Expressão Gênica: Princípios e Expressão Gênica: Princípios e AplicaçõesAplicações

Rodrigo A. Panepucci

Genoma Humano:

30 a 60 mil genes

3 bilhões pb

23 pares cromossômicos (50~300 milhões pb cada)

Como estudar tamanha complexidade, de forma abrangente ?

RNA mensageiroRNA mensageiro

Estrutura GênicaEstrutura Gênica

ProximalPromoterElement (TFBS)TATA box

Exon

Enhanceror UAS

Intron

-200 -30-10 to –50 kb +10 to +50 kb

TranscriçãoRNA

mRNA

Regiões Regulatórias Região Codante

DNA e RNADNA e RNA

Hibridização de Ácidos Hibridização de Ácidos NucléicosNucléicos

Northern BlottingNorthern Blotting

Probe labeling

pBS-SemaIII

dATP

dGTPdTTP

dCTPRNA isolation

AAAAAA

Gel electophoresis

Blotting

Hybridization

Autoradiography

Reverse Northern BlottingReverse Northern Blotting

Down-regulation of transcripts

Up-regulation of transcripts

* * labeled (specific) probe

target

Northern

* *

specific probes

labeled target

reverse Northern

Macro-ArraysMacro-Arrays

Densidade baixaMembranasSondas radioativasBaixa sensitividadeSpots de cDNABarato $

Alta densidadeLaminas de VidroSondas fluorescentesAlta sensitividadeSpots com cDNA ou OligonucleotideosCaro $$$

Micro-ArraysMicro-Arrays

Spots

Hibridização

Quantificando a Expressão Quantificando a Expressão GênicaGênica

Célula ou TecidoNormal

Célula ou TecidoNeoplásico

Célula ou TecidoIndiferenciado

Célula ou TecidoDiferenciado

A1x A1y

A2x A2y

A3x A3y

Duplicatas

A1A2A3

x y

Amostras

B1x B1y

B2x B2y

B3x B3y

Duplicatas

B1B2B3

x y

Amostras

Abordagem ExperimentalAbordagem Experimental

Plataforma CodeLinkPlataforma CodeLink

RNA totalRNA bacteriano

(controle) Transcrição reversa

Síntese da segunda fita de cDNA

Fragmentação & Hibridização

Matriz em gel

Sondas

cRNA

Biotina

Detecção

Biotina

Conjugado

Estreptavidina

T7 RNA polimerase e rNTPs biotinilados

TTTTT - T7

AAAAATTTTT - T7

TTTTT

cRNA

Plataforma CodeLinkPlataforma CodeLink

~ 10.000Genes

MicroarraysMicroarrays de oligonucleotídeos de oligonucleotídeos (CodeLink Human UniSet I)

AplicaçõesAplicações

Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)

Alvos terapêuticos

Marcadores Diagnósticos

Marcadores Prognósticos

Mecanismo de ação de drogas

Linfoma de Células do MantoLinfoma de Células do Manto

Zona marginalZona do manto

Origem CelularOrigem Celular

Centro germinativoCentro germinativo

Adaptado: Delves & Roitt. NEJMNEJM 343:108, 2000

(Linfócitos B virgens)(Linfócitos B virgens)

14q32

Ig Cµ

11q13

Ciclina D1

Translocação t(11;14)(q13;q32)

Patogênese molecularPatogênese molecular

Linfoma decélulas

do manto

LinfócitoB

virgemX

ObjetivoObjetivo

Vias alteradas(Alvos Terapeuticos)

Amostras de células isoladas com elevado grau de pureza

Microarrays

ScreeningMCL – 3

VsNBC - 3

MCL MCL NBCNBC

ValidaçãoMCL (PB) - 21MCL (pure) – 6NBC - 4

GenesGenesDiferencialmente ExpressosDiferencialmente Expressos

Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

Redes de Associação BiológicasRedes de Associação Biológicas(Pathway Studio)(Pathway Studio)

MedScanMedScan

MedScanMedScan

Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

Interpretação dasInterpretação dasRedes de Associação BiológicasRedes de Associação Biológicas

Identificação de Vias de SinalizaçãoIdentificação de Vias de Sinalização

Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

Vias de Sinalização AlteradasVias de Sinalização Alteradasno Linfoma de Células do Mantono Linfoma de Células do Manto

• Genes relacionados à apoptose

• Via PI3K/AKT (Fosfatidilinositol-3-quinase-AKT)

• Via WNT

• Via TGFβ (Fator de crescimento tumoral β)

