Post on 12-Dec-2018
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Declaração de Conflitos de Interesse
• Gestor de negócios – Diagnóstico Molecular
Diagnósticos da América S/A
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Diagnóstico MolecularDiagnóstico Molecular
• Discutir etapas e critérios necessários para garantir o controle de qualidade nos exames de Biologia Molecular.
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H I S T Ó R I C OH I S T Ó R I C O
•Diagnóstico Molecular: Critérios gerais ISO , PALC, CLSI, bulas e controles externos (PELM) – 2000 à 2003.
•Diagnóstico Molecular com certificação CAP: baseado em checklist específico –2003 até o momento.
•Diagnóstico Molecular com certificação CAP e checklist específico PALC – 2008.
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T E S T E S E M B I O L O G IA M O L E C U L ART E S T E S E M B I O L O G IA M O L E C U L AR
•Qualquer método que amplifique DNA/RNA independente da área.
•Todos os testes “home brew” (próprios).
•Mesmo se apenas 1 teste for realizado.
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DIAGNÓSTICO MOLECULARDIAGNÓSTICO MOLECULAR
Aplicação das técnicas de Biologia Molecular:
•Oncologia•Hematologia•Doenças infecciosas•Genética•Histocompatibilidade•Identificação humana
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G A R A N T I A D E Q U A L I D A D E
ASPECTOS GERAIS
•O Setor de Biologia Molecular deve ter um Programa de Garantia da Qualidade:Avaliação da qualidade analítica (CQE/CQI, PAC):
Análise critica.Limites de aceitabilidade. Critérios de avaliação.Indicadores.
•Programa de avaliação externa da qualidade.
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G A R A N T I A D E Q U A L I D A D E
ASPECTOS GERAIS - Definições• Controle Externo: usado para monitorar ou medir a exatidão de um sistema analítico. Ex: ensaios de proficiência = amostra clinica.
• Controle de reação: monitora o funcionamento de uma reação, detectando inibidores. Previne falso-negativos.
• Controle Interno: usado para monitorar estabilidade e precisão da reação.
Presentes nos ensaios qualitativos e quantitativos.
Positivo, alto e baixo, negativo, branco de reação.
Genética: heterozigoto, homozigotonormal e mutado.
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G A R A N T I A D E Q U A L I D A D E
ASPECTOS GERAIS
•Experiência ou especialização na área.
•Treinamento para os principiantes no setor e um programa de educação continuada para toda a equipe.
•Técnicos de nível superior.
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ROTINA DE TESTES COMERCIAIS
• Validação prévia e bem estabelecida.
• Registro FDA/Anvisa.
•Facilidade na importação.
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ROTINA DE TESTES PRÓPRIOS
Nos EUA...
•Os testes próprios são considerados“Reagentes analíto-específico” (ASR).
•Neste país existe uma legislação apropriada (que não é o caso do Brasil).
• É obrigado no laudo estar escrito que o teste foi desenvolvido, validado pelo laboratório e que o teste não foi aprovado pelo FDA.
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ROTINA DE TESTES PRÓPRIOS
•Descrição das etapas do processo.
•Especificação e sistemática de validação de insumos, reagentes e equipamentos.
•Sistemática de validação.
•Importação reagentes.
•Frase sugerida no laudo: Este teste foi desenvolvido e suas características avaliadas pelo (nome do laboratório).
No BRASIL...
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TESTES COMERCIAIS E PRÓPRIOS
Parâmetros comuns
•Testes de proficiência (CQE; PAC).
•Documentos sobre a validação do teste.
•Manuais de procedimento técnico.
•Documentação da Qualidade: análises e CQI.
•Manutenções e calibrações de equipamentos.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Validações de testes
Testes comerciais e próprios
•Análise critica e aprovação todas as validações dos métodos antes de serem implementados na rotina.
•Para os testes comerciais, o laboratório deve verificar as características de desempenho informadas pelos fabricantes.
•Modificações nos procedimentos recomendados pelo fabricante são permitidas desde que validadas.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Validações de testes
Testes comerciais e próprios
• Amostras representativas de todos os resultados (genótipos) possíveis e acessíveis.
• Número representativo de cada tipo de amostra que será analisada.
• Validação estatística (quantitativa/qualitativa) ou clínica.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Validações de testes
Testes próprios... Planejamento
•Estudos de validação e características de desempenho:
sensibilidade analítica e diagnóstica (clínica).
especificidade analítica e diagnóstica (clínica).
precisão.
linearidade (ensaios quantitativos).
faixa reportável de resultados de pacientes.
intervalo de referência.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Validações de testes próprios. Análise qualitativa
Definição dos valores de referência e interpretação dos resultados. Ex: detectado/não detectado; selvagem homozigoto; heterozigoto ou homozigoto mutante.
