Post on 05-Oct-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS
ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA E SUPLEMENTADOS
COM ANTIOXIDANTES
Roberta Dias da Silva
Orientadora: Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti
GOIÂNIA 2014
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ROBERTA DIAS DA SILVA
ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS
ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA E SUPLEMENTADOS
COM ANTIOXIDANTES
Tese apresentada para a obtenção do título de
Doutor em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal
de Goiás
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientadora:
Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti – EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo – EVZ/UFG
Pesq. Dr. Marcos Fernando Oliveira e Costa – Embrapa/CNPAF
GOIÂNIA
2014
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iv
DEDICO,
Aos meus pais, Divino Roberto da Silva e Gysele Aparecida de Oliveira Silva por terem acreditado na minha capacidade e força de vontade e, que apesar da distância, sempre se fizeram presente. As minhas irmãs Viviane Peixoto Dias Silva e Wanessa Peixoto Dias da Silva, que são minhas companheiras em todos os momentos. E ao meu namorado Paulo Henrique Jorge da Cunha pelo apoio imensurável em todas as etapas desse trabalho.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e a oportunidade concedida de poder sempre alcançar de uma
forma ou outra meus objetivos, iluminando os meus passos e dando-me forças nos momentos
de angústias e dificuldades.
À Universidade Federal de Goiás/Escola de Veterinária e de Zootecnia, pela
oportunidade de realizar este estudo.
À orientadora e amiga, Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti, pela
confiança em meu trabalho. Meu muito obrigada pela oportunidade, pela amizade, pelos
conselhos e ensinamentos dedicados sem os quais não seria possível a realização deste
trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, a todos os professores, pelos
ensinamentos e oportunidades.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela bolsa de estudos concedida e pelo financiamento do projeto de pesquisa.
Aos professores Andreza Amaral da Silva e Vitor Barbosa Fascina pelos
ensinamentos dedicados nas avaliações de estresse oxidativo. Aos Professores Paulo Henrique
Jorge da Cunha e Percílio Brasil dos Passos por cederem as dependências do Laboratório de
Toxicologia para o processamento das análises.
Aos amigos, Laudicéia Oliveira da Rocha, Juliana Luis e Silva, Claudia Paula de
Oliveira e Luma Tatiane Silva e Castro pela amizade e pelos momentos de descontração.
Aos condutores do experimento em campo Gustavo Lage Costa, Thiago de Jesus
do Carmo e Ulisses Reis Correia Pinto um agradecimento em especial, pois sem o auxílio e
colaboração de vocês não seria possível realizar e obter as amostras desejadas.
Aos alunos do Curso de Graduação em Medicina Veterinária Weyguer Cirillo
Fernandes e Helton Freire de Oliveira pela participação e ajuda nas atividades em campo do
experimento.
Às alunas de Residência, Neryssa Oliveira Alencar e Daniela Cardoso no
processamento e análise das amostras.
Aos funcionários da Escola de Veterinária e Zootecnia e do Departamento de
Patologia Animal agradeço pela ajuda, apoio, paciência e amizade.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste projeto e
contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada!
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SUMÁRIO
CAPITULO I – CONSIDERAÇÕES INICIAIS................................................................................ 1
Introdução........................................................................................................................................... 1
Revisão de literatura......................................................................................................................... 2
Referências.........................................................................................................................................
18
CAPITULO II – ERITROGRAMA E ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES............................................................................................................................
30
Resumo...............................................................................................................................................
29
Abstract...............................................................................................................................................
29
Introdução...........................................................................................................................................
30
Material e métodos.............................................................................................................................
32
Resultados...........................................................................................................................................
34
Discussão............................................................................................................................................
38
Conclusão...........................................................................................................................................
41
Referências.........................................................................................................................................
41
CAPITULO III – LIPOPEROXIDAÇÃO HEPÁTICA EM BOVINOS CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES............................................................................................................................
47
Resumo...............................................................................................................................................
47
Abstract...............................................................................................................................................
48
Introdução...........................................................................................................................................
48
Material e métodos.............................................................................................................................
50
vii
Resultados...........................................................................................................................................
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Discussão............................................................................................................................................
57
Conclusão...........................................................................................................................................
59
Referências.........................................................................................................................................
59
CAPÍTULO IV – CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................
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LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
FIGURA 1 - Etapas de reações de peroxidação lipídica................................................. 3
FIGURA 2 - Reações químicas de formação de radicais livres...................................... 6
FIGURA 3 - Reação de Haber-Weiss............................................................................. 7 FIGURA 4 - Mecanismo de ação do complexo glutationa. H2O2: peróxido de hidrogênio,
RO2H: hidroperóxido orgânico, GPX: glutationa peroxidase, ROH: peróxido, H2O: água, GSH: glutationa, GS-SG: glutationa oxidada, NADP: nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato, forma reduzida, FAD: flavina adenina dinucleotídeo, NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada, FADH2: flavina adenina dinucleotídeo, forma reduzida........................
11
CAPÍTULO III
FIGURA 1 - Aglomerado de macrófagos espumosos com macrófagos espumosos isolados (seta fina) e com formação de célula gigante de Touton (seta grossa) em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes, HE, 40x..............................................................................................................
59
FIGURA 2 - Correlação positiva forte entre macrófagos espumosos e concentração de MDA em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes................................................................................................
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II TABELA 1 - Médias ( X = média em cada momento e Média = média geral
considerando todos os momentos) de eritrócitos, hemoglobina e volume globular de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes.............................................................
36
TABELA 2 - Médias de TBARS (nM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................
37
TABELA 3 - Médias de GSH-T (µM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................
38
TABELA 4 - Médias de GSH-Px (UI/gHb) em células sanguíneas de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................
38
TABELA 5 - Médias de SOD (UI/mgHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E).............................................
39
TABELA 6 - Médias de CAT (UI/mgHb) em eritrócitos bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................
39
CAPÍTULO III
TABELA 1 - Médias da concentração de TBARS (µmol/Kg) em tecido hepático de
bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1 - Grupo controle, G2 - Grupo selênio e vitamina E, G3 - Grupo zinco, G4 - Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)......................................................................................
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x
TABELA 2 - Médias de GGT (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1 - Grupo controle, G2 - Grupo selênio e vitamina E, G3 - Grupo Zinco, G4 - Grupo Selênio e G5 - Grupo vitamina E)...................................................
