Post on 30-Nov-2015
HPLC – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
DQI - Química Analítica Instrumental II
LAVRAS 2013
Alexandre Alves de CastroMaisa Carla Ragozoni Pereira
Introdução
Nas indústrias químicas,
farmacêuticas, alimentícias,
refinarias, petroquímicas,
laboratórios de análises
clínicas, ambiental e forense;
Frequentemente é necessário
separar, isolar, purificar,
identificar e quantificar os
componentes de misturas
muitas vezes bastante
complexas.
Introdução
Definição de cromatografia:
Conjunto de técnicas de separação cujo
princípio depende da distribuição diferenciada
de um dos componentes de uma mistura entre
duas fases, uma considerada estacionária, e a
outra, móvel;
A natureza química e física dos componentes da
mistura definem o grau de afinidade entre as
duas fases, acontecendo o fenomeno de
migração diferencial.
Introdução
HPLC
Do ingles HPLC- High Performance Liquid
Chromatography. É também conhecida como:
Cromatografia Líquida de Alta Performance, de
Alta Pressão ou de Alto Desempenho;
É uma técnica ultra-microanalise podendo,
dependendo da substância e do detector
empregado, quantificar massas inferiores a 10-18
g.
Descrição Geral da HPLC
A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE);
Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna;
Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
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Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Descrição Geral da HPLC
Conceitos Fundamentais da HPLC
Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições;
É obtida por meios físicos embora reações químicas possam ser envolvidas no processo;
Os métodos físico-químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas.
Conceitos Fundamentais da HPLC
Importância da cromatografia: Velocidade; Poder de resolução; Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9
– 10-15g); Simplicidade da técnica.
Objetivo: Separar individualmente os diversos constituintes de
uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.
Instrumentação em HPLC
Fase Móvel
A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna;
A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel;
A fase móvel deve ser degaseificada;
As técnicas de degaseificação são: refluxo com resistência de aquecimento; vácuo (trompa d’água); purga com hélio; uso de membrana semipermeável.
Fase Estácionária
Basicamente são dois tipo de FE: Pelicular:Consiste de leito de polímero ou vidro não-
poroso,esférico, com diâmetros típicos da ordem
de 30 a 40mm, recoberto com uma camada fina e
porosa de: Sílica; Alumina; Resina de poliestireno-divinil-benzeno; Resina catadora de íons.
Fase Estácionaria
Partícula Porosa: Consiste em micropartículas porosas com
diametros de 3 a 10 mm. As partículas são constítuidas dos mesmos materias do recobrimento pelicular;
Quanto MENOR for a partícula, MAIOR será a eficiência na separação.
Partículas menores reduzem a distancia de contato do soluto com as FE e FM, facilitando o equilíbrio, e consequentemente melhorando a eficiência da coluna.
Fase Estácionaria
De acordo com as fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo basicamente como:
Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar, em relação a eluição, os solutos mais apolares são eluídos primeiramente, enquanto que os polares são retidos pela fase estácionaria e são eluídos depois;
Cromatografia em fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar, portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente.
Bomba
Principais características da
bomba: Leva a fase móvel desde o
reservatório até a coluna; Deve operar a pressões de até
500 atm com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase ambiente;
Devem ser constituídas de material inerte;
Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns;
As vazões normalmente empregadas vão de 0,005 até no máximo 4 ou 5ml/min.
Bombeamento por Gradiente
Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da vazão total;
O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão;
Bombeamento por gradiente baixa pressão:
Bombeamento por Gradiente
Bombeamento por gradiente alta pressão:
Injetor
Uso de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20µl;
A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta;
A injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.
Colunas Cromatográficas
Na HPLC podem ser usados três tipos de colunas:
Colunas Cromatográficas
Coluna de saturação: É colocada entre a bomba e o
injetor sendo usada para condicionar a fase estácionaria;
Empregada com finalidade de saturar a FM com o líquido da FE.