Quando os valores de referência dependerem da situação clínica, as diretrizes para a interpretação dos resultados de pacientes devem ser definidas e documentadas.Ex: Ca de tiróide (gene RET).
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GARANTIA DA QUALIDADE
Validações de testes próprios
. Análise quantitativa
definição de controles em níveis diferentes (negativo, positivo baixo e alto).
linearidade. Ex: cargas virais
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E P R É - A N A L Í T I C A
A documentação pré-analítica deve incluir, quando aplicável:•consentimento informado assinado pelo paciente ou responsável.•raça ou etnia.•heredograma.
Critérios documentados para a rejeição de amostras incluindo:•amostras mal identificadas.•material inadequado.•recipientes manipulados antes de darem entrada para os testes de biologia molecular.
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GARANTIA DE QUALIDADE
F A S E P R É - A N A L Í T I C A
•Alíquotas dos materiais: política para prevenir possíveis contaminações – recipiente primário.
•Processamento imediato das amostras ou conservação adequada para evitar degradação.
•Sistemática de comunicação ao requisitante caso a amostra seja inadequada.
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GARANTIA DA QUALIDADE
IDENTIFICAÇÃO HUMANA (PATERNIDADE)Comitê técnico
•Agendamento prévio.
•Local, data da coleta da amostra e Identificação do coletador da amostra.
•Cadastro completo dos participantes incluindo nome, etnia, parentesco.
•Termo de Consentimento assinado.
•História de transfusão nos últimos três meses e de transplante medula óssea em qualquer época.
•A identificação e informações da coleta devem ser conferidas pelos participantes do exame.
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GARANTIA DA QUALIDADE
IDENTIFICAÇÃO HUMANA (PATERNIDADE)Comitê técnico
•A qualidade da amostra deve ser avaliada, registrada no recebimento e mantidas com acesso limitado.
•Fluxo da Cadeia de custódia (coleta até recebimento do laudo).
•O laudo deve incluir um índice individual de paternidade (IP) para cada região estudada, um índice combinado (IPC), a probabilidade de paternidade percentual (PP) e a referência utilizada para cálculo da freqüência populacional.
•Dupla conferência especialmente nas exclusões.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Reagentes em geral,Primers e Sondas
Qualidade da água.Tamanho do fragmento esperado.Concentração do estoque.Conteúdo de bases CG.Sítios relevantes de enzimas de restrição.Temperatura de hibridização.Referencia na literatura e em caso de vírus, pesquisa de alinhamento com cepas divergentes.
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Alinhamento de algunssubtipos de HCV
ctagacgtcatcta6
ctaggcgtaaacta5
cc,tagacgca,c,gattta4
ctgggtgccgtccg3c
ctaggcgccgtccg3b
ctgggtgca,c,tg,atccg3a
taaagcatcatcta2b
taaggcgtcatcta2a/c
cc,taga,gcgtag,atcta1b
cc,tagacgtag,atcta1a
162158157156154153151150948281797245Genótipo
23a2b3a2b5433
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E A N A L Í T I C A
1
2
3
Extração de ácidos nucléicos
Amplificação
Detecção
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GARANTIA DA QUALIDADE
Extração
Os ácidos nucléicos devem ser extraídos e purificados por meio de métodos reportados na literatura ou validados pelo próprio laboratório.
Devem ser quantificados quando aplicável.
Para sistemas analíticos que tenham como alvo o RNA humano(ex: transcrição de genes), a integridade do RNA da amostra deve ser avaliada.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Ensaios de amplificação
Eliminar carreamento (“carryover”) e resultados falso-positivos por meio do uso de barreiras físicas para minimização de aerossóis.
Eficácia amplificação: controles de reação –falso-negativo.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Sistemas de detecção
1- Eletroforese em gel de agarose
Marcadores de peso molecular conhecido em intervalo compatível com o das bandas esperadas.
Quantidades padronizadas de ácido nucléico. Ex: ensaios com enzima de restrição.
Deve haver critérios objetivos para a interpretação dos resultados.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Sistemas de detecção
2- Sequenciamento automático de DNA ( eletroforese capilar)
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GARANTIA DA QUALIDADE
No sequenciamento...
. Os ensaios de seqüenciamento devem ser otimizados de forma a garantir a presença de sinal detectável em todo o comprimento da região alvo.
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. A detecção de seqüências variantes, especialmente aquelas em estado de heterozigose, devem ser comparadas com seqüências referências (NCBI –GenBank).
