Histologia e Seus Métodos de Estudo

Profa. Dra. Bella Luna Colombini Ishikiriama

Sistemas

Órgãos

Tecidos

Células

HistologiaEstuda as células no contexto da estrutura tecidual e a inter-relação delas com os constituintes da MEC.

?Histologia

• Ectoderme – pele e nervoso

• Endoderme – trato digestivo

• Mesoderme – músculos, ossos e sistema circulatório

Histologia

4 Tecidos Fundamentais

1) Tecido Epitelial

2) Tecido Conjuntivo

3) Tecido Muscular

4) Tecido Nervoso

Formados por:

- Vários tipos de células característicos

- Arranjos característicos entre células e MEChistologyguide.com

Histologia4 Tecidos Fundamentais

histologyguide.com

Histologia

Microscópios Fotônicos/Óptico Microscópios EletrônicosOlho Humano

Limite de Resolução Distância Mínima entre dois pontos que podemos observá-los como pontos individualizados

Luz visível Comp. onda 0.55 m Lente biconvexa =

cristalino L.R. = 0,2 mm

Luz visível Comp. onda 0.55 m Lentes de vidro

L.R. = 0,2 µm (1000 x)

Feixe de elétrons Comp. Onda 0.005 nm Lentes Magnéticas

L.R. = 0,2 nm (1.000.000)

Microscópios Fotônicos Microscópios Eletrônicos

Histologia

Histologia

Histologia

Preparação de Espécimes para Exame em Microscópio

Preparado Histológico Permanente - Lâminas Histológicas

Histologia

COLETA FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO INCLUSÃO MICROTOMIA COLORAÇÃO

Técnica Histológica

Conjunto de processos a que são submetidos os tecidos a fim de que possam ser observados significativa

e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou patológico.

CLIVAGEM DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

1) Biópsia Cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido;

Obtidas por meio de:

2) Biópsia Endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc.) através de endoscopia;

3) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a

cavidade natural;

5) Necropsia – retirada do órgão ou tecido de um animal morto;

4) Cirurgias amplas – a amostra corresponde a peças grandes (ex: tumores) ou órgãos (ex: mama, útero);

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COLETA

Histologia

COLETA

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

HistologiaFixação

Evitar a Autólise;

Tornar o tecido mais rígido – facilita manuseio e corte; preserva morfologia;

Preservar a estrutura e composição molecular dos tecidos;

Permitir a difusão de substâncias pela membrana celular e demais estruturas

teciduais;

Melhorar a diferenciação óptica das estruturas teciduais;

Propiciar boas condições químicas para a coloração escolhida;

Elimina m.o. patogênicos;

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Objetivos

HistologiaAgentes Fixadores

2) Físicos 1) Químicos

Ácidos Inorgânicos – Ác. ósmico/ Ác. crômico

Ácidos Orgânicos – Ác. Acético glacial/Ác. Tricloroacético/ Ác. pícrico

Sais Metálicos – Dicromatos ( K+/Na+)/ Dicloreto de mercúrio

Redutores Orgânicos – FORMOL/Metanol/Etanol/Acetona

Frio ou calor- Agentes coagulantes/desnaturantes – precipitam as

proteínas sem se ligar a elas

- Agentes não coagulantes/aditivos – precipitam as proteínas ligando-se a elas

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Agentes Fixadores1) Químicos

Leong, 1996; Hopwood, 1977.

• Fixadores aldeídos – formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído comercial

• Agentes oxidantes – tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de potássio e

ácido crômico

• Agentes desnaturantes ou coagulantes de proteínas – metanol, etanol, acetona e ácido acético

• Mecanismo desconhecido – cloreto de mercúrio, ácido pícrico e sais de zinco

• Combinação de reagentes – tetróxido de ósmio e glutraldeído, tetróxido de ósmio e iodeto de

zinco, glutaraldeído e carbodiamida e formaldeído com glutaraldeído

• Fixação a seco – carbowax 6000 (20% de polivinil – álcool ou 20% de polietileno glicol) ou

fixação no vapor

• Micro-ondas – fixação por ondas eletromagnéticas com ou sem agentes fixadores

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Agentes Fixadores SIMPLES1) Químicos

• FORMOL ou Formalina (aldeído fórmico)

• Glutaraldeído ou aldeído glutárico

• Álcool - Metanol/Etanol

• Acetona

• Éter etílico ou sulfúrico

• Ácido – acético, crômico, pícrico, ósmico, etc.

