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ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:
APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE
FILIPE BRUM MACHADO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
JUNHO DE 2008
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ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:
APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE
FILIPE BRUM MACHADO
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como
parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
JUNHO DE 2008
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ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:
APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE
FILIPE BRUM MACHADO
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como
parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia.
Aprovada em 5 de junho de 2008
Comissão Examinadora:
___________________________________________________________________
Profª. Ana Beatriz Garcia (Doutora, Genética Molecular de Plantas), UENF.
___________________________________________________________________
Profª. Regina Célia de Souza Campos Fernandes (Doutora, Doenças Infecciosas e Parasitárias), FMC. ___________________________________________________________________
Profª. Telma Nair Santana Pereira (Doutora, Melhoramento de Plantas), UENF.
__________________________________________________________________
Prof. Enrique Medina-Acosta (Doutor, Parasitologia Médica e Molecular), UENF (Orientador).
v
“Para descobrir caminhos é necessário sair dos trilhos” (Albert Einstein 1879-1955)
“Todo o interesse na doença e na morte é apenas uma outra forma de interesse pela
vida” (Thomas Mann 1875-1955)
vi
Dedico este trabalho ao meu amigo e
mestre Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta
vii
Agradecimentos
Agradeço a Deus por ter me concedido saúde e por iluminar o meu caminho. Aos meus pais Ioni e Celso, por não medirem esforços pela minha felicidade. Aos meus irmãos Fabrício e Carolina e toda minha família pelo apoio sempre. A Manuela pelo companheirismo, cumplicidade, carinho e compreensão mesmo nos momentos difíceis. Ao Meu amigo e mestre Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta, o qual eu dedico este trabalho, pelo exemplo de cientista e ser humano. Aos meus amigos do NUDIM: Jonilda, Antônio, Eduardo, Luana, Hazel,Esther, Laís, Cláudia, Luciana, Yvilin, Eliane pelo convívio harmonioso. Especialmente a Maria, Marília, José Eduardo e Rosângela que me receberam de braços abertos quando cheguei neste Núcleo em abril de 2006. A todos os meus amigos, em especial aos amigos do LBT e da turma de Ciências Biológicas 2006. A UENF, pela oportunidade concedida Ao hospital Escola Álvaro Alvim pela confiança e apoio na realização deste trabalho. Aos assistidos e responsáveis legais que doaram amostras como voluntários, em benefício da ciência. Aos colaboradores, que referenciaram o NUDIM e permitiram o enriquecimento científico desta dissertação. Ao revisor, Prof. Dr. Victor Flores pelas sugestões e pela amizade. Aos membros da banca Profa. Dra.Regina Célia Fernandes, Profa. Dra. Telma Nair e Profa. Dra. Ana Beatriz Garcia pelo aceite do convite. E a todos aqueles que acreditam e investem na ciência brasileira.
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SUMÁRIO
Página
Lista de figuras x
Lista de tabelas xi
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DA LITERATURA 4
2.1. O cromossomo X Humano 4
2.2. Microsatélites 5
2.2.1. Mecanismo de formação dos microsatélites 5
2.3. Aplicações das STR localizadas no cromossomo X na Genética Médica 8
2.3.1. Diagnóstico de aneuploidias 8
2.3.1.1. Síndrome de Klinefelter 8
2.3.1.2. Síndrome de Turner 9
2.3.2. Determinação e diferenciação sexual 10
2.3.2.1. Ambigüidade genital 11
2.3.3. Hemofilia 12
2.4. Aplicações Forenses das STR no cromossomo X 14
2.4.1. Desequilíbrio de ligação e haplótipos 16
CAPÍTULO I. Mineração de microsatélites no cromossomo X 17
3. OBJETIVOS 18
4. MATERIAL E MÉTODOS 19
4.1. Mineração de microsatélites nas regiões Xp e Xq 19
4.2. Critérios de seleção para locos potencialmente polimórficos 19
4.3. Validação in silico do polimorfismo 20
4.4. Desenho de Iniciadores 20
4.5. Construção de um mapa genético para STRs no cromossomo X 20
5. RESULTADOS 21
5.1. Abundância de microsatélites no cromossomo X Humano 21
5.2. Informatividade dos marcadores utilizados em Genética Forense 22
5.3. Busca de marcadores tetra e pentanucleotídeos 40
ix
5.4. Localização dos marcadores pentanucleotídeos validados in silico no
mapa genético do cromossomo X
45
6. DISCUSSÃO 48
7. CONCLUSÕES 52
CAPÍTULO II. Genotipagem de indivíduos com constituição alossômica
duvidosa
53
3. OBJETIVOS 54
4. MATERIAL E MÉTODOS 55
4.1. Material biológico 55
4.2. Aspectos éticos 55
4.3. Métodos 56
4.3.1. Extração de DNA 56
4.3.2. Amplificação de regiões polimórficas e monomórficas específicas dos
cromossomos sexuais
56
4.3.3. Quantificação de DNA genômico 56
4.3.4. Caracterização dos alelos amplificados 56
5. RESULTADOS 60
5.1. Caracterização molecular dos cromossomos sexuais em pacientes
com constituição alossômica duvidosa
60
5.2. Determinação da origem parental e meiótica da não disjunção
cromossômica em uma criança com dupla aneuplodia 48,XXY+21
70
5.3. Investigação molecular em menor hermafrodita verdadeiro
47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY
72
6. DISCUSSÃO 74
7. CONCLUSÕES 78
8. REFERÊNCIAS 79
ANEXOS
x
Lista de Figuras
Página
Figura 1 Ilustração esquemática do mecanismo de formação do polimorfismo, mediante o deslizamento (“slippage”) da polimerase durante a replicação do DNA
6
Figura 2 Eletroferograma dos produtos de amplificação de um microsatélite do tipo dinucleotídeo
7
Figura 3 Distribuição de elementos STR encontrados no cromossomo X humano segundo estringência da mineração
22
Figura 4 Validação in silico do loco DX6807 25
Figura 5 Relação entre a pontuação média e o poder de discriminação em mulheres
36
Figura 6 Relação entre a pontuação média e o Poder de Discriminação em homens
37
Figura 7 Informatividade de marcadores com o mesmo número observado de alelos
38
Figura 8 Relação entre a pontuação média e a taxa observada de mutação em marcadores autossômicos
39
Figura 9 Mapa de recombinação para o cromossomo X humano 46
Figura 10 Mapa genético do cromossomo X humano 47
Figura 11 Eletroferograma do perfil genético de paciente portador da síndrome de Klinefelter
69
Figura 12 Eletroferograma dos perfis genéticos para os marcadores D21S11e D21S226 evidenciando a origem materna da trissomia do cromossomo 21
71
Figura 13 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador X22 demonstrando a origem materna da cópia extra do cromossomo X
72
Figura 14 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador D13S305 (cromossomo 13) do núcleo familiar
73
Figura 15 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador XHPRT (cromossomo X) do núcleo familiar
73
Figura 16 Possíveis mecanismos de geração de indivíduos 2n XX/XY com 2 componentes genéticos maternos e 1 paterno
77
xi
Lista de Tabelas
Página
Tabela 1 Caracterização dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética forense, localizados no cromossomo X referência NC00023
24
Tabela 2 Média do número de alelos em diferentes populações para marcadores STR X-específicos
26
Tabela 3 Heterozigosidade média para marcadores STR X-específicos em diferentes populações
28
Tabela 4 Poder de discriminação médio para marcadores STR X-específicos em mulheres de diferentes populações
30
Tabela 5 Poder de discriminação médio para marcadores STR X-específicos em homens de diferentes populações
32
Tabela 6 Validação in silico de marcadores pentanucleotídeos 41
Tabela 7 Informação sobre os marcadores alossômicos que foram utilizados para genotipagem de indivíduos
58
Tabela 8 Perfil alélico dos marcadores específicos para o cromossomo 21 estabelecido por QF-PCR para o trio familiar
70
Tabela 9 Perfil alélico dos marcadores específicos para os cromossomos sexuais estabelecido por QF-PCR para o trio familiar
71
xii
Resumo
Os microsatélites, denominados seqüências curtas repetidas em tandem STR
(Short Tandem Repeats), exibem considerável variação em seqüência e número de
cópias entre os indivíduos. Em humanos, eles perfazem quase 4% do genoma e
constituem uma das principais fontes de marcadores genéticos polimórficos
utilizados em Genética Médica e Forense. Os critérios atuais de escolha de
marcadores são centrados em motivos históricos. Até o presente nenhuma análise
rigorosa havia sido feita para microsatélites localizados no cromossomo X humano.
Esta dissertação é apresentada em dois capítulos. No capitulo I procuramos
responder as seguintes questões baseados na informatividade dos microsatélites
conhecidos: O que é um bom marcador? Um bom marcador poderia ser predito por
uma análise in silico? Por meio de uma análise comparativa e compreensiva para
microsatélites em três seqüências referência para o cromossomo X humano foram
identificados e validados in silico 94 marcadores pentanucleotídeos, que serão úteis
no diagnóstico genético de aneuploidias, caracterização dos cromossomos sexuais e
investigação de parentesco. Na região Xq28, associada com hemofilia A, a análise
foi de alta resolução, obtendo-se um repertório 5,8 vezes maior do que o número de
elementos STR di-, tri- e tetranucleotídeos conhecidos, o que facilitará o diagnóstico
indireto da doença. Esses achados foram utilizados para gerar mapas físicos e
genéticos, úteis em estudos de análise de ligação. No capítulo II relatamos a
genotipagem, utilizando STR estabelecidos no diagnóstico genético, de indivíduos
com suspeita constituição alossômica e de dois casos raros; um indivíduo com as
síndromes de Down e Klinefelter combinadas e um indivíduo de provável origem por
diploidização de um embrião triplóide. A tipagem foi inequívoca no estabelecimento
do sexo genético e dosagem dos marcadores. Concluímos que a informatividade de
um marcador STR pode ser predita pela análise in silico e que os critérios de
escolha de um bom marcador dependerão da finalidade, se na Genética Médica ou
Forense. Os STR dinucleotídeos amplamente utilizados em citogenética molecular, e
que apresentam perfis eletroforéticos de difícil interpretação, devem ser substituídos
por STR pentanucleotídeos e tetranucleotídeos. A estratégia de mineração e
validação de marcadores polimórficos informativos descritos também será adequada
para a definição de critérios de predição de novos marcadores tanto para
autossomos quanto para o cromossomo Y.
xiii
Abstract
Microsatellites, also termed short tandem repeats (STR), exhibit considerable
variation in sequence and copy number among individuals. In humans, they make up
almost 4% of the genome and constitute one of the main source of polymorphic
genetic markers used medical genetics and forensics. Today’s selection criteria of a
good marker are centered in historical reasons. To this point, no rigorous analysis
had been carried out for microsatellites located on human X chromosome. This
dissertation is presented in two chapters. In chapter I, we intended to respond the
following questions based on the informativeness of known microsatellites: What is a
good marker? Could a good maker be predicted by an in silico analysis? By means of
a comparative and comprehensive analysis of microsatellites in three reference
sequences for the human X chromosome 94 pentanucleotide markers were identified
and validated in silico, which will be useful in genetic diagnosis of aneuploidies, sex
chromosome characterization and kinship analysis. In region Xq28, associated with
haemophilia A, the analysis was at high-resolution, yielding a 5.8-fold increase in the
repertoire of known di-, tri- and tetranucleotide STR, which will facilitate the indirect
diagnosis of the disease. These findings were used to create physical and genetic
maps, useful in studies of linkage analysis. In chapter II we report on the genotyping,
using STR already established for genetic diagnosis, of individuals with suspected
allosomic constitution and two rare cases, one individual with combined Down and
Klinefelter syndromes, and one individual likely originated by diploidization from a
triploid embryo. Typing was unequivocal in the establishment of the genetic sex and
markers amounts. We concluded that the informativeness of a given STR marker
may be predicted from the in silico analysis and that selection criteria of a good
marker will depend on the purpose of use, whether medical genetics or forensics.
The dinucleotide STR widely used in molecular cytogenetics, which present profiles
of difficult interpretation, ought to be substituted by pentanucleotide and
tetranucleotide STR. The strategy here described for mining and validation
informative and polymorphic will be adequate also for defining criteria of prediction of
new makers in both autosomes and the Y chromosome.
1
1. INTRODUÇÃO
Os microsatélites são seqüências de DNA curtas (1-6 nucleotídeos) repetidas
em tandem, isto é, em série, que exibem considerável variação em seqüência e
número de repetição entre os indivíduos. Os microsatélites, também denominados
seqüências curtas repetidas em tandem STR (Short Tandem Repeats), constituem
uma das principais fontes de marcadores genéticos polimórficos amplamente
utilizados nas áreas forense, antropologia evolutiva e genética médica. A crescente
disponibilidade de enormes bancos de dados de seqüências de DNA humano
acelerou estudos genoma abrangentes e compreensivos quanto à origem e função
dos microsatélites na procura de novas aplicações.
Vários marcadores microsatélites têm sido utilizados tanto no campo da
Genética Médica quanto na Genética Forense. Devido à individualidade do perfil
genético gerado pela genotipagem de microsatélites, este tipo de marcador
polimórfico possibilita não apenas o diagnóstico de aneuploidias, mas também a
determinação da origem parental e meiótica da cópia única ou extra cromossômica
em indivíduos portadores de aneuplodia. A origem parental da cópia extra do
cromossomo X em pacientes com Síndrome Klinefelter ou da cópia única em
pacientes com Síndrome de Turner interfere no quadro clínico desses pacientes
(Stemkens et al., 2006; Sagi et al., 2007). Outra aplicação na Genética Médica é a
genotipagem de microssatélites que segregam em desequilíbrio de ligação, ou seja,
em conjunto com genes importantes como o F8, cujas alterações resultam em
hemofilia A. Os genótipos de locos que segregam em conjunto formam haplótipos.
Na genética Forense, os microssatélites são utilizados na identificação de indivíduos,
tanto no campo de investigação de vínculo de parentesco como na identificação de
criminosos.
Os STR dinucleotídeos são amplamente utilizados para diagnóstico, embora
apenas o marcador DXS1214 foi validado para identificação de indivíduos. Este tipo
de marcador possui como característica intrínseca, um perfil eletroforético de difícil
interpretação devido à formação de stutters que são produtos de amplificação que
diferem do produto real e são inferiores a estes. A taxa de formação de stutter é
inversamente proporcional ao tamanho da unidade de repetição (Fan e Chu, 2007).
