2 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
10 µg mL-1 41,4 92,3 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
20 µg mL-1 47,4 93,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
BHT 5 µg mL-1 48,5 94,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
10 µg mL-1 52,7 95,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
20 µg mL-1 59,5 95,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 31,7 44,7 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
10 µg mL-1 44,7 35,2 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
20 µg mL-1 53,3 35,6 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
α-tocoferol 5 µg mL-1 28,4 88,6 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
10 µg mL-1 32,5 90,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
20 µg mL-1 42,7 94,4 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2
Controle positivop < 0,01
Atividade antioxidante (%) das espéciesACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
71
72
Os extratos brutos (metanol:clorofórmio) das algas vermelhas Polysiphonia
urceolata (DUAN et al., 2006) e Rhodomela confervoides (WANG et al., 2009), nas
concentrações 10 e 50 µg mL-1, exibiram atividades antioxidantes iguais a 20,3% e 61,7% e a
10,3% e 38,1%, respectivamente. Estes resultados foram inferiores aos observados nos
extratos das rodófitas do presente estudo. Porém na comparação com a atividade do BHT,
essas duas espécies foram menos ativas, semelhantemente ao encontrado no presente trabalho.
O extrato metanólico a 50% da alga vermelha Kappaphycus alvarezzi (CHEW et
al., 2008) apresentou em todas as concentrações testadas atividade antioxidante inferior (30%-
50%) às observadas nos extratos de rodófitas do presente estudo, e diferentemente desta
pesquisa, o extrato de K. alvarezii exibiu menor atividade do que a quercetina.
Com exceção do extrato de Padina gymnospora, com atividade antioxidante igual
a 91,9 ± 0,4%, todos os extratos de algas pardas mostraram baixa atividade, entre 34,3 ± 0,1%
(Lobophora variegata) e 40,5 ± 0,8% (Dictyota dichotoma) (Figura 11C).
As atividades antioxidantes dos extratos das algas pardas foram menores que as
dos controles positivos, com exceção daquelas referentes aos extratos de P. gymnospora e D.
dichotoma. O primeiro apresentou atividade superior a da quercetina e do ácido ascórbico nas
três concentrações e a do α-tocoferol (5 e 10 µg mL-1), mas semelhante a do BHA (5 e 10 µg
mL-1); e o segundo, a do ácido ascórbico (10 e 20 µg mL-1) (Tabela 14).
Assim como no presente estudo, os extratos das algas pardas (50 mg L-1)
analisados por Zubia et al. (2009), com exceção de Halidrys siliquosa (75,17%), também
apresentaram baixa atividade antioxidante, entre 5,62% e 24,63%. Alguns extratos, por
exemplo, de D. dichotoma e de Desmarestia ligulata apresentaram ação pró-oxidante. Todos
exibiram atividade inferior ao BHA (82,40%), BHT (80,44%) e α-tocoferol (77,02%).
Os extratos metanólicos (60%) das algas pardas (10 mg mL-1) analisadas por
O’Sullivan et al. (2011) apresentaram atividade antioxidante superior a 50%, sendo
semelhante ou ligeiramente inferior à observada com Trolox na concentração 0,53 mg mL-1. É
importante ressaltar que essa concentração era quase dezenove vezes inferior à do extrato.
O extrato de Padina antillarum apresentou atividade antioxidante (30%-50%) em
todas as concentrações testadas por Chew et al. (2008), bem inferior à observada em P.
gymnospora do presente estudo (91,9%). Diferentemente do presente trabalho, essa atividade
foi menor do que a da quercetina.
73 Tabela 14 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.
FDictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum
(%) dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare
Quercetina 5 µg mL-1 1.025,2 68,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
10 µg mL-1 412,5 66,3 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
20 µg mL-1 1.127,7 73,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
BHA 5 µg mL-1 788,4 92,2 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
10 µg mL-1 2.782,2 92,3 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
20 µg mL-1 2.215,9 93,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
BHT 5 µg mL-1 2.176,5 94,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
10 µg mL-1 1.881,5 95,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
20 µg mL-1 2.341,6 95,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
Ácido ascórbico 5 µg mL-1 989,0 44,7 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
10 µg mL-1 423,8 35,2 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
20 µg mL-1 1.112,2 35,6 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
α-tocoferol 5 µg mL-1 2.614,9 88,6 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
10 µg mL-1 2.215,0 90,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
20 µg mL-1 880,5 94,4 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9
Atividade antioxidante (%) das espéciesControle positivo
p < 0,01ACP*
*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.
Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.
73
74
4.2 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)
No presente trabalho, os resultados de CFT foram expressos em mg AGE g-1 alga
seca, calculados através da curva padrão de ácido gálico representada na Figura 12
( 9999,0,11,0099,00146,0 ==+−= rnxy ).
Figura 12 - Curva padrão de ácido gálico, com concentração de 1 a 250 mg L-1.
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 2750,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
2,75
y = -0,0146 + 0,0099 x(r = 0,9999, n = 11)
Abs
760
nm
mg ácido gálico L-1
Os extratos das algas pardas apresentaram maior teor de CFT, seguidos pelos
extratos das verdes e vermelhas (Figura 13). Comportamentos semelhantes foram observados
por Kumar et al. (2011b) em extratos metanólicos de 22 espécies de macroalgas marinhas, por
Wang, Jónsdóttir e Ólafsdóttir (2009) em extratos aquoso e acetônico (70%) de doze espécies
e por Chew et al. (2008) em extrato semelhante ao usado no presente trabalho (metanol 50%).
Yuan e Walsh (2006) determinaram CFT na fração butanólica, após extração em metanol,
tendo encontrado que na alga vermelha Palmaria palmata o CFT foi superior ao das pardas
Laminaria setchellii, Macrocystis integrifolia e Nereocystis leutkeana.
Dentre as algas verdes, os extratos de Caulerpa sertulatioides, C. prolifera e C.
racemosa apresentaram os maiores teores, expressos em mg AGE g-1 alga seca,
correspondentes a 2,334 ± 0,015; 1,480 ± 0,073 e 1,279 ± 0,071, respectivamente. Os extratos
de Ulva fasciata e U. lactuca apresentaram os menores, 0,214 ± 0,010 e 0,243 ± 0,008,
respectivamente, os quais foram de cinco a onze vezes inferiores aos observados nos extratos
que exibiram as maiores concentrações (Figura 13A).
75 Figura 13 - Conteúdo fenólico total nos extratos algáceos. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.
U. fasciata
U. lactuca
C. cupressoides
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
0 1 2 3 4 5
0,214 f
0,243 f
0,572 e
0,783 d
1,279 c
1,480 b
2,334 a
U. fasciata
U. lactuca
C. cupressoides
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. sertularioides
mg AGE g-1 alga seca
P. americana
C. crenulata
C. luxurians
G. domingensis
G. ferox
H. musciformis
B. occidentalis
B. triquetrum
B. seaforthii
A. multifida
--
0 1 2 3 4 5
0,221 f
0,241 ef
0,258 ef
0,292 e
0,300 de
0,359 cd
0,386 c
0,401 bc
0,453 b
0,656 a
P. americana
C. crenulata
C. luxurians
G. domingensis
G. ferox
H. musciformis
B. occidentalis
B. triquetrum
B. seaforthii
A. multifida
mg AGE g-1 alga seca
S. shoroederii
D. dichotoma
D. mertensii
P. gymnospora
S.vulgare
L. variegata
0 1 2 3 4 5
1,242 f
1,545 e
1,780 d
2,017 c
2,589 b
5,159 a
S. schroederi
D. dichotoma
D. mertensii
P. gymnospora
S. vulgare
L. variegata
mg AGE g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
76
Todos os extratos de Caulerpa analisados no presente trabalho, com exceção de
C. cupressoides, apresentaram CFT semelhante ou superior àquele do extrato etanólico de C.
lentillifera (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011). Os valores de CFT de C. racemosa,
determinados neste trabalho e por Chew et al. (2008), usando o mesmo sistema de extração,
foram semelhantes.
Os CFT determinados nas algas verdes no presente trabalho foram superiores aos
encontrados nos extratos aquoso (0,077 ± 0,001) e etanólico (0,369 ± 0,007) da clorófita
Halimeda macroloba (BOONCHUM et al., 2011), e aquoso (0,025 ± 0,004 e 0,044 ± 0,002) e
metanólico (0,032 ± 0,003 e 0,047 ± 0,001) de Enteromorpha intestinalis e Cladophora
glomerata, respectivamente (AKKÖZ et al., 2011). O extrato etanólico de Codium
tomentosum (CELIKLER et al., 2009) apresentou CFT inferior (0,30 ± 0,05) ao observado em
outra espécie do mesmo gênero (C. isthmocladum) do presente trabalho (0,783 ± 0,04).
Para efeito de comparação com outros trabalhos já publicados, sempre que
possível, os resultados de CFT expressos em unidades diferentes foram convertidos para mg
AGE g-1 alga seca.
Das rodófitas analisadas neste trabalho, o CFT, em mg AGE g-1 peso seco, do
extrato de Amansia multifida foi o que exibiu maior valor (0,656 ± 0,034). Nos demais
extratos, os conteúdos variaram de 0,221 ± 0,003 (Pterocladia americana) a 0,453 ± 0,028
(Bryothamnion seaforthii) (Figura 13B). Estes valores foram muito superiores ao observado
em Amphiroa sp. (0,085 mg AGE g-1 alga seca) (BOONCHUM et al., 2011), relativamente
próximos aos extratos de Gracilaria edulis (4,1 mg AGE g-1 extrato = 0,16 mg g-1 alga) e de
Acanthophora spicifera (3,55 mg AGE g-1 extrato = 0,8 mg g-1 alga) (GANESAN; KUMAR;
BHASKAR, 2008) e inferiores ao encontrado no extrato metanólico (80%) de Polysiphonia
morrowii (23,2 mg AGE g-1 extrato = 5,8 mg AGE g-1 alga) (JE et al., 2009).