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Agentes Fixadores COMPOSTOS1) Químicos

LÍQUIDO DE BOUIN

Solução aquosa saturada de

ácido pícrico (75mL)

Formol puro (37 -40%) (25mL)

Ácido acético glacial (05mL)

FIXADOR DE CARNOY

Álcool etílico absoluto (60mL)

Clorofórmio (30mL)

Ácido acético glacial (10mL)

FIXADOR DE ZENKER

Água destilada (100mL)

Cloreto de Mercúrio (5 mg)

Bicarbonato de sódio (2,5 mg)

Sulfato de sódio (1mg)

Ácido acético glacial (5mL)

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Fatores que influenciam a fixação:

• Temperatura

• Espessura do tecido

• Penetração

• Tempo de fixação

• Escolha do fixador

• Relaçaõ tamanho:volume peça

• Estocagem apropriada

• pH do fixador

• Osmolaridade da solução fixadora

• Adição de sais a mistura

• Concentração dos fixadores

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Agentes Fixadores2) Físicos

Frio – dióxido de carbono comprimido

- imersão em isopentano (-50oC)

Criostato ou Criomicrótomo

Menor tempo (10 min) – fixação e inclusão- Uso em hospitais - transoperatório

Não inativa enzimas e mantém proteínas; Não degrada lipídeos

- Histoquímica

Amostras congeladas – Cortes por congelação

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Planejar a coleta - elegendo um fixador que contribua para uma boa coloração;

Cuidados para uma boa fixação:

Respeitar intervalo mínimo entre coleta e fixação;

Utilizar volume de fixador adequado (10-20x volume da peça)

Respeitar o tempo adequado para cada fixador;

Espessura máxima (3-4mm);

Agitar suave e periodicamente a peça no fixador;

Manipular o mínimo possível a peça com pinças;

1) Químicos COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

3-5 mm de espessura

- Facilita penetração fixadores e difusão dos reagentes

CLIVAGEMCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Remoção do conteúdo mineral;

Avalia somente constituintes orgânicos;

DESCALCIFICAÇÃO

2) Físicos 1) Químicos

Soluções em pH ácido;

Soluções quelantes;

Meios de troca iônica;

Descalcificação eletrolítica

Descalcificação com auxílio de micro-ondas

Descalcificação com auxílio de ultrassom

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

DESCALCIFICAÇÃO

1) Químicos

a) Ácidos

FORTES

+ rápidos; > dano

Análises urgentes

(ác. nítrico; ác. clorídrico)

FRACOS

menores danos

Análises não urgentes

(ác. acético; ác. pícrico; ác. fórmico)

b) Quelantes

- Compostos orgânicos que se ligam ao

cálcio (metais)EDTA (ác. eitilenediaminetetracético)

• Desmineralização + LENTA

• SEM DANO ao tecido

• NÃO produz artefatos

• Preserva enzimas, ác. nucleicos e polissacarídeos

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

DESCALCIFICAÇÃO

1) Químicos

c) Resina de troca iônica

• Acelera a descalcificação

• Há RÁPIDA TROCA IÔNICA entre sol. e tecido• Boa preservação dos detalhes celulares

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.

DESCALCIFICAÇÃO

2) Físicos

Descalcificação com ultrassom / micro-ondas

Histologia

Agitação das moléculas e/ou aumento de temperatura

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

DESCALCIFICAÇÃO

2) Físicos

Descalcificação Eletrolítica ou Ionização Elétrica

Histologia

- Forma um campo elétrico entre 2 eletrodos.

- Ca+2 migra do osso para o eletrodo

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

CONTROLE DA DESCALCIFICAÇÃO

Flexibilidade do tecido Teste com alfinete

Radiografias

Teste do oxalato de amônia

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

PROCESSAMENTO

• Remoção e líquidos teciduais

• Difusão dos reagentes para o interior dos tecidos

• Torna os fragmentos rígidos

PARAFINAa) Desidratação

b) Diafanização/clarificação

c) infiltração

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

PROCESSAMENTO

• Remoção e líquidos teciduais

• H2O incompatível com material de inclusão

• AGENTES – Etanol; Acetona; Éter; Óxido de propileno

• Banhos em concentrações gradativas (70%-80%-100%)

a) Desidratação

b) Diafanização/clarificação

c) infiltração

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

PROCESSAMENTO

• Remoção do álcool – incompatível com a parafina

• Material se torna mais claro/transparente

Histologia

a) Desidratação

b) Diafanização/clarificação

c) infiltração

Xilol ou xileno

Toluol ou tolueno

Benzol ou benzeno

Clorofórmio

Óleo de cedro

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

PROCESSAMENTO

a) Desidratação

b) Diafanização/clarificação

c) impregnação/infiltração

PARAFINA

Paraplast

Celoidina

Historesina

Metacrilato

Resina epoxi

56 a 60oC2 imersões em parafina

I – 1h; II – 2h

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

INCLUSÃO

• Posicionar espécimes no interior de um molde com parafina

• Superfície a ser seccionada para baixo

• Bom resultado depende de etapas anteriores

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Micrótomo Rotativo - O bloco se movimenta

Micrótomo Deslizador - A navalha se movimenta

Micrótomo de Congelação - Corte sem inclusão

1 a 10 µm

Ultramicrótomo20 a 100 nm

MICROTOMIA

MICRÓTOMO ROTATIVO CRIOSTATO MICRÓTOMO DE CORREDIÇA

MICRÓTOMO DE CORRCONGELAÇÃO ULTRAMICRÓTOMO MICRÓTOMO VIBRATÓRIO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

MICROTOMIA

Histologia

MICROTOMIA

Histologia

MICROTOMIA

Histologia

MICROTOMIA

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

COLORAÇÃO

CORANTES

Compostos orgânicos aromáticos formados CROMÓGENOS + AUXOCROMO e coram

seletivamente os componentes teciduais, como as células e a matriz extracelular.