2
Notamos que os critérios na escolha de novos marcadores são falhos e que a
sua utilização tem sido baseada em motivos históricos. Até o presente nenhuma
análise criteriosa havia sido feita para as STR localizadas no cromossomo X
amplamente utilizadas pelos laboratórios e cujas análises constituem a maior banco
de dados de freqüências de alelos, haplótipos e taxas de recombinação. Nenhum
marcador pentanucleotídeo localizado no cromossomo X tem sido utilizado, sendo
que as propriedades combinadas de alto poder de discriminação, poucos
microvariantes e baixos níveis de produtos stutter fazem deste tipo de marcador STR
ideal para análise forense (Bacher e Schumm, 1998). Na presente dissertação
propomos trabalhar com uma técnica desenvolvida na década de 90, a Reação
Quantitativa Fluorescente em Cadeia da Polimerase (QF-PCR), que é de baixo custo
e os resultados podem ser entregues em menos de 24 horas.
Nesta dissertação procuramos responder as seguintes questões baseados na
informatividade dos marcadores STR conhecidos: O que é um bom marcador? Um
bom marcador poderia ser predito por uma análise in silico? Essas informações
serão úteis na estratégia da confecção de kits para diagnóstico de doenças ligadas o
cromossomo X e de investigação de vínculo de parentesco.
No Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular (NUDIM) implementamos
e validamos a metodologia para diagnóstico da trissomia livre do cromossomo 21
como teste único (Alves da Silva, 2007), a qual é utilizada na rotina nos casos de
suspeita clínica. Pelo nosso conhecimento, no Brasil, não há outro serviço de
citogenética molecular por QF-PCR. Buscando ampliar o atendimento para
comunidade regional que carece de serviço especializado na área de Genética
Humana, que no estado do Rio de Janeiro é restrito á capital, implementamos
também um teste rápido para a caracterização dos cromossomos sexuais nos
pacientes com constituição alossômica duvidosa (Turner, Klinefelter, genitália
ambígua, Homem XX, Mulher XY).
A dissertação está dividida em dois capítulos. O primeiro capítulo abrange a
estratégia de mineração e validação de novos sítios de microsatélites presentes no
cromossomo X humano. O segundo capítulo descreve a genotipagem de indivíduos
com constituição alossômica duvidosa e dois casos raros, um indivíduo com as
3
síndromes de Down e Klinefelter combinadas, e um indivíduo mosaico com provável
origem por diploidização de um embrião triplóide.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O cromossomo X humano
A origem dos cromossomos sexuais X e Y em humanos parece ser
autossômica, com a aquisição por um dos pares autossômicos de um loco de
determinação sexual como o fator de determinação testicular (TDF-Testis
Determining Factor). O acúmulo de alelos específicos masculinos selecionou a
repressão da recombinação criando uma região específica de X e de Y. A exclusão
da recombinação levou a rápida degradação da região específica masculina
restando somente uma pequena região pseudo-autossômica nas regiões
teloméricas do par sexual (Graves, 2006).
Aproximadamente 155 megabases (Mb) compõem o cromossomo
submetacêntrico X. O conteúdo de 39% G+C é mais baixo que a média do genoma
(41%). Foram anotados 1098 genes (7,1 por Mb), uma das mais baixas densidades
gênicas comparada a outros cromossomos. Os éxons dos 1098 genes
correspondem apenas 1,7% da seqüência completa do cromossomo X e 33% da
seqüência é transcrita. O comprimento médio de um gene no cromossomo X é de 49
Kilobases (Kb). Contudo, o cromossomo X possui o maior gene conhecido do
genoma humano, o da distrofina (DMD) localizado em Xp21.1, que se expande por
2.220.223 bp (Ross et al., 2005).
O cromossomo X possui muitas características que são únicas no genoma
humano. Mulheres herdam um cromossomo X de cada um dos pais, enquanto os
homens herdam somente o cromossomo X materno. Foram anotados 54 genes no
cromossomo X que possuem homólogos funcionais no Y. Embora o cromossomo X
contenha somente 4% de todos os genes humanos, quase 10% das doenças com
padrão de herança mendeliana têm sido atribuídas ao cromossomo X (Ross et al.,
2005).
4
As doenças recessivas ligadas ao X afetam principalmente homens devido ao
caráter de hemizigose para a maioria dos genes. Outras desordens ligadas ao sexo
podem exibir características atípicas que resultam do processo de inativação do
cromossomo X e de conseqüências de mosaicismo em alguns tecidos, o que
significa na ocorrência de células com constituição cromossômica variada (Ballabio
et al., 2006).
2.2. Microsatélites
As seqüências de DNA em tandem, isto é, em série, ocorrem na forma de
unidades de um único a milhares de nucleotídeos. Mono-, di-, tri- e tetranucleotídeos
são os principais tipos de microsatélites, e no conjunto são conhecidas como
seqüências curtas repetidas em tandem (“Short Tandem Repeats”, STR). Repetições
de cinco (penta) ou seis (hexa) nucleotídeos geralmente também são classificadas
como microsatélites. Repetições de unidades mais longas são denominadas de
minisatélites ou, no caso extremo, de DNA satélite (Ellegren, 2004).
Dependendo dos parâmetros utilizados o genoma humano pode apresentar
3,9% de nucleotídeos em microsatélites (Leclercq et al., 2007). Uma comparação do
recém seqüenciado genoma diplóide humano revelou 4.1 milhões de variantes de
DNA entre os genomas haplóides, perfazendo 12.3 Mb. Estas variantes incluem
3.213.401 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), 53.823 substituições de bloco
(2–206 pb), 292.102 eventos de inserção/deleção (indels) (1-571pb) onde estão
representadas as STR (Levy et al., 2007). Desse total, 1.288.319 são variações
novas.
Os microsatélites são predominantemente encontrados em íntrons ou em
seqüências intergênicas. Microsatélites que são usados como marcadores genéticos
normalmente encontram-se nessas regiões. Repetições de trinucleotídeos que estão
associadas com doença em humano incluem uma classe especial de microsatélites
em DNA codificante devido à sua importante associação com patologia em humanos
(Ellegren, 2004; Collins et al., 2003).
5
2.2.1. Mecanismo de formação dos microsatélites.
O mecanismo para expansão e contração de microsatélites é o
desacoplamento, e realinhamento errôneo da DNA polimerase durante a replicação
do DNA. (figura 1). Desta forma, o número de repetições no local pode ser diminuído
ou aumentado a cada replicação. Como conseqüência, surge novos alelos.
As taxas de mutação de contração de alelos estão relacionadas de maneira
exponencial com o tamanho do alelo (Xu et al., 2000) e seqüências longas tendem a
encurtar para prevenir crescimento infinito (Ellegren, 2000). Estudos em
Saccharomyces cerevisiae demonstraram que o limiar para que ocorra mutação
dinâmica nos sítios de microsatélites é mais consistente com o número de
nucleotídeos do que com o número de repetições. O limite mínimo de 8 nucleotídeos
para mono-, di- e tetranucleotídeos foi estabelecido para este modelo (Rose e
Falush, 1998).
Os deslizes da polimerase perante as repetições de DNA são claramente
manifestadas nos produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR, “polymerase
chain reaction”) que podem consistir, além da amplificação do alvo principal, de
mutações de inserção ou deleção que diferem da seqüência alvo original por
múltiplas unidades de repetição (Figura 2) (Shinde et al.,2003). Esses produtos com
menor representação quantitativa são conhecidos como “stutter”. As taxas de
mutação in vitro são maiores que as encontradas in vivo devido ao sistema de
reparo da replicação do DNA. Portanto, a taxa de mutação observada depende da
freqüência de deslizes da polimerase e da eficiência no mecanismo de reparo (Fan e
Chu, 2007).
A taxa de mutação e formação de “stutter” é inversamente proporcional ao
tamanho da unidade de repetição. Locos com imperfeições nessas unidades tendem
a ser menos mutáveis (Fan e Chu 2007). Mutações pontuais também estão
presentes nos microsatélites, embora o mecanismo de deslizamento da polimerase
exceda o número deste tipo de mutação por uma a duas ordens de grandeza
(Pumpernik et al., 2008).
Outro possível mecanismo na origem dos microsatélites é a recombinação
meiótica; porém, como a taxa de mutação em marcadores presentes na região não
6
recombinante do cromossomo Y é similar à observada em locos autossômicos, a
recombinação parece não ser um mecanismo predominante na geração de
variabilidade de STR (Fan e Chu, 2007).
Figura 1. Ilustração esquemática do mecanismo de formação do polimorfismo,
mediante o deslizamento (“slippage”) da polimerase durante a replicação do DNA
(Adaptado de Fan e Chu, 2007).
7
Figura 2. Eletroferograma dos produtos de amplificação de um microsatélite do tipo
dinucleotídeo. Os produtos stutter correspondem aos picos -2,-4, e -6 pares de
nucleotídeos do pico real com 164 pares de base de comprimento (Figura elaborada
de amostra de DNA doada ao NUDIM).
2.3 . Aplicações das STR localizadas no cromossomo X na Genética Médica
2.3.1. Diagnóstico de aneuploidias
Estima-se que de 10 a 30% dos óvulos humanos fertilizados tenham um
número errado de cromossomos, sendo na maioria dos casos, trissômicos ou
monossômicos. Isto tem profundas conseqüências clínicas: aproximadamente um
terço de todos os abortamentos são aneuplóides. Entre concepções que chegam a
termo, a aneuploidia é a principal causa genética de morbidade e retardo mental
(Hassold e Hunt, 2001).
Diversas metodologias têm sido utilizadas para o diagnóstico de aneuploidias.
A principal metodologia continua sendo a cariotipagem, seguido da Hibridação in situ
fluorescente (FISH, “Fluorecent in situ hybridization”) e da reação quantitativa
fluorescente em cadeia da polimerase (QF-PCR, quantitative fluorescence PCR),
sendo esta última utilizada principalmente em testes no pré-natal. É importante notar
que até mesmo no cariótipo por bandeamento G de alta resolução, deleções ou
duplicações <5 Mbp normalmente permanecem indetectáveis. A implicação é que
uma proporção de anormalidades cromossômicas que podem ser associadas com
8
inaptidões física e mental não é diagnosticada habitualmente, até mesmo com este
teste padrão-ouro (Hultén et al., 2003).
2.3.1.1. Síndrome de Klinefelter
O termo Síndrome de Klinefelter descreve um grupo de desordens
cromossômicas no qual há pelo menos um cromossomo X adicional ao cariótipo
masculino normal, 46,XY. A forma clássica é a mais comum desordem
cromossômica, na qual há um cromossomo X extra, resultando no cariótipo 47,XXY.
(Visootsak et al., 2006). Stemkens e colaboradores (2006) encontraram que
pacientes com o cromossomo X extra de origem paterna tinham mais problemas
motores e na fala que aqueles que portavam o X materno. Observaram também um
significante aumento no tamanho corporal no grupo com o X paterno, que concorda
com os dados que o crescimento é influenciado por genes derivados paternalmente.
Os dados sugerem que ocorre imprinting genômico do cromossomo X em homens
com constituição alossômica XXY. O imprinting genômico é um processo de herança
independente da herança mendeliana, pelo qual certos genes são expressos
seguindo um padrão de origem parental específico, o que resulta na modificação
herdada e reversível de um alelo que não altera a seqüência de nucleotídeos
determinada pelo sexo do genitor (Pasternak, 2005). Assim sendo, os genes sujeitos
à imprinting genômico são expressos somente a partir do alelo herdado da mãe ou
do alelo paterno.
A freqüência de nascidos vivos com Síndrome de Klinefelter é
aproximadamente 1 em 1000 meninos. A origem parental do cromossomo X
adicional em homens acometidos pode ser tanto paterna (50 a 60%) quanto materna
(40 a 50%). É possível a ocorrência de dupla aneuploidia em um mesmo indivíduo.
As freqüências de dupla aneuplodia, com exceção de 48,XXY,+21, são mais baixas
que o esperado, provavelmente por causa da forte seleção contra tais gravidezes.
Acometidos por dupla aneuplodia 48,XXY,+21 geralmente possuem mães com idade
superior a 35 anos e poucos estudos têm estabelecido a origem parental e meiótica
da não disjunção nestes casos (Kovaleva et al., 2005)
9
2.3.1.2. Síndrome de Turner
A Síndrome de Turner, também conhecida como Ullrich-Turner, pode ser
definida como a combinação de características físicas e a completa ou parcial
ausência do segundo cromossomo X, com ou sem mosaicismo celular. É uma
desordem cromossômica comum que afeta 1 a cada 2000 meninas nascidas vivas
(Saenger et al., 2001).
Todos os indivíduos com suspeita de Turner devem ser cariotipados. Células
suficientes devem ser contadas para identificação de possível mosaicismo. Embora
o cariótipo de sangue periférico seja geralmente adequado, se há forte suspeita
clínica da síndrome, apesar do cariótipo normal, um segundo tecido tal como pele
deve ser genotipado (Saenger et al., 2001). A determinação de derivativos do
cromossomo Y em pacientes com cariótipo 45,X é importante para o manejo dessas
pacientes devido ao aumento de risco de gonadoblastoma. Baixo nível de
mosaicismo do cromossomo Y pode não ser detectado por métodos citogenéticos
convencionais (Semerci et al., 2007).
Cerca de 60 a 80 % das pacientes Turner retém o X materno. Sagi e
colaboradores (2007) encontraram que malformações renais foram exclusivamente
encontradas em pacientes com o X materno retido. Anomalias oculares foram mais
comuns nas pacientes que possuíam o X paterno retido. Os dados sugerem um
potencial efeito de um indeterminado “imprinting” genômico no cromossomo X. Deve
ser enfatizado que indivíduos com Síndrome de Turner podem ser saudáveis, felizes
e serem membros produtivos da sociedade (Saenger et al., 2001).
2.3.2 Determinação e diferenciação sexual.
A história das idéias sobre a origem do sexo masculino e feminino tem pelo
menos três mil anos. As explicações bíblicas para a origem de Eva e as opiniões dos
filósofos da Grécia antiga relacionam-se de forma surpreendente com as idéias
atuais. Pode-se dizer que o estudo científico da determinação do sexo iniciou-se no
século XVII com a descoberta dos espermatozóides, mas sua origem e função foram
desvendadas em 1841. Somente no primeiro quarto do século XX que a
10
determinação do sexo por controle ambiental deu lugar à determinação
cromossômica do sexo (Mittwoch, 2005).
Os eventos de determinação sexual e diferenciação sexual podem ser
entendidos em 4 etapas: Determinação do sexo cromossômico, que é estabelecida
na fertilização; a diferenciação das gônadas em testículos ou ovários; a
diferenciação dos genitais internos e externos masculinos ou femininos a partir de
estruturas indiferenciadas presentes no embrião, que é dependente da presença ou
ausência de testículos; e as diferenciações secundárias, em resposta à vários
hormônios produzidos pelas gônadas para completar o fenótipo sexual (Mello et al.,
2005).