Nos extratos das algas pardas o CFT variou de 1,242 ± 0,013 em Spatoglossum
schroederi a 5,159 ± 0,078 em Lobophora variegata. O valor máximo correspondeu a oito
vezes os mais baixos que foram encontrados nas algas verdes e até seis vezes os das
vermelhas. O CFT do extrato de L. variegata foi, por sua vez, até mais de vinte vezes superior
aos observados nos extratos de algas verdes e vermelhas (Figura 13C).
Os resultados de CFT dos extratos de algas pardas analisados neste trabalho foram
semelhantes aos relatados para os extratos metanólicos (60%) de cinco espécies, cujos teores
variaram de 1,5 a 4,5 (O’SULLIVAN et al., 2011) e similares ou, algumas vezes, até mesmo
superiores aos determinados nos extratos butanólicos das algas pardas investigadas por Yuan
e Walsh (2006). Entretanto, os conteúdos reportados por Boonchum et al. (2011) para os
77
extratos aquosos de Sargassum binderi (0,267 ± 0,002) e de Turbinaria conoides (1,116 ±
0,011) foram superiores aos deste trabalho. Kumar et al. (2011b) também detectaram CTF
superiores, por exemplo, 8,5 mg floroglucinol equivalente (PGE) g-1 alga seca em Padina
tetrastromatica, valor quatro vezes mais elevado que o determinado em outra espécie deste
gênero, P. gymnospora.
Chandini, Ganesan e Bhaskar (2008) consideraram os CFT dos extratos
metanólicos das algas pardas elevados de 0,6 a 1,7, mas inferiores aos deste trabalho. O
mesmo foi observado na comparação com o CFT dos extratos metanólicos de três espécies de
algas pardas japonesas que variou de 0,718 a 0,868 mg pirocatecol equivalente (PCE) g-1 alga
seca (AIRANTHI; HOSOKAWA; MIYASHITA, 2011).
A variação do CFT nas macroalgas marinhas pode ser influenciada tanto por
fatores extrínsecos como pressão a herbivoria, irradiância, profundidade, salinidade e
nutrientes, quanto por intrínsecos como morfologia da alga, idade e estágio reprodutivo, além
do solvente utilizado no processo de extração (CHEW et al., 2008; GANESAN; KUMAR;
RAO, 2011; LANN et al., 2012).
4.3 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos
A prospecção fitoquímica é um ensaio qualitativo com o objetivo de averiguar a
presença dos principais grupos de compostos (terpenos, esteróides, saponinas, alcalóides,
fenólicos, dentre outros) em extratos vegetais, frequentemente envolvendo reações de
precipitação e mudança de coloração (BAI, 2010).
No presente trabalho a marcha fitoquímica foi realizada nos extratos algáceos com
a intenção de elucidar apenas a ocorrência de possíveis classes de compostos fenólicos, uma
vez que estes foram quantificados.
As principais classes de compostos fenólicos presentes nos extratos de
Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta analisadas no presente trabalho estão apresentadas na
Tabela 15. Estes resultados não são conclusivos, sendo insuficientes para confirmar a
ocorrência dessas classes de compostos, pois um único teste pode ser positivo para duas ou
mais classes. Desse modo a positividade é apenas um indicativo da presença das possíveis
classes de metabólitos, cuja comprovação requer uma investigação mais minuciosa com testes
mais específicos, tendo em vista que é comum observar falsos positivos.
78 Tabela 15 - Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos presentes nos extratos algáceos.
Classes de metabólitos
Chlorophyta Rhodophyta Ochrophyta
Cau
lerp
a cu
pres
soid
es
Cau
lerp
a pr
olif
era
Cau
lerp
a ra
cem
osa
Cau
lerp
a se
rtul
ario
ides
Cod
ium
isth
moc
ladu
m
Ulv
a fa
scia
ta
Ulv
a la
ctuc
a
Am
ansi
a m
ulti
fida
Bot
ryoc
ladi
a oc
cide
ntal
is
Bry
otha
mni
on s
eafo
rthi
i
Bry
otha
mni
on tr
ique
trum
Cry
pton
emia
cre
nula
ta
Cry
pton
emia
luxu
rian
s
Gra
cila
ria
dom
inge
nsis
Gra
cila
ria
fero
x
Hyp
nea
mus
cifo
rmis
Pte
rocl
adia
am
eric
ana
Dic
tyot
a di
chot
oma
Dic
tyot
a m
erte
nsii
Lob
opho
ra v
arie
gata
Pad
ina
gym
nosp
ora
Sarg
assu
m v
ulga
re
Spat
oglo
ssum
sch
roed
eri
Fenóis - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + +
Taninos - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + +
Antocianinas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -
Antocianidinas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -
Flavonas - + - + + - - + + + + + + - + + + - - - - - +
Flavonóis - + - + + - - + + + + + + - + + + + + - - + +
Xantonas - + - + + - - + + + + + + - + + + + + - - - +
Chaconas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -
Auronas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -
Leucoantocianidinas - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -
Catequinas + + - + - - - - - - - - + - + - + - - - - + -
Flavanonas - + - + - - - - - - - - + - - - - + + - - + -
Flavanonóis - - - - - - - - - - - - + - - - - + + - - - -
(+) presença da substância analisada (-) ausência da substância analisada
78
79
Fenóis, antocianinas, antocianidinas, chaconas, auronas, leucoantocianidinas e
flavanonóis não foram detectados nos extratos das algas verdes. Taninos provavelmente estão
presentes em todos os extratos de clorófitas com exceção do de Caulerpa cupressoides. O
indicativo da presença de flavonas, flavonóis, xantonas, catequinas e flavanonas foi observado
em C. prolifera e C. sertularioides. Os três primeiros compostos possivelmente também
ocorreram em C. isthmocladum e o quarto em C. cupressoides.
Em análises fitoquímicas Alencar (2010), Srivastava et al. (2010) e Premalatha,
Dhasarathan e Theriappan (2011) reportaram a possível presença de tanino em Ulva fasciata,
de flavonóides em C. racemosa, e de fenóis, taninos e flavonóides em U. fasciata e
Chaetomorpha antennina, respectivamente.
A presença de uma grande variedade de outros metabólitos secundários tem sido
relatada em diversos estudos com macroalgas.
Ácido caféico, catequina e epicatequina foram encontrados em Acetabularia
ryukyensis, enquanto rutina foi detectada em A. ryukyensis, Monostroma nitidum e Caulerpa
serrulata, onde também foram identificadas catequina e epigalocatequina (YOSHIE et al.,
2000). Outros isômeros de catequina como galocatequina, epicatequina e catequina galato
foram encontrados em C. sertularioides por Santoso, Yoshie e Suziki (2002) e quantidades
traço de epigalato catequina e epicatequina galato em Monostroma nitidum por Santoso,
Yoshie e Suzuki (2004), que observaram também a presença dos flavonóides rutina, catecol,
hesperidina e morina. Os três últimos foram detectados em A. ryukyensis, M. nitidum, C.
serrulata, C. racemosa, Tydemaniz expeditions e Valonia macrophysa por Yoshie-Stark,
Hsieh e Suzuki (2003).
Yoshie et al. (2002) extraíram compostos fenólicos e polifenólicos de duas
espécies do gênero Halimeda (H. macroloba e H. opuntia) e detectaram a ocorrência de
catequina, epicatequina, epigalocatequina, catequina galato, epicatequina galato,
epigalocatequina galato, rutina, quercetina, hesperidina, miricetina, morina, luteolina,
apigenina, kaempferol, baicalina, ácido caféico e catecol. Entretanto, a distribuição e a
composição destes metabólitos nas duas espécies foram diferenciadas. Por exemplo, ácido
caféico e hesperidina foram detectados apenas em H. macroloba, e a concentração de catecol
foi cinco vezes maior em H. opuntia. Novoa et al. (2011) quantificaram os ácidos salicílico
(cinâmico) e ferúlico na fração hidrofílica de H. incrassata.
Nas algas vermelhas com exceção de Gracilaria domingensis foram encontrados
resultados positivos para taninos, flavonas, flavonóis e xantonas na marcha fitoquímica. A
ocorrência de antocianinas, antocianidinas, chaconas e auronas foi registrada nos extratos de
80
Botryocladia occidentalis e Cryptonemia luxurians, que, aliás, foi a única espécie de rodófita
a apresentar leucoantocianidinas, flavanonas e flavononóis. Catequina só foi detectada nos
extratos de C. luxurians, Gracilaria ferox e Pterocladia americana. Em nenhum extrato foi
observada a presença de fenóis (Tabela 15). Entretanto, um estudo fitoquímico preliminar
realizado por Bai (2010) revelou sua presença no extrato etanólico de Gracilaria fergusonii.
A ocorrência de catequina, epicatequina, epigalocatequina, catequina galato e
epigalocatequina galato foi reportada por Yoshie et al. (2000) em diversas espécies de
macroalgas marinhas vermelhas, porém a distribuição desses metabólitos foi diferenciada
entre as espécies. Em Porphyra yezoensis Santoso, Yoshie e Suzuki (2004) quantificaram
catequina, epigalocatequina galato, ácido caféico, catecol, herperidina e morina. Os três
últimos flavonóides foram identificados em dez espécies de algas vermelhas por Yoshie-
Stark, Hsieh e Suzuki (2003). Além deles outros compostos (miricetina, rutina e ácido
caféico) foram quantificados em algumas das espécies estudadas. Queirós, Lage-Yusty e
López-Hernández (2010) encontraram catequina, catequina galato, epicatequina,
epigalocatequina, epigalocatequina galato e ácido gálico em Palmaria spp. e Porphyra spp.
Concentrações relevantes dos ácidos trans-cinâminos, cumárico e ferúlico foram
encontradas no extrato aquoso de Bryothamnion triquetrum (NOVOA et al., 2001).