Colunas Cromatográficas
Coluna de guarda: É colocada entre o injetor e a
coluna analítica, esta possui de 2 a 5 cm;
É utilizada para prevenir impurezas e compostos fortemente retidos;
Satura rapidamente; Aumenta o tempo de vida útil
da coluna analítica; O custo das diversas trocas
dessas coluna ainda é menor do que uma nova coluna analítica.
Colunas Cromatográficas
Coluna de separação: Responsável pela separação dos componentes da
amostra. Podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas.
Colunas Cromatográficas
Coluna preparativa: Cromatografia de filtração em gel- separação,
isolamento e purificação de proteínas.
Coluna analítica: Permitem a separação de pequenas quantidades
do material a ser analisado; São constituí das de um tubo de algum material
inerte. O aço inoxidável é o material mais frequentemente utlizado;
Colunas Cromatográficas
Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados;
Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às pressões em que será usada;
São normalmente retas, pois apresentam perda na eficiência quando são dobradas.
A coluna deve ser guardada em solvente orgânico ou FM.
Detector
Dispositivos que examinam continuamente o material elúido, gerando sinal quando da passagem de substâncias;
Um detector ideal deve possuir as seguintes características:
Alta sensibilidade; Estabilidade; Reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rápida aos analíticos; Não contribuir para o alargamento do pico; Confiabilidade
Detector
Falicidade do manuseio; Não destrutivo; Seletividade.
Tipos de detectores:
Os principais detectores utilizados em HPLC são: Índice de refração; Espectrofotometira UV-Visível; Fluorescência; Eletroquímico; Espectrometria de massa LC/MS.
Aquisição de dados
Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma;
Armazenar e registrar;
Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba,amostrador automático, temperatura da coluna;
Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST).
Vantagens e Desvantagens
Vantagens: Não necessita que a amostra seja volátil
( requisito da CG); Tempo reduzido da análise; Alta resolução; Boa detectabilidade e bons resultados quali e
quantitativos.
Desvantagens: Alto custo do equipamento e manutenção; Não existe um detector universal com boa
detectabilidade e baixo custo: Índice de refração: baixa detectabilidade(10 -6 g), pouco
estável.
Espectrômetro de massas: ~ US$ 150.000
Aplicabilidade
Aplicabilidade
Aplicabilidade
Dicas do que não fazer em HPLC Lavar um sistema com tampão usando orgânico
puro: precitiação; Injetar amostras que podem precipitar a fase
móvel: testar miscibilidade; Usar HCl, H2SO4 CCl3 em sistema de aço inox:
corrosão do sistema; Usar fita Teflon para vedar as conexões: sem
efeito e pode causa entupimento; Deixar o sistema parado com a fase móvel
contendo tampão ou acidos/bases fortes: cristalização= danificação dos selos da bomba, injetor, entupimento do detector.
Referências
HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis – George Lunn – Norman Schmulf – Wiley Interscience – 1997 (1632 pag.) – ISBN 0471181765.
HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals – George Lunn – Wiley 2005 (717 pag.) – ISBN 9780471669418.
HPLC for Pharmaceutical Scientists – Yuri Kazakevich – Rosario Lobrutto –Wiley Jan 2007(1104 pag.) – ISBN 9780471681625.
HPLC Made to Measure – Stravos Kromidas – Wiley – 2006 –ISBN 352731377X.
Validation Chromatographic Methods – A Practical Guide – David M. Bliesner Wiley 2006 – (304 pag.) – ISBN 9780471741473.
HPLC Practical and Industrial Applications – Joel Swadesh. Modern HPLC for practicing scientists – Michael W.Dong – Wiley Interscience –
2006. HPLC – A practical user’s guide – Marvin C. McMaster – John Wiley & Sons –
2007. Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho – REMOLO
CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1ª Ed. The Reporter, Optimizing HPLC Separations
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.htl
Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12.
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