O gene SRY (“Sex-determining Region on Y chromosome”) codifica um fator
de transcrição que é membro da família de proteínas do grupo de alta mobilidade
que se ligam ao DNA. Mutações neste gene em indivíduos com constituição
alossômica XY resultam em mulheres que apresentam disgenesia gonadal. A
translocação de parte do cromossomo Y contendo este gene para o cromossomo X
pode resultar em homens XX (Anderson et al., 1986). Em cerca de 80% dos homens
XX detecta-se a presença do gene SRY. Como os genes responsáveis pela
espermatogênese estão no braço longo do cromossomo Y, que homens XX não
possuem, esses pacientes são inférteis. No entanto, a caracterização do gene SRY
não esclareceu totalmente o problema da determinação gonadal, porque ficou
aparente que outros genes nos cromossomos sexuais ou em autossomos também
estão implicados nesse processo que foi se revelando muito mais complexo do que
imaginado inicialmente (Damiani et al., 2001).
2.3.2.1 Ambigüidade genital
Dentre as várias situações que podem configurar uma emergência pediátrica
do recém nascido, as ambigüidades genitais são de importância enorme tanto do
ponto de vista imediato, já que algumas etiologias (hiperplasia adrenal congênita,
síndromes malformativas) colocam a vida do neonato em risco, como em longo
prazo, em que uma situação mal definida quanto ao sexo acarretará prejuízos
irreparáveis ao bem-estar psico-social do indivíduo. Os problemas relacionados ao
11
determinismo gonadal abrangem o Hermafroditismo Verdadeiro, a disgenesia
gonadal mista, Homem XX, Pseudo-Hermafroditismo Feminino (PHF) e Pseudo-
Hermafroditismo Masculino (PHM) (Damiani et al., 2001).
O perfil etiológico em pacientes com genitália ambígua em um centro de
referência na Índia mostrou que 27% dos casos eram devido a PHF com hiperplasia
adrenal congênita, sendo 76,7% destes sob a forma perdedora de sal. A freqüência
de PHM foi de 52,3% em pacientes que tinham como principal categoria a síndrome
de insensibilidade a andrógenos (28%) e à deficiência na enzima 5 alfa-redutase
(23%) (Joshi et al., 2006).
Homens XX SRY+ geralmente possuem genitália masculina. Homens XX
SRY- possuem genitália ambígua ou normal e mostram gradação diversa (Rajender
et al., 2006). São raros os relatos de pacientes na faixa etária pediátrica de homens
XX, e o diagnóstico é feito nos casos com ambigüidade genital ou ginecomastia. A
constituição alossômica discordante, em alguns casos só é aparente ao exame
citogenético. Por exemplo, um homem XX foi detectado pela citogenética para
confirmação da Síndrome de Down, já que sua genitália externa não era ambígua,
podendo tratar-se de coincidência dessas duas situações clínicas ou haver alguma
relação entre elas ainda desconhecida (Damiani et al., 2005).
Como mencionado, além do SRY outros genes estão envolvidos na
diferenciação sexual. A ocorrência de cromossomo 13 em anel pode levar a
ambigüidade genital. A banda q34 está sempre ausente nos casos de genitália
ambígua com anormalidades do cromossomo 13, sugerindo que 13q34 possui
genes envolvidos no desenvolvimento genital (Sankar e Phadke, 2006).
Um caso de genitália ambígua em um dos irmãos gêmeos, sendo o outro
fenotipicamente masculino, chamou atenção de pesquisadores que constataram que
citogenética e molecularmente os gêmeos eram quimeras, e apresentavam ambos
os componentes maternos, porém um único componente paterno, suportando assim
a existência de um novo tipo de gemelaridade (Souter et al., 2007).
As propostas terapêuticas, no caso de neonatos portadores de genitália
ambígua, têm focado na definição sexual com o objetivo de minimizar os possíveis
traumas na criança ou, por outro lado, a resolução do dilema médico. O aspecto
12
psico-social da doença, das relações familiares, da aceitação da criança portadora
por ela mesma e pela família, tem sido em alguns serviços renegados a um segundo
plano em detrimento a gravidade do quadro (Silva et al., 2006). Estudos com pais de
portadores de genitália ambígua mostraram que os dois aspectos que se
destacaram nas falas dos pais foram o medo e a ansiedade. As principais formas de
enfrentamento foram a projeção, a negação/fuga e a racionalização (Silva et al.,
2006).
2.3.3. Hemofilia
No passado, muitas culturas compreenderam que alguns distúrbios humanos
tendem a ocorrer em famílias e responderam com tradições médicas e culturais para
acomodar este fenômeno até então inexplicável. O Judaísmo, por exemplo, requer a
circuncisão dos meninos, que é feita 8 dias após o nascimento. Entretanto, a lei do
Talmud, estabelecida a mais de 1.500 anos, criou exceções específicas. Se duas
irmãs perderam um filho como resultado de sangramento excessivo após a
circuncisão, nem elas nem outras irmãs teriam de submeter os filhos subseqüentes
ao procedimento. Embora não totalmente exatos, esses preceitos religiosos tornam
a herança da hemofilia recessiva ligada ao cromossomo X, um dos mais antigos
distúrbios genéticos registrados (Pasternak, 2005).
A hemofilia A (OMIM 306700) é a desordem hemorrágica mais comum e
severa em humanos, causada por qualquer inversão patológica nos íntrons ou por
quase 1700 mutações recorrentes de diferentes tipos (deleções, inserções, parada e
perda de sentido e mutações nos sítios de “splicing”), todas no gene (F8), do fator de
coagulação VIII. (Goodeve and Peake 2003, Kemball-Cook 2005, Oldenburg, et al.,
2004), que codifica uma glicoproteína fundamental de uma rede funcional de
proteínas estruturais e enzimas que integram a cascata de coagulação sanguínea.
O gene F8 humano está localizado na banda Xq28, com 186 kb de extensão
e compreende 26 éxons (Gitschier et al., 1986). A análise direita de mutação no
gene F8 em famílias com acometidos pela hemofilia A não é prática e tem um custo
que não permite sua realização, particularmente em países do terceiro mundo,
devido à natureza heterogênea das mutações patogênicas, pelo grande tamanho e
13
complexidade do gene F8. Ao invés disto, a análise genética de ligação (ver item
2.4.1.) com marcadores polimórficos F8 intragênicos e/ou extragênicos localizados
próximo ao gene, tais como os marcadores STR, é uma estratégia aceita para um
diagnóstico indireto e aconselhamento genético em famílias de portadores
(Harraway et al., 2006).
O número de elementos STR validado para este fim tem sido limitado a 14,
das quais 13 são dinucleotídeos, que apresentam perfis de difícil interpretação. Um
desses marcadores havia sido mapeado erroneamente e foi relocado para o loco
correspondente (Machado e Medina-Acosta, 2008a). No presente trabalho também
foram definidos novos sítios de microsatélites que serão úteis na identificação de
mulheres portadoras do gene mutante e no aconselhamento genético (Machado e
Medina-Acosta, 2008b).
2.4 Aplicações Forenses das STR no cromossomo X.
A idéia fundamental de utilizar marcadores do cromossomo X na prática
forense veio de experiências feitas na segunda metade do século passado no
campo da genética clínica (Szibor, 2007). A genotipagem de marcadores do
cromossomo X pode complementar a análise de autossomos e marcadores Y muito
eficientemente, especialmente em casos complexos de parentesco.
A característica especial da tipagem do cromossomo X em casos de
deficiência de indivíduos na análise de vínculo de parentesco pode ser explicada
pelos fatos seguintes: A tipagem do cromossomo X em homens com constituição
alossômica típica XY revela automaticamente seu haplótipo; homens transmitem seu
cromossomo X inteiro para suas filhas; todas as irmãs de pai biológico comum
compartilham o haplótipo X paterno; todos os alelos não compartilhados por irmãs
devem ser de origem materna e a genotipagem de dois ou mais irmãos indica
grande parte do genótipo materno. Além disso, é muito provável que haplótipos de
grupos de ligação permaneçam estáveis ao longo de muitas gerações (Szibor et al.,
2003d).
As investigações de rotina em que se aplica o teste de paternidade
compreendem trios (suposto pai, mãe e criança) ou duos (suposto pai e criança). As
14
inconsistências podem ser devido à mutações ou o verdadeiro pai ser parente
próximo do suposto pai testado, especialmente um irmão. Quando há poucas
inconsistências (< 2), a análise de marcadores STR do cromossomo X é importante
na resolução de casos envolvendo pai e filha (Silveira et al., 2007) e somente
poucos marcadores são requeridos para fornecer uma boa evidência em casos de
suposta meia-irmandade entre filhas (Hering et al., 2001). O teste também é útil em
casos de incesto ou onde os supostos pais são pai e filho e em casos de estupro
para complementar a investigação no pré-natal (Szibor,2007)
Vários locos têm sido validados para aumentar o painel de marcadores do
cromossomo X (Edelmann et al., 2003) e nos últimos anos vários países têm criado
bancos populacionais de freqüências alélicas, utilizando sistemas multiplex de
genotipagem (Shin et al., 2004; Bini et al., 2005; Pepinski et al., 2005; Poetsch et al.,
2005; Gu e Li, 2006; Gomes et al., 2007). Os marcadores STR utilizados por
laboratórios no mundo têm sido limitados a apenas 39. Esses marcadores se
localizam em íntrons e seqüências intergênicas; apenas o marcador HumARA está
localizado no éxon 1 do gene receptor de andrógenos e cujo número de repetições
está relacionado a aumento de risco a diversas patologias humanas. Portanto, é
recomendada a substituição deste marcador para que se mantenha a privacidade
individual (Szibor et al., 2005a).
Uma das características importantes da informatividade de cada marcador é o
seu poder de discriminação (PD), que no caso dos marcadores localizados no
cromossomo X pode ser definido matematicamente pelas fórmulas [1-∑ fi2], para
homens, e [1-2 (∑ fi2)2 + ∑ fi4] para mulheres, onde f é a freqüência de cada alelo (i)
em um determinado loco (Szibor et al., 2003a). Quanto maior o PD mais informativo
é o marcador. Outra característica importante na eficiência dos marcadores é o
poder de exclusão (PE); porém, mais de uma fórmula tem sido utilizada pela
comunidade científica.
Um novo sistema Mini X-STR foi implementado útil para genotipar DNA
degradado com produtos de amplificação variando entre 76 e 169 pares de
nucleotídeos para 8 marcadores (Asamura et al., 2006a). Neste sistema os sítios de
anelamento dos iniciadores ficam bem próximos dos microsatélites.
15
A taxa de mutação obtida para 16 marcadores do cromossomo X é 2,09 x 10-3
por meiose, similar àquelas descritas para marcadores STR autossômicos (Szibor et
al., 2003a). É de grande importância possuir DNA referência (K562 ou 9947) para
nomear os alelos, pois a designação alélica pode variar entre as publicações
impossibilitando a comparação entre os dados (Szibor et al., 2003b). Sabe-se que a
análise dos produtos da PCR por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração
com prata não é segura na discriminação de alelos que diferem de apenas 1
nucleotídeo. Deve-se então ser criterioso na nomeação de alelos para evitar
designações erradas que poderiam significar mutações, e portanto, alelos de
exclusão. Nesse sentido, os dados de algumas publicações devem ser
reconsiderados (Szibor et al., 2003c). Maiores informações sobre pesquisa forense
do cromossomo X estão disponíveis online no endereço www.chrx-str.org (Szibor et
al., 2006).
2.4.1 Desequilíbrio de ligação e haplótipos
O desequilíbrio de ligação (LD) é a associação não aleatória entre diferentes
locos, ou seja, há uma freqüência de uma determinada combinação entre alelos,
diferente da esperada pelo produto de suas freqüências individuais. Portanto,
marcadores em LD segregam em bloco formando haplótipos. Em um estudo
realizado por Szibor e colaboradores (2005b) com um grupo de 3 marcadores
ligados eram esperados teoricamente 1144 diferentes haplótipos baseados no
número de alelos observados para cada marcador; porém, de 806 homens
genotipados, foram encontrados 207 diferentes haplótipos. Logo, se os marcadores
se mostrarem estar em forte desequilíbrio de ligação a freqüência haplotípica não
pode ser calculada com base na freqüência alélica de cada loco individual, mas deve
ser estimada diretamente (Hering et al., 2006).
A análise simultânea de marcadores STR localizados no mesmo cromossomo
requer conhecimento sobre a distância dos pares e desequilíbrio de ligação entre
eles. A validação de novos marcadores deve inevitavelmente incluir um preciso
mapa de ligação. Como convenção a distância física de 1 megabase (Mb)
corresponde a distância genética de 1 centiMorgan (cM) isto é, uma recombinação
16
esperada em 100 meioses. Porém, a distância física e genética não são estritamente
correlacionadas (Szibor et al., 2003a).
Junto com mutação, o principal mecanismo de variabilidade genética em
eucariotes é a recombinação meiótica entre pares de cromossomos homólogos. A
abordagem básica para estudar taxas de recombinação no genoma é construir um
mapa genético por genotipagem, com uma alta densidade de marcadores, um
grande número de indivíduos em famílias e então agrupar os dados no mapa físico
correspondente (Kong et al., 2002). A taxa de recombinação varia enormemente
pelo genoma humano, com a maioria dos eventos ocorrendo em estreitas “zonas
quentes”. Setenta e dois por cento dos eventos de recombinação ocorrem em “zonas
quentes” inferidas por estudos de desequilíbrio de ligação (Coop et al., 2008).
17
CAPÍTULO I
Mineração de microsatélites no cromossomo X
18
3. OBJETIVOS
• Realizar uma análise in silico (computacional) compreensiva para
microsatélites no cromossomo X humano.
• Validar in silico marcadores pentanucleotídeos para diagnóstico genético
e investigação de parentesco.
• Validar in silico marcadores no gene do fator VIII de coagulação
sanguínea e adjacências para o diagnóstico indireto da hemofilia A.
19
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Mineração de microsatélites nas regiões Xp e Xq
Os cromossomos X referência disponíveis no NCBI (National Center for
Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) com os números de acesso
NC_000023, AC_000066, AC_000155 tiveram suas seqüências de nucleotídeos
varridas em busca de marcadores do tipo STR. Para tal, foi utilizado o programa
Tandem Repeat Finder TRF (Benson, 1999). Este software utiliza um algoritmo
capaz de encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela
freqüência de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma seqüência
referência com repetições perfeitas em série.