Sabina e Aliya (2009) reportaram a presença da flavona escutelareína 4’-metil éter
em Osmundea pinnatifida e Souza et al. (2011) a de apigenina (4’,5,7-trihidroxiflavona) nos
extratos metanólicos de Gracilaria birdiae e G. cornea.
Todos os extratos das algas pardas apresentaram fenóis e taninos. Antocianinas,
antocianidinas, chaconas, auronas e leucoantocianidinas não foram observadas nas ocrófitas.
A ocorrência de flavonóis foi observada em Dictyota dichotoma, D. mertensii, Spatoglossum
schroederi e Sargassum vulgare. Possivelmente os extratos das três primeiras espécies
também possuem xantonas, mas flavonas só foram detectadas em S. schroederi. Flavanonas e
flavanonóis foram observados nos extratos de D. dichotoma e D. mertensii. No extrato de S.
vulgare além de se observar os dois últimos metabólitos citados, foi o único que apresentou
catequina, dentre as algas pardas analisadas (Tabela 15).
No extrato metanólico (50%) de Stypocaulon scoparium foram detectados
quatorze polifenóis, com predominância de ácido gálico, catequina, epicatequina e ácido
gentísico. Protocatéquico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido clorogênico, ácido caféico,
ácido cumárico, ácido ferúlico, rutina, miricetina e quercetina ocorreram em menores
quantidades (LÓPEZ et al., 2011).
81
No trabalho de Li et al. (2009) foram isolados sete florotaninos (floroglucinol,
eckol, fucodifloroetol G, florofucofuroeckol, floro eckol, dieckol e 6,6’-bieckol) do extrato
metanólico de Ecklonia cava. Nos extratos etanólico de E. cava (CHO et al., 2012) e
metanólico de E. stolonifera (KANG et al., 2004) foram encontrados floroglucinol,
eckstolonol, eckol e dieckol.
Catequina e vários de seus isômeros foram observados em doze espécies de algas
pardas analisadas por Yoshie et al. (2000). A ocorrência de epigalocatequina foi reportada em
Sargassum polycystum e Turbinaria conoides. Nesta última também foram encontradas
catequina e epicatequina em quantidades traço, assim como no extrato Padina australis
(SANTOSO; YOSHIE; SUZUKI, 2002).
Santoso, Yoshie e Suzuki (2004) observaram a ocorrência de catequina
epicatequina e epigalocatequina em S. polycystum, T. conoides e Padina australis. Uma
variedade maior de isômeros (catequina, epigalocatequina, epicatequina, epigalocatequina
galato, epicatequina galato, hesperidina e morina) foi detectada em Eisenia bicyclis. Extratos
de Laminaria religiosa e de Hizikia fusiformis apresentaram catecol, morina, catequina e
epigalocatequina.
De acordo com Queirós, Lage-Yusty e López-Hernadez (2010), nas algas pardas
Undaria pinnatifida e Himanthalia elongata foi observada a presença de ácido gálico.
Epigalocatequina também foi encontrada nos extratos de H. elongata e Laminaria ochroleuca,
onde também foram quantificados epicatequina, epigalocatequina galato, epicatequina galato
e catequina galato.
A ocorrência de morina foi observada em onze espécies de algas pardas analisadas
por Yoshie-Stark, Hsieh e Suzuki (2003). Rutina foi detectada em Ecklonia cava, U.
pinnatifida e Ishige okamurae, enquanto ácido caféico, apenas nas duas últimas. A presença
de catecol não foi observada nem em Eisenia bicyclis nem em Padina minor, tampouco a de
hesperidina em U. pinnatifida, E. bicyclis e Padina arborescens. Quercetina, por sua vez, foi
detectada unicamente em U. pinnatifida e P. arborescens.
4.4 Correlação entre o conteúdo fenólico total (CFT) e os ensaios antioxidantes in vitro
Diversos trabalhos correlacionam os resultados do conteúdo de compostos
fenólicos presentes nos extratos algáceos preparados com diferentes solventes orgânicos com
as várias atividades antioxidantes exibidas por eles. Muitas vezes são estes metabólitos os
82
principais responsáveis por essas atividades (CHO et al., 2011; GANESAN; KUMAR;
BHASKAR, 2008; WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009).
Para investigar se as atividades antioxidantes dos extratos algáceos analisados no
presente trabalho foram resultantes do conteúdo de compostos fenólicos, foi estabelecida a
correlação entre o CFT e as atividades antioxidantes in vitro.
Nos extratos das algas verdes analisadas no presente trabalho, foi possível
observar uma forte correlação entre o CFT e a capacidade de sequestrar o DPPH (r = 0,808), o
poder de redução do ferro (r = 0,981) e a habilidade de quelação do íon ferroso (r = 0,969)
(Tabela 16). Possivelmente os compostos fenólicos presentes nos extratos das algas verdes
analisadas foram os principais responsáveis por essas atividades.
Tabela 16 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) para o conteúdo fenólico total (CFT) e ensaios antioxidantes in vitro.
CFT
Ensaios antioxidantes in vitro
r Chlorophyta Rhodophyta Ochrophyta
sequestro do radical DPPH 0,808* 0,939* 0,387 poder de redução do ferro (FRAP) 0,981* 0,929* 0,998* quelação do íon ferroso (FIC) 0,969* 0,599* -0,152 atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico
-0,552 -0,003 -0,194
Número de espécies 21 30 18 *p < 0,05
Resultados semelhantes foram relatados por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011),
quanto à elevada correlação entre CFT dos extratos de clorófitas e capacidade de sequestro do
DPPH (R2 = 0,88 / r = 0,938) e poder de redução do ferro (R2 = 0,93 / r = 0,964). Entretanto,
diferentemente do presente trabalho, foi observada fraca correlação entre CFT e habilidade de
quelação do íon ferroso (R2 = 0,13 / r = 0,360). Com base nestas informações, os autores
sugeriram que os polifenóis talvez não sejam os principais queladores de metais.
Comportamento distinto foi encontrado no trabalho de Ganesan, Kumar e Rao
(2011) com algas verdes em que os fenóis foram os responsáveis pela atividade de sequestro
do DPPH nos extratos de Enteromorpha linza e E. tubulosa, com R2 iguais a 0,89 (r = 0,943)
e 0,62 (r = 0,787), respectivamente. Outra espécie do mesmo gênero E. compressa apresentou
correlação baixa (R2 = 0,038 / r = 0,195), tendo essa atividade sido atribuída aos carotenóides,
ácidos graxos poli-insaturados e/ou polissacarídeos. Correlação baixa entre o CFT e a
atividade de sequestro do DPPH (R2 = 0,1227 / r = 0,350) e moderada entre o CFT e o poder
83
de redução do ferro (R2 = 0,4780 / r = 0,691) também foram verificadas em E. prolifera (CHO
et al., 2011).
O CFT dos extratos das algas vermelhas analisadas no presente trabalho exibiu
correlação forte com as atividades de sequestro do DPPH (r = 0,939) e poder de redução do
ferro (r = 0,929) e moderada com relação à habilidade de quelação do íon ferroso (r = 0,599)
(Tabela 16). Assim como nas algas verdes é possível que os compostos fenólicos das
rodófitas sejam os principais responsáveis por essas atividades.
Souza et al. (2011) também relataram existência de correlação entre o CFT e o
sequestro do DPPH (R2 = 0,92 / r = 0,959) para os extratos de algas vermelhas.
Nos extratos das algas pardas deste trabalho só foi possível estabelecer correlação
entre CFT e poder de redução do ferro (r = 0,998), a qual não foi encontrada nos extratos
algáceos analisados por Zubia et al. (2009). A correlação entre CFT e capacidade de
sequestrar o DPPH (r = 0,387) não pode ser visualizada, entretanto acredita-se que os
compostos fenólicos encontrados abundantemente nas algas pardas sejam os principais
responsáveis pela atividade sequestrante do DPPH que foi praticamente 100% em todos os
extratos (Tabela 16).
Assim como no presente trabalho, não houve correlção entre CFT e sequetro do
DPPH em algas pardas (AIRANTHI; HOSOKAWA; MIYASHITA, 2011; O’SULLIVAN et
al., 2011; ZUBIA et al., 2009). Estes autores atribuíram a capacidade antioxidante dos
extratos algáceos à presença de fucoxantina, proteínas, peptídeos e/ou polissacarídeos.
No entanto outros autores encontraram correlação significativa entre o CFT e o
sequestro do DPPH (LÓPEZ et al., 2011; WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009).
Embora os polifenóis encontrados abundantemente em algas pardas sejam considerados os
principais responsáveis pela atividade antioxidante, a utilização de solventes de baixa
especificidade pode favorecer a extração parcial e simultânea de outros compostos que
desempenham a mesma atividade.
Os extratos algáceos dos três Filos analisados não apresentaram correlação entre o
CFT e a atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico (Tabela 16). Embora
Souza et al. (2011) tenham demonstrado a existência de correlação entre ambos, muitos
estudos não lograram êxito no estabelecimento desta correlação (O’SULLIVAN et al., 2011,
ZUBIA et al., 2009).
Nem sempre é possível estabelecer correlação significativa entre CFT e as demais
atividades antioxidantes (FRAP, FIC e no sistema β-caroteno/ácido linoléico) exibidas pelos
extratos algáceos, isso porque as macroalgas marinhas possuem diversos compostos bioativos
84
como vitamina E, carotenóides provitamina A, polissacarídeos sulfatados, proteínas,
peptídeos, fibras alimentares, dentre outros que são considerados excelentes antioxidantes
(PIRES-CAVALCANTE et al., 2011, SOUSA et al., 2008; WANG; JÓNSDÓTTIR;
ÓLAFSDÓTTIR, 2009).
4.5 Extração, identificação e quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e
tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)
Experimentos prévios foram elaborados para desenvolver uma metodologia de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando sistema isocrático com coluna de
fase reversa C18, incluindo variações na composição da fase móvel, tipos de coluna e
velocidades de fluxo. A metodologia desenvolvida no presente trabalho com duração inferior
a 20 min foi comprovadamente eficiente para separar simultaneamente α- e β-caroteno,
luteína e α- e δ-tocoferol.