56
TABELA 3 - Médias de AST (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)...............................................................................
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TABELA 4 - Frequência total (%) por grupo de alterações hepáticas em bovinos alimentados com feno de Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................ 58
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LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Espécies reativas de oxigênio (EROs).......................................................... 5 QUADRO 2 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica.................................... 9 QUADRO 3 - Principais flavonoides estudados em pesquisas científicas.......................... 13
CAPÍTULO II
QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento.....................................................
34
QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais.
34
QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ).
34
CAPÍTULO III
QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento.....................................................
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QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais.
53
QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ).
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LISTA DE ABREVIATURAS 1O2 oxigênio singlet 4-HNE 4-hidroxynonenal AST aspartato aminotransferase CAT catalase CuZnSOD superóxido dismutase cobre-zinco dependente DTNB ácido 5,5 µ-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico e- elétron EDTA ácido etilediaminotetracético, sal dissódico EROs espécies reativas de oxigênio FAD flavina-adenina-dinucleotídeo FADH2 flavina-adenina-dinucleotídeo, forma reduzida Fe+2 íon ferroso Fe+3 íon férrico
GGT gama-glutamiltransferase GR glutationa redutase GS glutationa sintetase GSH glutationa GSH-Px glutationa peroxidase GSH-t glutationa total GSSG glutationa oxidada H2O2 peróxido de hidrogênio Hb hemoglobina HCl ácido clorídrico HO• radical hidroxila HO2• radical perhidroxil HOCl ácido hipocloroso LDL lipoproteína de baixa densidade MDA malondialdeído MnSOD superóxido dismutase dependente do manganês NADP nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada NO• óxido nítrico NOS óxido nítrico sintetase O2• ânion superóxido OH• radical hidroxila ONOO− peroxinitrito PBS solução tampão-salina-fosfato R• radical alquila RO• radical alquila ROO• radical peróxido ROOH hidroperóxido orgânico R-SH grupos tióis R-SSG componentes dissulfeto -SH grupos sulfidrilas SOD superóxido dismutase TBA ácido tiobarbitúrico TBARS substância reativa ao ácido tiobarbitúrico TCA ácido tricloroacético
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RESUMO
O estresse oxidativo está relacionado ao desenvolvimento de diferentes processos patológicos. Intervenções que diminuem a geração ou os efeitos dos radicais livres têm apresentado resultados controversos em modelos animais. Neste estudo, avaliou-se os efeitos da suplementação com diferentes antioxidantes, por meio de avaliação de biomarcadores de estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa peroxidase e catalase), em hepatócitos (malondialdeído) e de exames laboratoriais e histológicos. Foram avaliados 40 bovinos da raça Nelore, distribuídos em cinco grupos, o controle sem suplementação, três grupos suplementados individualmente com vitamina E, selênio e, zinco e um grupo suplementado com a associação de selênio e vitamina E. Durante o período de 105 dias de confinamento experimental, os bovinos foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado (ração), na proporção de 70:30. A avaliação dos biomarcadores de estresse oxidativo nos eritrócitos não indicou presença de lipoperoxidação nos eritrócitos. Na avaliação de estresse oxidativo em fragmentos hepáticos, a suplementação com o antioxidante selênio associado à vitamina E reduziu as alterações histopatológicas (número de macrófagos espumosos) no parênquima hepático e a lipoperoxidação tecidual. No período do confinamento, os bovinos não desenvolveram alterações hepáticas clínicas e laboratoriais, apresentando atividade sérica de gama glutamiltransferase e aspartato aminotrasferase dentro dos valores de normalidade. Houve correlação positiva entre a concentração do biomarcador malondialdeído e a quantidade de macrófagos espumosos. Em conclusão, bovinos confinados ingerindo feno de Brachiaria sp apresentam lipoperoxidação de hepatócitos e a associação dos antioxidantes selênio e vitamina E reduz os efeitos do estresse oxidativo. Palavras-chave: enzimas antioxidantes, lipoperoxidação, ruminantes e suplementação.
xiv
ABSTRACT
Oxidative stress is related to the development of different pathological processes. Interventions that reduce the generation or the effects of free radicals have shown controversial results in animal models. In this study, we evaluated the effects of supplementation with different antioxidants through assessment of oxidative stress biomarkers in erythrocytes (thiobarbituric acid reactive substances, superoxide dismutase, glutathione full, glutathione peroxidase and catalase) in hepatocytes (malondialdehyde), clinical laboratory tests and histological exam. 40 Nelore bovines were sorted into five groups, as follows: one control without supplementation, three groups individually supplemented with vitamin E, selenium and zinc and one group supplemented with the combination of selenium and vitamin E. For 105 days, all animals were fed roughage (brachiaria hay) and concentrate (feed) in a 70:30 ratio. The Biomarkers of oxidative stress evaluation in erythrocytes did not indicate the presence of lipid peroxidation. In the liver, supplementation with antioxidant selenium and vitamin E reduced the number of foamy macrophages in the parenchyma, as well as tissue lipid peroxidation. The animals did not develop clinical liver abnormalities throughout the experimental period, since aspartate aminotransferase and gamma glutamyltransferase serum activity remained within normal range. There was positive correlation between the concentration of the biomarker malondialdehyde and foamy macrophages. In conclusion, feedlot cattle ingesting Brachiaria sp present lipid peroxidation in hepatocytes and the combination of the antioxidants selenium and vitamin E reduces the effects of oxidative stress. Keywords: antioxidant enzymes, lipid peroxidation, ruminants and supplementation.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1 INTRODUÇÃO
O estresse oxidativo caracteriza-se pelo desequilíbrio entre moléculas oxidantes e
antioxidantes, que resulta na indução de danos às biomoléculas pelos radicais livres. Nas
últimas décadas tem-se observado um vertiginoso aumento no interesse pelo estudo de
estresse oxidativo. Este fato não ocorreu por mera casualidade, foi decorrência do rápido
crescimento do conhecimento técnico científico, que permitiu o estabelecimento da
participação dos radicais livres nos mecanismos desencadeadores de enfermidades, bem como
a adoção de antioxidantes na prevenção dessas doenças.