Quanto maior for o número de repetições e o tipo de repetição, maior será a
pontuação final. Por exemplo: 10 repetições perfeitas de tetranucleotídeos
apresentam pontuação igual a 80, enquanto 10 de dinucleotídeos apresentam
pontuação 40. Vinte repetições dinucleotídicas fazem 80 pontos. As seqüências
imperfeitas possuem pontuação menor do que as perfeitas com o mesmo número de
repetições, exemplo: a seqüência [AC AC AC AT AC AC AC AC] possui pontuação
menor do que a seqüência [AC AC AC AC AC AC AC AC]. Os descontos na
pontuação final dependem da proporção dos erros de pareamento com uma
seqüência perfeita. Os parâmetros de busca das repetições ({2,3,5}, {2,5,5}, {2,5,7},
{2,7,7}) também influenciam na pontuação final. O primeiro valor fixo {2} corresponde
à identidade e o segundo e terceiro valores {3 ou 5 ou 7} às imperfeições. O
parâmetro que desconta o menor valor da pontuação final devido às imperfeições é
o {2,3,5}; portanto, o mais permissivo. Por outro lado o {2,7,7} é o mais estringente.
No presente trabalho foi utilizado o parâmetro mais estringente.
Este programa foi utilizado pelo consórcio internacional de seqüenciamento
do genoma humano, que concluiu que repetições de 1-6 nucleotídeos constituem
1,5% do genoma humano e este valor pode aumentar para 3,9% utilizando outros
parâmetros (Leclercq et al., 2007).
4.2. Critérios de seleção para locos potencialmente polimórficos
Para selecionar novos marcadores potencialmente polimórficos foram
avaliados aqueles elementos STR com pontuação mínima de 80 e identidade de
20
90%; estes critérios correspondem aos valores mínimos apresentados por 97% e
79% dos tetranucleotídeos validados na Genética Forense, respectivamente. Outros
critérios foram utilizados para incluir os dinucleotídeos no mapa de alta resolução de
marcadores intragênicos e adjacentes ao Fator VIII (F8) de coagulação sanguínea
(Machado e Medina-Acosta, 2008b). As regiões pseudo-autossômicas não foram
avaliadas.
4.3. Validação in silico do polimorfismo
A natureza polimórfica dos locos STR foi validada utilizando banco de dados
dos 3 cromossomos X referência, NC_000023, AC_000066, AC_000155. As
seqüências dos 3 genomas foram alinhadas para cada loco microsatélite usando o
programa online Multiple Sequence Alignment CLUSTALW (http://align.genome.jp/)
para identificar variantes alélicas. Todos os locos foram qualificados utilizando uma
escala de polimorfismo in silico variando de 1 (um alelo) a 3 (três alelos).
4.4. Desenho de Iniciadores
Iniciadores foram desenhados apenas para novos marcadores na região
Xq28. Para as demais regiões, os valores correspondem à posição física em pares
de nucleotídeos do início e fim dos microsatélites.
Para o desenho de iniciadores ao redor das seqüências repetidas foram
utilizados os programas livres e online: OligoPerfect™ Designer da Invitrogen™
(http://www.invitrogen.com/) e o OligoCalc - Oligonucleotide Properties Calculator
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html). Os iniciadores
desenhados possuem de 18-22 nucleotídeos e amplificam produtos in silico de 100
a 450pb (Machado e Medina-Acosta, 2008b).
4.5. Construção de um mapa genético para STR no cromossomo X.
Para construção do mapa genético foram utilizadas as informações do mapa
combinado de ligação e mapa físico para o genoma humano (Rutgers Map)
elaborados por pesquisadores da Universidade Rutgers (Matise et al., 2007),
também disponível online (http://compgen.rutgers.edu/maps/). Neste mapa estão
presentes 779 marcadores no cromossomo X entre eles, SNPs, STRs, e RFLPs
(Random Fragment Length Polymorphism). O Rutgers é o mapa de ligação mais
informativo até o presente. Essas informações são utilizadas para, por meio de
21
interpolação, estimar a distância genética, conhecida a posição física do marcador a
partir da região telomérica do braço curto cromossômico. A posição genética pode
ser estabelecida para múltiplos marcadores que não estão presentes no mapa por
interpolação das distâncias genéticas conecidas.
22
5. RESULTADOS
5.1. Abundância de microsatélites no cromossomo X Humano
A quantidade de microsatélites variou de acordo com os parâmetros de
estringência da mineração utilizados. O número de elementos STR di- à
pentanucleotídeos variou de 34369 a 743 do critério menos estringente ({2,3,5} com
pontuação mínima igual a 20) para o mais estringente ({2,7,7} com pontuação
mínima igual a 150), respectivamente. A distribuição dos elementos identificados em
cada análise está representada na figura 3.
Figura 3. Distribuição de elementos STR encontrados no cromossomo X
humano segundo estringência da mineração. O quadro inferior relaciona, na
horizontal, a pontuação mínima de 20 a 150 e, na vertical, os critérios de
estringência {2,3,5} a {2,7,7}.
5.2. Informatividade dos marcadores utilizados em Genética Forense.
Após uma revisão sistemática da literatura foram encontrados apenas 39
locos validados para uso em Genética Forense. A distribuição segundo o tamanho
da repetição pela análise com o TRF foi: um STR dinucleotídeo, 4 STR
trinucleotídeo, 1 STR hexanucleotídeo e 33 STR tetranucleotídeo.
O marcador DXS8377 reconhecido como um hexanucleotídeo pelo TRF é na
verdade um trinucleotídeo previamente confirmado por seqüenciamento. Análise
deste loco com o programa IMEX (Imperfect Microsatelte Extractor) (Mudunuri e
23
Nagarajaram, 2007) também reconhece este padrão. O resultado da caracterização
dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética forense, localizados no
cromossomo X referência NC00023 quanto à localização, número de cópias,
identidade, pontuação e validação in silico, estão resumidos na Tabela 1. Os valores
mínimos de número de cópias, identidade e pontuação para tetranucleotídeos foram
de 10, 74 e 77, respectivamente. O sucesso de validação in silico do polimorfismo
para esse conjunto de marcadores foi de 79,5% (31/39). A Figura 4 ilustra a
validação in silico do loco DXS6807.
Considerando um bom marcador aquele que possui um alto poder de
discriminação e uma alta taxa de heterozigosidade, foram feitos levantamentos
sobre esses dados em publicações de revistas especializadas em biologia forense,
Tabelas 2,3,4 e 5. Estas tabelas relacionam o número observado de alelos (Tabela
2), a heterozigosidade observada (Tabela 3) e poder de discriminação em mulheres
(Tabela 4) e homens (Tabela 5) conforme dados da literatura (eixo horizontal) para
cada marcador (eixo vertical).
24
Tabela 1. Caracterização dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética
forense, localizados no cromossomo X referência NC00023.
Loco
S
eqü
ênci
a co
nse
nso
Localização a
Nú
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o d
e có
pia
s
Iden
tid
ade
(%)
Po
ntu
ação
Val
idaç
ão
in silico
1 DXS6807 TATC 4753382-4753648 15,3 92 104 3 2 DXS9895 TCTA 7387107-7387253 14,8 96 111 2 3 DXS10135 AAGA 9266321-9266515 36,5 83 180 2 4 DXS8378 ATAG 9330226-9330429 10,0 100 80 2 5 DXS9902 TAGA 15233537-15233708 11,0 100 88 2 6 DXS1214 TG 31170715-31170926 17,5 100 70 1 7 DXS6810 TAGA 42803634-42803854 22,0 90 131 2 8 DXS10076 GAAG 48194253-48194448 30,5 94 208 3 9 DXS10077 CCT 48201954-48202094 20,7 96 106 1* 10 DXS10078 AAAG 48207132-48207275 26,3 86 151 2 11 DXS7132 GATA 64572061-64572348 17,8 91 117 1 12 DXS10079 GAAA 66632579-66632883 23,0 95 166 2 13 AR GGC 66683000-66683210 17,3 100 104 1 14 DXS10074 AAAG 66893842-66894040 17,8 94 124 2 15 DXS10075 TAGA 66914898-66915133 18,3 97 137 2 16 DXS981 AGAT 68114084-68114270 14,3 96 105 3 17 DXS6800 TATC 78567066-78567259 18,5 88 112 3 18 DXS6803 GATA 86317826-86317938 11,5 100 92 2 19 DXS9898 TATC 87683075-87683268 25,3 78 107 2 20 DXS6801 TAGA 92397828-92397957 13,3 91 88 1 21 DXS6809 GATA 94824809-94825067 40,3 91 259 2
22 DXS6789 AGAT
95336070-95336210 14,3 92 96
2 ATAC 9,8 100 78
23 DXS6799 TATC 97265570-97265829 16,0 93 110 1 24 DXS7424 ATT 100505472-100505639 17,0 100 102 1
25 DXS101 TTC
101299672-101299898 17,7 100 106
2 TTA 14,3 100 86
26 DXS6797 TCTA 107367721-107367989 60,8 74 186 3 27 DXS7133 ATAG 108928199-108928320 11,8 100 94 2 28 DXS6804 TATC 111999363-111999547 13,0 100 104 2 29 GATA172D05 AGAT 113061249-113061368 10,8 94 77 2 30 DXS7130 TATC 118084196-118084371 12,3 100 98 1 31 GATA165B12 AGAT 120705649-120705777 11,3 95 81 2 32 HPRTB TCTA 133443071-133443357 18,0 91 117 3 33 DXS10101 AGAA 133482143-133482342 35,3 86 200 2 34 GATA31E08 AGAT 140061921-140062168 12,5 100 100 2 35 DXS9908 TATC 142768992-142769215 16,8 93 116 2 36 DXS8377 AGAAGA 149317129-149317374 29,5 95 255 3 37 DXS10134 AAAG 149400732-149400979 46,5 86 250 3 38 DXS7423 TGGA 149461561-149461747 17,8 92 115 2 39 DXS10011 TCTT 150938682-150939074 41,3 95 278 2
a Distância (em pares de bases) de Xp-tel ;*Disponível em 2 Cromossomos referência
25
Sequence 1: ref|NC_000023.9| 267 bp Sequence 2: ref|AC_000066.1| 263 bp Sequence 3: ref|AC_000155.1| 251 bp ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 TCTATCTATCTATCTATCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 ----------------TCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 TCTATCTATCTA----TCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ********************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AAATGAGATCATTGCTC ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AAATGAGATCATTGCTC ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AAATGAGATCATTGCTC *****************
Figura 4. Validação in silico do loco DX6807. Em vermelho e em rosa são
realçados os sítios de anelamento dos iniciadores sentido e anti-sentido
respectivamente. Os produtos da amplificação variam de 251 a 267 pares de
nucleotídeos para os três genomas referência.
26
Tab
ela
2. M
édia
do
núm
ero
de a
lelo
s em
dife
rent
es p
opul
açõe
s pa
ra m
arca
dore
s S
TR
X-e
spec
ífico
s.
Watanabe et al.,2000
Koyama et al., 2002
Zarrabeitia et al., 2002
Edelmann et al., 2002
Edelmann e Szibor, 2003
Edelmann et al., 2003
Huang et al., 2003
Hering et al., 2004
Shin et al., 2004
Chen e Pu, 2004
Lee et al., 2004
Zarrabeitia et al., 2004
Edelmann e Szibor, 2005
Shin et al., 2005
Bini et al., 2005
Pepinski et al., 2005
Poetsch et al., 2005
Tabbada et al., 2005
Yu et al., 2005
Asamura et al., 2006 a
Edelmann et al., 2006
Augustin et al., 2006
Hering et al., 2006
Zarrabeitia et al., 2006
Poetsch et al., 2006
Robino et al., 2006
Asamura et al., 2006 b
Turrina et al., 2007 a
Zalán et al.,2007
Rodrigues et al., 2007
Turrina et al., 2007 b
Aler et al., 2007
Pereira et al., 2007
Pico et al., 2008
Gomes et al., 2007
Zalán et al., 2008
Número médio de alelos
DX
S68
07
8
8
8
6
6
7
7
DX
S98
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7
7
8
7
DX
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29
29
DX
S83
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7
5 6
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6 5
5
6
DX
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DX
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DX
S10
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DX
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13
DX
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12
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8
DX
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13
13
DX
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13
14
DX
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14
14
DX
S98
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14
13
DX
S68
00
7
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DX
S68
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9
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8
DX
S98
98
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8
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11
7 7
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8
DX
S68
01
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DX
S68
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12
11
11
11
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11
10
16
12
DX
S67
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11
10
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13
10
13
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10
10
11
11
11
27
DX
S67
99
6
6
DX
S74
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11
9
10
10
DX
S10
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16
10
17
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17
15
15
14
DX
S67
97
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11
10
DX
S71
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6
7
5
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DX
S68
04
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GA
TA
172D
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6
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9 6
7
DX
S71
30
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12
11
AR
17
18
19
22
17
15
18
GA
TA
165B
12
6
6
6
HP
RT
B
8
6
10
7 10
8
8 8
8 6
9
10
9 9
7 9
8 9
8
GA
TA
31E
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9
9
10
9
DX
S10
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20
20
DX
S99
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DX
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18
19
17
20
17
17
19
20
19
20
19
DX
S10
134
23
23
DX
S74
23
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5
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4
4 7
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7 7
6 5
7
6
DX
S10
011
36
29
34
32
37
30
28
37
25
37
33
28
Tab
ela
3. H
eter
ozig
osid
ade
méd
ia p
ara
mar
cado
res
ST
R X
-esp
ecífi
cos
em d
ifere
ntes
pop
ulaç
ões.
Hering et al., 2001
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Edelmann et al., 2003
Huang et al., 2003
Hering et al., 2004
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Shin et al., 2005
Pepinski et al., 2005
Poetsch et al., 2005
Yu et al., 2005
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Edelmann et al., 2006
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Turrina et al., 2007 a
Zalán et al.,2007
Rodrigues et al., 2007
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Aler et al., 2007
Pico et al., 2007
Zalán et al., 2008
Heterozigosidade média
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,67
,6
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,7
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,6
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,68
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,7
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DX
S10
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,93
,93
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,6
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,65
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,65
,65
DX
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,62
DX
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,75
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,51
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,86
DX
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DX
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6
,75
DX
S67
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0
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DX
S74
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,7
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1
,8
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1
,6
3
,72
DX
S10
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,8
3
,83
,8
8 ,8
3
,8
6 ,8
1
,90
,77
,76
,8
3
DX
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,6
7
,7
1
DX
S71
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,69
,49
,66
,53
,6
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DX
S68
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4
,74
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172D
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,7
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DX
S71
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,79
,7
5
,7
7
AR
,8
9
,91
,90
GA
TA
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,6
1
,6
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,6
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HP
RT
B
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,78
,74
,80
,55
,7
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,7
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5
,73
GA
TA
31E
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,8
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,8
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,86
,86
DX
S99
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,9
0
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,9
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,92
DX
S10
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,85
,85
DX
S74
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,59
,76
,5
2
,54
,60
,78
,66
,69
,68
,61
,6
4
DX
S10
011
,9
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5
,95
,9
4
,95
,9
4
,9
5
30
Tab
ela
4. P
oder
de
disc
rimin
ação
méd
io p
ara
mar
cado
res
ST
R X
-esp
ecífi
cos
em m
ulhe
res
de d
ifere
ntes
pop
ulaç
ões.
