Post on 12-Feb-2019
FUNDAO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS GONALO MONIZ
Curso de Ps-Graduao em Biotecnologia em Sade e
Medicina Investigativa
TESE DE DOUTORADO
CONTRIBUIO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA
VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
NAIARA CARVALHO TEIXEIRA BAGUES
Salvador- Bahia
2016
FUNDAO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS GONALO MONIZ
Curso de Ps-Graduao em Biotecnologia em Sade e
Medicina Investigativa
CONTRIBUIO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA
VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
NAIARA CARVALHO TEIXEIRA BAGUES
Orientador: Geraldo Gileno de S Oliveira.
Co-orientadora: Cristiane Garboggini M. de Pinheiro.
Tese apresentada ao Curso de Ps-
Graduao em Biotecnologia em Sade e
Medicina Investigativa, para a obteno
do grau de Doutora.
Salvador- Bahia
2016
Ficha Catalogrfica elaborada pela Biblioteca do
Centro de Pesquisas Gonalo Moniz / FIOCRUZ - Salvador - Bahia.
Bagues, Naiara Carvalho Teixeira
B148c Contribuio para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose
visceral canina. / Naiara Carvalho Teixeira Bagues. - 2016.
98 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Gileno de S Oliveira, Laboratrio de
Patologia e Biointerveno.
Tese (Doutorado em Biotecnologia em Sade e Medicina Investigativa)
Fundao Oswaldo Cruz, Instituto de Pesquisas Gonalo Moniz, 2016.
1. Leishmaniose visceral. 2. Bao. 3. Vacina. 4. Carga parasitria. 5. Co.
I. Ttulo.
CDU 616.993.161
DEDICATRIA
Dedico a meu Pai Joaquim Lopes Teixeira (in memoriam)
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Dr. Geraldo Gileno e Dra. Cristiane Pinheiro pelo apoio e
incentivo durante todo o desenvolvimento do doutorado. Agradeo pela convivncia,
confiana e sugestes preciosas na elaborao do trabalho.
Aos pesquisadores Dr. Washington Luis, Dr. Lain Pontes-de-Carvalho, Dra. Patrcia
Veras e Dra. Deborah Fraga pelas colaboraes e sugestes dadas.
Ao CPQGM (Centro de Pesquisas Gonalo Moniz) e a PgBSMI (Ps-Graduao em
Biotecnologia em sade e Medicina Investigativa) pela infraestrutura disponibilizada para o
desenvolvimento do estudo.
A CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior) e ao
Programa Brasil Sem Misria pelo financiamento do projeto e pela bolsa de estudo concedida
durante a execuo deste trabalho.
Elivani Sacramento,tcnica e amiga do LPBI, pelos auxlios em experimentao
sempre que necessrio.
Aos tcnicos Srgio, Liliane e Rafela pelo apoio em suas respectivas reas de servio.
s bibliotecrias do CPqGM, pelas orientaes na elaborao da verso final desta
tese.
A todos os amigos do LPBI e em especial aos amigos do grupo Brbara Oliveira,
Catiule Santos, Jssica Mariane, Marcus Vincius, Maria Carolina e Matheus Moreno pelo
incentivo, conselho e carinho sempre que necessrio.
Ao meu marido Thiago Bagues pelo amor e companheirismo dedicados a mim ao
longo de todos esses anos.
A minha me e meus irmos por cada gesto de amor e incentivo ao longo de toda a
minha vida.
BAGUES, Naiara Carvalho Teixeira. Contribuio para o desenvolvimento de uma vacina
contra leishmaniose visceral canina. 98 f. il. Tese (Doutorado) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto de Pesquisas Gonalo Moniz, Salvador, 2016.
RESUMO
INTRODUO: A Leishmaniose visceral (LV) uma doena infecciosa e parasitria
que se encontra em expanso no Brasil. A espcie que causa a doena no Brasil a
Leishmania infantum. O co o principal reservatrio do parasita. Uma vacina contra
leishmaniose visceral canina (LVC) pode favorecer o controle da doena. Este trabalho tem
como objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma vacina contra LVC.
OBJETIVO: O estudo do primeiro captulo visou o desenvolvimento de um modelo
para a avaliao de antgenos candidatos vacina contra LVC. METODOLOGIA: Um
experimento foi realizado para obteno de ces resistentes a LVC. Os linfcitos dos animais
deveriam ser capazes de reconhecer antgenos potencialmente teis para o desenvolvimento
de uma vacina. Para isso, uma cepa de L.infantum foi isolada de co naturalmente infectado e
doente (Camaari, Bahia). Seis ces adultos e sadios foram inoculados com 1x108
formas
promastigotas em fase estacionria de cultura por via drmica e acompanhados por dois anos.
RESULTADOS: Os animais apresentaram: 1) rea de indurao e ulcerao rasa no local da
inoculao do parasita com cura espontnea em um perodo inferior a trs meses, 2) ausncia
de manifestaes clnicas e de alteraes hematolgicas e bioqumicas sricas, 3) produo
baixa e flutuante de anticorpos da classe IgG reativos a antgenos de Leishmania, 4) resposta
linfoproliferativa (em 4 de 6 ces) frente a estimulao com antgenos de Leishmania, 5)
produo baixa de IFN- em um ensaio realizado com sangue total incubado por 24h com
antgenos de Leishmania (4 de 5 ces), 6) carga parasitria baixa em aspirado de bao,
detectada por PCR em tempo real. CONCLUSO: Os animais desenvolveram uma forma
subclnica da infeco ao lado de resposta imune humoral e celular fracas.
OBJETIVO: No segundo captulo foi testado um ensaio de avaliao da produo de
citocinas por clulas de sangue de ces naturalmente infectados por Leishmania infantum. O
quantiFERON modificado permite a avaliao in vitro e de maneira rpida da produo de
citocinas contra Leishmania em animais de rea endmica. METODOLOGIA: Antgeno
solvel e antgenos recombinantes de L. infantum (rLci2-NT-5R-CT e rLci2-NT-CT) foram
produzidos e utilizados no ensaio para a estimulao do sangue total de27 ces de rea
endmica e no endmica para LVC por 24h. O plasma foi coletado e a produo das
citocinas caninas IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- foram quantificadas. RESULTADO:
Devido a problemas tcnicos no foi possvel avaliar os dados obtidos e, consequentemente,
no foi possvel caracterizar grupos de animais susceptveis e resistentes.
OBJETIVO: No terceiro captulo, a carga parasitria e aspectos histolgicos em
diferentes regies do bao de ces com LVC foi analisada. METODOLOGIA: A carga
parasitria e alteraes histolgicas no bao de 6 ces com LVC foram avaliados por
amostragem de trs seces inferior, mdia e superior do rgo. RESULTADO: Observou-se
uma variao na distribuio na carga parasitria do bao do mesmo animal. Avaliaes
histolgicas (desorganizao polpa branca, granulomas, periesplenite, clulas plasmticas, e
infiltrao polimorfonuclear) mostraram uma variao na freqncia (granulomas) ou
intensidade (perisplenite) no bao de 2 dos 6 ces. CONCLUSO: Conclui-se que a
distribuio da carga parasitria e as alteraes histolgicas no bao de ces com LV mostram
um certo grau de heterogeneidade.
Palavras-chave: Co, Leishmaniose visceral, Bao, Resposta imune, Carga parasitria,
Vacina
BAGUES, Naiara Carvalho Teixeira. Contribution to the development of a vaccine against
canine visceral leishmaniasis. 98f. il. Tese (Doutorado) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto
de Pesquisas Gonalo Moniz, Salvador, 2016.
ABSTRACT
INTRODUCTION: Visceral Leishmaniasis (VL) is an infectious parasitic disease
which is increasing in Brazil. The species that causes the disease in Brazil is
Leishmaniainfantum. The dog is the main reservoir of the parasite. A canine visceral
leishmaniasis vaccine (CVL) may favor the control of the disease. This paper aims to
contribute to the development of a vaccine against CVL.
OBJECTIVE: The first chapter study aimed the development of a model for the
evaluation of candidate antigens for a vaccine against CVL. An experiment was conducted to
obtain resistant dogs to CVL. Lymphocytes of these animals should be able to recognize
potentially useful antigens for a vaccine development. METHODOLOGY: For this, a strain
of L. infantum was isolated from naturally infected and sick dog (Camaari, Bahia). Six dogs
and healthy adults were intradermally inoculated with 1 x 108 promastigotes in the stationary
phase culture and were followed for two years. RESULTS: The animals showed: 1)
induration area and shallow ulceration in parasite inoculation site with spontaneous healing in
a period of less than three months, 2) absence of clinical symptoms and hematological and
biochemical changes, 3) low and floating production of antibodies IgG reactive to Leishmania
antigens, 4) lymphoproliferative response (in 4 of 6 dogs) compared to stimulation with
leishmanial antigens, 5) low IFN- in a test performed on whole blood incubated for 24 h with
antigen Leishmania (4 of 5 dogs), 6) a low parasite load in spleen aspirates, detected by real-
time PCR. CONCLUSION: These animals developed a subclinical form of the infection
alongside with a weakspecific humoral and cellular immune response and weak cell.
OBJECTIVE: The second section was tested in a trial evaluating cytokine production
by blood cells of dogs naturally infected with Leishmaniainfantum. The modified
QuantiFERON allows evaluation both in vitro and quickly production of cytokines against
Leishmania in animals in an endemic area. METHODOLOGY: Soluble antigen and
recombinant antigens of L. infantum (rLci2-5R-NT-CT and rLci2-NT-CT) were produced and
used in the assay for the stimulation of whole blood of 27 animals from endemic and non-
endemic area for LVC for 24h. Plasma was collected and cytokine production of canine IFN-
, IL-2, IL-6, IL-10 and TNF- cytokines were quantified. RESULTS: Due to technical
some problems, it was not possible to characterize groups of animals susceptible and resistant
in relation to modified QuantiFERON assay results.
OBJECTIVE: In the third chapter, the parasite load and histological aspects in
different regions of the spleen of dogs with CVL were analyzed. METHODOLOGY: The
parasite load and histological changes in the spleen of 6 dogs with CVL were evaluated by
sampling three sections of the spleen (lower, middle and upper section of the organ).
RESULTS: There was a variation in parasitic load distribution in the spleen of the same
animal. Histological evaluations (disorganized white pulp, granulomas, periesplenite, plasma
cells, and polymorphonuclear infiltration) showed a variation in the frequency (granulomas)
or intensity (perisplenite) in spleen in 2 of 6 dogs. CONCLUSION: Therefore, the
distribution of the parasitic load and histological changes in dogs spleen with VL show a
certain degree of heterogeneity.