Na medicina de produção animal, o campo do estresse oxidativo encontrasse em
desenvolvimento. Pesquisas têm relacionado à participação dos radicais livres no
desenvolvimento de mastites, quadros anêmicos, deficiências reprodutivas, inflamações,
qualidade de carcaça e imunidade que poderiam comprometer a cadeia produtiva. No entanto,
inúmeros questionamentos encontram-se sem elucidação, pois há muito a ser descoberto sobre
o papel desses agentes oxidantes sobre a sanidade e a produção animal.
Atualmente existe na produção animal uma preocupação constante em minimizar
custos e gerar aumento de lucros. Na pecuária brasileira, em particular bovinos confinados,
essa busca incessante faz com que os animais sejam submetidos a uma pressão produtiva
elevada, o que tem proporcionado o desenvolvimento de estresse oxidativo elevado nos
animais e, consequentemente, a produção de radicais livres.
Uma das vantagens da cadeia produtiva nacional reside na possibilidade de criar
bovinos a pasto com a oferta de espécies do gênero Brachiaria. Entretanto, algumas espécies
desse gênero têm sido descritas como agentes de fotossensibilização hepatógena. Porém,
ainda não há um consenso entre os pesquisadores sobre a causa da fotossensibilização em
bovinos, que poderia ser provocada pela ingestão da toxina esporidesmina produzida pelo
fungo Pithomyces chartarum ou por saponinas esteróides litogênicas que poderiam
desencadear a lipoperoxidação de biomolécula e ocasionar alterações sobre as células.
Nesse contexto, objetivou-se discutir a temática estresse oxidativo, desde a
formação de radicais livres, a ação dos antioxidantes e os efeitos resultantes do desequilíbrio
geral que levam a sua formação, bem como abordar ação à etiopatogenia de algumas doenças
com a participação dos mesmos, de modo a reconhecer a ocorrência de estresse oxidativo e
2
minimizar os efeitos deletérios dos radicais livres no organismo. Além disso, verificar se a
adoção de antioxidantes na forma de suplemento alimentar poderia reduzir as alterações
devido ao desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Estresse oxidativo
O desequilíbrio resultante dos processos de produção e remoção de radicais livre
pelos sistemas de defesa antioxidante é chamado de estresse oxidativo. Seu efeito deletério
apresenta variação considerável de um ser vivo para o outro, dependendo da idade, estado
fisiológico e da dieta (NIESS et al., 1999). O estresse oxidativo, decorrente da diminuição dos
antioxidantes endógenos ou do aumento da formação de espécies oxidantes, gera um estado
pró-oxidante que favorece a ocorrência de lesões oxidativas em macromoléculas e estruturas
celulares, como a lipoperoxidação, com consequente alteração funcional e prejuízo das
funções vitais em vários órgãos e tecidos (DROGE, 2002).
O estresse oxidativo pode ser benéfico nos casos de infecção, quando ocorre
produção de radicais livres por células fagocitárias para matar microrganismos invasores.
Porém, torna-se prejudicial quando a inflamação atinge o estágio sistêmico (sepse) e a perda
do controle da produção dos radicais livres pode causar lesões distantes do seu ponto de
origem (SIES, 1991; SIES, 1993). Os radicais livres lesam a célula de modo direto ou
danificam os ácidos nucleicos e as proteínas, tornando-os mais suscetíveis à degradação
(HALLIWELL, 1987; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Em ruminantes, o excesso de
radicais livres é responsável por vários processos patológicos, como por exemplo,
hepatopatias, inflamações, mastites, anemias dentre outros (MARÇAL, 2006; PASCHOAL et
al., 2006; BRITO et al, 2008; JUARÉZ et al, 2009; NICOLODI et al, 2010; SORDILLO,
2013).
2.1.1 Peroxidação lipídica
A peroxidação de lipídeos pode ser definida como uma cascata de eventos
bioquímicos, resultantes da ação de radicais livres sobre os lipídeos presentes em membrana
3
celulares (CURI et al., 2002), gerando principalmente radicais alcoxila (RO•) e peroxila
(OH•).
O processo é dividido em três etapas: iniciação, propagação e terminação (Figura
1). Na iniciação é removido um átomo de hidrogênio da molécula de ácido graxo insaturado,
que acarreta na formação de um dieno conjugado. Esse composto pode sofrer inúmeras
reações e, em meio aeróbico, ocorre a combinação com o oxigênio que leva a formação de um
peróxido, o qual pode remover outro hidrogênio de outro ácido graxo, promovendo assim a
etapa de propagação. O dieno também pode se combinar com um átomo de hidrogênio
retirado para formar um hidroperóxido lipídico ou romper a dupla ligação presente na cadeia,
gerando peróxidos cíclicos, aos quais também podem propagar a peroxidação lipídica
(KOWALE et al., 1996).
Na decomposição dos hidroperóxidos são gerados radicais peroxila e alcoxila, em
que íons metálicos, como o selênio, podem catalisar essa reação (ESTERBAUER et al.,
1992). A etapa de terminação se caracteriza pela destruição dos radicais pelos antioxidantes,
ou pela reação de dois radicais lipídicos originando outros produtos, principalmente aldeídos
que podem ser oxidados dando origem a outros hidrocarbonetos, aldeídos e ácidos
(KOWALE et al., 1996; CURI et al., 2002).
FIGURA 1 - Etapas de reações de peroxidação lipídica. Fonte: Adaptado de KOWALE et al. (1996)
Para acompanhar a evolução da peroxidação, o número de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido utilizado como valor empírico e tem sido relacionado
com outros métodos para determinação de lipídeos. O malondialdeído é um produto
secundário, formado durante a oxidação de ácidos graxos polinsaturados e reage com o
4
TBARS formando um complexo com absorbância máxima a 530 a 532nm. A mensuração de
TBARS é considerada adequada para determinar e avaliar o comprometimento que a oxidação
lipídica poderia promover no organismo (KOWALE et al., 1996).
GUIMARÃES et al. (2006), ao avaliarem a relação entre grau de estresse
oxidativo e a integridade de hepatócitos, concluíram que um dos mecanismos responsáveis
pela formação da fibrose hepática poderia ser a indução de peroxidação lipídica. Outro estudo
também demonstrou que a depleção de GSH, frequentemente encontrada nas doenças
hepáticas, poderia favorecer produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a
peroxidação lipídica (HAN et al., 2006).