Hering et al., 2001
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Edelmann et al., 2003
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Zarrabeitia et al., 2004
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Edelmann et al., 2006
Augustin et al., 2006
Hering et al., 2006
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Rodrigues et al., 2007
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Pereira et al., 2007
Pico et al., 2007
Zalán et al., 2008
Becker et al.,2008
Poder de discriminação médio
DX
S68
07
,8
3
,85
,8
2
,8
8
,81
,8
4
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,9
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,9
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DX
S10
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,99
,99
DX
S83
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,7
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,86
,82
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DX
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DX
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,7
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DX
S10
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DX
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DX
S10
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,9
5
DX
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,90
,8
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,9
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,89
,90
DX
S10
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DX
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DX
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,94
DX
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,7
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DX
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DX
S98
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,85
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0
,9
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,91
,87
,89
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S68
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,82
,79
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DX
S68
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,9
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,93
,94
,93
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,94
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S67
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,9
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,87
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S67
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,9
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,94
,90
,85
,85
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,8
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DX
S10
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,97
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,94
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,97
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,9
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DX
S67
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,88
,88
DX
S71
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,8
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,79
DX
S68
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,89
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TA
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,9
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,93
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DX
S71
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,89
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,9
2
AR
,97
,98
,98
,9
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,98
GA
TA
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HP
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B
,9
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,8
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,9
0
,83
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,89
,80
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,91
,90
,88
,88
,90
,90
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8
GA
TA
31E
08
,91
,92
,94
,93
,92
DX
S10
101
,92
,98
,95
DX
S99
08
,91
,9
1
DX
S83
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,98
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,99
,9
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,9
8 ,9
9
,99
,99
,99
,98
DX
S10
134
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,96
,97
DX
S74
23
,8
6
,67
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4
,71
,73
,87
,82
,81
,85
,84
,85
,8
8 ,8
1
DX
S10
011
1,
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0
1,
0
1,0
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,99
1,
0
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0
32
Tab
ela
5. P
oder
de
disc
rimin
ação
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mar
cado
res
ST
R X
-esp
ecífi
cos
em h
omen
s de
dife
rent
es p
opul
açõe
s.
Hering et al., 2001
Zarrabeitia et al., 2002
Edelmann et al., 2002
Edelmann e Szibor, 2003
Edelmann et al., 2003
Huang et al., 2003
Hering et al., 2004
Shin et al., 2004
Lee et al., 2004
Zarrabeitia et al., 2004
Edelmann e Szibor, 2005
Shin et al., 2005
Pepinski et al., 2005
Poetsch et al., 2005
Yu et al., 2005
Asamura et al., 2006 a
Edelmann et al., 2006
Augustin et al., 2006
Hering et al., 2006
Zarrabeitia et al., 2006
Poetsch et al., 2006
Robino et al., 2006
Asamura et al., 2006 b
Turrina et al., 2007 a
Zalán et al.,2007
Rodrigues et al., 2007
Turrina et al., 2007 b
Aler et al., 2007
Pereira et al., 2007
Pico et al., 2007
Zalán et al., 2008
Poder de discriminação médio
DX
S68
07
,7
0
,69
,6
6
,7
2
,63
,68
DX
S98
95
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4
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5
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5
DX
S10
135
,94
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DX
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0 ,7
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0 ,5
5
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,67
,57
,68
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9 ,7
2 ,6
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4
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DX
S99
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,6
6
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DX
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14
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,73
DX
S68
10
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7
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DX
S10
076
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8
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DX
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077
,5
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DX
S10
078
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2
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DX
S71
32
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6
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,76
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,7
5
DX
S10
079
,81
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DX
S10
074
,83
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DX
S10
075
,69
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DX
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1
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DX
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DX
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1
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6
DX
S98
98
,69
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6
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7 ,7
6
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7
,78
,77
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3
DX
S68
01
,63
,61
,6
2
DX
S68
09
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0
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0
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1
DX
S67
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1
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DX
S67
99
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DX
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2
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,80
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DX
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1
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DX
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97
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DX
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DX
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04
,73
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TA
172D
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6
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DX
S71
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31E
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DX
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DX
S10
134
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,87
DX
S74
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0
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1
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,66
,69
,65
,67
,68
,68
,68
,6
6
DX
S10
011
,95
,9
5
,9
5
,95
,94
,94
,9
6
,95
34
Visando responder a pergunta inicial se um bom marcador poderia ser predito
por uma análise in silico, comparamos a pontuação média in silico dos
tetranucleotídeos validados com dados forenses relevantes obtidos de diferentes
populações.
Para tal análise, os tetranucleotídeos complexos (mais de um tipo de
repetição no mesmo loco) DXS6789 e DXS6797 não foram analisados. Os STR
dinucleotídeos e trinucleotídeos que apresentam uma alta taxa de stutters e
pontuações que não podem ser comparadas aos tetranucleotídeos também foram
desconsiderados.
As Figuras 4,5 e 6 mostram a pontuação média in silico versus
heterozigosidade observada, poder de discriminação em mulheres e poder de
discriminação em homens, respectivamente. As maiores pontuações rendem
maiores taxas de heterozigosidade e poder de discriminação em homens e
mulheres. Para demonstrar a importância da distribuição alélica na informatividade
de um marcador, 5 locos com o mesmo número médio de alelos (7) são comparados
(Figura 7).
Um bom marcador na genética forense também deve possuir baixa taxa de
mutação. Assumindo que as taxas de mutação para os marcadores X-STR
comumente utilizados não diferem das encontradas em marcadores autossômicos,
comparamos pontuações médias de marcadores autossômicos utilizados em kits
comerciais de identificação de indivíduos. Essa abordagem foi realizada devido à
escassez de estudos sobre taxas de mutação para marcadores X-específicos e o
número de meioses limitado (Fracasso et al., 2008). A análise demonstrou que locos
com as menores pontuações possuem as menores taxas de mutação (Figura 8).
35
Fig
ura
4. R
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ão e
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ação
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5.
36
Fig
ura
5. R
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.
37
Fig
ura
6.
Rel
ação
en
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Po
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Dis
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m h
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91
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em p
oder
de
disc
rimin
ação
máx
imo
de 0
,79.
Loc
os c
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méd
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159
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oder
de
disc
rimin
ação
mín
imo
de
0,78
.
38
Fig
ura
7.
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rmat
ivid
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s co
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mer
o o
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arca
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GA
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172D
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info
rmat
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39
Fig
ura
8.
Rel
ação
en
tre
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em
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édia
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5 ex
ibem
tax
a de
mut
ação
mín
ima
de 0
,16%
.
40
5.3. Busca de marcadores tetra e pentanucleotídeos
Os critérios de escolha foram: Pontuação mínima de 80 onde se enquadram
97% dos tetranucleotídeos utilizados e identidade de 90%, valor mínimo
apresentado por 79% dos marcadores. Para busca de tetranucleotídeos foi utilizado
o cromossomo referência NC000023 e foram encontradas 889 repetições com este
critério (dados não mostrados). Nesta dissertação foram validados somente os
pentanucleotídeos encontrados nos 3 cromossomos X referência. Assim sendo,
foram encontrados 163 marcadores, dos quais, 57% apresentaram mais de um alelo
in silico estabelecendo a natureza polimórfica desses Locos (Tabela 6).
41
Tabela 6. Validação in silico de marcadores pentanucleotídeos. a
Lo
caliz
ação
b
NC
0000
23
Nú
mer
o d
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pia
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Iden
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ação
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caliz
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b
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(%)
Po
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ação
Lo
caliz
ação
b
AC
0001
55
Nú
mer
o d
e có
pia
s
Iden
tid
ade
(%)
Po
ntu
ação
4338640--4338689 10,2 95 84 8546573--8546622 10,2 95 84 2202847--2202896 10,2 95 84
5078938--5079020 17,4 90 138 9293393--9293480 18,4 90 148 2949427--2949514 18,4 90 148
5267696--5267784 17,8 91 144 9482441--9482529 17,8 91 144 3136682--3136770 17,8 91 144
5631230--5631282 10,6 100 106 9846034--9846086 10,6 100 106 3499560--3499607 9,6 100 96
6651714--6651757 8,8 100 88 10866799--10866842 8,8 100 88 4501255--4501298 8,8 100 88
7794401--7794452 10,4 91 88 12009685--12009736 10,4 91 88 5641586--5641637 10,4 91 88
8715315--8715437 25,2 95 225 12932972--12933089 24,2 94 215 6582394--6582511 24,2 94 215
9720010--9720200 38,2 100 382 13931929--13932277 69,8 100 698 7592280--7592828 109,8 100 1098
11124177--11124220 8,8 100 88 15341707--15341750 8,8 100 88 8994100--8994148 9,8 100 98
12061250--12061292 8,6 100 86 16268760--16268797 7,6 100 76 9922021--9922058 7,6 100 76
12648022--12648138 25,4 92 148 16852076--16852183 23,4 91 137 10504625--10504732 23,4 91 137
13134927--13134975 10,0 95 91 17342675--17342723 10,0 95 91 10986337--10986395 12,0 96 111
13799108--13799162 10,8 96 85 18006264--18006323 11,8 96 95 11647062--11647121 11,8 96 95
15088206--15088271 13,2 100 132 19293306--19293366 12,2 100 122 12936924--12936979 11,2 100 112
17030058--17030141 17,0 95 116 21240755--21240837 17,0 93 116 14880277--14880350 15,0 94 105
17149229--17149304 15,0 98 143 21360090--21360155 13,0 98 123 14997985--14998050 13,0 98 123
18370509--18370553 9,0 100 90 22580686--22580730 9,0 100 90 16215931--16215975 9,0 100 90
19754725--19754790 13,2 100 132 23967984--23968049 13,2 100 132 17590960--17591025 13,2 100 132
21380793--21380859 13,4 100 134 25591896--25591962 13,4 100 134 19213356--19213422 13,4 100 134
21412329--21412368 8,0 100 80 25623432--25623471 8,0 100 80 19245125--19245164 8,0 100 80
23500928--23500988 12,2 100 122 27712639--27712694 11,2 100 112 21329428--21329483 11,2 100 112
23795148--23795196 9,8 97 80 28002790--28002833 8,8 97 70 21629617--21629665 9,8 97 80
24681356--24681407 10,4 100 104 28894306--28894357 10,4 100 104 22513925--22513961 7,4 100 74
26034466--26034545 16,0 97 151 30252838--30252897 12,0 96 111 23861873--23861942 14,0 96 131
26886432--26886527 19,4 97 185 31105360--31105455 19,4 97 185 24717645--24717735 18,4 97 175
27047436--27047486 10,2 100 102 31266381--31266431 10,2 100 102 24878375--24878425 10,2 100 102
29009059--29009109 10,6 93 88 33228010--33228060 10,6 93 88 28053480--28053532 10,6 100 106
30852225--30852293 13,6 96 129 35069636--35069704 13,6 96 129 28683206--28683274 13,6 96 129
31402746--31402794 9,8 97 89 35620321--35620369 9,8 97 89 29231455--29231503 9,8 97 89
31841757--31841817 11,8 91 88 36059352--36059412 11,8 91 88 29669458--29669518 11,8 91 88
