Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA)

Paula Finger

Fevereiro de 2013

Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologia

Disciplina: Imunologia

- Prática -

Métodos de diagnóstico

ANTICORPOS

CHAVE PARA DIAGNÓSTICO

IDENTIFICAR ANTÍGENO

Combinação Ag-Ac

• Aglutinação

• Precipitação

• Ativação do Complemento

• Citólise

• Neutralização

Reação de precipitação

• Complexos moleculares gerados por Ag e Ac

• Formação de precipitados de acordo com os reagentes

▫ Efeito pré-zona

▫ Zona de equivalência

Curva de precipitação

Considerar concentração Ag x Ac

Reações de precipitação Ag com múltiplos

epitopos Ac bivalente

AG + EXCESSO DE AC

Reações de precipitação Ag com múltiplos

epitopos Ac bivalente

AG + AC EM

PROPORÇÕES ÓTIMAS

Reações de precipitação

Ag com múltiplos epitopos

Ac bivalente

AC + EXCESSO DE AG

IMUNODIFUSÃO - Tipos

• 2 Tipos:

DUPLA

RADIAL Permite determinar concentração de um

antígeno ou anticorpo

Permite determinar presença de anticorpos ou

antígeno

Técnica IDGA

• Placas de petry

• Tampão Tris HCl

• Agar noble

• Furador (roseta)

• Sugador

Material necessário:

- Realização da técnica -

Antígeno

Soro controle

Soros para testar

48-72 horas depois

Imunodifusão Dupla

Ag Ac

Linha de Precipitação

Difusão Radial

Imunodifusão Dupla

• O que determina a posição da linha de precipitação????

Ag Ac

Ag Ac

Imunodifusão Dupla

• Utilização

Diagnóstico

Leucose Bovina

Anemia Infecciosa Equina

Língua Azul

Distribuição dos reagentes

1 e 4: Ac padrão

7: Ag padrão

2, 3, 5 e 6 - soros de campo

2, 4 e 6: Ac padrão

7: Ag padrão

1, 3 e 5 - soros de campo

Reações observadas

Soros de campo 2 e 5 negativos;

Soros de campo 6 e 3 positivos,

Obs.: soro 3 positivo mais fraco

que soro 4.

Soros de campo 1 e 4 positivos;

Soro de campo 5 negativo.

Roseta A Roseta B SP

SP

SP

SP

SP

Possíveis reações

Anti -1

A: identidade

Ag

B: não identidade

C: identidade parcial

Anti –1, 2 e 4

Anti –1 e 3

esporão

1) Os arcos de precipitação formados

entre o Ac e os dois antígenos se

fundem, indicando que o Ac está

precipitando epitopos idênticos.

2) O Ac preparado distingue os três Ag

diferentes que formam arcos

independentes de precipitação.

3) Os antígenos compartilham o

epitopo 1, mas um deles também

possui um epitopo 3. A linha de

precipitação indica, então, uma

identidade parcial e não total, entre as

preparações de Ag.

Tipos de linhas:

Poços:

1 e 4: soros padrão

2,3,5 e 6: soros de

campo

7: antígeno

Linhas:

Vermelha: Identidade

Verde: Não identidade

Azul: Esporão

1

2

3 4

7 5

6

ANTÍGENO

LEUCOSE

SORO

PADRÃO

SORO

PADRÃO

SORO

PADRÃO

SORO de

CAMPO

(Pos)

SORO de

CAMPO

(Neg)

SORO de

CAMPO

(Neg)

Reações no teste de Leucose

• Vantagens

• Simplicidade e praticidade;

• Custo;

• Desvantagens

• Reações inespecíficas;

• Tempo

• Sensibilidade razoável.

Imunodifusão em gel de agarose - IDGA

Legenda da Placa 1 Roseta 1:

1. Bovino

2. Coelho

3. Bovino

4. Coelho

5. Bovino

6. Bovino

7. Anti-bovino

Roseta 2:

1. Equino

2. Bovino

3. Equino

4. Bovino

5. Equino

6. Bovino

7. Anti-bovino

Roseta 3:

1. Bovino

2. Bovino

3. Bovino

4. Bovino

5. Bovino

6. Bovino

7. Anti-bovino.

Roseta 4:

1. Bovino

2. Bovino

3. Bovino

4. Anti-Bovino

5. Anti-Bovino

6. Anti-Bovino

7. Equino/Anti-

bovino/Anti-caprino

Legenda da Placa 2 Roseta 1:

1. Bovino

2. Caprinp

3. Bovino

4. Caprino

5. Bovino

6. Caprino

7. Anti-bov e cap.

Roseta 2:

1. Coelho

2. Coelho

3. Coelho

4. Caprino

5. Caprino

6. Bovino

7. Anti-equino/Anti-

bovino

Roseta 4:

1. Equino/Anti-bovino

2. Equino/Anti-bovino/Anti-

cap

3. Equino/Anti-bovino

4. Equino/Anti-bovino/Anti-

cap

5. Equino/Anti-bovino

6. Equino/Anti-bovino

7. Anti-bov

Roseta 5:

1. Ceolho

2. Coelho

3. Equino/Anti-Bovino

4. Equino/Anti-Bovino

5. Anti-Bovino/Cap

6. Anti-Bovino/Cap

7. Bovino

Roseta 3:

1. Bovino

2. Bovino

3. Bovino

4. Bovino

5. Bovino

6. Bovino

7. Anti-bovino.