Keywords: Dog, Visceral leishmaniasis, Spleen, Immune response, Parasite load, Vaccine
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitria em ces de rea
endmica para leishmaniose visceral submetidos a ensaio de
quantiFERON modificado...........................................................................
64
Tabela 2 Caracterizao clnica e imunolgica de ces com leishmaniose visceral
avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica....................
78
Tabela 3 Achados histolgicos no bao de ces com leishmaniose visceral
avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica....................
80
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Acompanhamento de ces inoculados com Leishmania por via drmica
quanto a resposta humoral e celular, produo de IFN-, IL-2, IL-10 e
TNF- e carga parasitria esplnica...........................................................
26
Figura 2 Esfregao de material aspirado de bao de co de rea endmica
submetido a colorao pelo mtodo de Wright .........................................
35
Figura 3 Curva de proliferao de Leishmania isolada do co de rea endmica.... 36
Figura 4 Leso cutnea no local da inoculao experimental da Leishmania em
ces..............................................................................................................
37
Figura 5 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania por via
drmica........................................................................................................
39
Figura 6 Avaliao de anticorpos especficos em ces inoculados com
Leishmania por via drmica........................................................................
41
Figura 7 Avaliao da proliferao celular de PBMC ces inoculados com
Leishmania por via drmica........................................................................
43
Figura 8 Avaliao de IFN-, IL-2, IL-10 e TNF- em ces inoculados com
Leishmania por via drmica........................................................................
46
Figura 9 Determinao da carga parasitria no baco de ces inoculados com
Leishmania por via drmica........................................................................
47
Figura 10 Desenho esquemtico de antgenos recombinantes de Leishmania
derivados de cinesina .................................................................................
58
Figura 11 Avaliao por SDS-PAGE e Western blot de antgenos recombinantes
de Leishmania derivados de cinesina purificado........................................
66
Figura 12 Avaliao de IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- em ces de rea
endmica e em ces de rea no endmica para Leishmaniose visceral
canina..........................................................................................................
68
Figura 13 Desenho esquemtico do bao de co indicando as reas das quais foram
obtidas amostras para estudo histolgico e determinao da carga
parasitria ...................................................................................................
75
Figura 14 Carga parasitria em diferentes regies do bao de ces com
leishmaniose visceral .................................................................................
79
Figura 15 Achados histolgicos do bao de ces com leishmaniose visceral
avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica...................
81
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase BCIP 5-bromo 4-cloro 3-indolil fosfato BSA Soro albumina bovina CCZ Centro de Controle de Zoonoses cDNA cido desoxirribonucleico complementar CEUA Comit de tica para o Uso de Animais CFSE Carboxifluorsceina succinimidil ster CMNSP Clulas mononucleares de sangue perifrico Con A Concanavalina A cpm Cintilao de partculas betas por minuto DO Densidade ptica DMSO Dimetilsufxido DNA cido desoxirribonucleico DPP Ensaio imunocromatogrfico baseado em plataforma de duplo percurso DTH Reao de hipersensibilidade tardia EDTA cido etilenodiamino tetra-actico ELISA Ensaio imunoenzimtico EU Unidade de medida de endotoxina FML Fucose-Manose-Ligantes GM-CSF Fator estimulador de colnias de granulcitos e moncitos His Histidina IFAT Teste de imunofluorescncia indireta IFN- Interferon gama Ig Imunoglobulina IL Interleucina IPTG Isopropil--D-thiogalactosdeo LB Luria Bertani LPS Lipopolissacardeo LV Leishmaniose Visceral LVC Leishmaniose visceral canina MAPA Ministrio da Agricultura e Pecuria e Abastecimento MS Ministrio da Sade NBT Nitroazultetrazlio-dimetil formamida NK Natural killer PBMC Clulas mononucleares de sangue perifrico PBS Tampo fosfato tamponado com salina PCR Reao em cadeia da polimerase PHA Fito-hemaglutinina RIFI Ensaio de imunofluorescncia indireta RNA cido ribonucleico Rpm Rotaes por minuto SBF Soro Bovino Fetal SDS Dodecil sulfato e sdio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS SLA Antgeno solvel de Leishmania SRD Sem raa definida TAE Tris-acetato-EDTA Th Linfcitos T auxiliares TMB Tetrametilbenzidina TNF- Fator de necrose tumoral alfa TNF- Fator de necrose tumoral beta
SUMRIO
1 REVISO DE LITERATURA .................................................................................... 13
1.1 Aspectos gerais sobre a leishmaniose visceral ................................................................ 13
1.2 Diagnstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC).................................................... 14
1.3 Aspectos gerais da imunidade contra Leishmania infantum ........................................... 16
1.4 Estratgias utilizadas para o desenvolvimento de vacinas .............................................. 17
2 OBJETIVOS DO TRABALHO ................................................................................... 20
2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 20
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .......................................................................................... 20
3 DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO PARA AVALIAR ANTGENOS
CANDIDATOS A VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
...................................................................................................................................... 21
3.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 22
3.2 MATERIAL E MTODOS ........................................................................................... 24
3.2.1 Isolamento, caracterizao e obteno do inculo de Leishmania ................................ 24
3.2.2 Animais .......................................................................................................................... 25
3.2.3 Inoculao intradrmica com L. infantum ..................................................................... 25
3.2.4 Acompanhamento clnico dos ces................................................................................ 26
3.2.5 Avaliao clnico-patolgica ......................................................................................... 26
3.2.6 Coleta de sangue perifrico ........................................................................................... 27
3.2.7 Obteno de soro ........................................................................................................... 28
3.2.8 Obteno de clulas mononucleares de sangue perifrico ............................................ 28
3.2.9. Preparao de antgenos de Leishmania ........................................................................ 29
3.2.10 Resposta imune humoral ............................................................................................... 29
3.2.11 Resposta imune celular .................................................................................................. 30
3.2.12 Mensurao de citocinas ................................................................................................ 31
3.2.13 Avaliao da carga parasitria por PCR em tempo real e cultura ................................. 34
3.2.14 Anlise estatstica .......................................................................................................... 35
3.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 36
3.3.1 Isolamento, caracterizao e preparao do inculo de Leishmania para injeo
intradrmica em ces .................................................................................................... 36
3.3.2 Avaliao clnica de ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica ......... 37
3.3.3 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania infantum por via
drmica ......................................................................................................................... 39
3.3.4 Produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania infantum por
via drmica .................................................................................................................... 41
3.3.5 Resposta linfoproliferativa em ces inoculados com Leishmania infantum por via
drmica ......................................................................................................................... 42
3.3.6 Produo de citocinas em ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica . 44
3.3.7 Carga parasitria no baco de ces inoculados com Leishmania infantum por via
drmica ......................................................................................................................... 47
3.4 DISCUSSO ................................................................................................................. 49
3.5 CONCLUSO ............................................................................................................... 52
4 AVALIAO DE CITOCINAS PRODUZIDAS POR CLULAS DE SANGUE
PERIFRICO DE CES DE REA ENDMICA PARA LEISHMANIOSE
VISCERAL .................................................................................................................. 53
4.1 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................... 54
4.2 MATERIAL E MTODOS .......................................................................................... 56
4.2.1 Animais ......................................................................................................................... 56
4.2.2 Avaliao dos ces........................................................................................................ 56
4.2.3 Coleta de sangue perifrico .......................................................................................... 57
4.2.4 Antgenos e mitgenos .................................................................................................. 57
4.2.4.1 Antgeno solvel de Leishmania infantum .................................................................... 57
4.2.4.2 Antgeno recombinante de Leishmania infantum ......................................................... 57
4.2.5 Avaliao das protenas recombinantes por SDS-PAGE e Western Blot ........................ 61
4.2.6 Mensurao de citocinas: IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- .......................................... 62
4.2.7 Anlise estatstica ............................................................................................................ 63
4.3 RESULTADOS ............................................................................................................... 64
4.3.1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitria dos animais de rea endmica para
leishmaniose visceral .................................................................................................... 64
4.3.2 Produo de citocinas por clulas de sangue perifrico de ces de rea endmica para
leishmaniose visceral aps a estimulao com antgenos de Leishmania .................... 66
4.4 DISCUSSO ................................................................................................................. 70
4.5 CONCLUSO ................................................................................................................ 71
5. ESTUDO DA CARGA PARASITRIA E ASPECTOS HISTOLGICOS EM
DIFERENTES REGIES DO BAO DE CES COM LEISHMANIOSE
VISCERAL. ................................................................................................................. 72
5.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 73
5. 2 MATERIAIS MTODOS .............................................................................................. 75
5.2.1 Animais ........................................................................................................................... 75
5.2.2 Coleta de amostras de bao ............................................................................................ 75
5.2.3 Processamento histolgico ............................................................................................. 76
5.2.4 PCR em tempo real ......................................................................................................... 76
5.2.5 Declaraes ticas........................................................................................................... 77
5.2.6 Anlise estatstica ........................................................................................................... 77
5.3 RESULTADOS ............................................................................................................... 78
5.3.1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitolgica dos ces estudados. ..................... 78
5.3.2 Avaliao da carga parasitria em diferentes regies do bao de ces com leishmaniose
visceral .......................................................................................................................... 79
5.3.3 Anlise histolgica de diferentes regies do bao de ces com leishmaniose visceral ... 81
5.4 DISCUSSO ................................................................................................................... 83
5.5 CONCLUSO ................................................................................................................. 85
6 CONSIDERAES FINAIS E PERSPECTIVAS ...................................................... 86
REFERNCIAS ............................................................................................................. 88
ANEXOS .......................................................................................................................... 97
13
1 REVISO DE LITERATURA
1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A LEISHMANIOSE VISCERAL
A leishmaniose visceral (LV) endmica em mais de 80 pases e sua prevalncia
excede 12 milhes de casos no mundo. A cada ano, aproximadamente 500 mil casos de LV
ocorrem no mundo, 90% dos casos ocorrem na ndia, Sudo, Sudo do Sul, Nepal,
Bangladesh, Etipia e Brasil (ALVAR et al., 2012; SUNDAR, 2001). Epidemias recorrentes
de LV ocorrem na frica Oriental (Etipia, Qunia, Sudo do Sul e Sudo) causando altos
ndices de morbi-mortalidade nas comunidades afetadas(WHO, 2010).
