Introdução à Montagem de Genomas

Gustavo Gilson Lacerda Costaglacerda@lge.ibi.unicamp.br

Histórico

• 1995, Haemophilus influenzae • 1996, Methanococcus jannaschii • 1997, Saccharomyces cerevisiae • 1997, Escherichia coli• 1998, Caenorhabditis elegans• 2000, Drosophila melanogaster• 2000, Arabidopsis thaliana • 2001, Homo sapiens• 2002, Schizosaccharomyces pombe • 2002, Oryza sativa • 2002, Mus musculus• 2005, Pan troglodites

Onde sequenciar seu genoma

• Illumina (www.everygenome.com)– $9500 por indivíduo– $7500 para grupos de 5

• Serviço contratado sempre através do médico do paciente

• O médico recebe um notebook com um navegador genômico carregado com os dados do paciente

Onde sequenciar seu genoma

• DNAVision (www.dnavision.com)

Onde sequenciar seu genoma

• Complete Genomics (www.completegenomics.com)– Para grandes lotes, preço por genoma pode chegar a $5000– Serviço voltado para empresas e instituições acadêmicas

MONTAGEM DE GENOMAS

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Whole Genome Shotgun (WGS)

• Quebrar o DNA original em fragmentos aleatórios e selecionar os fragmentos de determinado tamanho (Ex: 2Kbp)

Não sabemos a posição de cada fragmento no genoma

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Whole Genome Shotgun (WGS)

• Sequenciar as pontas de cada fragmento

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Whole Genome Shotgun - Montagem

singlet

gap

DNA original

Montagem de genomas (ab initio)

• Reconstruir a sequência do genoma, dados vários (potencialmente milhões) fragmentos curtos de sequência (os reads)

• Os reads têm tamanho entre 35-800 bp• Os reads podem conter erros de sequenciamento

(mismatches ou indels)• A orientação (5`3` ou 3`5`) de cada read é

desconhecida

TAMANHO DOS GENOMAS

Tamanho do genomaTamanho do genoma

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3,4 GbpHomo sapiens

680 GbpAmoeba dubia

15 GbpAllium cepa

1pg ~ 1Gbp

Cobertura

• Total de pares de bases em reads dividido pelo tamanho do genoma

• Ex: Genoma de 1Mbp• 5 milhões de reads de 50bp• Cobertura = (5000000 * 50) / 1000000 = 25X

• Na prática, corresponde a quantas vezes, em média, cada base do genoma foi sequenciada

Cobertura

• É preciso ter várias coberturas para conseguir montar contigs grandes (oversampling)

• Sanger: 8X a 10X• 454 Titanium (pirosequenciamento): 15X• Solexa: > 50X

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Modelo de Lander-Waterman

L = tamanho do readT = overlap mínimoG = tamanho do genomaN = número de readsc = cobertura (NL / G)σ = 1 – T/L

E(#clusters) = Ne-cσ E(tamanho do cluster) = L((ecσ – 1) / c + 1 – σ)cluster = contig ou singlet

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Exemplo

c N #cluster #contigs bases não sequenciadas

1 1,667 655 614 367,806

3 5,000 304 250 49,787

5 8,334 78 57 6,735

8 13,334 7 5 335

Genome size: 1 Mbp L= 600 T= 40

Modelo de Lander waterman

Medidas para avaliar uma montagem

• Número de contigs• Tamanho médio dos contigs• Tamanho do maior contig• N50: maior N tal que 50% do total de pares de

base do genoma esteja contida em contigs >= N bp

Cálculo do N50

• Seja uma montagem de um genoma de 300 bp que produziu 8 contigs de tamanho (3, 3, 15, 24, 39, 45, 54 e 117)

• Ordenar os contigs em ordem decrescente de tamanho e ir somando um por um

• Quando a soma ultrapassar 150 (300/2), o tamanho do contig da vez é o N50

• Os dois maiores contigs (117+54=171) ultrapassam 150. Logo N50=54 (tamanho do segundo maior contig)