A identificação e a quantificação dos compostos de interesse nas 23 espécies de
algas do litoral cearense foram realizadas, comparando-se os tempos de retenção das soluções
padrões de β-caroteno, luteína e α- e δ-tocoferol com o tempo de retenção dos mesmos
compostos presentes nos extratos de alga e através da co-cromatografia.
A identificação de compostos através da comparação dos tempos de retenção é
uma prática muito utilizada por vários pesquisadores em diversos tipos de amostras, como
algas e vegetais folhosos normalmente consumidos nos países mediterrâneos (PIRES-
CAVALCANTE et al., 2011; SOUSA et al., 2008; ZNIDARCIC; BAN; SIRCELJ, 2011).
4.5.1 Curvas padrão de carotenóides e tocoferóis
A relação entre a área do pico e a quantidade de β-caroteno e luteína aplicados na
coluna foi estabelecida para os padrões de β-caroteno e luteína processados, ou seja,
submetidos ao processo de saponificação e partição. A quantificação desses compostos nos
extratos algáceos foi possível devido à existência de correlação linear entre a área do pico e as
concentrações de β-caroteno (r = 0,9996, p < 0,05) e luteína (r = 0,9993, p < 0,05), ambos
processados, correspondendo a aproximadamente 0,1 a 1,0 µg na coluna (Figura 14).
85 Figura 14 - Curvas padrão de carotenóides submetidos à saponificação e partição. (A) β-caroteno e (B) luteína.
Injeção de 0,1 a 1,0 µg em coluna Atlantis Waters Spherisorb S5 ODS 2 (4,6 x 250 mm) com fase móvel constituída de MeOH:THF (90:10),
fluxo 1,5 mL min-1 e detecção em 450 nm e 444 nm, respectivamente.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00
20
40
60
80
100
120
140
160 y = 1,86602 + 116,93486 x(r = 0,9996, n = 6)
Áre
a d
o p
ico
(m
AU
min
)
µg β-caroteno na coluna
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00
20
40
60
80
100
120
140
160y = - 0,96227 + 150,89738 x(r = 0,9993, n = 7)
Áre
a d
o p
ico
(m
AU
min
)
µg luteína na coluna
De forma idêntica, a relação entre a área do pico e a quantidade de tocoferóis
aplicada na coluna foi estabelecida para os padrões de α- e δ-tocoferol processados. A
existência de correlação linear (r = 0,9994, p < 0,05 para α-tocoferol e r = 0,9999, p < 0,05
para δ-tocoferol) entre a área do pico e a concentração de aproximadamente 1,0 a 10,0 µg
desses tocoferóis processados injetados na coluna (Figura 15) permitiu a quantificação desses
compostos nos extratos algáceos.
(A)
(B)
86 Figura 15 - Curvas padrão de tocoferóis submetidos à saponificação e partição. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.
Injeção de 1 a 10 µg em coluna Atlantis Waters Spherisorb S5 ODS 2 (4,6 x 250 mm) com fase móvel constituída de MeOH:THF (90:10),
fluxo 1,5 mL min-1 e detecção em 292 nm.
0 2 4 6 8 100
10
20
30
40
50
60 y = - 1,20966 + 2,87789 x(r = 0,9994, n = 4)
Áre
a d
o p
ico
(m
AU
min
)
µg α-tocoferol na coluna
0 2 4 6 8 100
10
20
30
40
50
60 y = - 1,38695 + 5,83225 x(r = 0,9999, n = 6)
Áre
a d
o p
ico
(m
AU
min
)
µg δ-tocoferol na coluna
4.5.2 Carotenóides (α- e β-caroteno e luteína)
Com o sistema cromatográfico usado neste trabalho, os tempos de retenção do
padrão de β-caroteno e do composto identificado como β-caroteno presente nos extratos
algáceos foram iguais a 15,07 ± 1,59 min (n = 28) e 15,10 ± 1,51 min (n = 132),
respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05) entre os
(A)
(B)
87
tempos de retenção do β-caroteno padrão e do composto nos extratos de alga, eluído em
aproximadamente 15 min.
A dificuldade de aquisição do padrão comercial de α-caroteno e o uso de sistema
cromatográfico semelhante em que a eluição de α-caroteno acontece imediatamente antes do
β-caroteno (SAKER-SAMPAIO, 1997) fizeram com que, neste trabalho, o composto com
tempo de retenção de 14,82 ± 0,83 min (n = 66) fosse considerado α-caroteno. Esse tempo de
retenção foi comparado com aquele referente ao do β-caroteno através do teste t de Student
não-pareado para dados independentes, havendo diferença estatisticamente significativa entre
eles (p < 0,05).
Com relação à luteína, os tempos de retenção do padrão comercial e do composto
identificado como tal nos extratos algáceos corresponderam respectivamente a 3,53 ± 0,06
min (n = 16) e 3,55 ± 0,13 min (n = 134). Na comparação estatística através do teste t de
Student não-pareado para dados independentes não houve diferença significativa entre ambos
(p ≥ 0,05).
Um cromatograma típico do padrão contendo 0,2 µg de β-caroteno e de luteína
está representado pela Figura 16.
Figura 16 - Cromatograma típico de β-caroteno (Sigma) e luteína (Duane Reade) submetidos à saponificação e partição.
O Filo Chlorophyta é reconhecido por possuir vários pigmentos como clorofila a e
b, luteína, como xantofila majoritária e carotenos, principalmente β-caroteno. Entretanto,
mesmo estando presente em pequena quantidade na maioria das espécies, o α-caroteno pode
88
ser o pigmento mais abundante em algumas delas (HOEK; MANN; JAHNS, 1995;
RAYMUNDO; HORTA; FETT, 2004; TAKAICHI, 2011).
Neste estudo todos os extratos das algas verdes com exceção de Ulva fasciata e U.
lactuca apresentaram α-caroteno, cujo teor máximo (µg g-1 alga seca) foi detectado em
Caulerpa sertularioides (3,341 ± 0,207). Nos extratos das outras espécies, os conteúdos
variaram de 0,452 ± 0,047 (Codium isthmocladum) a 2,474 ± 0,252 (Caulerpa cupressoides)
(Figura 17A). β-Caroteno, por sua vez, foi identificado em todas as clorófitas analisadas,
sendo os maiores conteúdos (µg g-1 alga seca) encontrados em C. cupressoides (3,140 ±
0,346) e C. sertularioides (1,125 ± 0,148) (Figura 17B).
Em todos os extratos das clorófitas em que ambos (α- e β-caroteno) foram
detectados os conteúdos de α-caroteno foram superiores aos de β-caroteno, com exceção de C.
cupressoides, embora a literatura informe que este último predomina sobre o primeiro
(HOEK; MANN; JAHNS, 1995; RAYMUNDO; HORTA; FETT, 2004). Alguns trabalhos
revelaram também que os teores de α-caroteno superaram os de β-caroteno em espécies do
gênero Caulerpa (PIRES, 2007; PIRES et al., 2008; SOUSA et al., 2008).
As concentrações dos carotenos nos extratos das mesmas espécies de Caulerpa
estudadas no presente trabalho foram inferiores àquelas mensuradas mensalmente ao longo de
um ano por Pires (2007). Diferentemente do que foi encontrado por Sousa et al. (2008),
α-caroteno não foi quantificado em Ulva fasciata. A avaliação sazonal de carotenos em
amostras desidratadas de U. fasciata e U. lactuca realizada por Sousa (2011) confirmou a
presença de α-caroteno em todos os meses, com exceção de novembro para U. fasciata e de
outubro e novembro para U. lactuca. Para o autor, estas diferenças podem estar relacionadas
com a época e o local de coleta ou com outros fatores, como idade da planta e radiação solar.
A luteína foi identificada em todos os extratos de algas verdes, sendo o
carotenóide majoritário, com valores até 7 e 43 vezes superiores aos observados para o α- e β-
caroteno, respectivamente. Os maiores teores (µg g-1 alga seca) foram observados nos extratos
de Caulerpa sertularioides (24,545 ± 1,101) e C. cupressoides (17,198 ± 1,656). Os menores
conteúdos, por sua vez, foram determinados em C. racemosa (1,701 ± 0,22) e Codium
isthmocladum (0,612 ± 0,045). Nos extratos das demais espécies, a quantidade ficou entre
12,211 e 14,659, aproximadamente, (Figura 17C). Apesar de a luteína ser um composto
resultante do processo de hidroxilação do α-caroteno (SILVA et al., 2010), nos extratos de U.
lactuca e U. fasciata, embora ele não tenha sido quantificado, a luteína apareceu como
carotenóide majoritário.