2.2 Radicais livres
A presença de radicais livres em materiais biológicos foi descoberta há menos de
70 anos. Em 1956, Denham Harman elaborou a hipótese de que radicais de oxigênio
poderiam ser formados como subprodutos de reações enzimáticas in vivo. Assim, descreveu
os radicais livres como a “Caixa de Pandora” responsável por danos celulares em algumas
enfermidades, como o processo de mutagênse, o câncer, o processo degenerativo do
envelhecimento biológico, dentre outros (DROGE, 2002).
A ciência dos radicais livres nos organismos vivos encontrou uma segunda fase
depois que McCord e Fridovich, em 1969, descobriram a enzima superóxido dismutase
(SOD) e, finalmente, convenceram a maioria dos colegas que os radicais livres são
importantes na biologia. A partir desse momento, vários pesquisadores foram inspirados a
investigar os danos oxidativos causados por tais agentes oxidantes sobre ácido
desoxirribonucleico (DNA), proteínas, lipídeos e outros componentes celulares
(VASCONCELOS et al., 2007).
Um radical livre é qualquer átomo, molécula ou íon que possui um ou mais
elétrons livres na sua órbita externa. Essas partículas, formadas por elétrons livres ou não
pareados têm instabilidade elétrica muito grande e, por esta razão, apresentam também grande
capacidade reativa. Isso pode afetar qualquer composto que esteja próximo, a fim de captar
um elétron desse composto para sua estabilização. Devido a esta característica, é denominada
de substância oxidante (PERCIVAL, 1998; BIANCHI & ANTUNES, 1999; LEITE &
SARNI, 2003).
5
A formação de radicais livres pelo organismo em condições normais é inevitável,
pois são necessários no processo de respiração celular que ocorre nas mitocôndrias, a fim de
gerar a energia na forma de adenosina trifosfato (ATP). Entretanto, a formação de radicais
livres não se restringe somente as mitocôndrias, pode ocorrer no citoplasma, na membrana
e/ou em seu alvo celular, tais como: proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA (ANDERSON,
1996; YU & ANDERSON, 1997).
Grande parte das moléculas biológicas pode ser oxidada pelos radicais livres. No
entanto, CHEESEMAN & SLATER (1993) descreveram que os lipídeos são os mais afetados
pelo estresse oxidativo e dano celular. As consequências oriundas da lesão de lipídeos pelos
radicais livres são evidentes, pois eles são componentes estruturais das membranas celulares,
alterando desta maneira sua função metabólica e permeabilidade. Como consequência, ocorre
passagem de substâncias entre o meio intra e extracelular e até danos ao DNA intranuclear
(RADAK et al., 1999). Tal fato, em última instância altera e prejudica o metabolismo
intracelular, podendo inclusive ocasionar a morte celular (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
2007).
No metabolismo celular normal existe a produção constante de EROs (Quadro 1)
e, condições em que sua concentração está elevada acarretam ações deletérias em todos os
componentes celulares (LEITE & SARNI, 2003).
QUADRO 1 – Principais espécies reativas de oxigênio (EROs) O2•- Ânion superóxido ou radical superóxido
HO2• Radical perhidroxil
H2O2 Peróxido de hidrogênio
OH• Radical hidroxila
RO• Radical alquila
ROO• Radical peróxido
ROOH Hidroperóxido orgânico 1O2 Oxigênio singlet
Fonte: Adaptado de SIES (1991)
Devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio, principal oxidante em virtude
do metabolismo aeróbico, tende a receber um elétron de cada vez, o que resulta na formação
6
de compostos intermediários altamente reativos (Figura 2). O primeiro composto obtido é o
O2•-, que é gerado pela reação entre moléculas de substâncias que participam da cadeia de
transporte de elétrons na mitocôndria e no retículo endoplasmático. As células fagocitárias
produzem o O2•- como parte do mecanismo de defesa imunológica e inflamatória para
eliminar microrganismos patogênicos ou corpos estranhos. Os fagócitos o produzem com
auxílio da enzima leucocitária nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH oxidase),
que catalisa a redução por um elétron do O2 com gasto de uma molécula de NADPH
(BARREIROS & DAVID, 2006). Nas doenças inflamatórias crônicas esta produção torna-se
excessiva, provocando lesões nos tecidos (LEITE & SARNI, 2003).
FIGURA 2 - Reações químicas de formação de
radicais livres. Fonte: Adaptado de SORDILLO et al. (2009)
O radical O2•- ao contrário da maioria dos radicais livres é inativo, visto que sua
principal função é auxiliar na produção de radical HO•, por meio da redução de quelatos de
Fe+3 em Fe+2 (reação de Haber-Weiss) (Figura 3). Além disso, esse radical possui a habilidade
de liberação de Fe2+ das proteínas de armazenamento e de ferro-sulfoproteínas, tais como
ferritina e aconitase, respectivamente, e de reagir com o radical HO• produzindo oxigênio
singlet 1O2 e com o óxido nítrico (NO•) produzindo peroxinitrito (ONOO−) (SORDILLO et
al., 2009).
A atuação do radical O2•- como oxidante direto é irrelevante, pois dentre os
aminoácidos, o único que sofre oxidação com esse radical é a cisteína. Outro fato que
corrobora com sua baixa capacidade oxidante é a sua eliminação pela enzima SOD, que
catalisa a dismutação de duas moléculas de O2•- em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Sendo
7
que, este último, quando não eliminado do organismo pelas enzimas peroxidases e catalase,
pode gerar radicais hidroxila (HALLIWELL et al., 2000). Apesar destes efeitos danosos, o
radical O2•- apresenta importância vital para as células de defesa e sem ele o organismo
encontra-se desprotegido contra infecções causadas por vírus, bactérias e fungos
(ANDERSON, 1996).
FIGURA 3 - Reação de Haber-Weiss. Fonte: Adaptado de SORDILLO et al. (2009)
O O2•- formado é bactericida fraco, capaz de inativar proteínas ferro-sulfurosas
das bactérias, entretanto gera alguns produtos que possuem forte atividade antimicrobiana,
tais como ácido hipocloroso (HOCl), peróxido de hidrogênio (H2O2) e peroxinitrito (ONOO–),
que são os principais responsáveis pelo combate a corpos estranhos. Em alguns casos, o
radical O2•- age como antioxidante, reduzindo semiquinonas para que elas possam retomar
suas atividades metabólicas na célula, como por exemplo, a redução da ubiquinona em
ubiquinol no interior da mitocôndria (BABIOR & BRAZ, 1997; HALLIWELL et al., 2000).