32064591--32064637 9,4 100 94 36282150--36282191 8,4 100 84 29892724--29892765 8,4 100 84
33927343--33927384 8,4 100 84 38144656--38144700 9,0 100 90 31754482--31754528 9,4 100 94
34123936--34123978 8,6 100 86 38341251--38341293 8,6 100 86 31952978--31953025 9,6 100 96
34532895--34533003 22,2 94 195 38750213--38750321 22,2 94 195 32365732--32365840 22,2 94 195
34701644--34701689 9,0 95 83 38918965--38919008 9,0 95 81 32533395--32533440 9,0 95 83
35410034--35410086 10,6 100 106 39627582--39627634 10,6 100 106 33239587--33239639 10,6 100 106
37195167--37195208 8,4 100 84 41447936--41447977 8,4 100 84 35056704--35056745 8,4 100 84
42
37356079--37356125 9,8 90 80 41608821--41608867 9,8 90 80 35217525--35217571 9,8 90 80
38049944--38049997 10,8 100 108 42302648--42302701 10,8 100 108 35909559--35909607 9,8 100 98
38506957--38507013 11,6 98 107 42759644--42759695 10,6 97 97 36366241--36366292 10,6 97 97
39153009--39153109 20,0 93 175 43405876--43405981 21,0 94 185 37010571--37010681 22,0 94 195
39537164--39537209 9,2 100 92 43790012--43790057 9,2 100 92 37390488--37390533 9,2 100 92
39881746--39881795 9,6 91 82 44135614--44135667 10,8 100 108 37733232--37733301 13,6 94 122
40365022--40365068 9,8 95 80 44620388--44620434 9,8 95 80 38211185--38211241 11,8 96 100
40520637--40520690 10,8 100 108 44775220--44775273 10,8 100 108 38365452--38365515 12,8 100 128
40762705--40762831 25,6 96 238 45018514--45018641 25,6 95 231 38608033--38608109 15,6 94 138
42213465--42213515 10,2 100 102 46471275--46471325 10,2 100 102 40061462--40061512 10,2 100 102
44103964--44104015 10,4 95 95 48358785--48358836 10,4 95 95 41946316--41946367 10,4 95 95
44503396--44503440 9,0 100 90 48755250--48755294 9,0 100 90 42339956--42339995 8,0 100 80
46544222--46544273 10,6 95 97 50851142--50851188 9,6 95 87 44371388--44371434 9,6 95 87
46670401--46670456 11,2 100 112 50977719--50977754 7,2 100 72 44496936--44496971 7,2 100 72
47244530--47244572 8,6 100 86 51554849--51554891 8,6 100 86 45071779--45071816 7,6 100 76
49263271--49263333 12,8 96 119 53445845--53445902 11,8 96 109 46843318--46843375 11,8 96 109
53036673--53036762 17,8 93 155 56854367--56854459 18,8 97 179 50080809--50080901 18,8 97 179
53516091--53516156 13,2 100 132 57330930--57330995 13,2 100 132 50556282--50556342 12,2 100 122
54111928--54112006 15,8 94 140 57926438--57926516 15,8 91 122 51147705--51147783 15,8 91 122
54160513--54160574 12,4 100 124 57975024--57975080 11,4 100 114 51195147--51195203 11,4 100 114
54282267--54282315 9,8 100 98 58096765--58096813 9,8 100 98 51316988--51317036 9,8 100 98
56256423--56256496 15,6 94 95 60078195--60078268 15,6 94 95 53293135--53293203 14,6 93 85
56582516--56582564 9,8 100 98 60398078--60398121 8,8 100 88 53617966--53618009 8,8 100 88
62161394--62161451 11,6 100 116 62572784--62572841 11,6 100 116 56128749--56128806 11,6 100 116
63555304--63555395 18,8 92 145 63985411--63985492 16,8 91 125 57461085--57461166 16,8 91 125
64678213--64678268 11,2 96 103 65108632--65108687 11,2 96 103 58591637--58591692 11,2 96 103
64697870--64697918 9,8 100 98 65128280--65128328 9,8 100 98 58609528--58609576 9,8 100 98
64785458--64785520 13,0 93 112 65215870--65215932 13,0 93 112 58697245--58697307 13,0 93 112
64882243--64882282 8,0 100 80 65312661--65312700 8,0 100 80 58793833--58793872 8,0 100 80
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66359776--66359823 9,4 97 87 66792137--66792184 9,4 97 87 60271341--60271388 9,4 97 87
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67009341--67009389 10,0 95 91 67444090--67444138 10,0 95 91 60923152--60923200 10,0 95 91
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71902961--71903016 11,2 100 112 72329958--72330013 11,2 100 112 65740806--65740861 11,2 100 112
71976720--71976805 17,6 92 142 72403710--72403775 13,6 90 102 65814970--65815035 13,6 90 102
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43
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82243764--82243839 15,6 94 138 82594375--82594455 16,6 94 148 75929493--75929573 16,6 94 148
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85410150--85410211 12,4 100 124 85763053--85763109 11,4 100 114 79099417--79099473 11,4 100 114
85571195--85571239 9,2 95 83 85924097--85924141 9,2 95 83 79259061--79259105 9,2 95 83
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87376384--87376423 8,0 100 80 87727925--87727959 7,0 100 70 81071717--81071751 7,0 100 70
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96467199--96467250 10,4 100 104 97098268--97098319 10,4 100 104 86383082--86383133 10,4 100 104
96754517--96754563 9,4 95 85 97385546--97385592 9,4 95 85 86672209--86672260 10,4 95 95
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98353399--98353453 10,8 98 101 98987222--98987276 10,8 98 101 88270822--88270876 10,8 98 101
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100464188--100464244 11,8 98 100 101096993--101097049 11,8 98 100 90382527--90382598 14,8 98 130
101805151--101805197 9,4 100 94 102357126--102357172 9,4 100 94 91583677--91583723 9,4 100 94
105187285--105187361 15,4 91 82 105775229--105775305 15,4 91 82 94927569--94927645 15,4 91 82
105730150--105730209 11,8 98 111 106314839--106314898 11,8 98 111 95470509--95470568 11,8 98 111
105783391--105783437 9,4 100 94 106368081--106368127 9,4 100 94 95524808--95524854 9,4 100 94
107632145--107632184 8,0 100 80 108216919--108216958 8,0 100 80 97368429--97368468 8,0 100 80
107828222--107828272 10,8 97 81 108412987--108413037 10,8 97 81 97565449--97565499 10,8 97 81
109638110--109638161 10,8 91 90 110231080--110231128 9,8 91 82 99371437--99371483 9,8 90 80
109897483--109897536 10,8 100 108 110490420--110490468 9,8 100 98 99629539--99629587 9,8 100 98
110502936--110502981 9,2 100 92 111095857--111095902 9,2 100 92 100238435--100238480 9,2 100 92
110533933--110533978 9,2 100 92 111126851--111126906 11,2 100 112 100269895--100269950 11,2 100 112
111011020--111011078 12,0 90 93 111603880--111603938 12,0 90 93 100745393--100745451 12,0 90 93
113336601--113336652 10,4 93 88 113933196--113933247 10,4 93 88 103077591--103077642 10,4 93 88
113546772--113546829 11,6 100 116 114075748--114075800 10,6 100 106 103225055--103225122 13,6 100 136
114400844--114400891 9,6 95 87 114929754--114929796 8,6 94 77 104079725--104079767 8,6 94 77
114672554--114672602 9,8 100 98 115201353--115201411 11,8 100 118 104350177--104350225 9,8 100 98
116310482--116310543 12,4 98 115 116883545--116883601 11,4 98 105 105920969--105921030 12,4 98 115
44
116368393--116368448 11,4 96 105 116941446--116941516 14,4 97 135 105977956--105978026 14,4 97 135
119314264--119314320 11,4 100 114 119895821--119895881 12,2 100 122 108882580--108882661 16,4 100 164
119650004--119650055 10,8 97 90 120230300--120230351 10,8 97 90 109229834--109229885 10,8 97 90
120913705--120913755 10,2 95 84 121467251--121467301 10,2 95 84 110463210--110463260 10,2 95 84
121422118--121422157 8,0 100 80 121975668--121975712 9,0 100 90 110970570--110970614 9,0 100 90
121674034--121674097 13,0 98 121 122227481--122227544 13,0 98 121 111222116--111222154 8,0 97 71
122715923--122715978 11,2 100 112 123274270--123274325 11,2 100 112 112275172--112275222 10,2 100 102
125276629--125276680 10,2 97 95 125834621--125834672 10,2 97 95 114828694--114828745 10,2 97 95
126096800--126096842 8,6 100 86 126651159--126651211 10,6 100 106 115671938--115672000 12,6 100 126
128441312--128441372 12,2 100 122 129002330--129002390 12,2 100 122 118019799--118019839 8,2 100 82
128863499--128863577 15,8 94 95 129422322--129422400 15,8 94 95 118436565--118436643 15,8 94 95
129063458--129063501 8,8 100 88 129622334--129622382 9,8 100 98 118632346--118632394 9,8 100 98
129155573--129155614 8,4 100 84 129714368--129714409 8,4 100 84 118723235--118723276 8,4 100 84
129284456--129284545 17,2 96 135 129843272--129843361 17,2 96 135 118851624--118851713 17,2 96 135
129428002--129428061 12,0 96 111 129986787--129986846 12,0 96 111 118995379--118995438 12,0 96 111
130339326--130339372 9,4 95 85 130898081--130898127 9,4 95 85 119917196--119917242 9,4 95 85
130462225--130462294 14,6 95 110 131020976--131021045 14,6 95 110 120039135--120039204 14,6 95 110
130819485--130819527 8,6 100 86 131378208--131378250 8,6 100 86 120396428--120396470 8,6 100 86
131497687--131497765 15,8 100 158 132056406--132056484 15,8 100 158 121073798--121073876 15,8 100 158
131856178--131856253 15,2 93 127 132414872--132414942 14,2 92 117 121432986--121433056 14,2 92 117
132435888--132435958 15,0 91 114 132994651--132994721 15,0 91 114 122009430--122009500 15,0 91 114
132438350--132438432 16,8 98 159 132997113--132997205 18,8 98 179 122011842--122011959 23,8 99 229
133372318--133372360 8,6 100 86 133931481--133931523 8,6 100 86 122943202--122943239 7,6 100 76
133438712--133438771 12,6 94 99 133997876--133997935 12,6 94 99 123009253--123009312 12,6 94 99
133642214--133642304 18,2 95 164 134201405--134201495 18,2 95 164 123213079--123213169 18,2 95 164
134445849--134445897 9,8 100 98 135002143--135002196 10,8 100 108 123976367--123976420 10,8 100 108
135195344--135195397 10,8 100 108 135730329--135730382 10,8 100 108 124638610--124638653 8,8 100 88
136422769--136422819 10,4 95 95 136961115--136961165 10,4 95 95 125863776--125863826 10,4 95 95
136952415--136952466 10,4 100 104 137490740--137490791 10,4 100 104 126392975--126393051 15,4 100 154
137964690--137964761 14,4 98 90 138503012--138503083 14,4 98 90 127404323--127404399 15,4 98 109
139326336--139326400 12,8 98 121 139870775--139870844 13,8 98 131 128766605--128766664 11,8 98 111
145152732--145152791 12,0 100 120 145657493--145657552 12,0 100 120 134311158--134311197 8,0 100 80
145619648--145619730 16,6 100 166 146124379--146124461 16,6 100 166 134775606--134775713 21,6 100 216
146031211--146031258 9,4 97 87 146578452--146578499 9,4 97 87 135184339--135184386 9,4 97 87
150880936--150880982 9,6 95 87 151375871--151375917 9,6 95 87 139984576--139984622 9,6 95 87
152910286--152910340 11,2 96 103 153490799--153490853 11,2 96 103 141909307--141909361 11,2 96 103 a Os pentanucleotídeos com mais de um alelo estão sombreados. b Distância (em pares de bases) a partir da região telomérica do braço curto do
cromossomo X.
45
5.4. Localização dos marcadores pentanucleotídeos validados in silico no
mapa genético do cromossomo X
Para construção do mapa genético foi utilizado os mapa Rutgers (Matise et
al., 2007). Foram marcados pontos a cada megabase de 1 a 154 no cromossomo X
NC000023 que possui 196 cM. Com os dados da localização física de cada
marcador foi criado um mapa de recombinação em cM/Mb . As regiões em azul e
vermelho representam “zonas frias” e “zonas quentes” de recombinação,
respectivamente. A distribuição de 31 STR tetranucleotídeos utilizados em genética
forense é indicada no mapa de recombinação (Figura 9). A posição no mapa de
recombinação das 94 STRs pentanucleotídeos validados neste trabalho é indicada
na figura 10. Este mapa será de grande importância na montagem de marcadores
em haplótipos para identificação de indivíduos.
46
Fig
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48
6. DISCUSSÃO
O principal critério de escolha de marcadores microsatélites tanto nos campos
da Genética Médica quanto na Forense baseia-se na prioridade histórica. Durante a
última década, a comunidade científica que trabalha em identidade humana
estabeleceu um conjunto de marcadores STR autossômicos que é extensamente
usado para tipagem de DNA. Uma variedade de kits comerciais possibilita a
amplificação robusta destes marcadores. Treze de tais marcadores foram
selecionados em 1997 para montar o Sistema de Índice de DNA combinado (CODIS
Combined DNA Index System) com base em seu uso pelos laboratórios do FBI e na
criação da base nacional de dados dos Estados Unidos (NDNAD) bem como por
outras bases de dados em outros países (Butler, 2006). Os marcadores alossômicos
complementam os resultados obtidos por microssatélites autossômicos.
Diversas ferramentas computacionais têm sido desenvolvidas para mineração
de microsatélites em genomas. Vinte e um programas foram descritos em uma
revisão de Sharma e colaboradores (2007). O programa TRF utilizado neste trabalho
possui como características importantes a gratuidade, disponibilidade de versões
online e doméstica, minera repetições perfeitas e imperfeitas é executável em
diferentes sistemas operacionais.
Nenhum marcador STR pentanucleotídeo no cromossomo X havia sido
validado mesmo que in silico para aumentar o painel de marcadores na prática
forense, até a execução do presente trabalho. As propriedades combinadas de alto
poder de discriminação, poucos microvariantes e baixos níveis de produtos stutter
fazem deste tipo de marcador STR ideal para análise forense (Bacher e Schumm,
1998). Na presente dissertação foram identificados e analisados 163 novos
microsatélites pentanucleotídeos bem distribuídos no cromossomo X, sendo que 94
apresentaram mais de um alelo na comparação com 3 genomas referência. Alguns
elementos STR não foram encontrados nos três genomas devido a que as
seqüências disponíveis para o cromossomo X são de projetos com versões de
finalização diferenciada. Essas diferenças são genoma-abrangentes devido à
disparidade observada no tamanho dos três genomas referência.
Quanto à aplicabilidade deste novo repertório de marcadores STR podemos
prever a sua inclusão em novos kits para identificação de indivíduos. Da mesma
49
forma, os STR tetranucleotídeos identificados neste trabalho quando validados
deverão ser utilizados para genotipagem. Também prevemos a crescente
substituição de marcadores STR dinucleotídeo, amplamente utilizados em estudos
de ligação em genética médica, pelos novos STR penta- e tetranucleotídeos, uma
vez que a tipagem destes geralmente não está associada com artefatos do tipo
stutter que dificultam muitas vezes a interpretação dos dados. A tipagem com STR
penta e tetranucleotídeos permitirá a determinação inequívoca, acurada, de
freqüências alélicas em diferentes populações humanas. Neste sentido, atenta-se às
discrepâncias entre as freqüências alélicas e, por conseguinte, das taxas de
heterozigosidade e poder de discriminação comumente encontradas na literatura em
relação aos marcadores STR dinucleotídeos. Assim sendo, recomendamos
fortemente a tipagem de indivíduos utilizando o repertório de STR penta e
tetranucleotídeos descrito nesta dissertação.
Atenta-se também ao fato que várias publicações recentes (Gomes et al.,
2006; Turrina et al., 2007; Rodrigues et al., 2007; Aler et al., 2007; Pico et al., 2008)
têm utilizado erroneamente a regra do produto (multiplicação do poder de
discriminação de cada loco) para calcular o poder de discriminação combinado em
locos que estão distanciados a menos de 50cM, quando na verdade deveriam ser
calculadas freqüências haplotípicas. Lamentavelmente foram também encontrados
trabalhos que utilizam a mesma fórmula para calcular o poder de discriminação em
homens e mulheres (Gu e Li, 2006; Liu e Li, 2006; Cainé et al., 2007) e fórmulas
invertidas para homens e mulheres (Gao et al., 2007), o que indica descuido e
desconhecimento do significado desta variável importante na Genética Forense.
Acreditamos que os mapas genéticos e de recombinação apresentados nesta
dissertação sejam de grande valia para os pesquisadores de ambas as áreas
médica e forense. Os mapas foram elaborados por interpolação dos mapas Rutgers,
cujos dados são mais robustos do que os dados relativos ao mapa genético
Marshfield (www.marshfieldclinic.org), que se baseia em um número muito limitado
de marcadores. Embora muito utilizado e referenciado por pesquisadores, não é
possível uma interpolação acurada com os dados do mapa Marshfield. Nesse caso,
para os marcadores que não estão disponíveis no mapa, a estimativa é feita pela
conversão 1Mb=1cM, o que pode levar a erros em análises de ligação. Prevemos,
50
assim, a necessidade de uma mudança para a utilização de mapas mais densos
como os descritos nesta dissertação
O único kit comercial para análise de microsatélites no cromossomo X,
Mentype Argus®, descreve que os marcadores exibem distâncias genéticas de 50
cM (Becker et al., 2008). Porém, quando interpolados no mapa Rutgers combinado,
isto é, físico e de ligação, mais informativo disponível atualmente (Matise et al.
2007), dois grupos de ligação do kit estão a de 34 cM de distância, portanto, não
pertencendo a grupos de ligação independentes (Machado e Medina-Acosta,
2008c).
Quanto aos novos marcadores STR para o diagnóstico molecular indireto de
portadores de mutações causadoras de hemofilia A, criamos um mapa
compreensivo de alta resolução de 2,4Mb em Xq28. Nesta região estão presentes
74 genes e foram selecionados 95 microsatélites que incluem os 14 locos validados.