Glossário de montagem

• Read: fragmento sequenciado• Contig: Pedaço contíguo de sequência formado a

partir da sobreposição dos reads• Singlet: read sem sobreposição com nenhum

outro• Gap: região do genoma não capturada por

nenhum read• Cobertura: Total de bases sequenciadas dividido

pelo tamanho do genoma

Paradigmas de montagem

I. Guloso (Greedy)II. Overlap – Layout – Consensus (OLC)III. Grafo de De Bruijn (DBG)

I - Guloso (Greedy)

• Phrap, TIGR assembler, CAP3

Guloso

• Criação de uma tabela de sobreposições

• Pegue a sobreposição de melhor score

• Junte os fragmentos• Repita até que não possa ser

feita mais nenhuma junção

I - Guloso (Greedy)

• Phrap, TIGR assembler, CAP3– Mesmo paradigma, diferentes resultados– Cada programa usa uma série de heurísticas próprias,

pré e pós processamentos– Cap3: montagem de ESTs (transcritos)– Phrap e TIGR: genomas (pequenos e simples)– Nenhum deles funciona bem com reads curtos

(Illumina/Solid)

II - Overlap – Layout – Consensus (OLC)

• Overlap: alinhamento par a par entre todos os reads sequenciados para detectar sobreposições

• Layout: ordenação/orientação dos reads de acordo com os overlaps

• Consensus: reconstrução da sequência do genoma através do alinhamento múltiplo dos reads (obedecendo ao layout)

II - Overlap – Layout - Consensus

• Montadores OLC usam uma estrutura de dados chamada grafo de overlap– Celera Assembler– Arachne– Mira– Newbler

O que é um grafo?O que é um grafo?

• Informalmente, um grafo é um conjunto de Informalmente, um grafo é um conjunto de vértices conectados por um conjunto de arestasvértices conectados por um conjunto de arestas

1 12 3

4 45 56 6

2 3

Grafo direcionado Grafo não direcionado

II - Overlap-Layout-ConsensusGrafo de overlaps

Overlap graph for a bacterial genome.  The thick edges in the picture on the left (a Hamiltonian cycle) correspond to the correct layout of the reads along the genome (figure on the right).  The remaining edges represent false overlaps induced by repeats (exemplified by the red lines in the figure on the right)

Vértices: readsArestas: overlaps

Fonte: http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly_primer.shtml

III - Grafo de De Bruijn (DBG) - Definição

• É uma representação de uma sequência (ou conjunto de sequências) através de sua decomposição em subsequências de tamanho K (K-mer)

• Os vértices são sequências de k-1 caracteres• Arestas são inseridas entre pares de vértices (u,v) em que o

sufixo de tamanho k-2 de u é igual ao prefixo de tamanho k-2 de v

• k=7, k-1=6, k-2=5• O k-mer ou aresta é ACCTGAT

Construção de um grafo de De Bruijn

Reads= (GTGC,ATGT,GCCG,CGCA,TGCC) k=3

AT TG

GT

GC

CC CG

CA

Grafo de De Bruijn

Fonte: http://www.homolog.us/blogs/2011/07/28/de-bruijn-graphs-i/

K=8

Grafo de De Bruijn

GENOMA

E se o genoma fosse desconhecido?Vamos ver como ficaria o grafo de De Bruijn construído a partir dos reads

Cada read é decomposto em subsequências de tamanho K (K-mers) e inserimos todos os K-mers no grafo de uma vez

Grafo de De Bruijn

Grafo de De Bruijn

• Sem erros de sequenciamento e com cobertura alta– DBG do genoma ~ DBG dos reads

• A sequência do genoma pode ser recomposta através de um caminho euleriano no DBG

• Caminho euleriano: caminho que passa por todas as arestas do grafo exatamente uma vez

• Se o DBG não for euleriano, tenta-se simplificá-lo ao máximo e encontrar subgrafos eulerianos