A LV uma doena parasitria que se encontra em expanso no Brasil (BRASIL,
2014). uma zoonose que pode acometer tanto o homem, quanto o co. O co (Canis
familiaris) parece ser o principal reservatrio do agente causal (CORREDOR, 1989; DEANE
e DEANE, 1954). No Brasil, no perodo de 2003 a 2012, a mdia anual de casos de LV foi de
3.565 casos e a incidncia de 1,9 caso/ 100.000 habitantes e quando no tratado, o indivduo
pode evoluir para o bito em mais de 90% dos casos.(BRASIL, 2014)
A LV causada, na maioria das vezes, por uma das espcies de protozorios do
complexo Leishmania donovani, composto pela Leishmania donovani, Leishmania infantum e
Leishmania chagasi (LAINSON; RYAN; SHAW, 1987). No Novo Mundo, a Leishmanisose
visceral (LV) causada por Leishmania chagasi, idntica Leishmania
infantum(MAURCIO; STOTHARD; MILES, 2000). A L. donovani a espcie causadora da
doena no subcontinente indiano, em partes da sia e na frica, enquanto que, a L. infantum
causa uma zoonose na Bacia Mediterrnea, na regio central e no sudoeste da sia e da
Amrica do Sul (DESJEUX, 2001; MAURICIO et al., 1999)
Protozorios do gnero Leishmania possuem um ciclo heteroxnico, sendo necessrio
um hospedeiro invertebrado e outro vertebrado para completarem seu ciclo de vida. A
Leishmania transmitida pela picada de fmeas de dpteros da famlia Psychodidae e
subfamlia Phebotominae (flebotomneos), sendo Lutzomyialongipalpis a principal espcie
transmissora da Leishmaniainfantum no Brasil (LAINSON et al., 1977). O parasito pode ser
adquirido pelo inseto durante a realizao do repasto sanguneo em um hospedeiro vertebrado
infectado, que na forma zoontica da leishmaniose visceral pode ser o co. No tubo digestivo
do flebtomo, o protozorio se transforma em formas promastigotas, a passa por um processo
de multiplicao e mudanas bioqumicas, resultando em formas infectivas chamadas
14
promastigotas metacclicas (RITTIG; BOGDAN, 2000). Quando o inseto vetor infectado
realiza um novo repasto sanguneo, promastigotas metacclicas podem ser inoculadas em um
novo hospedeiro vertebrado, que pode ser o homem ou o co. Aps serem fagocitados por
macrfagos, essas formas se transformam em amastigotas dentro de fagolisosomas, onde
ocorre a multiplicao. A partir da os parasitos podem disseminar-se para rgos ricos em
clulas do sistema fagoctico mononuclear, como por exemplo, bao, fgado, medula ssea e
linfonodos (HANDMAN, 2001).
Tanto o homem quanto o co, podem desenvolver desde um quadro de infeco
assintomtico at uma doena grave potencialmente letal aps terem sido inoculados com L.
infantum pelo inseto vetor (BRASIL, 2014). Quando ocorre o desenvolvimento da doena, as
manifestaes clnicas e alteraes anatomopatolgicas, clinico-patolgicas e imunolgicas
apresentadas so semelhantes no homem e no co (BRASIL, 2014). Aps um perodo de
incubao, alguns ces com doena progressiva podem desenvolver linfoadenopatia,
dermatite, onicogrifose, perda de peso, caquexia, conjuntivite, elevada resposta de anticorpos
e uma baixa resposta mediada por clulas do sistema imune entre outros (SEMIAO-SANTOS
et al., 1995).
As medidas para o controle da leishmaniose visceral preconizadas pelo Ministrio da
Sade so: 1) diagnstico precoce e tratamento adequado de casos da doena em humanos; 2)
eliminao de ces infectados; 3) utilizao de inseticida no domiclio e peri-domiclio em
reas endmicas para combate ao inseto vetor; 4) atividades em educao em sade (BRASIL,
2014). Portanto, as medidas recomendadas incluem diagnstico e tratamento de casos
humanos, controle do inseto vetor e eliminao de ces soropositivos (DESJEUX, 2004). No
entanto, a eliminao dos ces soropositivos pode ser dada tardiamente,isso ocorre, em parte,
porque tais medidas aplicadas pelo Sistema de Sade so de difcil execuo e de alto custo
para serem mantidas de forma sistemtica e por longos prazos (COURTENAY et al., 2002), o
que implicaria em um maior investimento por parte do governo e, alm disso, nem todos os
ces infectados apresentam-se sintomticos, mascarando a doena. Ou seja, uma parcela
apresenta manifestaes clnicas compatveis com a doena e outra parcela no revela
manifestaes clnicas (assintomticos) (MORENO; ALVAR, 2002).
1.2 DIAGNSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA (LVC)
Ces desempenham papel fundamental na epidemiologia da leishmaniose visceral,
sendo considerados os principais reservatrios para a doena humana. Os parasitas se alojam
15
em rgos linfides perifricos e o bao o rgo que se destaca na filtrao do sangue
corpreo (STEINIGER; RTTINGER; BARTH, 2003) e consequentemente no
armazenamento de altas densidades do parasito (REIS et al., 2006). O diagnstico
parasitolgico feito pelo encontro de formas amastigotas do parasito em material biolgico
obtido de medula ssea, linfonodo ou do bao uma tcnica muito confivel. E a deteco
precoce de ces infectados em rea endmica importante para minimizar a expanso da
doena e faz parte das medidas preconizadas pelo Ministrio da Sade (MS) para o controle
da LV (BRASIL, 2014).
Atualmente existem diferentes testes que podem ser usados para diagnsticos. Os
parasitolgicos visam a deteco do parasito em esfregaos e imprints, alm do isolamento
do parasita em cultura; os testes imunolgicos utilizam mtodos sorolgicos (deteco de
anticorpos anti-Leishmania ex.: ensaio de imunofluorescncia indireta (RIFI) e ELISA)
(BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C, 2006; DOS-SANTOS et al., 2008) e a amplificao
do DNA do parasita por PCR (REIS et al., 2013; SOLC et al., 2012).
Cada teste apresenta seus pontos positivos, mas tambm os negativos. Apesar de
existir uma grande variedade de tcnicas, nenhuma apresenta 100% de sensibilidade e
especificidade (GONTIJO; MELO, 2004). Por vezes ces assintomticos podem produzir
resultados falso-negativos(ALMEIDA et al., 2005; BRASIL, 2014) ou at mesmo ocorrer
reao cruzada com outros parasitas e outras espcies de Leishmania (FERREIRA et al.,
2007; SCHULZ et al., 2003).
O Ministrio da sade atualmente indica para o diagnstico imunolgico para a
pesquisa de anticorpos contra Leishmania, o ensaio deimunofluorescncia indireta (RIFI),
testes rpidos imunocromatogrficos e o ensaio imunoenzimtico (ELISA). Para o RIFI,
consideram-se como positivas as amostras reagentes a partir da diluio de 1:80. Nos ensaios
imunocromatogrficosso considerados positivos quando a linha controle e a linha teste
aparecem na fita ou plataforma. J o ELISA no est disponvel na rede pblica de sade, no
entanto, algumas unidades de sade da rede privada utilizam kits de ELISA registrados e
comercializados no Brasil. (BRASIL, 2014)
Estudos que utilizaram as tcnicas de biologia molecular (ex.: reao em cadeia da
polimerase em tempo real) descrevem alta sensibilidade e especificidade (MIR et al., 2008;
SOLANO-GALLEGO et al., 2001; SOLC et al., 2012).
Diversos autores sugerem a associao entre os parmetros clnicos, epidemiolgicos,
parasitolgicos e sorolgicos como necessrios para o diagnstico definitivo da leishmaniose
visceral canina. Dos-Santos relata que utilizao associada de parmetros parasitolgicos e
16
imunolgicos podem melhorar o desempenho e predio da susceptibilidade a LVC (DOS-
SANTOS et al., 2008)
1.3 ASPECTOS GERAIS DA IMUNIDADE CONTRA LEISHMANIA INFANTUM
Ainda no so completamente compreendidos os fatores que predispem ao
desenvolvimento da forma clnica polissintomtica ou que promovem o controle, mesmo que
temporrio, da infeco por L. infantum no co. No entanto, estudos tem demonstrado que a
resposta imune no homem e no co envolvida no reconhecimento e controle de infeces por
patgenos intracelulares, incluindo a infeco causada por L. infantum, dependente de
linfcitos T especficos com diferenciao Th1 (clulas T CD4+ e T CD8+) e do
estabelecimento de linfcitos T de memria (PINELLI, 1995; KAYE et al., 2004a; PINELLI
et al., 1994a).
Linfcitos do tipo Th1 so capazes de produzir diversas citocinas (exemplo: IFN-,
IL-2, IL-3, fator estimulador de colnias de macrfagos e granulcitos (GM-CSF) e fator de
necrose tumoral alfa (TNF-)) e so responsveis pela imunidade celular, por reaes
inflamatrias, e auxlio de linfcitos B para a produo de anticorpos da subclasse IgG2a. Por
outro lado, os linfcitos do tipo Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e so responsveis
pela imunidade humoral, reaes alrgicas e estmulo de linfcitos B para a produo,
predominantemente, de anticorpos da subclasse IgM, IgA e IgG1 (MOSMANN; COFFMAN,
1989)
Ces com doena sintomtica podem apresentar febre, anemia, leses de pele,
onicogrifose, emagrecimento, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatias, entre outros sinais da
doena (MORENO; ALVAR, 2002). Estudos demonstram que a susceptibilidade est
correlacionada com ausncia da resposta linfoproliferativa e ausncia da produo de
citocinas como IFN- e IL-2 (PINELLI et al., 1994; RHALEM et al., 1999) e produo de IL-
10 que capaz de suprimir a atividade de clulas apresentadoras de antgenos e linfcitos T
(BACELLAR et al., 2000).A parcela de ces que no apresentam manifestaes clnicas,
provavelmente, composta por um subgrupo de animais resistentes, que controlaro a
infeco. Embora no existam evidncias diretas de todas as etapas do processo de induo de
resposta imune Th1 contra a L. infantum no homem, no co e at mesmo no modelo murino, o
cenrio geral parece ser o descrito a seguir. Clulas apresentadoras de antgeno, incluindo
clulas dendrticas, capturam os microrganismos invasores, ou fragmentos desses
microrganismos, na pele e migram para regio T de linfonodo de drenagem (RIBEIRO-
17
GOMES; SACKS, 2012; THALHOFER et al., 2011). Clulas dendrticas que amadurecem
em condies de estimulao intensa desenvolvem a capacidade de expressar molculas
coestimulatrias e produzir IL-12 (LANGENKAMP et al., 2000). No linfonodo, aps
processamento de antgenos do protozorio, clulas dendrticas que expressam peptdeos da
Leishmania acoplados a molculas do complexo principal de histocompatibilidade (classe I e
classe II), molculas coestimulatrias como (por exemplo, CD80 e CD86) (PINELLI et al.,
1999)e produzem IL-12 (KAYE et al., 2004) so capazes estimular a proliferao e a
diferenciao de linfcitos T nave em linfcitos T efetores (T CD4+ e T CD8+) Th1. Com a
diferenciao, as clulas T CD4+ Th1 produzem IFN- e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa
nos tecidos afetados pela infeco e essas citocinas ativam mecanismos leishmanicidas
(incluindo a produo de xido ntrico, H2O2 e on superxido) em macrfagos infectados
pelo protozorio (KAYE et al., 2004; MURRAY; CARTELLI, 1983). Alm disso, linfcitos
T CD8+ tambm podem produzir IFN- ou exercer atividade citotxica sobre clulas
infectadas pela Leishmania (TSAGOZIS; KARAGOUNI; DOTSIKA, 2005).