Por fim, o radical O2•- funciona como sinalizador molecular por meio da sua capacidade de
oxidar grupos –SH em ligações dissulfeto, podendo ativar e desativar enzimas que contenham
metionina (POLIDORI et al., 2001).
Outro exemplo de radical que apresenta pouca reatividade frente às moléculas
orgânicas na ausência de metais de transição é o H2O2. Sua formação ocorre por meio da
redução parcial do radical O2•- pela recepção de dois elétrons. Porém, o H2O2 não é
considerado um verdadeiro radical livre, por ter sua órbita externa pareada (HALLIWELL et
al., 2000). Entretanto, por ser altamente hidrossolúvel e penetrar facilmente na célula, esse
radical exerce papel importante no estresse oxidativo por ser capaz de transpor as membranas
celulares facilmente e gerar o radical hidroxila. Desse modo, ele tem sido qualificado como
precursor da formação de outros radicais livres (HALLIWELL, 1990).
O radical H2O2 atua oxidando proteínas que apresentem resíduos de metionina ou
grupos tiol muito reativos, como a glutationa (GSH). A sua formação in vivo ocorre pela
8
dismutação do O2•- por enzimas oxidases ou pela β-oxidação de ácidos graxos
(HALLIWELL, 1990). O peróxido de hidrogênio gerado é então parcialmente eliminado por
CAT, GSH-Px e peroxidases ligadas à tioredoxina, mas como essa eliminação tem baixa
eficiência, grande parte do H2O2 é liberado para a célula (HALLIWELL et al., 2000). O H2O2,
assim como o O2• têm sido considerados extremamente tóxicos em quantidades elevadas no
organismo, por danificar os ácidos graxos presentes nas membranas celulares, o que leva a
lesão celular (HALLIWELL, 1987; HALLIWELL, 1990).
A toxicidade do H2O2 se deve, em grande parte, à conversão da molécula em
radical hidroxila (OH•) por hidrólise. Este último radical é reativo, pois precisa de apenas
mais um elétron para se estabilizar (VASCONCELOS et al., 2007). Este radical
frequentemente danifica as moléculas por retirada de hidrogênio e por adição a ligações
insaturadas em decorrência de sua eletrofilicidade (BARREIROS & DAVID, 2006). Uma vez
formado, o OH• promove quebra e modificações nas bases de DNA das células, resultando
em alterações na expressão genética, mutação, apoptose celular, modificações em proteínas e
peroxidação lipídica (CHEESEMAN & SLATER, 1993). No DNA, esse radical compromete
tanto as bases nitrogenadas quanto a desoxirribose, sendo que a agressão ao monossacarídeo
pode ocorrer por retirada de um dos átomos de hidrogênio e quase sempre leva à ruptura da
cadeia de DNA (SINGAL, 1999; BARREIROS & DAVID, 2006).
Nos aminoácidos e proteínas, o radical HO• pode reagir na cadeia lateral, em que
agride preferencialmente cisteína, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina, e, em
menores proporções, arginina e asparagina. As agressões aos aminoácidos que compõem as
proteínas podem promover danos como clivagem de ligações, com ou sem geração de
fragmentos e ligações cruzadas, o que pode ocasionar perda de atividade enzimática,
dificuldade no transporte ativo por meio das membranas celulares, citólise e morte celular
(VASCONCELOS et al., 2007).
Além do oxigênio, o nitrogênio também participa da estrutura dos radicais livres,
em especial o óxido nítrico. O seu efeito tóxico contribui de modo importante para a lesão
tecidual que ocorre nos processos inflamatórios crônicos, assim como na sepse
(ANDERSON, 1996). O óxido nítrico é sintetizado a partir da arginina por ação da enzima
óxido nítrico sintetase (NOS), que está presente no endotélio e nos macrófagos. O óxido
nítrico promove relaxamento do endotélio vascular (vasodilatação com redução da resistência
periférica), inibe a agregação plaquetária e desempenha papel importante na lesão por
isquemia e reperfusão (POMPELLA, 1997; YU & ANDERSON, 1997).
9
2.3 Antioxidantes
A produção contínua de radicais livres durante os processos metabólicos levou ao
desenvolvimento de vários mecanismos orgânicos de defesa antioxidante para limitar as
concentrações intracelulares e impedir a indução de danos (SIES, 1993). Os antioxidantes são
agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas pelos radicais livres nas
células. Define-se antioxidante como “qualquer substância que, presente em baixas
concentrações em comparação ao substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste
substrato de maneira eficaz” (SIES & STAHL, 1995). Essas substâncias que representam a
defesa dos organismos contra as EROs são divididas em dois tipos, os não enzimáticos e os
enzimáticos (Quadro 2).
QUADRO 2 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica Não enzimático Enzimático
L-cisteína Superóxido dismutase
α-tocoferol (vitamina E) Catalase
β-caroteno NADPH-quinona oxidoredutase
Glutationa Glutationa peroxidase
Ácido ascórbico (vitamina C) Enzimas de reparo
Flavonoides
Proteínas do plasma
Selênio
Clorofilina
Fonte: Adaptado de SIES (1993)
É importante salientar que o efeito prejudicial dos radicais livres ocorre quando
eles estão em quantidade excessiva no organismo, ultrapassando a capacidade do organismo
de neutralizá-los com os seus sistemas naturais (VASCONCELOS et al., 2007). E que essas
proteções abrangem a proteção enzimática ou por micromoléculas, que podem ter origem no
próprio organismo ou são adquiridas por meio da dieta (BARREIROS & DAVID, 2006).
2.3.1 Antioxidantes enzimáticos
10
O sistema enzimático de defesa é o primeiro a agir, sendo formado por diversas
enzimas, em especial SOD, CAT e GSH-Px, que representam os três sistemas enzimáticos
antioxidantes (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).