Portanto, o repertório de novos marcadores representa um aumento de 5,8 vezes de
locos STR que serão úteis no diagnóstico indireto em famílias de portadores da
hemofilia A. O uso de marcadores intragênicos, inevitavelmente deve ser feito por
genotipagem de dinucleotídeos, uma vez que a seqüência do gene F8 não possui
elementos STR tetra- ou pentanucleotídeos adequados ao diagnóstico. Acreditamos
que a tipagem de marcadores tetra- e pentanucleotídeos F8-extragênicos já
validados in silico deva substituir os marcadores dinucleotídeos extragênicos. Como
mencionado, o principal inconveniente prático da genotipagem de dinucleotídeos
que complica o uso em análise genética, é a ocorrência de produtos stutter, que são
gerados por desacoplamento e acoplamento da polimerase durante a replicação in
vitro. A tipagem acurada com STR tetra e pentanucleotídeos resultará em menor
taxa de falso diagnóstico.
No presente trabalho procuramos responder as seguintes perguntas: O que é
um bom marcador? Um bom marcador poderia ser predito por uma análise in silico?
Se por um lado os marcadores mais informativos, ou seja, aqueles que possuem
maiores taxas de heterozigosidade e poder de discriminação possuem as maiores
pontuações, por outro, os marcadores com as maiores pontuações possuem as
maiores taxas de mutação. Então, que marcador utilizar?
51
As nossas análises permitem concluir que um bom marcador pode ser
definido diferentemente para o uso na genética médica ou na genética forense. A
elevada taxa de mutação de microsatélites não é um ponto crítico no diagnóstico
individual de alterações cromossômicas ou na caracterização dos cromossomos
sexuais em pacientes portadores de genitália ambígua. Entretanto, para estudos de
segregação gênico-cromossômica em famílias e identificação de indivíduos, um
marcador estável, isto é, com baixa taxa de mutação, deve ser preferencialmente
usado.
Na identificação de indivíduos a dosagem alélica não é tão importante quanto
na determinação de aneuploidias. Locos muito polimórficos tendem a apresentar
diferenças significativas entre o menor e maior alelo. Um estudo de Robino e
colaboradores (2006) demonstrou que mulheres heterozigotas para o marcador
altamente polimórfico DXS10011 possuíam em média uma relação de 1:0,63 entre o
produto amplificado do menor e maior alelos. Portanto, locos altamente polimórficos
podem gerar falso-positivos no diagnóstico de aneuploidias. Desta forma, a nossa
recomendação é que a escolha de um bom marcador deve ficar a critério do
propósito a ser utilizado. Claramente, a informatividade in silico, definida no presente
estudo, é um bom guia para definir novos alvos de estudo nas áreas da Genética
Médica ou Forense.
Por último, acreditamos que a estratégia de mineração e validação de
marcadores polimórficos informativos descrita na presente dissertação também será
adequada para validação e definição de critérios de predição de novos marcadores
tanto para autossomos quanto para o cromossomo Y.
52
7. CONCLUSÕES
o A tipagem com os novos STR penta e tetranucleotídeos permitirá a
determinação inequívoca, acurada, de freqüências alélicas em diferentes
populações humanas. Neste sentido, atenta-se às discrepâncias entre as
freqüências alélicas e, por conseguinte, das taxas de heterozigosidade e
poder de discriminação comumente encontradas na literatura em relação aos
marcadores STR dinucleotídeos. Assim sendo, recomendamos fortemente a
tipagem de indivíduos utilizando o repertório de STR penta e
tetranucleotídeos descrito nesta dissertação.
o Os novos marcadores tetra- e pentanucleotídeos F8-extragênicos validados in
silico deverão substituir os dinucleotídeos extragênicos, já que estes geram
resultados de difícil interpretação.
o Os mapas genéticos e de recombinação são de grande valia para os
pesquisadores de ambas as áreas médica e forense, visto que os dados são
mais robustos do que os dados relativos ao mapa genético Marshfield, que se
baseia em um número muito limitado de marcadores.
o A informatividade in silico, definida no presente estudo, é um bom guia para
definir novos alvos de estudo nas áreas da Genética Médica ou Forense. A
escolha do marcador deve ficar a critério do propósito a ser utilizado. Os
marcadores mais informativos possuem maiores taxas de heterozigosidade e
poder de discriminação e, na análise in silico, as maiores pontuações. Atenta-
se ao fato que os marcadores autossômicos que exibem as maiores
pontuações possuem as maiores taxas de mutação.
o A estratégia de mineração e validação de marcadores polimórficos
informativos descrita na presente dissertação também é adequada para
validação e definição de critérios de predição de novos marcadores tanto para
autossomos quanto cromossomo Y.
53
CAPÍTULO II
Genotipagem de indivíduos com constituição alossômica duvidosa
54
3. OBJETIVOS
• Genotipar pacientes com constituição alossômica duvidosa.
• Determinar a origem parental e meiótica da não disjunção cromossômica
em portadores de aneuploidia gonossômica
55
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material biológico
Sangue venoso: amostras de 0,5-2mL de sangue venoso foram coletadas
em tubo contendo anticoagulante EDTA e mantidas sob refrigeração até o
momento da extração de DNA dos leucócitos.
Líquido Amniótico: Amostras de conveniência encaminhadas pelo Dr.
Francisco Coelho do Centro de Infertilidade e Medicina Fetal de Campos, sede
Hospital Escola Álvaro Alvim,
Células do epitélio bucal: Células bucais foram coletadas por esfregaço
bucal utilizando haste flexível, estéril, com ponta de algodão hidrofílico. Este
material foi coletado preferencialmente de crianças menores de cinco anos.
Amostras de DNA referidas: Enviadas por colaboradores do projeto: DNA de
pacientes acometidos pelas síndromes de Turner e Klinefelter, paciente com
suspeita de mosaicismo ou quimerismo autossômico e alossômico foram doadas
pela Profa Dra Mônica Vanucci Lipay (Universidade Federal de São Paulo); DNA de
paciente portador de dupla aneuploidia autossômica e gonossômica e dos
respectivos pais biológicos foram doados pelas Profa Dra Eny Maria Goloni Bertollo
e Profa Dra Érika Cristina P. Bertelli (Faculdade de Medicina de São José do Rio
Preto).
4.2. Aspectos éticos
Todas as coletas de pacientes com suspeita clínica foram feitas perante
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo). As coletas
foram feitas por profissionais autorizados e/ou remetidas por especialistas que
encaminharam o material ao NUDIM.
56
4.3. Métodos
4.3.1. Extração de DNA
As amostras biológicas foram submetidas ao método de extração do DNA
genômico utilizando o kit de extração e purificação de DNA genômico (Ilustra blood
genomicPrep), GE Heathcare, UK, conforme a especificação do fabricante.
4.3.2. Amplificação de regiões polimórficas e monomórficas específicas dos
cromossomos sexuais
Uma alíquota de 2 ng de DNA total, após diluição, foi submetida ao processo
de amplificação em sistema multiplex (amplificação de vários marcadores em reação
única), pelo método da PCR Quantitativa Fluorescente (QF-PCR) utilizando os
iniciadores listados na tabela 7 para os marcadores DXS981, DXS1187, XHPRT,
P39, DXS996, DXS1283E, X22, AMEL, SRY, DYS448 (Ogilvie et al., 2005). Este
sistema foi otimizado pelo Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular (Moreira,
2007). Para amplificação das seqüências de DNA foi utilizado o seguinte programa
da PCR: Estágio I, 1 ciclo a 95º por 1 minuto; Estágio II, 28 ciclos a 94ºC por 1
minuto, 57ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; Estágio III, 1 ciclo a 60ºC por 60
minutos. O tampão de reação é composto por: 0,2 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1,25 U
Taq Polimerase (Alves da Silva, 2007). Os marcadores do cromossomo Y foram
utilizados como controles positivos ou negativos no caso de genotipagem de
homens e mulheres respectivamente. Também foram utilizados para dosagem da
proporção de X para Y nos casos suspeitos de Síndrome de Klinefelter.
4.3.3 Quantificação de DNA genômico
DNA foi quantificado de forma indireta através de diluições de acordo com o
rendimento do kit de extração e purificação de DNA genômico, para cada tipo de
material biológico.
4.3.4. Caracterização dos alelos amplificados
Aos produtos de amplificação foram adicionados formamida (Hi-Di
Formamida, Applied Biosystems) e o padrão de massa molecular GeneScan LIZ
500, marcado com o fluorocromo LIZTM (fluorescência laranja) (Applied
Biosystems). Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese capilar
57
com o polímero POP 4 (Applied Biosystems), utilizando a plataforma ABI PrismTM
310 Genetic Analyzer. Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando os
programas GeneScanTM e GenotyperTM (Applied Biosystems). Os alelos foram
nomeados com o valor em pares de nucleotídeos dos produtos da PCR. A Figura 3
mostra as informações requeridas para interpretar um eletroferograma.
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60
5.RESULTADOS
5.1. Caracterização molecular dos cromossomos sexuais em pacientes com
constituição alossômica duvidosa.
No histórico do atendimento do serviço social do NUDIM constam 17 casos de
investigação da constituição dos cromossomos sexuais em pacientes com suspeita
de síndrome de Turner ou genitália ambígua. Todos os relatos de caso foram feitos
por médicos especialistas e apresentação clínica não está presente nesta
dissertação. Em todos os casos o diagnóstico final foi feito pelos médicos
especialistas remetentes. Alguns exemplos da caracterização molecular dos
cromossomos sexuais em pacientes são apresentados a seguir.
Suspeita de síndrome de Turner
Menor, encaminhada com suspeita clínica de síndrome de Turner. A presença
de perfis dialélicos em marcadores X específicos (Figura 4) afastou a suspeita
clínica. Esta paciente foi diagnosticada posteriormente pela abordagem clínica como
portadora da síndrome de Noonan, que possui como um diagnóstico diferencial da
síndrome de Turner a presença do par de cromossomos X.
Ambigüidade genital
Neste item são apresentados 5 casos de pacientes portadores de genitália
ambígua, sendo 1 no pré-natal, que foram encaminhados por médicos especialistas
para caracterização dos cromossomos sexuais. Os pacientes são indicados como A-
E.
Paciente A. Menor de 8 anos de idade, com sexo de criação feminino e sexo
psicológico masculino. Foi caracterizado o par sexual (XX) ,figura 5, nesta paciente
que foi diagnosticada posteriormente como portadora de hiperplasia congênita da
supra-renal.
Paciente B. Menor de 13 anos de idade, sexo de criação feminino. A
investigação molecular demonstrou a presença de monoalelismo para marcadores
do cromossomo X e amplificação de marcadores específicos do cromossomo Y
(figura 6). A paciente foi diagnosticada como portadora da síndrome de
insensibilidade a andrógenos, tratando-se, portanto de um caso de mulher XY sry+.
61
Paciente C. Foi encaminhada amostra de líquido amniótico da gestante, pois
na ultra-sonografia o feto teve indicação clínica de ambigüidade genital. O feto foi
caracterizado como portador da constituição XY (Figura 7). Após o nascimento, os
pais retornaram ao NUDIM e relataram o nascimento de um menino.
Paciente D. Recém nascida, registrada como menina, pois a ultra-sonografia
de abdômen revelou a presença de genitais internos femininos. Paciente com
histórico familiar de genitália ambígua. A caracterização molecular demonstrou
constituição XX (Figura 8). O diagnóstico clínico foi de pseudo-hermafroditismo
feminino (hiperplasia congênita da supra-renal).
Paciente E. Recém nascido com 15 dias, registrado como menino. A
presença de marcadores específicos para o cromossomo Y indicou constituição
alossômica típica masculina XY, sry+ (Figura 9). O paciente foi diagnosticado como
portador de hipospádia e indicado para correção cirúrgica.
Confirmação molecular das síndromes de Turner e Klinefelter.
Amostras de uma paciente Turner e um Klinefelter foram recebidas em caráter
de colaboração, para demonstrar a eficiência da citogenética molecular nesses
casos clínicos. Os resultados moleculares corroboram com os da citogenética
clássica, utilizada para diagnosticar os dois pacientes referidos (Figuras 10 e 11).
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70
5.2 Determinação da origem parental e meiótica da não disjunção
cromossômica em uma criança com dupla aneuplodia 48,XXY+21
O trio familiar foi genotipado com os marcadores alossômicos para determinar
a origem parental da cópia extra do cromossomo X, e com 5 marcadores localizados
na região 21q (Alves da Silva, 2007) para determinar a origem parental da cópia
extra do cromossomo 21.
A origem de ambos os eventos de não disjunção foi materna, uma vez que o
probando possui duas cópias de alelos maternos exclusivos para ambos os
cromossomos adicionais (Tabelas 8 e 9 e Figuras 12 e 13). Os erros ocorreram
durante a meiose I, devido à manutenção da heterozigosidade materna entre os
alelos dos cromossomos não disjuntos na criança. Não foram observados eventos
de recombinação entre os marcadores genotipados (Manuscrito em preparação).
Tabela 8. Perfil alélico dos marcadores específicos para o cromossomo 21
estabelecido por QF-PCR para o trio familiar.
PERFIL ALÉLICO a Nº DE CÓPIAS b
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D21S11 (21q21) 243 257 239 239 239 243 257 1 1 1
D21S226 (21q22.1) 451 459 455 459 451 459 1 2
D21S1270 (21q21-
q22.1)
293 299 299 312 293 299 312 1 1 1
D21S1411 (21q22.3) 284 292 288 292 284 292 1 2
IFNAR (21q22.1) 384 388 388 388 384 388 1 2
a Tamanho do alelo em pares de nucleotídeos. b Marcadores exibindo perfil dialélico com razão entre áreas > 1,8 foram
considerados evidência de trissomia.
71
Tabela 9. Perfil alélico dos marcadores específicos para os cromossomos sexuais
estabelecido por QF-PCR para o trio familiar.
PERFIL ALÉLICO a
Marcador Mãe Pai Filho
P39 (Xq28) 151 159 159 151 159
DXS981 (Xq13.1) 244 244 244 244 244
DYS448 (Yq11.2) Ausente 351 351
DXS1187 (Xq26.2) 143 147 147 143 147
XHPRT (Xq26.1) 276 284 276 276 284
AMEL (Xp22.22/Yp11.2) 104 104 109 104 b 109
DXS996 (Xp22.3) 129 162 152 129 162
SRY (Yp11.2) Ausente 244 244
DXS1283E (Xp22.3) 311 326 320 311 326
X22 (Xq28/Yq12) 204 218 204 243 204 b 218 a Tamanho do alelo em pares de nucleotídeos. b Alelo informativo com razão de área 2:1.
Figura 12. Eletroferograma dos perfis genéticos para os marcadores D21S11e
D21S226 evidenciando a origem materna da trissomia do cromossomo 21. (Detalhes
para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).