PIK3R1PIK3CA

AKT

AKT

PDK1 PDK2AKT AKTP

PP

P

Thr308Ser473

Thr308Ser473

Alvos celulares

PIP2

PIP3

p110p85

Via de sinalização PI3K/AKTVia de sinalização PI3K/AKT

Adaptado: Vivanco & Sawyers. Nat Rev CancerNat Rev Cancer 2:489, 2002

AplicaçõesAplicações

Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)

Alvos terapêuticos

Marcadores Diagnósticos

Marcadores Prognósticos

Mecanismo de ação de drogas

Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Gold, M. R. Blood 2006;108:1425-1426

AKTion on Mantle Cell Lymphoma

Linfoma de células do mantoLinfoma de células do manto

AplicaçõesAplicações

Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)

Alvos terapêuticos

Marcadores Diagnósticos

Marcadores Prognósticos

Mecanismo de ação de drogas

Mecanismo de ação de drogas

Ação in-vitro do inibidor da via TGF-B (Halofuginona), na linhagem GRANTA de Linfoma da Zona do Manto

Efeito in-vivo da droga Hidroxyurea na Anemia Falciforme

AplicaçõesAplicações

Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)

Alvos terapêuticos

Marcadores Diagnósticos

Marcadores Prognósticos

Mecanismo de ação de drogas

Baixo Risco

LLA Pediátrico

Diagnostico:

Reavaliação: Baixo Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Quimioterapia

Baixo Risco

Expressão Gênica e Risco Associado

Diagnóstico:

Reavaliação: Baixo Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Avaliação da expressão gênica ao diagnósticoAgrupamento baseado na reavaliação

Baixo Risco

Expressão Gênica e Marcadores

Diagnóstico:

Reavaliação: Baixo Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Marcadores de Prognóstico ou Diagnóstico DiferencialSERP1 - 25 ALL children (14 good responders vs 11 poor responders)

Baixo Risco

Bases Moleculares do Risco

Diagnóstico:

Reavaliação: Baixo Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Anti-Apoptóticos ? Proliferação ? Resistência a Drogas ?

Baixo RiscoDiagnóstico:

Reavaliação: Baixo Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Pró-Apoptóticos ? Anti-Proliferação ?

Bases Moleculares do Risco

Bases Moleculares daMudança de Risco

Pró-Apoptóticos

Anti-Apoptóticos

AplicaçõesAplicações

Pesquisa Básica (Biologia de Células Tronco)

Alvos terapêuticos

Marcadores Diagnósticos

Marcadores Prognósticos

Mecanismo de ação de drogas

Células Tronco Hematopoéticas

CD34+CD34+&&

CD133+CD133+

Células CD133+ Uma sub-população mais primitiva dentre as CD34+(Potencial endotelial)

Redes TranscricionaisRedes Transcricionais

BM

A1A2

B1B2

UCB BM UCB

12

12

12

1 & 2 = Pooled SamplesA & B = Individual Samples

Experimental Design

CodeLink Human UniSet I (~10.000 genes)

CD34 CD133Vs

Comparison of gene expression profiles betweenCD133+ and CD34+ from BM & UCB cells

CD133+ (BM&UCB) CD34+ (BM&UCB)

Vs

891 Up-Regulated in CD133+ 375 Down-Regulated in CD133+

Name DescriptionCTNNA2 catenin (cadherin-associated protein), alpha 2DLX2 distal-less homeo box 2E4F1 E4F transcription factor 1EP300 E1A binding protein p300FOXG1B forkhead box G1BGATA3 GATA binding protein 3HMGA1 high mobility group AT-hook 1HOXA9 homeo box A9HOXB4 homeo box B4HOXC6 homeo box C6JUND jun D proto-oncogeneKLF2 Kruppel-like factor 2 (lung)MEF2D MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide D

(myocyte enhancer factor 2D)PAX5 paired box gene 5 (B-cell lineage specific activator)PAX6 paired box gene 6 (aniridia, keratitis)PML promyelocytic leukemiaRUNX1 runt-related transcription factor 1 (acute myeloid

leukemia 1; aml1 oncogene)SRF serum response factorTAL1 T-cell acute lymphocytic leukemia 1USF1 upstream transcription factor 1

47Differentially

ExpressedTranscription

Factors

Hemato-Endothelial

Related

Transcription Factors Over-Representedin CD133 cells

GATA3 (BM: CD34-CD133)

BM-CD34 BM-CD1330.25

0.5

1

2

4

8

16

32

Samples

Fold

(Lo

g 2)

P < 0.0001

Mann-Whitney Test

Higher Expression of GATA3 in CD133+ Cells

GATA3

Complexo Transcricional eFatores de Transcrição (TF)