Com a montagem da resposta imune celular especfica ocorre o desenvolvimento de
linfcitos T de memria (provavelmente linfcitos de T de memria central e de memria
efetora), os quais promovem o controle da infeco em longo prazo. Por outro lado, quando
acontece uma falha no estabelecimento de reposta imune Th1 em indivduos inoculados por L.
infantum, pode ocorrer diferenciao de linfcitos naive em linfcitos Th2 e/ou de linfcitos
T regulatrios (Treg), os quais no contribuem para o controle da infeco e/ou favorecem a
instalao da doena. (RAI et al., 2012; ZWINGENBERGER et al., 1990)
1.4 ESTRATGIAS UTILIZADAS PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINAS
So muitas as tentativas de controle da leishmaniose visceral canina, mas uma
alternativa para o controle da leishmaniose visceral zoontica seria a preveno da infeco
canina e/ou da transmisso do parasito do co para o inseto vetor. Assim, a utilizao de uma
vacina efetiva para uso canino, culminaria, provavelmente, na reduo da incidncia de LV
humana (DYE, 1996; MORENO; ALVAR, 2002).
Vrias estratgias distintas j foram usadas para seleo de antgenos de candidatos a
componente de vacina contra leishmaniose como, por exemplo: a) obteno de uma frao de
protenas, dentro de uma faixa de peso molecular, a partir de lisado de Leishmania
(MONJOUR et al, 1988), b) identificao de antgenos solveis de Leishmania, fracionados
por eletroforese em duas dimenses, e capazes de induzir resposta linfoproliferativa em
18
indivduos curados de leishmaniose tegumentar (MELBY; NEVA; SACKS, 1989); c) seleo
de uma frao de antgenos de Leishmania capazes de ligar-se a fucose e manose
(PALATNIK-DE-SOUSA et al., 1996); d) seleo de plasmdeos de biblioteca de expresso
codificando antgenos capazes de induzir resposta imune protetora em camundongos
(MELBY et al., 2000)
Vrios antgenos candidatos a componente de uma vacina, incluindo Fucose Manose
Ligante (FML), protena quimrica Q, LACK, MML quimrica, cistena proteases (CPA e
CPB), KMPII, TRYP, GP63, A2 e fatores excretados os secretados de formas promastigotas
Leishmania infantum (LiESP), foram avaliados em associao com adjuvante (entre eles,
saponina Quil A, uma frao de saponina denominada QA-21 e MPL-SE) em camundongos e
em ces, mostrando graus variados de proteo contra a infeco causada pelo desafio
experimental (GRADONI, 2015)
A avaliao da resposta imune de indivduos aps a administrao de antgenos
produzidos por DNA plasmideal vem sendo realizada. Alm disso, formulaes que
favoream a distribuio de plasmdeos, a otimizao de plasmdeos (com otimizao de
cdons) (SCHNEIDER; GREENE; ALLISON, 1997), a adio de sequncia lder para
promover a secreo de protenas (YANG et al., 2001) e mtodos para aumentar a entrada de
plasmdeo em clulas teciduais e, consequentemente, promover a expresso de protenas
recombinantes codificadas pelo plasmdeo, tm sido desenvolvidas (AIHARA; MIYAZAKI,
1998).
Muitos experimentos so realizados no sentido de caracterizar a resposta imune
induzida por antgenos candidatos vacina contra LV canina, incluindo parasitas vivos ou
mortos, antgenos purificados, antgenos recombinantes, bactrias vivas expressando
antgenos recombinantes e plasmdeos codificando antgenos (MIR et al., 2008).
No Brasil, h mais de trs dcadas pesquisadores vm trabalhando com o objetivo de
desenvolver uma vacina contra leishmaniose visceral canina. As formulaes vacinais que
foram estudadas de forma mais avanada foram elaboradas protena A2/saponina
(comercializada com o nome de Leish-Tec, de Leishmania infantum, (FERNANDES et al.,
2008) e fatores secretados/excretados de Leishmania infantum (LiESAp-MDP, (LEMESRE et
al., 2007). Contudo, os resultados obtidos com essas formulaes vacinais ainda no foram
confirmados de forma independente, usando-se uma metodologia adequada, por outros grupos
pesquisa.
At o presente momento duas vacinas contra leishmaniose visceral canina foram
desenvolvidas e avaliadas em Fase III, a Leish-Tec (Hertape, Brasil) e a Canileish (Virbac,
19
Frana). A vacina Leish-Tec formulada com a protena recombinante de L. donovani A2 e
saponina Quil A, enquanto que a vacina Cani-Leish formulada com LiESP e a frao de
saponina QA-21.
Em um ensaio de fase III da vacina Cani-Leish, realizado com ces beagle, os animais
foram avaliados por 24 meses aps alojamento em uma rea altamente endmica. Nesse
ensaio, foi observada prenveno do surgimento de manifestaes clnicas compatveis com
LV, sendo a eficcia de 68%. A avaliao de parasitismo por cultura de material aspirado de
medula ou linfonodo, mostrou que 3 de 41 e 9 de 39 dos animais vacinados e do grupo
controle, respectivamente, exibiam infeco ativa (OLIVA et al., 2014).
As vacinas contra leishmaniose visceral canina avaliadas em fase III mostram apenas
proteo parcial contra o desenvolvimento da infeco, doena ou transmisso de Leishmania
de ces infectados para o inseto vetor (BORJA-CABRERA et al., 2002; DA SILVA et al.,
2001; FERNANDES et al., 2012; LEMESRE et al., 2007). Isso sugere que continua sendo
necessria a seleo de novos antgenos com capacidade proteger ces contra leishmaniose
visceral
20
2 OBJETIVOS DO TRABALHO
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver ferramentas teis para o desenvolvimento uma vacina contra leishmaniose
visceral canina
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Desenvolver um modelo para avaliar antgenos candidatos a vacina contra
leishmaniose visceral canina;
Avaliar citocinas produzidas por clulas de sangue perifrico em ces de rea
endmica para leishmaniose visceral
Estudar a carga parasitria e aspectos histolgicos em diferentes regies do bao de
ces com leishmaniose visceral.
21
3 DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO PARA AVALIAR
ANTGENOS CANDIDATOS A VACINA CONTRA
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
22
3.1 JUSTIFICATIVA
Vrias estratgias tm sido utilizadas para a seleo ou avaliao de antgenos
candidatos a compor uma vacina contra leishmaniose visceral. Muitos pesquisadores
selecionaram antgenos baseados em: a) facilidade de isolamento, por exemplo, fatores
excretados ou secretados (CIBRELUS et al., 1999), b) separao de molculas de formas
promastigotas em gel de poliacrilamida (FROMMEL et al., 1988), c) separao molculas de
formas promastigotas em gel de poliacrilamida seguida de transferncia para membrana de
nitrocelulose e reatividadea clulas mononucleares de sangue perifrico humano infectados
com L. donovani (MELBY; NEVA; SACKS, 1989), e) reatividade de polipeptdeos
recombinantes a anticorpos e esplencitos de camundongos infectados com L.
infantum(WILSON et al., 1995), f) expresso em formas amastigotas, na ausncia de
expresso em formas promastigotas, de L. donovani (CHAREST; MATLASHEWSKI, 1994),
ou g) reatividade de polipeptdeos recombinantes a anticorpos de ces ou seres humanos
infectados com L. infantum (OLIVEIRA et al., 2011). Vrios pesquisadores avaliaram o
potencial de antgenos para compor uma vacina contra LV canina pela imunizao de
camundongos ou ces e estudo da resposta imune induzida (GHOSH; ZHANG;
MATLASHEWSKI, 2002; LEMESRE et al., 2005). Nem sempre existe correlao entre a
induo resposta imune protetora em camundongos e em ces (DUNAN et al.,
1989;FROMMEL et al., 1988) e a avaliao inicial de antgenos em ces muito onerosa.
Portanto, provavelmente, uma estratgia melhor para a seleo de antgenos candidatos e
avaliao inicial seria utilizar clulas de sangue perifrico de ces resistentes a LV que
apresentem resposta imune celular especfica. Tais ces podem ser obtidos pela inoculao
natural ou experimental com Leishmania. Em princpio, esses animais apresentam resistncia
ao desenvolvimento da doena pelo fato do sistema imune deles ter montado reposta imune
celular contra alguns antgenos do parasito. Portanto, clulas mononucleares de sangue
perifrico desses animais devem ser capazes de revelar os antgenos protetores.
Previamente, Teixeira e colaboradores (TEIXEIRA et al., 2011) imunizaram com
lisado de L. infantum em adjuvante incompleto de Freund e, posteriormente, inocularam com
formas promastigotas da fase estacionria de cultura em ces. Esses animais no
desenvolveram manifestaes clnicas e apresentaram resposta imune celular especfica
durante dois anos de acompanhamento. Provavelmente, tais animais desenvolveram
resistncia contra LV e clulas mononucleares de sangue perifrico deles poderiam ser teis
23
para a seleo de antgenos candidatos. Infelizmente, a administrao de adjuvante
incompleto de Freund promoveu o aparecimento de abscesso no local da injeo, impedindo o
uso desse modelo para a seleo de antgenos candidatos. Uma alternativa para a obteno de
ces resistentes a LV seria a inoculao de Leishmania, em cultura de promastigotas na fase
estacionria, por via intradrmica (Eugenia Carrillo e Francisco Javier Moreno, Instituto de
La Salud Carlos III, Madrid/ Espanha, comunicao pessoal, dados no publicados).