Grafo de De Bruijn

• Erros de sequenciamento tipicamente geram topologias características no DBG

Grafo de De Bruijn

• Repeats também induzem topologias características

Grafo de De Bruijn

• Repeats também induzem topologias características

Reconstituição do genoma com o DBG

Reads= (GTGC,ATGT,GCCG,CGCA,TGCC) k=3

• Reconstruir a sequência do genoma é encontrar um caminho euleriano (caminho que passa por cada aresta uma unica vez)

AT TG

GT

GC

CC CG

CA

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Reconstrução da sequência (De Bruijn)

Montagem - De Bruijn (Velvet, Euler-USR, Abyss)

• Escolha um valor de K, menor que o tamanho do read– K grande: mais especificidade– K pequeno: mais sensibilidade

• Inicie um grafo G vazio• Para cada read sequenciado, divida-o em palavras de

tamanho k (k-mers), com passo de 1, e insira os k-mers no grafo G

• Simplifique o grafo G (remova tips e bubbles)• Busque caminhos eulerianos• Se não houver, busque subgrafos eulerianos

Montagem - De Bruijn (Velvet, Euler-USR, Abyss)

• Os montadores DBG conseguem gerenciar quantidades massivas de sequência

• Não precisa alinhar todo mundo contra todo mundo• Construção do grafo em tempo linear• Erros de sequenciamento -> grafo maior -> muita, muita

memória

O problema dos repeats

• Trechos de sequência repetidos ao longo do genoma

• Em procariotos: pouco frequente• Em fungos: média quantidade• Em algumas plantas e em vertebrados compõem

a maior parte do genoma• Desafio para qualquer software, independente

do paradigma usado

A DCB E F IHG J K L

123456789101112

A B C D

1

2

3

4

O problema dos repeats

• Vamos tentar reconstruir a seguinte frase (genoma) a partir de alguns fragmentos (reads)

• It was the best of times, it was the worst of times, it was the age of wisdom, it was the age of foolishness, …

Qual a próxima palavra? Worst ou Age?

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Erros de montagem causados por Repeats

a b c

a c

b

a b c d

I II III

I

II

III

a

b c

d

b c

a b d c e f

I II III IV

I III II IV

a d b e c f

a

collapsed tandem excision

rearrangement

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Resolvendo repeats com paired ends

O problema dos repeats

• O maior repeat tem tamanho 5. Logo eu precisava de reads maiores que 6 para conseguir montar sem ambiguidades

O problema dos repeats

• Ou então: vínculos par a par entre os reads com distância conhecida (paired ends)

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Construindo Scaffolds

• Os paired ends também são muito úteis para ordenar e orientar os contigs

• Mesmo que não tenhamos a sequência entre dois contigs, a informação de que eles são vizinhos é de grande valor

SCAFFOLD

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Resumo do processo de montagem

Montagem

Scaffolding

Scaffolding

• Alguns montadores são capazes de produzir scaffolds– Velvet– Celera assembler– SoapDeNovo– Newbler

• Programas standalone– Bambus– Supercontigs

• Construção de scaffolds também é um problema modelado em grafos (caminho de custo mínimo)

Tamanho do read, paired-ends e cobertura

– Reads grandes facilitam a montagem. Se eles forem pareados melhor ainda

• Reads longos podem atravessar repeats• Reads paired-ends ajudam a resolver ambiguidades e

atravessar repeats maiores– Cobertura alta também ajuda, mas só até um certo ponto

• Mais precisão para determinar as bases do consenso• Diminui as chances de haver regiões do genoma não

sequenciadas• Regiões do genoma de cobertura atipicamente alta

provavelmente representam repeats fundidos

April 11, 2023 · Computational

Genomics

Montagem comparativa

• Em algumas ocasiões, já existe um genoma de algum organismo parecido sequenciado (referência)

• Queremos saber as diferenças entre o nosso genoma de interesse e a referência

• Mais simples computacionalmente• Alinhamos os reads contra a referência, fazemos

o layout e o consenso• Alignment-Layout-Consensus

Ressequenciamento

Ressequenciamento: SNPS, variações estruturais, variações de número de cópias

DELSNP

reference genome

REFERÊNCIA= TODAY_IS_SUNDAY

Montagem ab initio Montagem comparativa