89 Figura 17 - Teores de carotenóides nos extratos de Chrolorophyta. (A) α-caroteno, (B) β-caroteno e (C) luteína.
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. cupressoides
C. sertularioides
0 5 10 15 20 25 30
0,452 d
1,268 c
2,410 b
2,474 b
3,341 a
C. isthmocladum
C. racemosa
C. prolifera
C. cupressoides
C. sertularioides
µg α-caroteno g-1 alga seca
C. isthmocladum
C. racemosa
U. fasciata
U. lactuca
C. prolifera
C. sertularioides
C. cupressoides
0 5 10 15 20 25 30
0,127 d
0,169 d
0,285 d
0,647 c
0,864 bc
1,125 b
3,140 a
C. isthmocladum
C. racemosa
U. fasciata
U. lactuca
C. prolifera
C. sertularioides
C. cupressoides
µg β-caroteno g-1 alga seca
C. isthmocladum
C. racemosa
U. fasciata
C. prolifera
U. lactuca
C. cupressoides
C. sertularioides
0 5 10 15 20 25 30
0,612 e
1,701 e
12,232 d
12,211 d
14,659 c
17,198 b
24,545 a
C. isthmocladum
C. racemosa
U. fasciata
C. prolifera
U. lactuca
C. cupressoides
C. sertularioides
µg luteína g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
90
Hegazi et al. (1998) separaram e identificaram clorofilas e carotenóides de
macroalgas marinhas. Na clorófita Caulerpa prolifera foi constatada a presença de dezoito
pigmentos fotossintéticos dentre os quais α- e β-catoteno e luteína. Na possibilidade de haver
ligação entre a síntese de pigmentos e as variações ambientais, Kakinuma, Kuno e Amano
(2004) avaliaram a composição dos pigmentos em resposta ao estresse salino na clorófita
Ulva pertusa. Praticamente em todas as simulações (salinidade / tempo de exposição), os
teores de luteína (48,3 a 79,4 mg 100 g-1 peso seco) foram superiores aos de β-caroteno (21,9
a 80,7 mg 100 g-1 peso seco). Com o mesmo propósito, Bischof et al. (2002) estudaram a
composição de pigmentos fotossintéticos de U. lactuca frente às condições de radiação, tendo
observado que os teores (mg g-1 peso fresco) de luteína e de β-caroteno variaram de 0,10 a
0,22 e de 0,01 a 0,05, respectivamente. Nas espécies de algas verdes, a luteína aparece com
frequência como pigmento majoritário. Por exemplo, Esteban et al. (2009b) e Yoshii et al.
(2004) estudaram a composição dos carotenóides de 27 amostras pertencentes à ordem
Cladophorales e dessas 56% exibiram a luteína como carotenóide majoritário contribuindo
com até 60% dos carotenóides totais. No entanto, há registro de resultados diferentes dos
relatados anteriormente. Ortiz et al. (2009) determinaram o teor de luteína na macroalga verde
Codium fragile (0,7 µg g-1 alga seca) muito inferior ao de β-caroteno (197,9 µg g-1 alga seca).
Alguns pigmentos presentes nas algas vermelhas são clorofila a, carotenos e
xantofilas. Frequentemente a luteína é o principal carotenóide, podendo contribuir com mais
de 50% dos carotenóides totais, entretanto em algumas espécies essa xantofila é substituída
por zeaxantina ou anteraxantina. De um modo geral, os teores de α- e β-caroteno são baixos,
porém eles podem ser majoritários em algumas espécies (HOEK; MANN; JAHNS, 1995;
SCHUBERT; GARCÍA-MENDOZA, 2008; TAKAICHI, 2011).
Todas as espécies de rodófitas analisadas no presente trabalho apresentaram β-
caroteno e luteína, que foi o carotenóide majoritário. α-Caroteno foi quantificado em todas as
espécies com exceção de Bryothamnion seaforthii, Gracilaria domingensis e G. ferox. Os
extratos das rodófitas que apresentaram ambos α- e β-caroteno exibiram concentrações de β-
caroteno superiores as de α-caroteno, com exceção de Cryptonemia crenulata (Figura 18).
α-Caroteno não foi detectado nos extratos de Bryothamnion seaforthii, Gracilaria
domingensis e G. ferox. As concentrações (µg g-1 alga seca) máxima e mínima foram
determinadas em Amansia multifida (1,659 ± 0,131) e Hypnea musciformis (0,042 ± 0,004),
respectivamente. Nos demais extratos os teores variaram de 0,113 ± 0,011 (Bryothamnion
triquetrum) a 0,387 ± 0,025 (Cryptonemia luxurians) (Figura 18A).
91 Figura 18 - Teores de carotenóides nos extratos de Rhodophyta. (A) α-caroteno, (B) β-caroteno e (C) luteína.
H. musciformis
B. triquetrum
C. crenulata
B. occidentalis
P. americana
C. luxurians
A. multifida
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0,042 de
0,113 de
0,185 cde
0,321 bcd
0,348 bc
0,387 b
1,659 a
H. musciformis
B. triquetrum
C. crenulata
B. occidentalis
P. americana
C. luxurians
A. multifida
µg α-caroteno g-1 alga seca
C. crenulata
B. occidentalis
G. ferox
C. luxurians
G. domingensis
P. americana
B. seaforthii
H.musciformis
B. triquetrum
A. multifida
--
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0,738 c
0,042 d
0,122 d
0,193 d
0,596 c
0,834 c
0,845 c
0,855 c
2,435 b
3,798 a
C. crenulata
B. occidentalis
G. ferox
C. luxurians
G. domingensis
P. americana
B. seaforthii
H. musciformis
B. triquetrum
A. multifida
µg β-caroteno g-1 alga seca
G. ferox
C. crenulata
C. luxurians
G. domingensis
B. occidentalis
H.musciformis
P. americana
B. seaforthii
B. triquetrum
A. multifida
--
0 5 10 15 20 25 30 35 40
1,072 g
1,428 g
2,409 fg
3,771 f
3,398 f
6,731 e
12,926 d
15,127 c
17,728 b
35,363 a
G. ferox
C. crenulata
C. luxurians
G. domingensis
B. occidentalis
H. musciformis
P. americana
B. seaforthii
B. triquetrum
A. multifida
µg luteína g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
(A)
(B)
(C)
92
Sousa et al. (2008) também não encontraram α-caroteno em B. seaforthii, G.
domingensis, G. ferox nem em outras seis espécies de rodófitas das vinte analisadas. No
trabalho de Pires et al. (2008), α-caroteno não foi detectado nem em B. seaforthii nem em
Enantiocladia duperreyi, entretanto, em B. triquetrum, o teor desse caroteno (0,311 µg g-1
peso seco) foi superior ao encontrado no presente trabalho (0,113 µg g-1 peso seco).
Os maiores conteúdos de β-caroteno (µg g-1 alga seca) nas algas vermelhas foram
detectados em A. multifida (3,798 ± 0,303) e B triquetrum (2,435 ± 0,114). A concentração
mínima foi observada em C. crenulata (0,042 ± 0,002). Nos demais extratos a variação ficou
entre 0,122 ± 0,017 e 0,855 ± 0,079 (Figura 18B).
Os teores de luteína (µg g-1 alga seca) mais elevados foram detectados em A.
multifida (35,363 ± 2,689), B. triquetrum (17,728 ± 1,077), B. seaforthii (15,127 ± 1,304) e
Pterocladia americana (12,926 ± 0,478). Nos outros extratos, os teores variaram entre 1,072
± 0,074 (G. ferox) e 6,731 ± 0,180 (Hypnea musciformis) (Figura 18C).
Palermo, Gros e Seldes (1991) isolaram e caracterizaram oito carotenóides de
algas vermelhas. β-Caroteno foi o carotenóide majoritário, com 18,4 mg 100 g-1 peso seco
(60,8% do total), 12,2 mg 100 g-1 peso seco (74,8% do total) e 20,9 mg 100 g-1 peso seco
(53,3% do total), em Corallina officinallis, C. elongata e Jania sp., respectivamente. Esses
valores foram mais elevados do que os encontrados nas espécies de rodófitas analisadas no
presente trabalho. A presença de α-caroteno ou luteína, entre os carotenóides estudados nessas
espécies, não foi reportada. Ortiz et al. (2009) também encontraram β-caroteno como
pigmento majoritário em Gracilaria chilensis cujo teor correspondeu a 113,7 µg g-1 alga seca,
e a concentração de luteína foi de 2,0 µg g-1 alga seca. Estes resultados foram,
respectivamente, superior e inferior aos determinados nas rodófitas do presente trabalho.
Hegazi et al. (1998) identificaram dezesseis pigmentos fotossintéticos na rodófita Jania
rubens, dentre eles, luteína, α-caroteno e β-caroteno.
Ainda com relação à composição de carotenóides de algas vermelhas, Esteban et
al. (2009a) encontraram luteína em todas as treze espécies, sendo o carotenóide majoritário
em dez delas (77%). β-Caroteno também foi identificado em todas as espécies e, assim como
no presente trabalho, os teores foram superiores aos de α-caroteno, o qual não foi encontrado
nem em Phyllophora sicula nem em Osmundea pinnatifida. Como previamente ressaltado,
nem sempre que a luteína é quantificada, α-caroteno também é detectado, observação feita
com Gracilaria ferox, G. domingensis e Bryothamnion seaforthii.
Andersson, Schubert e Snoeijs (2006) reportaram a existência de uma ampla
variação na distribuição dos pigmentos carotenóides em algas vermelhas que foram divididas
93
em três grupos. O primeiro formado por Gracilaria domingensis e G. birdiae não apresentou
α-caroteno nem luteína, tendo anteraxantina e β-caroteno como pigmentos majoritários. No
segundo grupo, constituído por Gracilaria chilensis, G. tenuistipitada, Graciliopsis sp. e G.
lemaneiformis, a zeaxantina foi o carotenóide predominante (> 25%). No terceiro grupo,
composto por Eucheuma denticulata, Kappaphycus alvarezii, Halimenia floresia e
Cordyclada erecta, os pigmentos principais foram em ordem decrescente luteína (> 25%), β-
caroteno e zeaxantina (5-25%) e α-caroteno (1-5%).
Schubert, García-Mendoza e Pacheco-Ruiz (2006) avaliaram a composição de
carotenóides em 65 espécies de rodófitas, sendo a luteína a xantofila majoritária
representando de 50,7% a 99,7% dos carotenóides totais em 49 das 53 espécies que exibiram
esse pigmento. A distribuição de α- e β-caroteno foi bastante diversificada, com a ocorrência
de ambos ou às vezes de apenas um deles. A presença de α-caroteno não foi observada em dez
das 53 amostras em que a luteína foi detectada. De acordo com os autores, as algas vermelhas
não possuem composição de carotenóides com perfil único, e isso pode ser resultante da
aclimatação de cada espécie à luminosidade.