No presente trabalho, foi avaliada a inoculao de Leishmania por via drmica visando
a obteno de um modelo de ces resistentes a LV til para a seleo ou avaliao de
antgenos candidatos a vacina contra LV canina
24
3.2 MATERIAL E MTODOS
3.2.1 Isolamento, caracterizao e obteno do inculo de Leishmania
No curso da implementao de medidas de controle da LV por parte de agentes do
Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Camaari, Bahia, um co foi identificado com
resultados positivos no ensaio imunocromatogrfico baseado em plataforma de duplo
percurso (DPP) com antgeno rK28, (BioManguinhos)]. O animal tambm apresentava
manifestaes clnicas compatveis com LV, incluindo perda de peso, linfadenopatia,
onicogrifose e ceratoconjuntivite. Esse animal tambm foi submetido puno aspirativa de
bao guiada por ultrassonografia, conforme mtodo descrito previamente (BARROUIN-
MELO et al., 2004) com permisso do proprietrio, o que resultou no encontro do parasito. O
animal foi submetido eutansia e pequenos fragmentos deregies diferentes do bao foram
coletados, macerados e ressuspensos em meio de cultura Schneider (Sigma Aldrich, St Louis,
Missouri, EUA)com dimetilsulfxido (DMSO) a 20% e armazenados em nitrognio lquido.
O material aspirado do bao foi usado para fazer esfregaos em lmina de vidro e
submetido colorao pelo mtodo de Wright e examinado ao microscpio ptico.
Amostras da suspenso de tecido esplnico armazenada em nitrognio lquido foram
descongeladas e colocadas em meio de cultura bifsico [gar-sangue e meio de cultura
Schneider contendo 20% de Soro Bovino Fetal (SBF, Gibco BRL Life Technologies, Nova
York, EUA). Depois da observao de formas promastigotas sob o microscpio invertido,
foram feitas passagens sucessivas do parasita em frascos plstico em meio Schneider
contendo 20% de SBF. Ao longo de duas passagens sucessivas foi determinada a curva de
proliferao da Leishmania. Alm disso, uma amostra da cultura foi enviada ao Laboratrio
de Referncia Nacional para Tipagem de Leishmania [Coleo de Leishmanias do Instituto
Oswaldo Cruz (CLIOC), Fundao Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro]para caracterizao da
espcie de Leishmania, realizada pelo mtodo de eletroforese de enzimas (registro RE-
020/2013, CAM/BR2013/CAO01).
Para apreparao do inculo, 7,5 mL da cultura de Leishmania em meio Schneider
contendo 20% de SBF que estava em fase estacionria foi centrifugada a 2.500 x g durante 10
minutos a temperatura ambiente e o sedimento foi ressuspenso em PBS a 1 x 109/ mL e
armazenado em gelo at o momento do uso.
25
3.2.2 Animais
Foram usados 12 ces adultos, 4 machos e 8 fmeas, sem raa definida, com idade
entre 2 e 3 anos. Esses animais foram doados pelos seus proprietrios quando tinham cerca de
60 a 90 dias de idade. Os animais foram mantidos no canil de experimentao do Centro de
Pesquisas Gonalo Moniz (CPqGM/ FIOCRUZ) recebendo rao industrializada e gua ad
libitum. Alm disso, os ces foram tratados com vermfugos, vacinados contra raiva em co e
contra as principais doenas infecciosas que acometem a espcie, como por exemplo,
leptospirose, cinomose, adenovirose, virose causada por parainfluenza, parvovirose, hepatite
viral e coronavirose.
Dois grupos de 6 ces cada foram formados, um grupo controle e um grupo teste.
Tanto o grupo controle quanto o grupo teste foram formados com 2 machos e 4 fmeas cada.
Os ces foram submetidos puno esplnica, usando-se mtodo descrito previamente
(BARROUIN-MELO et al., 2004). O material aspirado do bao dos animais foi submetido a
extrao de DNA e reao de PCR em tempo real para deteco de DNA de Leishmania,
conforme mtodo descrito previamente (FRANCINO et al., 2006). O resultado da PCR em
tempo real foi negativo para todos os animais.
Todos os procedimentos realizados com os animais no presente estudo foram
realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo
Comit de tica para o Uso de Animais (CEUA) do Centro de Pesquisa Gonalo Moniz,
Fundao Oswaldo Cruz (CPqGM FIOCRUZ), sob protocolo de n. 021/2011.
3.2.3 Inoculao intradrmica com L. infantum
Os ces do grupo controle foram utilizados apenas como doadores de sangue para uso
como controle negativo nos ensaios realizados in vitro.
Os animais do grupo teste foram injetados com 100 L de soluo salina tamponada
com fosfato (PBS, NaCl a 137 mM, KCl a 2,68mM, Na2HPO4 a 9,58 mM e NaK2PO4 a
1,47 mM) por via drmica no lado esquerdo do abdmen. Alm disso, cada animal do grupo
teste foi inoculado com 1x108 formas promastigotas de fase estacionria de cultura de
Leishmania, em um volume de 100 L por via drmica no lado direito do abdmen. O
isolamento, caracterizao e obteno do inculo foram descritos no item 3.2.1. As injees
26
foram realizadas usando-se seringas de 1 mL e agulha de 8 x 0,3 mm (BD Pharmingen, San
Jose, EUA).
3.2.4 Acompanhamento clnico dos ces
Os animais foram avaliados clinicamente pela Dra. Julia Liger de Freitas, mdica
veterinria, 1, 3, 6, 9, 12 e 14 meses aps a inoculao de Leishmania. No exame clnico
foram avaliados estado geral, temperatura, pele e mucosas, unhas, linfonodos superficiais,
fgado e bao. (Figura 1)
Alm disso, a pele na regio do abdmen foi examinada em busca de rea de induo
e/ou ulcerao 1, 10, 30, 45, 80 e 90 dias aps a injeo de PBS ou de inoculao de
Leishmania.
3.2.5 Avaliao clnico-patolgica
Para avaliao clnico-patolgica, foram realizadas coletas 6 mL de sangue pela veia
jugular de cada co inoculado com Leishmania, usando-se seringa e agulha, 1 dia antes e 9
meses aps a inoculao. As mostras de sangue foram transferidas para tubos de poliestireno
com ou sem anticoagulante (cido etilenodiamino tetra-actico-EDTA,) (Vacuette, Campinas,
So Paulo, Brasil). As amostras de sangue foram usadas para realizao de hemograma
(eritrograma, leucograma e plaquetograma), dosagem de uria, creatinina, protenas sricas
(totais, albumina e globulinas) e transaminases [transaminase alanina aminotransferase
(ALT), e transaminase aspartato aminotransferase (AST)]. (Figura 1)
27
Figura 1. Acompanhamento de ces inoculados com Leishmania por via drmica quanto a
resposta humoral e celular, produo de IFN-, IL-2, IL-10 e TNF- e carga parasitria
esplnica.Linha do tempo (em meses) representando as atividades realizadas para avaliao e
acompanhamento da gerao do modelo canino potencialmente resistente a leishmaniose visceral
canina. Leishmania infantumfoi isolada de um co naturalmente infectado e inoculada em 6 ces do
canil (dia zero). Foram feitas avaliaes clnicas (0, 1, 3, 6, 9, 12 e 14) bioqumicas, hematolgicas,
avaliao da resposta humoral com dosagem de IgG (0, 3, 6, 9, 12, 14), avaliao de resposta imune
celular com ensaio de proliferao celular frente a antgeno solvel de Leishmania (3 e 18
meses),mensurao de IFN- (3 e 6 meses) por ELISA e das citocinas (IFN-, IL-2, IL-10 e TNF-) no
18 ms com kit Milliplex (Millipore), avaliao da carga parasitria no bao realizada a partir da
extrao de DNA para a posterior anlise de amplificao de DNA de Leishmania por PCR em tempo
real e busca do parasito no material esplnico atravs de cultivo (12 e 21).
3.2.6 Coleta de sangue perifrico
Para a avaliao de anticorpos sricos, foram realizadas coletas de amostras de 6 mL
de sangue um dia antes e 3, 6, 9, 12 e 14 meses aps a inoculao em cada animal do grupo
teste.
Para a avaliao de linfoproliferao e/ou mensurao de citocinas foram realizadas
coletas de amostras de 20 mL de sangue aps a inoculao de Leishmania. As amostras de
sangue foram coletadas 18 meses ou 3, 6 e 18 meses de cada animal do grupo controle e teste,
respectivamente, aps a inoculao de Leishmania. As amostras foram coletadas pela veia
ceflica.
-1 0 1 3 6 9 12 14 21
Inoculao
meses
A: Avaliao clnica: Estado geral, peso, temperatura, aspectos de pele, linfonodos, fgado, bao etc.
B: Avaliao hematgica e bioquimica: Hemograma completo, dosagem de enzimas hepticas, uria, cretinina,
etc.
C: Avaliao da resposta imune humoral: Mensurao de IgG no soro por ELISA
Avaliao da resposta imune celular
D: Linfoproliferao (ensaio com timidina ou ensaio com CFSE e citometria de fluxo utilizando PBMC em
cultura)
E: Mensurao de citocinas (IFN- SN PBMC 48 h por ELISA e IFN-, IL2, IL10 e TNF sangue
total 24 h por Luminex)
F: Avaliao do parasitismo no bao (PCR de puno esplnica e cultura)
A
C
BB F FE EE
D
18
D
28
3.2.7 Obteno de soro
As amostras de sangue coletadas dos ces do grupo teste foram transferidas para tubo
de falcon com capacidade de 15 mL e mantidas 4 C por cerca de 8 horas. Em seguida os
tubos foram centrifugados por 10 minutos a 1.500 x g, temperatura ambiente. O soro de
cada tubo foi coletado e alquotas de soro foram colocadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL. Os
tubos foram armazenadas a -20 C at o momento do uso.
Alm disso, alquotas de soro provenientes de dois ces de Pelotas, Rio Grande do Sul
(rea no endmica para LV) (gentilmente cedidas pela Msc Manuela Silva Solc), e de dois
ces oriundos de Jequi, Bahia, apresentando LV, mantidas em nosso laboratrio a -20 oC,
foram usadas como controle negativo e positivo de ensaio, respectivamente.