A SOD tem papel fundamental na defesa do organismo contra as espécies reativas
de oxigênio, pois atua na remoção do O2•-. Antes da sua descoberta em 1969, a SOD já havia
sido descrita por alguns autores como uma proteína que continha cobre (Cu), mas sem a
descrição de atividade catalítica (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Seu papel foi
estabelecido na dismutação (oxidação e redução) do O2•- e até hoje, apesar de inúmeras
pesquisas realizadas com essa enzima, nenhum outro substrato foi descrito, mostrando a sua
especificidade para esse radical livre (BASU et al., 1999; BELLÓ, 2002; HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2007). Essa enzima apresenta associação de um metal a sua estrutura
molecular, o que lhe confere formas diferenciadas (PERCIVAL, 1998).
A forma que contém cobre (Cu2+) e zinco (Zn2
+), denominada de superóxido
dismutase cobre-zinco dependente (CuZnSOD), é muito estável e encontra-se presente em
praticamente todas as células eucarióticas (plantas ou animais). A CuZnSOD é constituída de
duas subunidades proteicas idênticas, com um átomo de cobre e um de zinco em cada uma
delas, e que atua como catalisadora da decomposição do O2•- (BELLÓ, 2002; HALLIWELL
& GUTTERIDGE, 2007).
A superóxido dismutase dependente do manganês (MnSOD), tem sua atividade
diminuída em pH alcalino. A remoção do Mn dos sítios ativos causa perda da atividade
catalítica, não podendo ser reposto por nenhum íon de transição, pois perde a sua atividade
funcional. As sequencias de aminoácidos de todas as MnSOD, em todas as espécies, são
parecidas e não estão relacionadas com a CuZnSOD (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
2007). É salutar que, o local de ocorrência dessas enzimas influencia em sua atividade, a
CuZnSOD por ocorrer no citosol celular, não sofre efeitos em sua atividade pelo estresse
oxidativo. Entretanto, MnSOD por ocorrer na mitocôndria, que é considerada centro redox,
tem sua atividade aumentada em situações de estresse oxidativo (SORDILLO et al., 2009).
A GSH também apresenta importante papel na defesa das células contra o estresse
oxidativo, em que concentrações baixas de GSH têm sido associadas a maior risco de
desiquilíbrio oxidativo. Sua ação ocorre por meio da redução do peróxido de hidrogênio e da
detoxificação de hidropeptídeos orgânicos em água e oxigênio, em que a GSH é usada como
substrato pela enzima GSH-Px, na eliminação de peróxidos. Essa reação resulta na oxidação
de GSH à glutationa oxidada (GSSG), que uma vez formada, é então, reduzida pela glutationa
11
redutase (GR) por meio de um ciclo catalítico, que regenera a GSH, num processo as custas
da transferência de hidrogênio do NADPH (Figura 4) (BASU et al., 2009).
Outro antioxidante enzimático é a CAT, que está presente na maioria das células
aeróbicas, sendo encontrada principalmente no fígado, rins e eritrócitos (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2007). Os nutrientes mais importantes coadjuvantes da CAT são o ferro e os
tocoferóis (vitamina E), que se acham distribuídos na fase hidrofóbica da membrana celular
(MARRONI & MARRONI, 2002). A CAT evita o acúmulo de metahemoglobina, resultante
da oxidação da hemoglobina (MAZULLO FILHO et al, 2012) e a decomposição do peróxido
de hidrogênio em água e oxigênio molecular (NOVAS et al, 2007).
FIGURA 4 - Mecanismo de ação do complexo glutationa. H2O2: peróxido de hidrogênio,
RO2H: hidroperóxido orgânico, GPX: glutationa peroxidase, ROH: peróxido, H2O: água, GSH: glutationa, GS-SG: glutationa oxidada, NADP: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida, FAD: flavina adenina dinucleotídeo, NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada, FADH2: flavina adenina dinucleotídeo, forma reduzida.
Fonte: Adaptado de BASU et al., 2009
Experimentos têm sido realizados para avaliar a competição entre as enzimas
CAT e GSH-Px em eritrócitos. A CAT é a enzima que se encarrega de realizar a conversão de
H2O2 em água e oxigênio, quando esse radical livre encontra-se em elevadas concentrações.
Quando o peróxido de hidrogênio está presente em baixas concentrações, ou seja, condições
fisiológicas normais, a GSH-Px se encarrega de transformá-lo em água (CHEESEMAN &
SLATER, 1993; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
2.3.2 Antioxidantes não enzimáticos
12
Alguns nutrientes essenciais podem atacar diretamente os radicais de oxigênio. A
vitamina E (alfa-tocoferol) é o antioxidante lipossolúvel mais eficiente presente em todas as
membranas celulares. Cada tocoferol pode reagir com até dois radicais peroxila e, nesse caso,
o tocoferol é irreversivelmente desativado, ou seja, atua inibindo a peroxidação de lipídeos.
Assim, a vitamina E atua minimizando os danos provocados pelos radicais livres nas
membranas biológicas e as protege contra o ataque de radicais superóxido (BARREIROS &
DAVID, 2006).
Os carotenóides, principalmente o beta-caroteno, podem funcionar como
precursores da vitamina A. Essa vitamina tem pouca ação antioxidante e é incapaz de agir
sobre o oxigênio singlet, mas seu precursor, o beta-caroteno, é o mais eficiente ligante desta
forma reativa de oxigênio encontrada na natureza e pode agir como antioxidante, devido a sua
velocidade de reação que é superior aos tocoferóis (MACHLIN & BENDICH, 1987). Além
de desativar o oxigênio singlet, os carotenoides atuam como sequestradores dos radicais
peroxila, que reduzem a oxidação do DNA e lipídeos (SIES & STAHL, 1995).
A vitamina C (ácido ascórbico) é sintetizada por plantas e animais, com exceção
dos primatas, que necessitam obtê-lo na dieta (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O
ácido ascórbico é necessário in vivo como cofator de várias enzimas, sendo as mais
conhecidas a prolina-hidroxilase e a lisina-hidroxilase, envolvidas na biossíntese do colágeno.
A deficiência do ascorbato na dieta humana causa o escorbuto. A mais impressionante
propriedade química do ascorbato é a sua habilidade para agir como agente redutor - doador
de elétrons (CHAIYOTWITTAYAKUN et al., 2002).