Contrariamente Marquardt e Hanelt (2004) acreditam que a composição dos
carotenóides nas Rhodophyta segue um padrão definido pela presença de α- e/ou β-caroteno e
uma xantofila majoritária, normalmente luteína ou zeaxantina. A comprovação desta hipótese
foi obtida na investigação em dezesseis espécies de ambientes polar e temperado que exibiram
esse padrão, com exceção de Delesseria lancifolia.
Entretanto para ESTEBAN et al. (2009a) é difícil desenvolver uma hipótese sobre
a presença de grupos de pigmentos em comunidades ficológicas, porque essa composição não
é somente resultado da aclimatação fotossintética, mas também pode ser consequência do
processo evolucionário.
Godínez-Ortega et al. (2008) avaliaram o crescimento e a composição de
pigmentos da alga vermelha Halymenia floresii cultivada sob luz branca, verde, azul e
vermelha. Neste experimento a concentração de luteína permaneceu entre 30 e 50 µg g-1 peso
fresco sendo o carotenóide majoritário. Os teores de α-caroteno foram sempre superiores aos
de β-caroteno, com concentrações (µg g-1 peso fresco), variando de 15 a 30 e de 6 a 9,
respectivamente. Estas quantidades foram fortemente influenciadas pelas diferentes condições
de cultivo.
As algas pardas possuem as clorofilas a e c, fucoxantina, violaxantina e
zeaxantina, como principais xantofilas, quantidades consideráveis de β-caroteno, mas nenhum
α-caroteno. Micro e macroalgas dos filos Cryptophyta, Euglenophyta, Chloraracniophyta e
94
Chlorophyta possuem α-caroteno e seus derivados, como luteína, loraxantina e sifonaxantina,
os quais ocorrem apenas nas macroalgas do Filo Rhodophyta (TAKAICHI, 2011; YOSHII et
al., 2004).
Takaichi et al. (2012) investigaram a ocorrência de α-caroteno e seus derivados
em diversas classes de algas (micro e macro). Os referidos autores não observaram a presença
desses compostos em Glaucophyceae, Chryosophyceae, Raphydopyceae, Bacillariophyceae,
Phaeophyceae, Xanthophyceae, Eustigmatophyceae, Haptophyceae e Dinophyceae, todas
elas, famílias de microalgas pardas, detentoras das clorofilas a e c.
Os teores de β-caroteno (µg g-1 alga seca) foram determinados em todos os
extratos de Ochrophyta, com máximos em Spatoglossum schroederi (1,744 ± 0,177), Padina
gymnospora (1,705 ± 0,239) e Sargassum vulgare (1,690 ± 0,183). Nos demais extratos, os
valores variaram de 0,371 ± 0,034 (Dictyota dichotoma) a 0,995 ±0,123 (D. mertensii)
(Figura 19A). Como era se de esperar, não foi detectada a presença de α-caroteno nos extratos
das algas pardas analisadas no presente trabalho.
Resultados análogos foram relatados em diversos trabalhos sobre a composição de
carotenóides nessas algas. Sousa et al. (2008) quantificaram β-caroteno em P. gymnospora,
D. dichotoma e Lobophora variegata. Hegazi et al. (1998) reportaram a presença de quatorze
pigmentos entre clorofilas e carotenóides, como fucoxantina, violoxantina, β-caroteno, mas
nenhum α-caroteno ou luteína em Padina pavonica. O conteúdo total de carotenóides em
Laminaria cichorioides foi igual a 12,9 g 100 g-1 peso fresco, sendo β-caroteno o carotenóide
minoritário e os pigmentos fucoxantina e violaxantina, os majoritários (VERSHININ;
KAMNEV, 1996).
Os teores de β-caroteno (mg 100 g-1 peso seco) foram 1,30 e 2,99 em Undaria
pinnatifida e Laminaria digitata japonica, respectivamente (KOLB et al., 2004), superiores
aos observados nas espécies de algas pardas do presente trabalho. A quantidade de β-caroteno
em Macrocystis pyrifera (17,4 µg g-1 alga seca) coletada no Chile (ORTIZ et al., 2009) foi de
6 a 56 vezes superior àquelas observadas nas algas pardas do presente trabalho.
Assim como no presente trabalho, Pires et al. (2008) quantificaram β-caroteno em
cinco espécies de algas pardas desidratadas a 40°C por 15 h. O extrato de D. dichotoma que
naquela ocasião apresentou o máximo teor (7,259 µg g-1 peso seco), agora exibiu o menor
conteúdo (0,320 µg g-1 peso seco). Aliás, os teores de β-caroteno em todas as amostras deste
trabalho foram inferiores aos reportados pelos pesquisadores supracitados. Esta diferença
marcante pode estar relacionada com a estação (chuvosa e seca) e/ou o local da coleta
(Paracuru e Pacheco), respectivamente nos dois casos. De acordo com Ursi et al. (2003), a
95
variação intraespecífica na composição dos pigmentos fotossintéticos pode estar associada à
adaptação genética da espécie, ou seja, a população de uma determinada espécie de alga pode
estar mais adaptada às condições ambientais de uma localidade do que de outra.
Figura 19 - Teores de carotenóides nos extratos de Ochrohyta. (A) β-caroteno e (B) luteína.
D. dichotoma
L. variegata
D. mertensii
S. vulgare
P. gymnospora
S. shoroederii
0 1 2 3
0,371 c
0,375 c
0,995 b
1,690 a
1,705 a
1,744 a
D. dichotoma
L. variegata
D. mertensii
S. vulgare
P. gymnospora
S. schroederi
µg β-caroteno g-1 alga seca
D. dichotoma
D. mertensii
S. vulgare
L. variegata
P. gymnospora
S. shoroederii
0 1 2 3
0,320 d
0,803 c
1,249 b
1,308 b
2,690 a
2,718 a
D. dichotoma
D. mertensii
S. vulgare
L. variegata
P. gymnospora
S. schroederi
µg luteína g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
Apesar de a luteína ser um pigmento derivado do α-caroteno não encontrado nas
algas pardas, um composto com características cromatográficas de luteína foi detectado e
quantificado em todos os extratos das Ochrophyta. A identificação baseada nos tempos de
retenção do padrão comercial e do composto considerado luteína nos extratos algáceos, os
(A)
(B)
96
quais não apresentaram diferença estatisticamente significativa (p = 0,1659) (item 4.5.2,
página 87), e na co-cromatografia em que uma quantidade de luteína era adicionada ao extrato
algáceo não suscitou dúvida de que o composto existe e, por esse motivo, foi quantificado. As
concentrações de luteína, em µg g-1 alga seca, variaram de 0,320 ± 0,051 (D. dichotoma) a
2,718 ± 0,238 (S. schroederi) (Figura 19B), valores semelhantes ou superiores aos observados
para o β-caroteno. Ao contrário do observado nos extratos das algas verdes e vermelhas, a
luteína não foi o carotenóide majoritário nas pardas.
É importante destacar que a ausência de α-caroteno em amostras nas quais a
luteína foi quantificada não é uma peculiaridade das algas marinhas. Este perfil pode ser
observado em muitos vegetais e grãos (MAMATHA; SANGEETHA; BASKARAN, 2011).
Nas algas pardas a ocorrência de luteína é pouco reportada na literatura. Ortiz et
al. (2009) quantificaram 0,3 µg luteína g-1 da alga Macrocystis pyrifera desidratada, usando
extrato acetônico particionado em éter de petróleo, cromatografado em coluna semelhante,
fase móvel constituída de metanol:acetonitrila:acetato de etila (20:65:15) com fluxo de 1 mL
min-1 e detecção com arranjo de fotodiodo.
A investigação sobre a ocorrência de luteína nas algas pardas deve ser mais
aprofundada, através de coleta da fração de interresse usando coluna cromatográfica
semipreparativa para posterrior análise por espectrometria de massa.
Foi possível observar que a distribuição dos carotenóides foi bastante
diversificada nas 23 espécies de algas analisadas no presente trabalho e que nem sempre essa
distribuição coincidiu com àquela reportada na literatura.
A distribuição e o teor dos carotenóides nos vegetais, incluindo as algas,
dependem da espécie, estágio de maturação da planta, estágio do ciclo de vida, método de
cultivo, presença de metais, salinidade, qualidade e quantidade de luz, efeitos climáticos,
manipulação na colheita e diferentes partes da planta (CHAKRABORTY; SANTRA;
BHATTACHARYA, 2010; COLLÉN et al., 2003; GODÍNEZ-ORTEGA et al., 2008; HART;
SCOTT, 1995, PINTO et al., 2011).
Como a distribuição das algas marinhas no ambiente ocorre em função das marés,
de acordo com Pires et al. (2008) e Roleda et al. (2010) é bastante razoável aceitar que as
clorófitas sintetizem mais carotenóides, que dentre outras funções desempenham o papel de
proteger o aparato fotossintético contra os danos da fotoxidação, por permanecerem expostas
à radiação solar por períodos mais prolongados, pois habitam predominantemente as zonas de
supra e meso litoral. Pinto et al. (2011) destacaram que os teores de clorofila a e de
carotenóides como β-caroteno, luteína, violaxantina e anteraxantina aumentaram de maneira
97
expressiva em Gracilaria tenuistipitata na presença de metais pesados como cádmio (Cd2+) e
cobre (Cu2+). Possivelmente a síntese desses pigmentos é uma resposta da alga aos efeitos
pró-oxidantes desses metais.
4.5.3 Tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)
Os tempos de retenção dos padrões de α- e δ-tocoferol obtidos pelo sistema
cromatográfico usado neste trabalho foram iguais a 5,81 ± 0,26 min (n = 28) e 4,80 ± 0,17
min (n = 28), respectivamente. Os tempos de retenção dos compostos considerados α- e δ-
tocoferol detectados nos extratos algáceos foram, respectivamente, 5,83 ± 0,37 min (n = 108)
e 4,88 ± 0,34 min (n = 55).