Os ces provenientes de Pelotas mostravam-se sadios, sem anticorpos anti-Leishmania
em avaliao feita pelo ensaio imunoenzimtico (ELISA), e exibiam resultados negativos de
cultura e PCR em tempo real de material aspirado de bao para deteco de Leishmania. Os
animais oriundos de Jequi apresentavam manifestaes clnicas compatveis com LV,
anticorpos anti-Leishmania avaliados por ELISA e resultados positivos para cultura e PCR em
tempo real de material aspirado do bao para a deteco de Leishmania.
3.2.8 Obteno de clulas mononucleares de sangue perifrico
A obteno de CMNSP foi realizada, essencialmente, conforme mtodo descrito por
Pereira e colaboradores (PEREIRA et al., 2015). Resumidamente, as amostras de sangue
foram diludas de 1:2 em soluo de Hanks (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA)
tamponada com 10 mM de HEPES (Sigma Aldrich), pH 7,0, colocadas sobre Ficoll-paque
(GE Healthcare, Pittsburgh, EUA) e centrifugadas a 450 x g por 30 minutos a temperatura
ambiente. As clulas localizadas na interface entre o plasma e o Ficoll-paque foram coletadas
e lavadas 2 vezes com salina pela centrifugao a 450 x g por 10 minutos a 4 C. Finalmente,
as clulas foram ressuspensas em meio RMPI 1640 com 10% de soro fetal bovino(Gibco BRL
Life Technologies), L-glutamina a 2 mM, (Sigma-Aldrich), e 2-mercaptoetanola 0,01
mM(Sigma-Aldrich) (meio RPMI completo) e ajustadas para a concentrao de 2 x
106CMNSP /mL ou lavadas e ressuspensas em PBS /BSA 0,1% (Sigma-Aldrich).
29
3.2.9. Preparao de antgenos de Leishmania
Antgenos solveis de Leishmania foram obtidos a partir da
cepaMHOM/BR2000/Merivaldo previamente obtida no laboratrio a partir de paciente com
leishmaniose visceral do municpio de Jequi, Bahia (BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C,
2006). A cepa foi utilizada para infectar hamster e posteriormente fragmentos de bao de
hamster foram macerados e armazenados em nitrognio lquido at o momento do uso.
Uma alquota foi descongelada e cultivada em meio de cultura Schneider (Sigma-
Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) com pH 7,2 e suplementado com 20 % de soro bovino fetal
inativado (meio Schneider suplementado) a 24 oC por 4 dias. As formas promastigotas
resultantes foram transferidas apartir de 6 passagens em meio Schneider suplementado para
eliminao de debris de tecido esplnico.
Para a obteno das formas amastigotas, formas promastigotas em uma concentrao
de 5x106 parasitos/mL, foram cultivadas a 24 C, por 3-5 dias, at o incio da fase estacionria
e posteriormente foram transferidas para estufa 37C. Aps 13 dias de cultivo, formas
amastigotas foram lavadas 3 vezes em salina, centrifugando-se a 2.500x g, por 10 minutos a 4
oC. Em seguida, os parasitos em suspenso foram submetidos a lise por 5 ciclos de
congelamento em nitrognio lquido e descongelamento a 4 C e seguido por sonicao
(Sonifier 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, EUA) para fragmentao com
aplicao de 10 pulsos de 500 watts, com 20 segundos de durao, com intervalos de 1
minuto entre cada dois pulsos consecutivos, mantendo-se o material sob gelo. A eficincia do
processo de lise dos parasitos foi testada visualmente ao microscpio ptico. O lisado foi
dividido em duas partes. Uma parte para ser usada sem modificao adicional (denominada
lisado total) e a outra parte para ser usado somente o sobrenadante obtido aps centrifugao a
3000x g, por 5 minutos a 4 oC (denominado frao solvel). Vrias alquotas da frao solvel
foram congeladas a -70 oC at o momento do uso.
3.2.10 Resposta imune humoral
A deteco de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania nos animais do grupo teste foi
realizada por ELISA usando-se, essencialmente, o mtodo descrito por Baleeiro e
colaboradores (BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C, 2006). Resumidamente, em placas de
microtitulao de 96 poos de fundo chato, os poos foram sensibilizados com antgenos
30
solveis (SLA) de Leishmania infantum na concentrao de 3,125 g/mL (diludos em
tampo carbonato-bicarbonato a 0,06 M, pH 9,6) usando-se 100 L/poo. Os poos das placas
foram lavados com tampo de lavagem (PBS pH 7,2 contendo 0,05% tween 20 (Vetec, Duque
de Caxias, Brasil), bloqueados com tampo de bloqueio (PBS pH 7,2, BSA 4 mg/mL, 0,05%
tween 20) e, depois, lavados novamente com PBS pH 7,2 contendo 0,05% tween 20. As
amostras de soro de cada co do grupo teste, de Jequi e de Pelotas, foram colocadas
duplicadas de poos. As amostras de soro de co, foram diludas de 1:800 em soluo
diluente (PBS pH 7,2, BSA 4 mg/mL, 0,05% tween 20),foram aplicados100 L/poo, por 1
hora. Os poos foram lavados e, depois disso, foram acrescentados anticorpos de coelho anti-
IgG de co conjugados a peroxidase (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, EUA)
diludos a 1:8.000 em soluo diluente, usando-se 100 L/poo. As placas foram incubadas
por 1 hora a temperatura ambiente e, depois disso, os poos foram lavados. O substrato da
peroxidade [TMB (3,3, 5,5-tetrametilbenzidina) a 1 mg/mL em tampo fosfato/citrato
(fosfato de sdio a 0,046 M, citrato de sdio a 0,022 M, pH 5,0) com 10 % de
dimetilsulfxido (DMSO) e 2 L de H2O2 a 30 %(v/v)] foi acrescentado aos poos, 100
L/poo. As placas foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente, protegidas da
luz. A reao enzimtica foi interrompida pela adio de 50 L/poo de cido sulfrico a 4 M
(Quimex, So Paulo, Brasil). A densidade ptica foi avaliada a 450 nm em um
espectrofotmetro (SpectraMax 340PC, Molecular Devices, Califrnia, EUA).
3.2.11 Resposta imune celular
A resposta linfoproliferativa frente estimulao com antgenos de Leishmania ou
mitgenos foi avaliada em clulas mononucleares de sangue perifrico (CMNSP) pelo ensaio
de incorporao de timidina triciada ou pelo ensaio de marcao com carboxifluorescena
succimidil ster (CFSE).
O ensaio de linfoproliferao pela incorporao de timidina triciada a CMNSP foi
realizada em placas de microtitulao de 96 poos de fundo chato. Nas placas, 2 x 105
CMNSP de co ressupensas em meio RPMI completo foram colocadas por poo usando-se
um volume de 100L/poo. Em triplicatas de poos com CMNSP de cada co, foram
adicionados 100 L de meio RMPI completo, meio RMPI completo com SLA para alcanar a
concentrao final de 10 L/mL ou concanavalina A (Con A) para alcanar a concentrao
final de 5 L/mL. As placas contendo CMNSP em meio de cultura ou Con A foram incubadas
por 3 dias a 37 C em atmosfera mida com 5% de CO2. As placas contendo CMNSP em
31
meio de cultura ou em meio de cultura com SLA foram incubadas por 5 dias sob as condies
descritas acima. Dezoito horas antes do congelamento das clulas, foram adicionados a cada
poo 30 L de meio RMPI completo contendo 1 Ci de timidina [H]3+ (atividade especfica
2 Ci/mM, Amersham Biosciences,Uppsalla, Sucia). Depois disso, as placas foram
armazenadas a -20 C at o momento da coleta das clulas. As clulas foram coletadas em
uma membrana de fibra de vidro (Packard, Meriden, EUA) usando-se um coletor de clulas.
Finalmente, a radioatividade na membrana foi determinada em um aparelho Matrix 9600
Direct Beta Counter (Packard, Houston, Texas, EUA)
O ensaio de linfoproliferao com CMNSP marcadas com CFSE (Life Technologies)
foi realizado aps colorao das clulas seguindo-se as recomendaes do fabricante.
Resumidamente, 1 x 107
CMNSP de cada co foram ressuspensas em um volume de 2 mL de
PBS com BSA a 0,1 % em um tubo Falcon de 50 ml (BD Falcon, Bedford, EUA) e incubadas
com CFSE a 5 M por 10 min, a 37 C. Cada tubo Falcon foi imerso em gelo picado por 5
min. As clulas de cada tubo foram lavadas 2 vezes com RPMI base gelado, centrifugando-se
a 450 x g por 10 minutos a 20 oC. Depois disso, as clulas foram ressuspensas em meio RPMI
completo e foram colocadas em placas de microtitulao 96 poos de fundo chato. As clulas
foram colocadas a 2 x 105/poo em 100 L/poo. As duplicatas de poos de cada co, foram
acrescentados 100 L de meio RPMI completo ou RPMI completo com SLA para
concentrao final de 1 g/mLou 10 g/mL ou fito-hemaglutinina (PHA) (Sigma-Aldrich)
para a concentrao final de 6 g /mL. As placas foram incubadas por 5 dias a 37 C em
atmosfera mida com 5% de CO2.As clulas de duplicatas de poos foram transferidas para
um tubo de poliestireno de 5 mL com tampa (BD falcon). A cada tubo foram adicionados 2
mL de PBS 1x. Os tubos foram centrifugados a350 x g por10 minutos a 20oC. Os
sobrenadantes foram descartados e as clulas de cada tubo foram ressuspensas com 250 L de
PBS com formaldedo a 1%. Os tubos foram armazenados a 4 oC protegidos da luz por cerca
de 15 h at a aquisio em citmetro. A anlise das clulas de cada tubo foi realizada pela
aquisio 10.000 eventos em um citmetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences, New
Jersey, EUA), utilizando-se o software FACS Diva. A anlise dos dados adquiridos foi
realizada usando-se o programa de computador FlowJo verso 7.6.
.
3.2.12 Mensurao de citocinas
A concentrao de interferon gama (IFN-) em sobrenadantes de CMNSP cultivadas
por 48horas e a concentrao de IFN-, IL-10, IL-2 e TNF- em plasmas de sangue total
32
cultivados por 24 horas foram determinadas por ELISA ou por Milliplex (EDM Millipore,
Darmstadt, Alemanha), respectivamente.