Existe, ainda, uma série de outros antioxidantes não enzimáticos que participam
da defesa contra as espécies reativas do oxigênio nos sistemas biológicos como, por exemplo,
a ubiquinona, a ceruloplasmina, o ácido úrico, a bilirrubina, a biliverdina, a taurina, os
flavonoides e outros compostos fenólicos de origem vegetal (POLIDORI et al., 2001;
VASCONCELOS et al.,2007).
Os flavonoides são substâncias polifenólicas, amplamente distribuídas em plantas,
frutas, verduras e em diversas bebidas. O termo fenólico ou polifenólico é empregado para
definir uma substância que apresenta um ou mais núcleos aromáticos na sua estrutura
molecular, e que contém substituintes hidroxilados e/ou derivados funcionais, como ésteres,
glicosídeos e outros. A atividade antioxidante dos flavonoides depende da sua estrutura e
pode ser determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e elétrons,
estabilidade do radical flavanoil formado, reatividade frente a outros antioxidantes,
13
capacidade de quelar metais de transição e solubilidade e interação com as membranas
(LYKKESFELDT & SVENDSEN, 2007).
Existe na literatura muita controvérsia sobre o mecanismo de ação dos
flavonoides, pois a atividade de sequestro está diretamente ligada ao potencial de oxidação
dos flavonoides e das espécies a serem sequestradas. Quanto menor o potencial de oxidação
do flavonoide, maior é sua atividade como sequestrador de radicais livres (Quadro 3).
Atualmente, já foram identificados mais de 5.000 flavonoides diferentes. Entretanto, alguns
flavonoides ganharam destaque em pesquisas (MILTERSTEINER et al., 2003).
A melatonina é um antioxidante conhecido, produzido pela glândula pineal
(GUYTON, 1997). Recentemente, a melatonina foi descrita como participante da função
imunológica dos organismos e como um potente antioxidante; conferindo proteção
substancial contra os radicais livres que são gerados em uma variedade de situações
experimentais, incluindo dano por isquemia e reperfusão. Por essa razão, vem sendo utilizada
terapeuticamente em cirurgias e transplantes (REITER & MAESTRONI, 1999).
QUADRO 3 - Principais flavonoides estudados em
pesquisas científicas Ácido caféico Miricetina
Ácido gálico Naringenina
Ácido elágico Epicatequina
Curcumina Epigalocatequina
Isoflavona Rutina
Quercetina
Fonte: Adaptado de SIES (1993)
Existem vários nutrientes essenciais de origem mineral, que participam do
processo antioxidante em associação com enzimas. São eles, zinco, cobre, manganês, selênio
e ferro (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O papel exato do zinco como antioxidante
não foi ainda elucidado, mas as evidências disponíveis indicam ação desse mineral
envolvendo vários mecanismos. Esses mecanismos incluem a regulação da expressão de
metalotioneína, a atividade da enzima S e a proteção de grupamentos sulfidrila de proteínas de
membranas celulares por antagonismo com metais pró-oxidantes como cobre e ferro
(KOURY & DONANGELO, 2003). O selênio tem sido empregado na dieta animal sob forma
14
de selenito associado à vitamina E, com função protetora das membranas biológicas contra a
degeneração oxidativa promovida por radicais livres (LIMA & DOMINGUES, 2007).
2.4 Relação da sanidade e produção animal com o estresse oxidativo e o uso de
antioxidantes
O agronegócio brasileiro caminha para a próxima década com foco na
competitividade e na modernidade, fazendo da utilização permanente da tecnologia um
caminho para a sustentabilidade. Em 2012, foram abatidos 31 milhões de cabeças em todo o
país, sendo que os estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, São Paulo, Minas
Gerais, Pará e Rondônia, lideram os abates, com 70,6% dos abates no país (BRASIL, 2013).
As projeções da produção de carne para o Brasil mostram que esse setor deve
apresentar intenso crescimento nos próximos anos. Sendo que, a carne bovina apresenta
crescimento projetado para os próximos anos de 3% ao ano. As estimativas também projetam
um quadro favorável para as exportações brasileiras. As carnes bovina e suína lideram as
taxas de crescimento anual das exportações para os próximos anos e a taxa anual prevista para
carne bovina deve situar-se numa média anual de 2,5%, exportada para numerosos países
(BRASIL, 2013; CARDOSO, 2014).
Em 2012, o Brasil situou-se como segundo colocado no ranking mundial do
número de cabeças bovinas, enquanto que a Índia manteve a primeira colocação. Entre os oito
primeiros colocados nos últimos dois anos analisados, somente Índia, Brasil, Argentina e
Austrália apresentaram crescimento no rebanho. Os outros países avaliados (China, Estados
Unidos, União Europeia, México, Paquistão, Rússia, Canadá e Colômbia) apresentaram
decréscimo, devido a problemas climáticos (principalmente a seca), econômicos e
conjunturais (MEZZADRI, 2013; CARDOSO, 2014).
Apesar deste cenário favorável é importante enfatizar que o Brasil ainda apresenta
potencial de crescimento na pecuária de corte. Uma das vantagens competitivas da cadeia
produtiva da carne brasileira reside na possibilidade de criar os bovinos a pasto, mas esse
sistema de criação pode acarretar algumas ineficiências na produção (FIORAVANTI, 1999).
15
No Brasil, dentre as diversas variedades de pastagens oferecidas ao rebanho, as
espécies de Brachiaria sp foram consideradas a “salvação da pecuária nacional” em virtude
de sua adaptação ao clima tropical e ao solo brasileiro (GHISI, 1991). Algumas espécies
como B. brizantha, B. humidicola e, especialmente, B. decumbens têm sido descritas como
causadoras de fotossensibilização hepatógena em ruminantes (TOKARNIA et al., 2000;
LEMOS & PURISCO, 2002). A sua primeira descrição ocorreu em 1975 (RUSSOMANNO et
al, 2003) em bovinos alimentados por pastagens formadas com as sementes de B. decumbens
cv. Basilisk. Posteriormente, a doença foi diagnosticada em bovinos mantidos em pastagens
de B. brizantha (LEMOS et al., 1996).
A causa principal da fotossensibilização hepatógena em bovinos é a ingestão da
toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo Pithomyces chartarum, habitante natural
das espécies de Brachiaria sp (MOTA et al., 2000; MACEDO et al., 2006). O principal efeito
tóxico da esporidesmina deve-se à formação de quantidade excessiva de radicais livres,
responsáveis pela lipoperoxidação das membranas celulares (MUNDAY, 1982).