GARANTIA DA QUALIDADE
Seqüência referência Qualidade da seqüência
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Site de Interpretações de resultados - HIV
Escolher um método . Usar nomenclatura padrão para descrever as mutações e polimorfismos. Ex: sites
Escolher a região a ser analisada
Analisar mutações
http://hivdb.stanford.edu/index.html
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Site de Interpretações de resultados - HIV
HIVdb: Algorítimo de interpretação resistência genotípica SeqID: Date: 27-Aug-2007
Drug Resistance InterpretationNRTI Resistance Mutations:M41L, T215YNNRTI Resistance Mutations:NoneOther Mutations:None
Intermediate resistanceTDF
SusceptibleFTC
Intermediate resistanceDDI
Intermediate resistanceD4T
Intermediate resistanceAZT
Intermediate resistanceABC
Susceptible3TC
SusceptibleTMC125
SusceptibleNVP
SusceptibleEFV
SusceptibleDLV
http://hivdb.stanford.edu/index.html
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BANCO DE DADOS
"
•Utilizar banco de dados atualizado. Ex: Fibrose cística.
Name: 175insTNucleotide Change: insertion of T after 175Consequence: frameshiftExon happened: 1
•www.genet.sickkids.on.ca/cftr
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GARANTIA DA QUALIDADE
. Validação das seqüências
Critérios para validar e interpretar os dados do seqüenciamento (dados primários).
Seqüência das fitas “sense” e “anti-sense” em heterozigotos, alelos raros e combinações raras de alelos.
Confirmação periódica por fitas complementares quando utilizar somente uma seqüência para analise.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Sistemas de detecção3- PCR em tempo Real
Para testes quantitativos, os resultados do controle interno devem estar dentro do intervalo especificado e os controles positivos alto e baixo dentro da média e seu desvio padrão previamente estabelecido.
Para testes que geram resultados baseados em Tm, devem ser definidos e monitorados intervalos estreitos de temperatura (= +/- 2,5 ºC).
Lotes novos de todos os reagentes, controles e curvas padrão devem ser testados e validados.
Os sistemas multiplex devem ser otimizados para evitar perda da eficiência da amplificação (competição).
Validação de nova versão de softwares com controles conhecidos.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Sistemas de detecção
4. Ensaios tipo arranjo (Microarrays)
A integridade do DNA bem como sua marcação (sondas de hibridização) deve ser verificada e monitorada.
A qualidade dos arranjos deve ser verificada de acordo com as especificações do fabricante.
Para ensaios quantitativos (expressão gênica, cargas virais) deve ser usado níveis de controles para uma ou mais sondas e ainda um branco de reação a cada corrida.
Avaliação periódica nas funções do softwares.
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GARANTIA DA QUALIDADE
Sistemas de detecção
5. Hibridação in situ com fluorescência(FISH)Titulação sondas.
Validação de tecido e sondas controles para verificar a sensibilidade e especificidade do ensaio.
O resultado é interpretado levando em consideração a morfologia do tecido/célula.Verificação do microscópio/filtros.
Revisão lâminas (controles) para avaliar o sinal, o background e a morfologia.
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E P Ó S - A N A L Í T I C A
.Testes Qualitativos e quantitativos:
Testes qualitativos que usam um valor de ponto de corte (cutoff) para a distinção entre os resultados positivos e negativos, a rotina deve ser avaliada de acordo com os critérios preconizados pelo fornecedor ou validados pelo setor
Critérios para interpretação de resultados bem como desempenho de cada ensaio. Ex: avaliação padrão de bandas, linearidade e sensibilidade.
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E P Ó S - A N A L Í T I C A
. Testes Quantitativos:
Ter os métodos para o cálculo dos resultados e unidades descritos de maneira clara
A faixa de trabalho (Range) do ensaio deve ser definida e o desempenho deve ser monitorado a cada corrida com o uso de controles negativo e positivos baixo e alto. Monitoramento de rotina (calculo CV)
Para detecção de sinais quantitativos deve haver critérios para a realização e avaliação do(s) controle(s) de reação(ões), seja(m) ela(s) efetuada(s) pelo fabricante ou pelo laboratório.
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E P Ó S - A N A L Í T I C A
Detecção de falhas nas reações
•É importante monitorar para saber se algum problema está começando a acontecer no processo.
•Investigação da causa.
•Ação corretiva sem impacto ao cliente.
•Necessidade de nova amostra –comunicação imediata.
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GARANTIA DA QUALIDADE
F A S E P Ó S - A N A L Í T I C A
• Análise de consistência (correlatos clínicos).
• Devem ser gerados resultados preliminares, quando apropriado.
• Discrepâncias entre os achados da biologia molecular e a clínica ou outros achados de laboratório devem ser investigadas e documentadas, e devem ser tomadas ações corretivas quando indicadas.
• Estatísticas dos resultados de testes moleculares de maneira que permita o acompanhamento do desempenho analítico, a avaliação de tendências populacionais.
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GARANTIA DA QUALIDADE
LAUDOS
Protocolos para a liberação de laudos.