O ensaio para a avaliao de IFN- em sobrenadantes de cultura de CMNSP de ces
foi realizado em placas de microtitulao de 96 poos de fundo chato, 2 x 105 CMNSP de
cada co, ressuspensas em meio RPMI completo, foram colocadas em cada 12 poos, em um
volume de 100 L/poo. Em cada quadruplicata de poos com CMNSP de cada co foram
adicionados 100 L de meio RPMI completo ou RPMI completo com SLA para a
concentrao final de10 g/mL ou Con A a 5 g /mL (Sigma-Aldrich). As placas foram
incubadas por 48 horas a 37 C em atmosfera mida com 5% de CO2. Depois disso, o
sobrenadante de CMNSP cada co cultivado em condies idnticas foi coletado em tubo
Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos foram centrifugados a400 x g por 10 minutos a temperatura
ambiente e os sobrenadantes resultantes foram transferidos para novos tubos Eppendorf e
armazenados a -20 oC at o momento do uso.
A determinao da concentrao de IFN- por ELISA foi realizada usando-se
anticorpos produzidos pela R&D Systems (Minneapolis, EUA) e seguindo-se as
recomendaes do fabricante. Resumidamente, placas de microtitulao de 96 poos de alta
capacidade de ligao de protenas (Corning Costar, Nova Iorque, EUA) foram sensibilizadas
com anticorpo monoclonal de camundongo anti-IFN- de co a 2 g/mL (MAB 781, R&D
Systems), diludo em PBS, com 100 L/poo. As placas foram incubadas a temperatura
ambiente durante cerca de 14 horas. Os poos foram lavados com tampo de lavagem (PBS
pH 7,4, 0,05% de tween 20). Os poos foram bloqueados com tampo de bloqueio (PBS pH
7,4, 1% de BSA, 5% de sacarose e 0,05% de azida de sdio) por 1 hora a temperatura
ambiente. Os poos foram lavados com soluo de lavagem. As amostras de sobrenadante
foram testadas em duplicata com 100 L/poo. Para a curva padro, foram preparadas
diluies seriadas duplas de IFN- canino (R&D systems) comeando com a concentrao de
8.000 pg/mL e terminando 15,6 pg/mL. Em duplicatas de poos foram colocadas 100 L/poo
de IFN- em cada uma das diluies descritas acima. As placas foram incubadas por 24 horas
a 4 C. Os poos foram lavados com 400L de tampo de lavagem. Em seguida, anticorpos
de cabra anti-IFN- canino conjugado a biotina (BAF781) a200ng/mL foram acrescentados
100 L/poona concentrao de 200ng/mL, diludo em PBS com 2% de soro de cabra
inativado, e as placas foram incubados por 2 horas a temperatura.Os poos foram lavados com
400L de tampo de lavagem. Posteriormente, estreptavidina conjugada a peroxidase (R&D
systems) diluda de 1:200 em tampo diluente (PBS pH 7,4, 1% de BSA), foi acrescentada
100 L/poo. As placas foram incubadas por 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente,
33
o substrato da peroxidase (TMB) em tampo fosfato-citrato (previamente descrito) foi
adicionado aos poos a 100 L/poo. A reao enzimtica foi interrompida pela adio de
50 L/poo de cido sulfrico a 1 M (Quimex, So Paulo, Brasil). A densidade ptica
avaliada a 450 nm em um espectrofotmetro (SpectraMax 340PC, Molecular Devices).A
concentrao de IFN- canino foi estimada pela comparao da mdia dos valores de DO das
duplicatas de cada amostra com a curva de calibrao, usando o programa GraphPad Prism
v.5.0 software (San Diego, EUA) e expressas em pg/mL.
O ensaio para a avalio de IFN-, IL-10, IL-2 e TNF-em plasma de sangue total
(ensaio do quantiFERON modificado) foi realizado em tubo Eppendorf de 2 mL. Amostras de
1 mL de sangue heparinizado de 5 ces do grupo teste e de 3 ces do grupo controle foram
colocadas em 6 tubos cada. Os tubos com amostras de sangue receberam 10 L de PBS, SLA
a 5, 10 ou 25 mg/mL. Alm disso, amostras de 1 mL de sangue heparinizado diludo de 1:2 ou
1:4 em RPMI completo dos 8 animais mencionados acima, foram colocadas em tubos de 2
mL contendo 10 L de Con A a 5 g/mL. Os tubos foram incubados a 37 oC por 24 horas.
Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 2.000 x g por 10 minutos a 4C e o plasma foi
coletado e armazenado em quadruplicatas a -20 C at o momento do uso.
Para a mensurao das citocinasIFN-, IL-10, IL-2 e TNF-, os plasmas foram
descongelados e utilizadoscom o Kit Milliplex (Millipore, Darmstadt, Alemanha), seguindo-
se as recomendaes do fabricante. Resumidamente, placas de 96 poos foram sensibilizadas
com 25 L da mistura de anticorpos imobilizados em esferas magnticas. Posteriormente
foram acrescentadas 25 L da curva padro de citocinas caninas (IFN-, IL-10, IL-2 e TNF-)
em diluio seriada (de 10.000 a 2,44 pg/ mL para IFN- e de 50.000 a 12,2 pg/ mL para as
demais citocinas) em duplicata. Alm disso, tambm foram acrescentadas 25 L dos
plasmasobtidos e descongelados previamente. As placas foram incubadas a 4C, por
aproximadamente 15 h.
Os poos foram lavados com 200 L de tampo de lavagem 1x (diludo em gua
deionizada), posteriormente foram acrescentados 25 L de anticorpo de deteco e a placa foi
incubada sob agitao durante 1h em agitador de placas digital (IKA MS3, Staufen,
Alemanha). Em seguida, 25 L de Estreptavidina Ficoeritrina foram incubadas s placas por
30 minutos, posteriormente lavadas com 200 L de tampo de lavagem e acrescentadas 150
L de tampo de ensaio. A intensidade de florescncia mdia e a quantidade de cada citocina
em pg/mL foi lida em aparelho LUMINEX 200 (Milliplex Analyzer Millippore) com auxlio
de um programa computacional software Xponent 3.1. Os ensaios foram realizados na
34
Plataforma Luminex situada no Laboratrio de Imunofarmacologia do Instituto Oswaldo
Cruz/ RJ.
3.2.13 Avaliao da carga parasitria por PCR em tempo real e cultura
A determinao da carga parasitria por grama de tecido foi realizada por PCR em
tempo real em amostras de aspirado de bao coletadas 12 e 21 meses aps a inoculao de
Leishmania. Os ces foram submetidos puno esplnica, usando-se mtodo descrito
previamente (BARROUIN-MELO et al., 2004). O material aspirado do bao dos animais foi
pesado e submetido a extrao de DNA e reao de PCR em tempo real para deteco de
DNA de Leishmania.
A partir de amostras de aspirado esplnico obtidas aps a inoculao, o DNA das
amostras foi extrado com DNAeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Alemanha),
seguindo as recomendaes do fabricante, e a concentrao foi determinada em um
espectrofotmetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA). As
amostras de tecido foram digeridas com proteinase K overnight (Mary et al., 2004).
O ensaio de PCR em tempo real foi realizado, essencialmente, de acordo com o
mtodo descrito por Francino e colaboradores (FRANCINO et al., 2006). Resumidamente,
triplicatas de 25 l de reaes foram realizadas com 150 ng de DNA da amostra, primers
LEISH-1(5'-AACTTTTCTGGTCCTCCGGGTAG-3') e LEISH-2 (5'-
ACCCCCAGTTTCCCGCC-3') e uma sonda FAM-MGB (FAM-5'-
AAAAATGGGTGCAGAAAT-3'-MGB) de seqncia conservada de mini crculo de DNA
de Leishmania ou iniciadores especficos e sonda para a deteco de gene 18S rDNA
mamferos (controlo negativo, Applied Biosystems, Carlsbad, EUA), 0,2 mg / L de
albumina de soro bovino, e TaqMan mix master (Applied Biosystems). Para a preparao de
uma curva de calibrao, foram utilizadas quantidades de 0,1-105 de DNA de promastigotas
de Leishmania. As reaes foram realizadas e lidas num sistema de PCR em tempo real fast
7500 (Applied Biosystems, Foster City, EUA). A carga parasitria foi expressa por nmero de
Leishmanias por 100 mg de DNA)
A partir de amostras de aspirado esplnico obtidas 12 e 21 meses aps a inoculao de
Leishmania nos ces, culturas foram mantidas a 23 C e examinadas semanalmente sob
35
microscpio ptico por um ms. A presena de formas promastigotas vivas e ativas foram
consideradas como resultado positivo.
3.2.14Anlise estatstica
Os grficos e a maioria das anlises foram realizados a partir do software GraphPad
Prism v.5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). A proliferao celular foi avaliada de
modo qualitativo, comparando a mdia de proliferao celular dos dois grupos (teste e
controle) frente estimulao com o antgeno solvel de Leishmania infantum.
A produo de anticorpos da classe IgG e a produo das citocinas foram avaliadas
atravs do Teste No-Paramtrico de Friedman seguido de ps teste de Dunn para
comparao adicional entre cada dois grupos. Os valores estabelecidos para a significncia
estatstica foram definidos como: * p
36
3.3 RESULTADOS
3.3.1 Isolamento, caracterizao e preparao do inculo de Leishmania para injeo
intradrmica em ces
Uma cepa de Leishmania foi isolada de um co de Camaari, Bahia, com sinais
clnicos compatveis com LV (perda de peso, linfadenopatia, onicogrifose e
ceratoconjuntivite), resultado de ensaio imunocromatogrfico DPP positivo e apresentando
formas amastigotas dentro de macrfagos em esfregao de material esplnico e colorao pelo
mtodo de Wright (Figura 2). O isolamento da Leishmania foi realizado aps a eutansia do
animal e cultura de macerado de tecido do bao em meio bifsico gar sangue-Schneider com
20 % SBF.
Figura 2 Esfregao de material aspirado de bao de co de rea endmica submetido a colorao pelo
mtodo de Wright. Esfregao foi realizado a partir da puno esplnicade um co de rea endmica para
leishmaniose visceral canina. O esfregao de puno esplnica foi realizado em lminas de vidro que foram
posteriormente coradas pelo mtodo Wright e analisadas em microscpio ptico com objetiva de 100x. Foram
observadas formas amastigotas de Leishmania em macrfagos.