Complexo Transcricional eFatores de Transcrição (TF)

Fatores de Transcrição (TFs)Fatores de Transcrição (TFs)Zinc FingerZinc Finger

123456789……AAGTTAATGACTAACCGGTTAATGAGAACCAGGTTAATGAGAACCAAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGACCAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGAC AGGTTAATGACTAACGGGTTAATGACTAACACGTTAATGACTAACGTGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACGAGTTAATGACTAACCAGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACATGTTAATGACTAAC

Pos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A 14 16 4 0 1 19 20 1 4 13 4 4 13 12 3C 3 0 0 0 0 0 0 0 7 3 1 0 3 1 12G 4 3 17 0 0 2 0 0 9 1 3 0 5 2 2T 0 2 0 21 20 0 1 20 1 4 13 17 0 6 4

• Uma matriz de freqüência (PWM) para um Fator de Transcrição pode ser construída a partir de um conjunto de sítios de ligação determinados empiricamente.

Representação Esquemática

Sítios de Ligação de TFsSítios de Ligação de TFs

Promoter Analysis Transcription Element Listening System (TELIS)

V$NFKAPPAB_01V$NFKAPPAB65_01V$CREL_01

600bp Upstream Promoters of 44 Differentially Expressed Transcription

Factors

TF-BS Search

Statistically Significant

(Top 3)

Highly Stringent

FrequencyNumber of binding sites

per promoter

  

Incidence% of promoters with at least one binding site

1.    V$NFKAPPAB_01z = 4.37  p = 1.25E-5

Sample mean = 0.114Population mean = 0.020

Ratio = 5.8

    

n = 4/44  p = 0.0097Sample mean = 9.09%Population mean = 1.90%Ratio = 4.8

 2.    V$NFKAPPAB65_01

z = 4.10  p = 4.10E-5Sample mean = 0.114

Population mean = 0.022Ratio = 5.2

    

n = 5/44  p = 0.0025Sample mean = 11.36%Population mean = 2.15%Ratio = 5.3

 3.    V$CREL_01

z = 3.07  p = 0.0022Sample mean = 0.182

Population mean = 0.063Ratio = 2.9

    

n = 7/44  p = 0.0149Sample mean = 15.91%Population mean = 5.98%Ratio = 2.7

Overrepresented NFB Biding Sites andTF Genes Potentially Up-Regulated by NFB

in CD133+ cells

p50 p65

O Fator Transcricional NF-B

NFKB1

NFKB2

Chen et al, 1998, Nature, Vol 391 -N 22

RelA

NFKB2 (BM: CD34-CD133)

BM-CD34 BM-CD1330.125

0.250.5

1248

163264

Samples

Fold

(Lo

g 2)

RELB (BM : CD34-CD133)

BM-CD34 BM-CD1330.25

0.5

1

2

4

8

16

Samples

Fold

(Lo

g 2)

P = 0.0247 P = 0.0944

Mann-Whitney Test

Higher Expression ofNon-Canonical NFB Sub-units onCD133+ HSC Compared to CD34+

NFB2 RELB

Correlation RELB (BM-CD133)

-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -74

5

6

7

8

9

10

NFKB2 (Ct)

RE

LB (

Ct)

P = 0.0002

Spearman’s Correlation (r = 0.6028)

0 to 2 TF Binding Sites

Correlation of NFB2 and RELB Levelsin HSC

CorrelationRELB & NFKB2

0 to 2 TF Binding Sites

Correlation GATA3 (BM-CD133)

-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7

6

7

8

9

10

NFKB2 (Ct)

GA

TA3

(C

t)

P = 0.0008

Spearman Correlation (r = 0.5415)

Correlation GATA3 BM CD133+

Correlation of NFKB2 and GATA3in HSC

Correlation RELB-GATA3 (BM-CD133)

4 5 6 7 8 9 10 11

6

7

8

9

10

RELB(Ct)

GA

TA3

(C

t)

0 to 2 TF Binding SitesP = 0.0013

Spearman’s Correlation (r = 0.4995)

Correlation GATA3 & RELB

Correlation of RELB and GATA3in HSC

RNAi

GATA3 NFKB2 RELB02468

101214

Unstimulated CD34Stimulated CD34 (Control)Stimulated CD34 (NFKB2 RNAi)

125

150

175

Evaluated Transcript

Rel

ativ

e Fo

ld C

hang

e

Effect of NFKB2 RNAi Inhibition onRELB and GATA3 Levels

NFKB2Inhibition