Anel aromático

de composto insaturado

Cromógeno

Cromóforos

- Tecido +

+ -

Auxocromos

- Direta = corante penetra sem tratamento intermediário- Indireta = corante necessita tratamento intermediário

Histologia

AÇÃO

CORANTES

- Progressiva = coloração é feita gradualmente, sem remover excesso- Regressiva = hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu excesso

TEMPO

- Quantidade de corantes utilizados- Monocrômica = 1 cor- Bicrômica = 2 cores- Tricrômica = 3 cores

- Policrômica = + de 3 cores

CROMATIZAÇÃO

Hematoxilina/Eosina

Tricrômio de Masson+ Fucsina aldeída

Cristal Violeta

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

CORANTES

VITAIS – Cora células em cultura e células em organismos vivos

NÃO - VITAIS – Cora tecidos previamente fixados

https://www.liberaldictionary.com https://www.histologyguide.com

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

CORANTES

NÃO - VITAIS – Cora tecidos previamente fixados

Histologia

HematoxilinaFucsina Eosina

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

CORANTES

VITAIS – Cora células em cultura e células em organismos vivos

Histologia

Azul de Trypan

Verde Janus B

Azul de Metileno

Vermelho Neutro

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

CORANTES

Histologia

Tricrômio de Masson

Hematoxilina/Eosina

https://www.histologyguide.com

Cristal Violeta

Tricrômio de Masson+ Fucsina aldeída

Schmorl

Fosfotungstênio e hematoxilina ácida

Iron Hematoxilina+ anilina azul

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

DESPARAFINIZAÇÃO

HIDRATAÇÃO

COLORAÇÃO

DESIDRATAÇÃO

CLARIFICAÇÃO

SELAGEM/MONTAGEM

Retirar a parafina dos cortes com XILOL

Reidratar os tecidos com banhos com álcool (100%, 95%, 80%, 70% até água destilada)

Imersão propriamente dita no corante

Retirar H2O com álcool(70%, 80%, 95%, 100%)

Xilol como intermediário álcool/meio de selagem

Adicionar meio de montagem/selagem;Cobrir o tecido com uma lamínula de vidro e

fixando-a

Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

DESPARAFINIZAÇÃO HIDRATAÇÃO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

COLORAÇÃO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

DESIDRATAÇÃO CLARIFICAÇÃO

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

SELAGEM/MONTAGEM

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

SELAGEM/MONTAGEM

HistologiaCOLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

SELAGEM/MONTAGEM

Histologia

Preparado Histológico Permanente - Lâminas Histológicas

Imunologia

Imunohistoquímica / ImunofluorescênciaConjugação de anticorpos específicos com

corantes (fluorescentes)

Permite detectar proteínas nas células

Química

Histologia

Histologia

Técnicas de Microscopia Óptica

2) Campo Escuro1) Campo Claro 3) Contraste de Fases

4) Contraste Interferencial 5) Polarização 5) Fluorescência

Técnicas de Microscopia Eletrônica

1) Microscopia Eletrônica de Transmissão

2) Microscopia Eletrônica de Varredura

3) Microscopia Eletrônica de Tunelamento

Histologia

COLETA FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO INCLUSÃO MICROTOMIA COLORAÇÃO

Técnica Histológica

Conjunto de processos a que são submetidos os tecidos a fim de que possam ser observados significativa

e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou patológico.

CLIVAGEM DESCALCIFICAÇÃO

COLETA

FIXAÇÃO

PROCESSAMENTO

INCLUSÃO

MICROTOMIA

COLORAÇÃO

CLIVAGEM

DESCALCIFICAÇÃO

Histologia

ATIVIDADE PARA REALIZAR EM CASA

Navegar pelo site:www.histologyguide.com

Montar um portfólio com uma imagem de cada um dos diferentes corantes utilizados para

microscopia óptica encontrados e citar o tipo de coloração utilizada

Visualizar todas as imagens disponíveis no “SLIDE BOX”

Referências

Imagens e Conteúdo

Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap. 3), Fio Cruz.

Netter,FH; Ovalle, KW; Nahirney, PC. Bases da Histologia, 2ed, 2014.

Junqueira, LC; Carneiro, J. Histologia Básica, 13ed, 2018.

www.google.com

www.histologyguide.com

Obrigada!bellacolombini@usp.br

Profa. Dra. Bella Luna Colombini Ishikiriama