Oito a nove dias aps a inoculao de macerado de tecido esplnico em meio gar
sangue-Schneider, foram observadas formas promastigotas de Leishmania na cultura. Depois
da primeira, as passagens subsequentes foram realizadas em meio Schneider com 20 %
SBF.Uma amostra da cultura foi utilizada para identificao taxonmica como Leishmania
infantum (cepa CAM/BR2013/CAO01) atravs do mtodo de eletroforese de enzimas pelo
servio do Laboratrio de Referncia Nacional para Tipagem de Leishmaniada Coleo de
Leishmanias do Instituto Oswaldo Cruz CLIOC.
37
Para determinar a curva de proliferao e identificar a fase estacionria de crescimento
da cepa isolada, foi avaliada a concentrao de Leishmania em amostras do primeiro ao
stimo dia de cultura da segunda passagem. Pela curva de proliferao, observou-se que no
quinto e sexto dia que o parasito havia alcanado a fase estacionria de crescimento. (Figura
3)
Figura 3. Curva de proliferao de Leishmania isolada do co de rea endmica.As culturas foram iniciadas
com 1x105/mL em meio Schneider contendo 20% de SBF e foram acompanhadas por 7 dias at final da fase
estacionria. As Leishmanias foram cultivadas em quadruplicatas. Os cultivos so representados nas curvas em
verde, laranja, azul escuro e preto. De acordo com as curvas de crescimento, a cepa recm isolada
CAM/BR2013/CAO01alcanou a fase estacionria no 5 dia de cultivo.
Formas promastigotas de Leishmania da cepa CAM/BR2013/CAO01 na fase
estacionria de crescimento, obtidas aps cinco dias da terceira passagem de cultura, foram
lavadas e ressuspensas em PBS e ajustada em concentrao 1 x 109/mL, e 100 L foram
usadas para a inoculao intradrmica em ces.
3.3.2 Avaliao clnica de ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica
Seis animais do grupo teste foram injetados com 100 L de PBS com 1x10
8 formas
promastigotas de fase estacionria de cultura de Leishmania, por via drmica no lado direito
do abdmen.
Avaliao clnica dos animais consistiu na avaliao no local a inoculao. A pele do
abdmen do animal foi analisada em busca de rea de indurao e/ou ulcerao 1, 10, 30, 45,
Tempo (dias)
0 1 2 3 4 5 6 7 80
1000
2000
3000
Pro
masti
go
tas X
10
5/m
L
38
80 e 90 dias aps a inoculao de Leishmania. As dimenses mdias das leses dos ces
foram registradas em diferentes tempos. As mdias de todos os 6 ces nos diferentes tempos
foram: 0 (tempo 1), 0,47 (tempo 10), 1,08 (tempo 30), 1,06 (tempo 45), 0,59 (tempo 80) e 0
(tempo 90) conforme demosntrado na figura 4.
Na avaliao clnica sistmica foram avaliados o estado geral, a temperatura, pele e
mucosas, unhas, linfonodos superficiais, fgado e bao. Alm da presena, a severidade dos
sinais clnicos tambm foram analisados. No houve qualquer alterao sistmica ou
manifestao clnica caracterstica para leishmaniose visceral canina ao longo dos dois anos
de acompanhamento, exceto pela endurao cutnea causada provavelmente por inflamao
drmica no local da inoculao.
Figura 4: Leso cutnea no local da inoculao experimental da Leishmania em
ces.Ces foram inoculados com 1 108Leishmania por via intradrmica no lado direito e
com PBS do lado esquerdo do abdmen. (A) A mdia das medidas da leso foi registrada nos
tempo 0, 10, 30, 45, 80 e 90. Os pontos significam amdia das medidas da rea de endurao
(cm) obtida por animal. As curvas representam a evoluo das medidas das ulceras por cada
PBS L. infantum PBS L. infantum PBS L. infantum
C
o 0
4
C
o 0
1
C
o 0
5
C
o 0
2
C
o 0
6
Co
03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
Dim
en
so
md
ia d
a
en
du
rao
(cm
)
Tempo (dias)
A
B
39
animal. (B) Imagens representativas do 30 dia de acompanhamento aps a inoculao da
Leishmania: presena da endurao nos seis animais e formao de ulcera rasa em trs
animais.
3.3.3 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania infantum por
via drmica
Para avaliao clnico-patolgica, amostras de sangue foram usadas para realizao de
hemograma (eritrograma, leucograma e plaquetograma), dosagem de uria, creatinina,
protenas sricas (totais, albumina e globulinas) e transaminases [transaminase alanina
aminotransferase (ALT), e transaminase aspartato aminotransferase (AST)].
O ensaio de eritrograma consitiu em diversos exames como: contagem de hemcia
hemoglobina, hematcrito, volume corpuscular mdio (VCM), hemoglobina corpuscular
mdia (HCM), concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) e RDW. Nove
meses aps a inoculao, as mdias dos valores dos animais e o valor de referncia para cada
paramtro foram: contagem de hemcia: 7,3 (valor de referncia: 5,5 - 8,5milhes/mm),
hemoglobina: 15,9 (valor de referncia: 12,0 - 18,0 g/dL), hematcrito: 48,5 (valor de
referncia: 37,0 - 55,0 %), VCM: 66,7 (valor de referncia: 60,0 - 77,0 fL), HCM: 21,9 (valor
de referncia: 19,0 - 23,0 pg), CHCM: (valor de referncia:32,0 - 36,0 g/dL), RDW: 16,4,
(valor de referncia:14,0 - 17,0 %).
O ensaio de leucograma consitiu em leuccitos, neutrfilos segmentados, neutrfilos
bastonetes, linfcito, moncito, eosinfilo. Nove meses aps a inoculao, as mdias dos
valores dos animais foram: contagem de leuccitos: 7.200 (valor de referncia: 6.000-17.000),
neutrfilos segmentados: 4.396(valor de referncia: 3.500 - 11.500), neutrfilos
bastonetes:279,8(valor de referncia: 0 300), linfcito:2.055(valor de referncia: 1.000 -
4.800), moncito: 72 (valor de referncia: 150 - 1.350), eosinfilo:375,7(valor de
referncia:100 - 1.250).
O ensaio de plaquetograma consitiu em contagem de plaquetas: 231.500 (valor de
referncia: 175.000 - 500.00) e PPT: 6,7 (valor de referncia:6,0 - 8,0)
No ensaio bioqumica srica, nove meses aps a inoculao foram realizadas dosagem
de ALT: 85,8 (valor de referncia:21 -102 UI/L), fosfatase alcalina: 28,6 (valor de
referncia:20 - 156UI/L), protena total: 6,1 (valor de referncia:5,4 - 7,1g/dl), albumina:
2,7(valor de referncia:2,6 - 3,3g/dl), globulina: 3,4(valor de referncia:2,7 - 4,4g/dl), uria:
55,1(valor de referncia:21,0 - 60,0mg/dl) e creatinina 1,1(valor de referncia:0,5 - 1,5mg/dl)
Para a maioria dos parmetros testados, no houve qualquer alterao em relao aos
valores de referncia, no entanto para contagem de hemcias, dosagem de uria e creatinina,
40
dois ces apresentaram valores pouco acima dos valores de referncia e para a dosagem de
albumina, um co apresentou valor pouco abaixo do valor de referncia (Figura 5).
Figura 5:Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania por via drmica. Cerca
de 6mL de sangue foram coletados em momentos distintos e submetidos a anlise laboratorial.
Diversas anlises foram realizadas como: Hemcias, Hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, RDW,
Leuccitos, Neutrfilos segmentados, Neutrfilos bastonetes, Metamielcitos, Linfcitos, Moncitos,
Eosinfilos, Plaquetas, ALT (TGP), Fosfatase Alcalina, Protenas Totais, Albumina, Globulinas,
Uria, Creatinina. Apenas algumas das anlises esto sendo mostradas nos grficos acima
demonstrando que no houve alterao excessiva em relao aos valores de referncia (representados
nas barras horizontais). Barras vermelhas: valores mnimos e mximos de referncia, barra preta:
mdia e desvio padro.
globulinas
2
3
4
5
6
g/d
l
uria
0
20
40
60
80
mg
/dl
creatinina
0 90.5
1.0
1.5
2.0
mg
/dl
Hemcias
5
6
7
8
9
10
milh
es /
mm
3
Hemoglobina
12
14
16
18
20
g/d
l
albumina
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
g/d
l
linfcitos
0
1000
2000
3000
4000
/mm
3
plaquetas
0 9
200000
300000
400000
500000
/mm
3
Tempo (meses) Tempo (meses)
41
3.3.4 Produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania
infantum por via drmica
Para a produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania
infantum por via drmica, soros dos animais foram coletados antes da inoculao e 3, 5, 9, 12
e 14 meses aps a inoculao. A deteco de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania nos
animais do grupo teste foi realizada por ensaio imunoenzimtico indireto (ELISA) usando-se,
essencialmente, o mtodo descrito por Baleeiro e colaboradores(BALEEIRO; PARANHOS-
SILVA; C, 2006). Alm dos soros de ces do grupo teste, foram utilizados tambm soros de
ces de rea endmica (Jequi, Bahia) e soros de ces de rea no endmica para leishmaniose
visceral (Pelotas, Rio Grande do Sul).
O grupo de seis ces inoculados com Leishmania exibiu baixos valores de densidade
ptica (DO) em ELISA para mensurao de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania:
tempo (X SD): antes da inoculao (0,19 0,02), 3 meses (0,57 0,28), 5 meses (0,36
0,15), 9 meses (0,53 0,10), 12 meses (0,50 0,11) e 14 meses (0,45 0,13) (Figura 6)
Os nveis de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania antes da inoculao
apresentavam-se baixos e aumentaram no terceiro ms aps infeco experimental por
Leishmania infantum principalmente para o co 06que atingiu o nvel mximo de DO aps a
inoculao (1,1). Nos demais meses de acompanhamento, os nveis de anticorpos foram
baixos e oscilantes e mantidos at o 14 ms aps a inoculao com valores mnimos de 0,2 e
mximo de 0,7 conforme figura 6.
A produo de anticorpos em cada ms foi avaliada atravs do Teste No-Paramtrico
de Friedman seguido do Ps-teste de Dunn para comparao adicional entre cada ms em
relao ao tempo zero. A Produo de anticorpos foi estatisticamente significante aos 3 meses
(* p
42
Figura 6 Avaliao de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania por via
drmica. Sangue perifrico de ces experimentalmente infectados com Leishmania infantum foi
coletado nos tempos 0, 3, 6, 9, 12 e 14 meses ps infeco e o s