Os tempos de retenção dos padrãos comerciais (α- e δ-tocoferol) e dos compostos
correspondentes presentes nos extratos algáceos não apresentaram diferença estatisticamente
significativa (p ≥ 0,05). Um cromatograma típico do padrão de α- e δ-tocoferol, contendo
2 µg, está apresentado na Figura 20.
Figura 20 - Cromatograma típico de α- e δ-tocoferol (Sigma) submetidos à saponificação e partição.
98
Existem poucos trabalhos sobre composição e distribuição de tocoferóis em algas
marinhas (PIRES-CAVALCANTE et al., 2011) quando se compara com o grande número de
publicações com vegetais superiores.
Nas algas verdes, os teores de α-tocoferol foram muito variados. Ulva fascita e U.
lactuca não apresentaram α-tocoferol, mas nas demais clorófitas os teores (µg g-1 alga seca)
variaram de 5,770 ± 0,860 em Codium isthmocladum a 163,100 ± 7,200 em Caulerpa
prolifera (Figura 21A). O isômero δ-tocoferol não foi detectado em Ulva nem em C.
prolifera. Ao contrário do observado para o α-tocoferol, a variação nos conteúdos deste
isômero não foi muito elevada, sendo o valor máximo registrado em Caulerpa racemosa
(17,926 ± 0,676) e o mínimo em C. isthmocladum (6,443 ± 0,452) (Figura 21B).
Skinner e Sturm (1968) também não identificaram α-tocoferol em Ulva taeniata.
Entretanto, ele e outros isômeros foram detectados em espécies do gênero Ulva. Sousa (2011)
registrou teores de α-tocoferol (2,524 a 9,621 µg g-1 peso seco) e δ-tocoferol (2,913 a 11,291
µg g-1 peso seco) ao longo de um ano em U. lactuca e U. fasciata, valores inferiores aos
observados nas clorófitas do presente trabalho.
As quantidades destes compostos são variáveis, podendo ser muito baixas como
reportado por Ortiz et al. (2006), apenas 9 mg α-tocoferol por quilograma de Ulva lactuca
desidratada, mas aproximadamente 25 mg kg-1 para γ- e δ-tocoferol, que foram majoritários;
ou bastante expressivas (19,7 mg kg-1 peso seco) como observado por Taboada, Millán e
Míguez (2010) em U. rigida.
Jensen (1969) quantificou α-tocoferol em U. lactuca e Enteromorpha intestinalis
35 e 92 mg kg-1 peso seco, respectivamente. Esses valores foram inferiores aos observados em
Caulerpa prolifera e C. sertularioides no presente trabalho.
A presença dos isômeros α-, β-, γ- e δ-tocoferol foi reportada por Miyashita e
Takagi (1987) nas espécies Chaetomorpha moniligera, Enteromorpha prolifera e U. pertusa.
α-Tocoferol foi o composto majoritário contribuindo com até 95% dos tocoferóis totais, com
teores entre 0,06 e 0,14 µg g-1 peso fresco. δ-Tocoferol variou de 0,003 a 0,009 µg g-1 peso
fresco, correspondendo de 2% a 11% do total. Se os resultados referidos acima tivessem sido
expressos em peso seco, os teores de α- e δ-tocoferol seriam muito inferiores aos
quantificados nas clorófitas do presente trabalho.
Pires-Cavalcante et al. (2011) acompanharam a variação sazonal de α-tocoferol
em espécies do gênero Caulerpa. α-Tocoferol não foi detectado em C. racemosa coletada no
mês de março. Os menores conteúdos anuais (22,37 a 138,44 µg g-1 peso seco) foram
semelhantes aos observados nas Caulerpa analisadas no presente trabalho. Mantanjun et al.
99
(2009) investigaram o conteúdo de α-tocoferol em C. lentillifera cujo teor (8,41 mg 100 g-1
peso seco) foi inferior aos determinados em C. prolifera e C. sertularioides do presente
estudo.
Figura 21 - Teores de tocoferóis nos extratos de Chlorophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.
C. isthmocladum
C. racemosa
C. cupressoides
C. sertularioides
C. prolifera
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
5,770 d
6,018 d
20,363 c
100,397 b
163,100 a
C. isthmocladum
C. racemosa
C. cupressoides
C. sertularioides
C. prolifera
µg α-tocoferol g-1 alga seca
C. isthmocladum
C. sertularioides
C. cupressoides
C. racemosa
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
6,443 d
10,714 c
14,140 b
17,926 a
C. isthmocladum
C. sertularioides
C. cupressoides
C. racemosa
µg δ-tocoferol g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
No trabalho de Ortiz et al. (2009) a alga verde Codium fragile apresentou como
tocol majoritário o δ-tocoferol (677,8 µg g-1 lipídio o que equivale a 10,2 µg g-1 alga seca).
Entretanto esse teor foi inferior àqueles observados na maioria das algas verdes do presente
trabalho que apresentaram esse composto. O teor de α-tocoferol (453,5 µg g-1 lipídio = 6,8 µg
(A)
(B)
100
g-1 alga seca) foi inferior aos de Caulerpa prolifera, C. sertularioides e C. cupressoides e
semelhante aos de C. racemosa e Codium isthmocladum do presente estudo. Além de α- e δ-
tocoferol também foram quantificados γ-tocoferol e seu isômero tocotrienol.
Nas algas vermelhas analisadas no presente trabalho a presença de α-tocoferol foi
detectada em todos os extratos. Os maiores teores (µg g-1 alga seca) foram quantificados em
Cryptonemia luxurians (51,985 ± 1,737), Amansia multifida (16,731 ± 1,402) e Hypnea
musciformis (10,812 ± 0,672). Nos demais extratos as concentrações ficaram ente 0,885 ±
0,011 (Pterocladia americana) e 5,718 ± 0,794 (Cryptonemia crenulata) (Figura 22A). Por
sua vez, δ-tocoferol (µg g-1 alga seca) foi detectado em apenas quatro das dez rodófitas
analisadas, com variação de 1,148 ± 0,070 (A. multifida) a 1,832 ± 0,164 (Gracilaria ferox)
(Figura 22B).
Jensen (1969) investigou a ocorrência de tocoferóis em sete espécies de algas
vermelhas. Os teores de α-tocoferol variaram de 17 a 80 mg kg-1, sendo semelhantes ou
inferiores aos das espécies C. luxurians, A. multifida e H. musciformis analisadas no presente
trabalho. Os resultados observados por Wen et al. (2006) em Gracilaria lemaneiformis (1,02
mg 100 g-1 peso seco) e Porphyra yezoensis (1,72 mg 100 g-1 peso seco) foram semelhantes
aos determinados em A. multifida e H. musciformis, porém três e cinco vezes inferiores aos
encontrados em C. luxurians do presente trabalho, que por sua vez, foi similar ao de
Eucheuma cottonii (5,85 mg 100 g-1 peso seco) (MATANJUN et al., 2009).
Nas espécies de algas vermelhas japonesas analisadas por Miyashita e Takagi
(1987), α-tocoferol foi o composto majoritário contribuindo com 66% a 99% dos tocoferóis
totais, com concentrações variando de 0,033 a 2,186 µg g-1 peso fresco. δ-Tocoferol foi
detectado apenas em Carpopeltis flabellata (0,0076 µg g-1 peso fresco) e Neodilsea yendoana
(0,0024 µg g-1 peso fresco), correspondendo, respectivamente, a 15% e 12% dos tocoferóis
totais. Os isômeros β- e γ-tocoferol foram quantificados em praticamente todas as espécies,
entretanto em baixas concentrações (0,4% a 9,7% dos tocoferóis totais). Para efeito de
comparação, se os teores de α- e δ-tocoferol fossem expressos em base seca, eles seriam
muitas vezes inferiores aos observados nas algas vermelhas do presente trabalho.
Skinner e Sturm (1968) não detectaram α-tocoferol nas rodófitas Gigartina
corymbifera e Drionitis lanciolata. A presença desse tocoferol também não foi reportada em
40% das espécies de rodófitas estudadas por Sousa et al. (2008), dentre as quais Botryocladia
occidentalis e H. musciformis, ambas analisadas no presente trabalho que apresentaram
conteúdo considerável. Entretanto, em Gracilaria chilensis α-tocoferol foi o isômero
101
majoritário (86,6 µg g-1 lipídio = 1,12 µg g-1 alga seca), não tendo sido detectada a ocorrência
de δ-tocoferol (ORTIZ et al., 2009).
Figura 22 - Teores de tocoferóis nos extratos de Rhodophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.
P. americana
G. domingensis
G. ferox
B. occidentalis
B. triquetrum
B. seaforthii
C. crenulata
H. musciformis
A. multifida
C. luxurians
--
0 20 40 60
0,885 f
1,825 f
2,667 f
3,987 de
5,005 d
5,085 d
5,718 d
10,812 c
16,731 b
51,985 a
G. ferox
P. americana
G. domingensis
B. occidentalis
B. triquetrum
B. seaforthii
C. crenulata
H. musciformis
A. multifida
C. luxurians
µg α-tocoferol g-1 alga seca
A. multifida
C. crenulata
C. luxurians
G. ferox
0 20 40 60
1,148 c
1,261 bc
1,413 b
1,832 a
A. multifida
C. crenulata
C. luxurians
G. ferox
µg δ-tocoferol g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
Os teores de tocoferóis, expressos em µg g-1 alga seca, nos extratos das algas
pardas analisadas no presente trabalho estão apresentados na Figura 23. Todos os extratos
apresentaram α-tocoferol, cujos máximo e mínimo foram detectados em Padina gymnospora
(20,385 ± 3,408) e Lobophora variegata (0,784 ± 0,098), respectivamente. Nos outros
extratos os conteúdos permaneceram entre 4,013 e 5,363 (Figura 23A). δ-Tocoferol foi
(A)
(B)
102
detectado em três espécies: Spatoglossum schroederi (6,608 ± 0,313), Dictyota mertensii
(2,618 ± 0,298) e D. dichotoma (2,453 ± 0,721) (Figura 23B).