Informação suficiente para que a decisão clinica possa ser feita de forma apropriada:• Resultado com respectiva unidade
de medição.• Valores de referência.• Técnica usada/versão kit.• Gene estudado.• Achados não usuais com registro.• Retificação se pertinente.
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GARANTIA DA QUALIDADE
LAUDOS• Especialmente nos testes de genética molecular:
Informação interpretativa ou relevante no resultado da análise – ciência e revisão pelo especialista na área.
Confidencialidade.
Linguagem clara, estimativa da chance de detecção da mutação e o risco residual de ser portador de uma ou mais das mutações não testadas, quando aplicável (ex: fibrose cística, câncer de mama e ovário...).
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GARANTIA DA QUALIDADE
LAUDOS•Recomendações para que o paciente receba aconselhamento genético pré e pós-teste para implicações e esclarecimentos do resultado do teste.
• Discussão das limitações dos achados e das implicações clínicas da mutação detectada (ou do resultado negativo) com respeito à herança recessiva ou dominante, o risco de recorrência, a penetrância, a gravidade e estimativa de falso-positivo.
• Deve ser usada nomenclatura padrão internacionalpara designar genes e mutações. (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)
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GARANTIA DA QUALIDADE
REGISTROS - RASTREABILIDADE
Amostras (boa qualidade) devem ser guardadas por um período de tempo que permita a solicitação de um novo teste.Lote.Laudos.dados brutos.Membranas.auto-radiografiasfotografias de géislâminas de hibridização in situ
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GARANTIA DA QUALIDADE
EQUIPAMENTOS
• Plano de manutenção preventiva em comum acordo com o fornecedor.
• Termocicladores: verificação periódica da temperatura dos poços individuais ou de uma amostra significativa deles.
•Luminômetros, densitômetros: os níveis aceitáveis de contagem de fundo devem ser medidos e registrados a cada dia ou a cada uso.
•Inter-equipamentos: garantir a reprodutibilidade.
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GARANTIA DA QUALIDADE
EQUIPAMENTOS
•Processadores de filmes fotográficos:Manutenção adequada das fontes de luz
UV protegidas por barreiras.
•Espectrofotômetros:checagem periódica dos filtros.
Calibração regular da leitura dos comprimentos de onda de acordo com as instruções do fabricante.
Curvas de calibração, elas devem ser repetidas ou verificadas regularmente.
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GARANTIA DA QUALIDADE
EQUIPAMENTOS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL (EPI)
. Obrigatoriedade do uso de luvas, óculos de segurança, máscara, avental, etc...
. Devem ser tomadas medidas de proteção (EPC ou EPI) para prevenir os riscos causados por líquidos voláteis. Ex: cabine de biossegurança certificada pelo menos anualmente, capelas exaustão.
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GARANTIA DA QUALIDADE
CONTAMINAÇÃOSistemática para prevenção de
contaminação das amostras pelo operador:
Utilização de cabines de PCR•Fluxo unidirecional•Áreas pré e pós-amplificação
Plano de descontaminação para previnircontaminação do sistema analítico: ribonucleases, produto de PCR.
Licença CNEN para manipulação e descarte devem ser atendidas e o laboratório ter um plano PGRSS
Plano de descarte para brometo de etídeo
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DIFICULDADES NO CONTROLE DA QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR
Testes oferecidos pelo CAP- Alto custo- Dificuldades na importação:
. Falta de registro do controle.
. Condições inadequadas devido à problemas na alfândega (classificação de itens -NCM).
. Análise crítica: documentação e ações corretivas.
. Inexistência de programa alternativo de controles (todos analítos devem ser contemplados).
1. O laboratório não participa de um programa externo de qualidade (CAP/PALC).
2. Testes de Proficiência:
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DIFICULDADES NA GARANTIA DE QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR
Ensaios com e sem proficiência pelo CAP e PELM
Adenovirus
Dengue
Herpes 6
HTLV 1-2
Parvovírus
Identificação de bactérias
Programa alternativo
de controle
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DIFICULDADES NA GARANTIA DE QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR
Validação de ensaio de testes in house:• Falta de legislação apropriada no
Brasil como nos EUA para a aprovação de novos testes.
• Dificuldade de obtenção de painel de amostras estáveis conforme solicitação do PALC/CAP.
3. Validações
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DIFICULDADES NA GARANTIA DE QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR
4. Pessoal
• Não existe certificado de “Patologia Molecular” no Brasil.
• Os profissionais que trabalham com Biologia molecular, em geral, vieram de laboratórios de pesquisa onde as normas de qualidade não são sistematizadas como em um laboratório clínico.
• Necessidade de treinamento específico na área, no CAP e PALC.
• Treinamento inspetores/auditores.
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DIFICULDADES NA GARANTIA DE QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR
5. Espaço físico
•Equipamentos
•Trabalho técnico
•Análise