Post on 02-Nov-2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Acadêmica de Ciências Biológicas da UCSal Paula Braga Daltro sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia
Brodskyn e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
• O teste de fixação do complemento (FC) é um método sorológico usado
para determinar a presença ou semi-quantificar anticorpos (Ac) ou
antígenos (Ag) (Inibição da Fixação do Complemento) em uma amostra,
utilizando a ação do Sistema do Complemento.
• O sistema complemento é um conjunto de proteínas séricas que tem por
função ajudar na eliminação de microorganismos invasores. Este sistema
funciona em cascata e possui três vias. O teste de fixação do complemento
tem como base a via clássica, onde o complemento liga-se ao sítio ativo
formado pelo complexo antígeno-anticorpo.
• O complexo Ag-Ac: Quando moléculas de anticorpos ligam-se ao antígeno,
os sítios ativos da região Fc tornam-se disponíveis para a ligação do
complemento.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o FUNDAMENTOS:
• A ativação do sistema complemento por anticorpos ligados a
antígenos resulta na formação de complexos de ataque a
membrana que podem romper a membrana celular. Se o
anticorpo é ligado a antígenos adsorvidos nas hemácias, estas
são destruídas e ocorre hemólise.
• Pode ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo, quando é
então realizada uma diluição seriada da amostra, observando-se
a máxima diluição onde ocorre reação positiva.
CARACTERÍSTICAS BÁSICASo CURIOSIDADES SOBRE O SISTEMA COMPLEMENTO PARA MELHOR
COMPREENSÃO DO ENSAIO:
• Função: ligar covalentemente a moléculas específicas na superfície
de microorganismos invasores, ou em complexos Ag-Ac.
• Objetivo: induzir desequilíbrio osmótico e/ou apoptose em
microorganismos invasores ou células tumorais.
• Componentes : formado por um grupo de proteínas séricas
numericamente denominadas, e na sua maioria produzidas pelo
fígado.
CARACTERÍSTICAS BÁSICASo CURIOSIDADES SOBRE O SISTEMA COMPLEMENTO PARA MELHOR
COMPREENSÃO DO ENSAIO:
• Complexo de ataque a
membrana: Ao unir-se à
membrana microbiana ou ao
complexo Ac-Ag, o complemento
forma um canal transmembrânico
de forma anelar, causando uma
lise osmótica, induzindo apoptose
e, conseqüentemente, a morte da
célula.
Complexo de ataque à membrana
Bicamada fosfolipídicaCitoplasma
Influxo de fluidos
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o ELEMENTOS NECESSÁRIOS PARA A REALIZAÇÃO:
• Soro teste
• Sistema Complemento
• Sistema hemolítico (hemácias recobertas com antígenos)
• Estufa para incubação
• Centrífuga
• Antígeno purificado (na Inibição da Fixação do Complemento)
CARACTERÍSTICAS BÁSICASo ELEMENTOS NECESSÁRIOS PARA A REALIZAÇÃO:
Estufa incubadora
Centrífugas de microtubos
Microtubos
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
o VANTAGENS:
• Baixo custo.
• Boa especificidade.
• Boa sensibilidade.
o DESVANTAGENS:
• Probabilidades para falso-negativos devido a:
• Perda da atividade do complemento.
• Diluições inadequadas.
• Contaminação em soluções (gerando efeito
anticomplementar).
• Sensibilização insuficiente de hemácias.
• Probabilidades para falso-positivos devido a:
• Hemácias fragilizadas (velhas).
• Soro não-inativado.
• Baixa especificidade (dependendo do
antígeno adsorvido na hemácia).
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
• Além do teste de fixação do complemento, também
existe o teste de inibição da fixação do complemento,
o qual tem por objetivo detectar e semi-quantificar
Ags específicos em uma amostra.
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Y
1) O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste.
3) O complemento é inserido para identificar a presença ou não do complexo Ag/Ac. Em caso positivo, as proteínas do sistema complemento se ligarão à porção Fc dos Acs, iniciando uma cascata de reações que culminará com a lise das hemácias, liberando hemogoblina.
4) Após centrifugação, o que se observa é uma solução vermelho-amarronzada homogênea, devido a liberação de hemoglobina das hemácias.
2) O soro inativado é incubado com hemácias (ou outras células) que contêm o Ag específico para os Acs pesquisados adsorvido em sua membrana. O Ac pesquisado, caso presente na amostra, se ligará ao Ag da superfície das células.
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Y
Y
Y
Sistema Complemento
Ac do soro
Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico)
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTOo INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS: • No caso de não haver anticorpo específico para o
antígeno pesquisado, não ocorre hemólise e nem
liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste
negativo). Portanto, após a centrifugação dos tubos,
será observada a presença de um precipitado
avermelhado no fundo dos mesmos, o qual
corresponde às hemácias não lisadas.
• No caso de encontrar o complexo Ag/Ac, o
complemento é ativado e leva a lise das hemácias, com
liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste
positivo).
Resultado negativo
Resultado positivo
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Resultado Negativo Resultado Positivo
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Y
1) O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste.
5) Portanto, após centrifugação, o que se observa é um precipitado avermelhado no fundo do tubo (resultado positivo).
2) O soro inativado é incubado com anticorpo monoclonal dirigido para o antígeno pesquisado. No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados.
INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
3) A solução de soro-Ac monoclonal é então incubada com Sistema Hemolítico e com o Sistema Complemento. Caso os Acs monoclonais estejam previamente ligados aos Ags da amostra, eles não se ligarão com os Ags na membrana da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina).
Y
Sistema Complemento
Ac monoclonal
Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico)
Ag do soro
Y
o INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
• No caso de não haver o antígeno pesquisado na amostra, o
anticorpo monoclonal ficará com seus sítios de ligação
livres, podendo se ligar ao antígeno adsorvido na
membrana das hemácias, ativando o complemento e
causando hemólise com liberação de material intracelular
(hemoglobina) (teste negativo).
• No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os
sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados,
o que inibirá a sua ligação com os antígenos na membrana
da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de
material intracelular (hemoglobina) (teste positivo).
INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Resultado negativo
Resultado positivo
REFERÊNCIAS
• Imunologia Veterinária 6ª ed. Tizard, Ian R. Editora
ROCA.
• Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações. Vaz,
Adelaide J.; Takei, Kioko; Bueno, Ednéia C. Editora
Guanabara Koogan
• Imunologia Celular e Molecular 5ª ed. Abbas, Abul K.