Interações antígeno-anticorpo: Reações sorológicas (parte II). Testes sorológicos primários

Prof. Helio José Montassier

INTRODUÇÃO

• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma doença:

• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ouidentificar um Ag de interesse.

• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possíveldeterminar se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.

• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico édenominada sorologia, soro-diagnóstico ou imuno-diagnóstico.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

INTRODUÇÃO

• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandescategorias:

• Testes de ligação primária• Detectam / Mensuram diretamente a ligação do Ag x Ac in vitro

• Testes de ligação secundária• Detectam / Mensuram os resultados da interação Ag x Ac in vitro.

• Testes terciários• Compreendem os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em

cultivos celulares (Testes de Soro-Neutralização), ou em animais (Testes deSoro-Proteção).

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS

• Soro

• Antiglobulinas / Anti-Imunoglobulinas (IgG; IgM; IgA)

• Anticorpos monoclonais

• Anticorpos policlonais específicos

• Antígenos

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA

• Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.

• Permitem que a interação dos Ags e dos Acs e os complexos imunesformados sejam, então, diretamente mensurados.

• Para mensuração desta reação, um dos reagentes (Ac* / Ag) deveestar quimicamente marcado, com substâncias fluorescentes(fluorocromos), enzimas, radioisótipos e partículas coloidais coradas.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA

1) Reações / Ensaios / Testes de imunofluorescência

2) Reações / Ensaios / Testes imunoenzimáticos (ELISA; Imuno-dot;Western-blotting; Imuno-Peroxidase (Imuno-Histoquímica – IHC)

3) Reações / Ensaios / Testes rápidos de imunocromatografia

4) Citometria de fluxo

5) Radioimunoensaios

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

HISTÓRICO

•Utilização de anticorpos /antígenos marcados em Ensaios Sorológicos: –

• 1954: Teste de Imunofluorescência (Weller & Coons);

• 1959: Radioimunoensaio (Yallow & Berson).

• Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas & Uriel; Nakane& Pierce, 1966).

• Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorpos monoclonais(Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novos testes (kits comerciais).

• Os primeiros testes imunocromatográficos ("testes de fluxo lateral“) eram maissimples no início quando surgiram no final dos anos 80 e passaram a usar partículascoloidais coloridas para conjugar com Anticorpos e suportes apropriados(membranas de nitrocelulose). Exemplos que ainda estão no mercado hoje são astiras de teste para gravidez (Chard, 1992).

• Desenvolvimento e Aplicação de Métodos imunoezimáticos colorimétricos / quimioluminescentes, radioativos, fluorescentes, testes imunocromatográficos / imunomigração rápida etc.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

Anticorpos (+ frequentemente) ou antígenos são conjugados (ligados demodo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitadapor radiações UV, emite luz no espectro visível.

A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação se faz emum microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tiposde reações de imunofluorescência: direta, indireta ou sanduíche.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)

Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos

Referência para sorodiagnóstico de várias doenças por:-

• Vírus, bactérias e protozoários

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

Teste direto - pesquisa de antígenos

• Ex. – Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV)

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

RIFD p/ Diagnóstico / Detecção do Vírus da

Raiva em amostras do SNC de animais

suspeitos de infecção

ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

Vantagens: relativamente baixo limiar de detecção; técnica + específica;reprodutível; de execução relativamente simples; permite a determinaçãode isótipos diferentes de anticorpos a RIFI.

Desvantagens: necessita de microscópio de fluorescência; diminuição dafluorescência dos conjugados sob irradiação; subjetividade na leitura; >dificuldade de automação.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

TESTES IMUNOENZIMÁTICOS

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags. Fundamentos: Uso de conjugados de Acs + Enzimas e interações Ags- Acs em suportes sólidos

(Microplacas de ELISA*) e desenvolvimento de cor após a adição de substratos apropriados noconjunto das interações Ags – Acs

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS

Método direto – Ags

Método indireto – Acs

Sandwich e Competitivo – Ags ou Acs

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

3

1

4

POSITIVO

5

L L

1 2

LL

NEGATIVO

5

ELISA INDIRETO – Detecção de Acs(?)