Figura 23 - Teores de tocoferóis nos extratos de Ochrophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.
L. variegata
D. dichotoma
D. mertensii
S. shoroederii
S.vulgare
P. gymnospora
0 10 20 30
0,785 c
4,013 bc
4,360 bc
4,501 b
5,363 b
20,385 a
L. variegata
D. dichotoma
D. mertensii
S. schroederi
S. vulgare
P. gymnospora
µg α-tocoferol g-1 alga seca
D. dichotoma
D. mertensii
S. shoroederii
0 10 20 30
2,453 b
2,618 b
6,608 a
D. dichotoma
D. mertensii
S. schroederi
µg δ-tocoferol g-1 alga seca
Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).
De um modo geral, nas espécies em que ambos os isômeros foram detectados,
houve predominância de α-tocoferol, o que está de acordo com Sánchez-Machado, López-
Hernández e Paseiro-Losada (2002) que afirmaram ser este o principal isômero das algas
pardas. Sousa et al. (2008) também reportaram a ocorrência dele nas ocrófitas inclusive em
espécies que foram também investigadas no presente trabalho como D. dichotoma, L.
(A)
(B)
103
variegata e P. gymnospora. Esta última apresentou a maior concentração, que foi semelhante
à observada na Laminaria japonica (1,72 mg 100 g-1 peso seco) analisada por Wen et al.
(2006), porém superior aos teores de Macrocystis integrifolia (12,2 µg g-1 peso seco) e Fucus
distichus (11,1 µg g-1 peso seco) estudadas por Skinner e Sturm (1968). Todos os outros
extratos de ocrófitas analisados no presente trabalho apresentaram concentrações de
α-tocoferol inferiores às exibidas por M. integrifolia e F. distichus.
MacArtain et al. (2007) determinaram os teores de vitamina E de várias espécies
de algas pardas consumidas na Ásia e expressaram seus resultados em porções de 8 g de alga
desidratada. O teor em Ascophyllum nodosum (0,029 mg) foi inferior a praticamente todas as
ocrófitas analisadas no presente trabalho, entretanto em Laminaria digitata (0,275 mg) e
Undaria pinnatifida (1,392 mg) as concentrações foram muito superiores.
Vários tocóis foram quantificados em Macrocystis pyrifera por Ortiz et al. (2009).
α-Tocoferol foi o composto majoritário, seguido por γ-tocoferol e β- e δ-tocoferol que
apresentaram teores similares. O conteúdo do primeiro foi superior a todos os encontrados nas
algas pardas analisadas no presente trabalho com exceção de P. gymnospora, enquanto o do
último foi inferior.
Assim como observado com relação ao conteúdo de carotenóides das algas, a
variabilidade dos tocoferóis também foi muito marcante e, além de ser uma particularidade da
espécie, depende também de fatores ambientais (DURMAZ et al., 2007; 2009), que se
modificam com a estação do ano. Collén e Davison (2001) avaliaram a sazonalidade dos
tocoferóis em Fucus vesiculosus, tendo identificado todos os isômeros com conteúdos
variados em todas as estações, mas independentemente da estação, o α-tocoferol foi o
composto majoritário.
Da mesma forma α-tocoferol foi predominante em algas pardas japonesas
chegando a representar mais de 90% dos tocoferóis totais. δ-Tocoferol foi identificado em
todas as espécies, com exceção de U. pinnatifida, sendo expressivo em Analipus japonicus e
Pelvetia wrightii contribuindo com mais de 42% dos tocoferóis. Nas espécies A. japonicus e
Hizikia fusiformis, a variação sazonal nos conteúdos de tocoferóis foi avaliada e atribuída às
mudanças ocorridas nos parâmetros ambientais como temperatura da água e luz. Nos meses
em que a temperatura da água e a luminosidade foram mais elevadas foi possível observar os
teores máximos (MIYASHITA; TAKAGI, 1987).
No trabalho de Hernández-Carmona et al. (2009) Eisenia arborea exibiu teores de
α-tocoferol também variáveis ao longo do ano, de 0,9 a 9,6 mg 100 g-1. Apenas o teor mínimo
foi semelhante aos determinados nas algas pardas no presente trabalho. Jensen (1969)
104
observou a ocorrência de α-, β-, γ- e δ-tocoferol nas algas pardas (A. nodosum, Fucus
serratus, F. spiralis, F. vesiculosus e Pelvetia canaliculata). As concentrações de α- e δ-
tocoferol, mg kg-1 peso seco, foram bastante expressivas com teores variando de 80 a 220 e de
110 a 320, respectivamente. Alaria esculenta, Laminaria hyperborea, L. digitata e L.
saccharina apresentaram apenas α-tocoferol e com teores variando de 9 a 30. Esses teores
foram superiores ou semelhantes aos das ocrófitas do presente estudo.
Outros fatores podem ser determinantes quanto à distribuição da vitamina E nas
algas. Por exemplo, os isômeros de tocoferol e tocotrienol em Durvilleae antarctica foram
encontrados em quantidades diferentes dependendo da porção analisada, sendo α-tocoferol
mais abundante na parte basal onde nenhum δ-tocoferol foi detectado. Os teores de α-
tocoferol (179,4 a 258,0) e δ-tocoferol (245,9), ambos expressos em mg kg-1 lipídio em base
seca (ORTIZ et al., 2006) foram superiores aos das algas pardas do presente trabalho.
O processamento adotado também pode influenciar nos teores de vitamina E.
Sánchez-Machado, López-Hernández e Paseiro-Losada (2002) determinaram α-tocoferol,
µg g-1 peso seco, em algas pardas submetidas a diferentes tratamentos térmicos. Himanthalia
elongata e Laminaria ochroleuca desidratadas a 45°C por 24 h e Saccorhiza polychides e H.
elongata enlatadas e aquecidas a 112°C por 40 min apresentaram teores iguais a 33,3 ± 4,2,
8,9 ± 2,1, 5,7 ± 1,3 e 12,0 ± 2,0, respectivamente. A diferença entre as amostras de H.
elongata desidratada a 45°C por 24 h e esterilizada comercialmente a 112°C por 40 min foi
atribuída às condições do processamento, variação sazonal e/ou variação entre os locais de
coleta. De um modo geral, estas quantidades foram semelhantes àquelas mensuradas nas algas
pardas do presente trabalho, com exceção de δ-tocoferol em L. ochroleuca (8,9 µg g-1 peso) e
H. elongata (33,4 µg g-1 peso) que foram superiores.
Le Tutour et al. (1998) também quantificaram os isômeros α-, γ- e δ-tocoferol em
ocrófitas desidratadas, com umidade inferior a 10%, coletadas em diferentes estações do ano.
Laminaria digitata, Himanthalia elongata, Fucus vesiculus, F. serratus e Ascophyllum
nodosum apresentaram predominância de α-tocoferol. Na amostra de L. digitata coletada no
inverno nenhum isômero foi observado, mas naquela do verão foram detectados α- e γ-
tocoferol. O teor de α-tocoferol em L. digitata foi semelhante aos encontrados em todas as
algas pardas analisadas no presente trabalho, enquanto as quantidades de α- e δ-tocoferol em
F. vesiculus, F. serratus e A. nodosum foram várias vezes superiores. Resultados desta
natureza levam à suposição de que a ausência de isômeros de tocoferóis nas algas estudadas
não está necessariamente associada ao fato de elas não serem capazes de sintetizá-los, mas
sim devido a algum fator ambiental que inviabilizou ou não propiciou sua síntese.
105
Burtin (2003) elegeu as algas pardas como as melhores fontes de vitamina E,
observação feita também por Matanjun et al. (2009) e Miyashita e Takagi (1987). Entretanto,
no presente trabalho, assim como no trabalho de Sousa et al. (2008), os teores de α-tocoferol
nas algas verdes foram maiores do que nas vermelhas e pardas.
106
5 CONCLUSÃO
As 23 espécies de macroalgas marinhas do litoral cearense analisadas no presente
trabalho apresentaram expressiva atividade antioxidante, muitas vezes até superior àquelas
exibidas pelos produtos sintéticos. Entretanto, essa atividade foi distinta entre os filos
Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta. As algas verdes apresentaram maior atividade
antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, as vermelhas foram mais efetivas
na quelação do íon ferroso e as pardas exibiram maior capacidade para sequestrar o radical
DPPH, maior poder de redução do ferro e maior conteúdo de compostos fenólicos.
O conteúdo de compostos fenólicos foi o principal responsável pelas atividades de
sequestro do radical DPPH, poder de redução do ferro e quelação de íon ferroso nas algas
verdes e vermelhas. Nas algas pardas esses compostos só influenciaram na redução do ferro;
as demais atividades provavelmente são resultantes da presença de outros compostos como
pigmentos, polissacarídeos e/ou proteínas.
Muitas classes de metabólitos fenólicos com relevante atividade antioxidante
parecem ocorrer nas 23 espécies de macroalgas marinhas analisadas. Os fenóis foram
encontrados apenas nas algas pardas. Antocianinas, antocianidinas, chaconas, auronas e
leucoantocianidinas foram encontradas em algumas espécies de algas vermelhas. Taninos,
flavonas, flavonóis, xantonas, catequinas, flavanonas e flavanonóis foram observados nos
filos Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta, com exceção da última classe que não foi
detectada nas algas verdes.
Além dos compostos fenólicos, as macroalgas marinhas foram também boas
fontes de outras moléculas com atividade antioxidante como luteína, α- e β-caroteno, sendo o
primeiro majoritário nas espécies verdes e vermelhas, e vitamina E (α- e δ-tocoferol), sendo o
isômero α-, o mais abundante nas 23 espécies analisadas.
Diante das atividades exibidas pelos extratos algáceos e dos conteúdos dos
compostos fenólicos, carotenóides e vitamina E presentes nas espécies analisadas é possível
afirmar que as macroalgas marinhas do litoral cearense apresentam grande potencial para
exploração de compostos bioativos com atividade antioxidante.
107
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