Mãe
Filho
Pai
72
Figura 13. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador X22 demonstrando
a origem materna da cópia extra do cromossomo X. (Detalhes para interpretação de
um eletroferograma na Figura 3).
5.3 Investigação molecular em menor hermafrodita verdadeiro
47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY
Para diferenciar entre quimerismo e mosaicismo na origem de formação em
um paciente hermafrodita verdadeiro apresentando 4 linhagens celulares
47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY em proporções [1:1:27:14] foram genotipados
neste trabalho 31 marcadores microssatélites em 13 cromossomos autossômicos e
27 marcadores nos cromossomos sexuais. Ensaios de FISH, executados pela Profa
Dra. Mônica Lipay (Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São
Paulo) tinham demonstrado que os cromossomos marcadores são derivados do
cromossomo Y.
Para todos os marcadores investigados o paciente apresentou dois
componentes paternos e um materno. As Figuras 14 e 15 exemplificam marcadores
informativos no cromossomo 13 e X respectivamente. As dosagens alélicas
corroboram com as proporções encontradas no cariótipo.
Mãe
Filho
Pai
73
Figura 14. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador D13S305
(cromossomo 13) do núcleo familiar. A) Mãe, B) Criança, C) Pai. A criança possui
duas cópias de alelos paternos exclusivos (440pb e 451pb) e um alelo materno
(447pb). (Detalhes para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).
Figura 15. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador XHPRT
(cromossomo X) do núcleo familiar. A) Mãe, B) Criança, C) Pai. A criança possui
um alelo paterno exclusivo 288pb, demonstrando a origem paterna de um dos
cromossomos X. (Detalhes para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).
A
B
C
A
B
C
74
5. DISCUSSÃO
É reconhecido que tempo de espera longo para entrega de resultados
laboratoriais pode causar muito sofrimento psicológico para as famílias, que é uma
das razões principais do uso de métodos moleculares para diagnóstico de
desordens cromossômicas comuns. Este tipo de abordagem não requer cultura de
células e os relatórios podem ser emitidos habitualmente entre 1-2 dias (Hultén et
al., 2003).
Implementamos a metodologia QF-PCR de citogenética molecular no auxílio
ao diagnóstico de diferentes casos clínicos suspeitos de aneuploidias ou constituição
alterada dos cromossomos sexuais. A maioria dos resultados foi entregue em até 48
horas.
A automatização da QF-PCR permite que um único operador manipule 40
amostras por dia. A disponibilidade de seqüenciadores multicapilares permite o
processamento de grande número de amostras a baixo custo (Cirigliano et al.,
2004). No Reino Unido o custo do cariótipo é em média 264 dólares por amostra e
pode chegar a 74 dólares por QF-PCR (Grimshaw et al., 2003).
Contaminação com células maternas é um dos principais problemas na
genotipagem de amostras no pré-natal. Nós realizamos apenas uma genotipagem
no pré-natal com amostra de líquido amniótico de boa qualidade que nos permitiu
com segurança afirmar o sexo cromossômico do concepto. Acreditamos que como
no Brasil a interrupção da gravidez devido a diagnóstico pré-natal de anomalias
cromossômicas é proibida, não há muito interesse na comunidade acadêmica e/ou
na indústria nacional no desenvolvimento de kits de diagnóstico por QF-PCR.
Mesmo nos países onde o aborto é permitido, o diagnóstico molecular durante o pré-
natal é importante não só para o casal, mas no manejo da gestação e para o
cuidado multidisciplinar do neonato acometido com aneuploidias.
O sistema empregado na genotipagem apresentou artefatos inerentes ao tipo
de repetição STR. Três dos seis marcadores polimórficos específicos para o
cromossomo X são STR dinucleotídeos, apresentando alta taxa de stutters. Embora
estes marcadores possuam perfil eletroforético de difícil interpretação, eles são
polimórficos e discriminam indivíduos. Devido a grande quantidade de STR tetra e
75
pentanucleotídeos presentes no cromossomo X (capítulo I), sugerimos que eles
devam substituir os STR dinucleotídeos para fins de diagnóstico envolvendo o
cromossomo X, exceto quando o uso de dinucleotídeos é inevitável, isto é não
existam outros STR tipáveis na região de interesse, como no gene F8 para o
diagnóstico indireto da Hemofilia A
A genotipagem de marcadores STR polimórficos permite determinar a origem
parental e meiótica da não disjunção cromossômica em pacientes aneuplóides.
Essas informações serão úteis para o cálculo do risco de recorrência e atenção
especial aos sintomas clínicos. No presente estudo foram investigados dois casos
raros de aneuplodia.
Relatamos um caso de dupla aneuploidia 48, XXY +21 em criança nascida de
mãe de 13 anos de idade. Poucos estudos moleculares em dupla trissomia estão
disponíveis, e a origem parental da não-disjunção nesses casos é
predominantemente materna (Li et al., 2005). No presente caso, ambos os eventos
de não-disjunção eram maternos e aconteceram durante MI. Glass e colaboradores
(2006) relataram um caso de 48,XXY,+21 no pré-natal no qual os cromossomos X e
21 extras eram provindos da não disjunção na MI materna. Em contraste, Lorda-
Sanchez e colaboradores (1991) relataram um nascido vivo 48,XXY,+21 com o
cromossomo 21 adicional de origem materna e não-disjunção na MII e o
cromossomo X adicional de origem paterna e não-disjunção na MI.
A ocorrência de dupla aneuplodia em uma mulher muito jovem, como no caso
presente (12 anos na concepção), contrasta com relatos publicados que indicam um
risco aumentado de para não-disjunção autossômica e alossômica com o aumento
da idade materna (Jyothy et al., 2001; Morris et al., 2002). De acordo com estudos
de população pelo Registro Citogenético Nacional da Síndrome de Down (NDSCR)
no Reino Unido (Morris et al., 2002), nenhum caso de trissomia 21 simples em mãe
de 13 anos havia sido registrado. A exclusão de idade materna avançada como fator
de risco para a não disjunção cromossômica no presente caso sugere a existência
de outros fatores de risco idade independente.
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a origem da constituição
46, XX/XY em hermafroditas verdadeiros (Niu et al., 2002), entre esses se
encontram o quimerismo partenogenético e a diploidização de triplóides. A prova
76
molecular para diferenciar indivíduos gerados por quimerismo partenogenético ou
diploidização de zigoto triplóide é difícil de ser obtida. O estudo molecular irá
demonstrar a presença de dois constituintes genéticos paternos e um materno
(Malan et al., 2006).
Central para a compreensão do mecanismo genético na origem da criança
hermafrodita apresentada nesta dissertação é a ocorrência de um pequeno
cromossomo marcador derivado de Y estabelecido por FISH, em duas linhagens
celulares; 46,XX,+mar e 46,XY,+mar. Os cromossomos Y marcadores não estavam
presentes nos pais e esses exibem tamanhos diferentes evidenciando dois tipos de
marcadores derivados de Y. Análise molecular comparativa de microssatélites
autossômicos e alossômicos nos pais e na criança permitiu a conclusão inequívoca
que a criança possui apenas um componente genético materno e dois paternos.
Assim, em nenhum dos locos genotipados em regiões centroméricas e distais a
criança exibiu dois alelos maternos. As dosagens alélicas observadas em DNA de
leucócitos foram coincidentes com os valores esperados das proporções de células
estabelecidas por cariotipagem.
Embora a maioria dos cromossomos marcadores resulte de erros mitóticos
em embriões diplóides, acreditamos que os marcadores Y nesta criança foram
originados de um extensivo e efetivo evento de diploidização de um embrião triplóide
como postulado por Golubovsky (2003), Figura 16. A maioria dos embriões triplóides
é abortada e há um número limitado de casos de nascidos vivos (Iliopoulos et al.,
2005). A prova do evento de diploidização de um embrião triplóide é sem
precedentes e pode ser visto como um mecanismo de proteção que efetivamente
restabelece a ploidia para gerar mosaicos complexos viáveis.
77
Figura 16. Possíveis mecanismos de geração de indivíduos 2n XX/XY com 2
componentes genéticos maternos e 1 paterno. a) Representa o mecanismo de
ativação partenogenética do ovócito seguido pela fertilização de células idênticas por
dois diferentes espermatozóides contendo diferentes cromossomos sexuais. b)
Representa o cenário de fertilização dispérmica de um ovócito seguido de
diploidização pós-zigótica de concepto triplóide como postulado por Golubovsky
(2003). (Figura adaptada de Souter et al., 2007)
78
7. CONCLUSÕES
o A genotipagem de marcadores STR polimórficos permite determinar a origem
parental e meiótica da não disjunção cromossômica em pacientes
aneuplóides de maneira eficiente e rápida. Os testes podem ser aplicados em
amostras diversas durante o pré-natal ou após o nascimento. Essas
informações serão úteis para o cálculo do risco de recorrência e atenção
especial aos sintomas clínicos.
o Análise molecular comparativa de microssatélites autossômicos e
alossômicos nos pais e na criança acometida por dupla aneuploidia confirmou
os dados citogenéticos e permitiu estabelecer a origem materna da não
disjunção para ambos os cromossomos não disjuntos.
o A tipagem molecular permitiu a conclusão inequívoca que a criança
acometida por hermafroditismo verdadeiro possui apenas um componente
genético materno e dois paternos. Quanto ao possível mecanismo genético
na origem da criança hermafrodita atenta-se ao fato que ambos os estudo de
citogenética clássica e molecular são indispensáveis para diferenciar entre
mosaicismo e quimerismo partenogenético.
79
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Andrews, T.D.; Scott, C.E.; Searle, S.; Ramser, J.; Whittaker, A.; Deadman, R.;
Carter, N.P.; Hunt, S.E.; Chen, R.; Cree, A.; Gunaratne, P.; Havlak, P.; Hodgson,
A.; Metzker, M.L.; Richards, S.; Scott, G.; Steffen, D.; Sodergren, E.; Wheeler,
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D.A.; Worley, K.C.; Ainscough, R.; Ambrose, K.D.; Ansari-Lari, M.A.; Aradhya, S.;
Ashwell, R.I.; Babbage, A.K.; Bagguley, C.L.; Ballabio, A.; Banerjee, R.; Barker,
G.E.; Barlow, K.F.; Barrett, I.P.; Bates, K.N.; Beare, D.M.; Beasley, H.; Beasley,
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A.M.; Brown, A.J.; Brown, M.J.; Bonnin, D.; Bruford, E.A.; Buhay, C.; Burch, P.;
Burford, D.; Burgess, J.; Burrill, W.; Burton, J.; Bye, J.M.; Carder, C.; Carrel, L.;
Chako, J.; Chapman, J.C.; Chavez, D.; Chen, E.; Chen, G.; Chen, Y.; Chen, Z.;
Chinault, C.; Ciccodicola, A.; Clark, S.Y.; Clarke, G.; Clee, C.M.; Clegg, S.; Clerc-
Blankenburg, K.; Clifford, K.; Cobley, V.; Cole, C.G.; Conquer, J.S.; Corby, N.;
Connor, R.E.; David, R.; Davies, J.; Davis, C.; Davis, J.; Delgado, O.; Deshazo,
D.; Dhami, P.; Ding, Y.; Dinh, H.; Dodsworth, S.; Draper, H.; Dugan-Rocha, S.;
Dunham, A.; Dunn, M.; Durbin, K.J.; Dutta, I.; Eades, T.; Ellwood, M.; Emery-
Cohen, A.; Errington, H.; Evans, K.L.; Faulkner, L.; Francis, F.; Frankland, J.;
Fraser, A.E.; Galgoczy, P.; Gilbert, J.; Gill, R.; Glockner, G.; Gregory, S.G.;
Gribble, S.; Griffiths, C.; Grocock, R.; Gu, Y.; Gwilliam, R.; Hamilton, C.; Hart,
E.A.; Hawes, A.; Heath, P.D.; Heitmann, K.; Hennig, S.; Hernandez, J.;
Hinzmann, B.; Ho, S.; Hoffs, M.; Howden, P.J.; Huckle, E.J.; Hume, J.; Hunt, P.J.;
Hunt, A.R.; Isherwood, J.; Jacob, L.; Johnson, D.; Jones, S.; de Jong, P.J.;
Joseph, S.S.; Keenan, S.; Kelly, S.; Kershaw, J.K.; Khan, Z.; Kioschis, P.; Klages,
S.; Knights, A.J.; Kosiura, A.; Kovar-Smith, C.; Laird, G.K.; Langford, C.; Lawlor,
S.; Leversha, M.; Lewis, L.; Liu, W.; Lloyd, C.; Lloyd, D.M.; Loulseged, H.;
Loveland, J.E.; Lovell, J.D.; Lozado, R.; Lu, J.; Lyne, R.; Ma, J.; Maheshwari, M.;
Matthews, L.H.; McDowall, J.; McLaren, S.; McMurray, A.; Meidl, P.; Meitinger, T.;
Milne, S.; Miner, G.; Mistry, S.L.; Morgan, M.; Morris, S.; Muller, I.; Mullikin, J.C.;
Nguyen, N.; Nordsiek, G.; Nyakatura, G.; O'Dell, C.N.; Okwuonu, G.; Palmer, S.;
Pandian, R.; Parker, D.; Parrish, J.; Pasternak, S.; Patel, D.; Pearce, A.V.;
Pearson, D.M.; Pelan, S.E.; Perez, L.; Porter, K.M.; Ramsey, Y.; Reichwald, K.;
Rhodes, S.; Ridler, K.A.; Schlessinger, D.; Schueler, M.G.; Sehra, H.K.; Shaw-
Smith, C.; Shen, H.; Sheridan, E.M.; Shownkeen, R.; Skuce, C.D.; Smith, M.L.;
Sotheran, E.C.; Steingruber, H.E.; Steward, C.A.; Storey, R.; Swann, R.M.;
Swarbreck, D.; Tabor, P.E.; Taudien, S.; Taylor, T.; Teague, B.; Thomas, K.;
Thorpe, A.; Timms, K.; Tracey, A.; Trevanion, S.; Tromans, A.C.; d'Urso, M.;
Verduzco, D.; Villasana, D.; Waldron, L.; Wall, M.; Wang, Q.; Warren, J.; Warry,
G.L.; Wei, X.; West, A.; Whitehead, S.L.; Whiteley, M.N.; Wilkinson, J.E.; Willey,
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D.L.; Williams, G.; Williams, L.; Williamson, A.; Williamson, H.; Wilming, L.;
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S.; Buck, D.; Reinhardt, R.; Poustka, A.; Rosenthal, A.; Lehrach, H.; Meindl, A.;
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93
ANEXOS
94
A. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .
B. Artigo publicado na revista Haemophilia.
C. Artigo aceito para publicação na revista Haemophilia.O material suplementar
não está anexado.
D. Artigo aceito para publicação na revista Forensic Science International
Genetics.