Antígeno (conhecido) Fonte de proteínas

estranhas ao sistemaAnticorpo anti

Conjugado anti

Cromógeno sem corCromógeno com cor

L Lavagens?

?

ELISA SANDWICH / DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA – Detecção

de Ags

Fonte de proteínas

estranhas ao sistemaAnticorpo anti

Conjugado anti

Cromógeno sem corCromógeno com cor

L Lavagens

AntígenoAnticorpo anti

L L L

L L

POSITIVO NEGATIVO

1

665

432

ELISA SANDWICH / INDIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA – Detecção

de Acs

L L L

L L

POSITIVO NEGATIVO

1

65

432

Fonte de proteínas

estranhas ao sistemaAnticorpo anti

Conjugado anti

Cromógeno sem corCromógeno com cor

L Lavagens

AntígenoAnticorpo anti

?

6

QUIMIOLUMINESCENTE IMUNO ENSAIO- CLIA – CHEMILUMINESENCE IMMUNOASSAY

• Princípio ELISA

• Exceto que:-

• Usa substrato quimioluminescente (emissão de luz)

• Não é necessário solução de parada da reação (stop

solution)

• Período de incubação no final é menor

• Leitura é feita em Luminômetro

Comparação entre CLIA, ELISA e RIA

DOT-ELISA reação imunoenzimática sobre membranas

Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida e simples

Proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias e vírus

Stott, 2000

IMMUNO-DOT

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel de

poliacrilamida para membranas ELISA

Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas +

especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags

Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon,

polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas

Quantificação de bandas por densitometria.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

IMMUNO-DOT

TESTES DE IMUNO-PEROXIDASE / IMUNO-FOSFATASE ALCALINA –IMUNO-HISTOQUÍMICA (IHC)

IMUNOHISTOQUÍMICA

1. Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.

2. Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolorem produto colorido (deposição pode ser observada diretamente aomicroscópio óptico).

3. Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina.

4. Método direto Acs primários conjugados (antígenos).

5. Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ouanticorpos).

6. Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamentoinadequado dos conjugados.

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS /IMUNOMIGRAÇAO RÁPIDA

Imunocromatografia

Os testes de imunocromatografia ou fluxo lateral envolvem:-

• A migração de um antígeno, ou complexos antígeno-anticorpo, através

de um suporte, por exemplo, filme de nitrocelulose, papel de filtro ou

agarose.

• Em um formato típico, um anticorpo marcado (partícula coloidal

colorida) é colocado para reagir com o antígeno desconhecido, o

complexo antígeno-anticorpo migra por ação capilar através do suporte

sólido, e um segundo anticorpo incorporado no suporte sólido permite

a detecção dos complexos se o antígeno estiver presente.

• Controles positivos e negativos são incluídos para garantir que os

testes individuais sejam válidos.

• Os testes de imunocromatografia estão disponíveis para a medição de

antígenos virais tais como HIV p24, dengue NS1, influenza A e B, RSV,

etc. e são de particular valor para testes rápidos em locais onde

resultados rápidos são necessários e o acesso ao equipamento é

limitado.

Imunocromatografia

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de

nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a

visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na

forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com

proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).

Imunocromatografia

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

Imunocromatografia

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

Imunocromatografia

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

CITOMETRIA DE FLUXO

Citometria de Fluxo

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

• Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e

fluorescência sob feixe de laser

• Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula

• Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B

• FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula

Citometria de Fluxo

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

Citometria de Fluxo

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

RADIO IMUNO ENSAIO

Limiar de detecção: nano ou picogramas

Quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos,anticorpos e antígenos microbianos

Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não-marcado na amostra competição

Marcação com radioisótipos (125I e 131I)

Determinação de curvas-padrão

Desvantagens: custo, vida média dos reagentes e risco operacional

RADIOIMUNOENSAIO

FIGURE 41-1 The principle of competitive radioimmunoassay. Unlabeled antigen in the test solution displaces labeled antigen from immune complexes. The amount of labeled antigen released will be proportional to the amount of unlabeled antigen added.

RADIOIMUNOENSAIO

Ac + Ag* AcAg*

Lembrando o equilíbrio!

AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*

RADIOIMUNOENSAIO

Curva-padrão

RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

Limiar de Detecção dos Testes Sorológicos

Obrigado!