Laboratorialmente, as principais disfunções hepáticas observadas em ruminantes com
fotossensibilização são as alterações na atividade sérica de gama glutamiltransferase (GGT).
Esta elevação indica lesão hepática semelhante a provocada por esporidesmina (TOWERS &
STRATTON, 1978).
CRUZ et al. (2000, 2001) e BRUM et al. (2007, 2009) relatam que a intoxicação
não seria causada pela presença do fungo, mas por saponinas esteróides litogênicas presentes
nas espécies de Brachiaria sp. Essas saponinas ao sofrerem hidrólise no metabolismo do
animal acarretam em formação de radicais livres, conjugações com ácido glicurônico e
ligações com íons cálcio que levam a formação de sais insolúveis que se depositam na forma
de cristais no sistema biliar (MILES et al., 1991). Os cristais causam inflamação e obstrução
do sistema biliar, além de necrose dos hepatócitos periportais resultando em hepatite, icterícia
e fotossensibilização. Encontram-se, também, cristais aciculares nos hepatócitos, células de
Kupffer e células dos túbulos renais (RADOSTITS et al., 2002).
Microscopicamente as principais alterações observadas no fígado de ruminantes
com fotossensibilização são colangite, pericolangite, proliferação de ductos biliares e de
tecido fibroso (FIORAVANTI, 1999, MOREIRA et al., 2009). É bastante comum, nos casos
de fotossensibilização de animais que pastejam Brachiaria sp, a presença de macrófagos e
células gigantes multinucleadas com citoplasma espumoso, localizadas principalmente na
região periacinar. Macrófagos espumosos são células de citoplasma abundante, com inúmeros
16
vacúolos pequenos opticamente vazios, que dão ao citoplasma aparência de espuma
(BARBOSA et al., 2006).
De acordo com KINSCHERF et al. (1997), o macrófago espumoso deriva da
internalização da lipoproteína de baixa densidade (LDL) modificada por mecanismos de
oxidação, via receptores inespecíficos. O estresse oxidativo, por diminuição dos mecanismos
de proteção do organismo ou pela presença de uma substância exógena capaz de produzir
lipoperoxidação, também promove a oxidação da LDL e consequentemente o surgimento dos
macrófagos espumosos. A esporidesmina é rapidamente auto-oxidada, gerando radicais
superóxidos (FAGLIARI et al., 2003; MOREIRA et al., 2009) Estes radicais podem ocasionar
no fígado a peroxidação de lipídeos, que, por sua vez, poderia desencadear o surgimento de
macrófagos espumosos (FIORAVANTI,1999).
As primeiras descrições da presença de macrófagos espumosos no fígado de
bovinos se seguiram a disseminação da Brachiaria sp como principal pastagem no Brasil.
Observou-se que macrófagos de citoplasma espumoso não estavam presentes em bovinos que
não ingeriram Brachiaria sp, o que indicou a relação entre a sua presença e a ingestão da
planta (DRIEMEIER et al., 1999). Aglomerados de macrófagos espumosos no fígado e em
linfonodos, com algumas células contendo cristais birrefringentes, foram observados em
bovinos ingerindo feno de Brachiaria brizantha (TORRES & COELHO, 2003).
Segundo JIMÉNEZ et al. (2005) e PENHA-SILVA et al. (2005), os antioxidantes
de maior importância para os ruminantes são vitamina E, selênio, carotenoides (vitamina A e
β-carotenos) e zinco.
A suplementação de vitamina A em bovinos foi avaliada por PASCHOAL &
ZANETTI (2004) e MARÇAL (2006) que verificaram que a utilização do antioxidante atuaria
na prevenção do edema de úbere e da mastite pós-parto em vacas leiteiras. BRYANT et al.
(2010) ao trabalharem com o mesmo antioxidante em garrotes confinados, relataram que uma
concentração até duas vezes maior que a recomendada para bovinos apresenta pouco efeito
sobre o desempenho e o acabamento de carcaça do animal. AMARAL et al. (2004) ao
avaliarem o efeito da vitamina A sobre a atividade reprodutiva em vacas de corte concluíram
que a suplementação aumenta o número de embriões viáveis sem interferir na quantidade de
embriões produzidos.
Conforme McDOWELL (1992), o papel do selênio na nutrição animal foi
descoberto quando se observou que a suplementação evitava necrose hepática em ratos. Após
essa constatação, também foram relatadas prevenções de distrofia muscular nutricional
quando bovinos e ovinos foram suplementados com selênio (PASCHOAL et al., 2003). Em
17
ruminantes, os problemas com selênio são mais tipicamente observados próximos ao parto,
com maior incidência de mastite e retenção de placenta na fêmea, e doença do músculo
branco nos recém-nascidos (TOKARNIA et al., 2000; SORDILLO, 2013)
LIMA & DOMINGUES (2007) recomendaram a suplementação de selênio na
forma de mistura mineral para bovinos, a fim de proporcionar efeitos positivos sobre a
produção (ganho de peso, reprodução), tanto na saúde e bem estar animal, como na eficiência
dos processos e produtos. PASCHOAL et al. (2003) confirmaram a teoria de promoção da
saúde animal pela suplementação de selênio associado a vitamina E, ao concluírem que a
administração conjunta desses antioxidantes diminuiu a incidência de mastite clínica nas 12
primeiras semanas de lactação.
Inúmeros pesquisadores demonstraram os efeitos da suplementação da vitamina E
em bovinos na qualidade da carne de bovinos Nelore (PEREIRA, 2002; FACO et al., 2009),
no período de pré e pós-parto em vacas leiteiras (PASCHOAL et al., 2004), no metabolismo
oxidativo de neutrófilos (COSTA et al., 2004), na infecção por herpesvírus tipo 1 (CUSACK
et al., 2005) e na ocorrência de mastite em vacas (VALLE, 2005; FERREIRA et al., 2007;
BRITO et al., 2008). No entanto, nenhum desses trabalhos conseguiu demonstrar o efeito da
suplementação com a vitamina E de forma isolada. Segundo VALLE (2005), a suplementação
isolada de vitamina E não foi capaz de evidenciar diferenças estatísticas sobre a quantidade de
neutrófilos presente no leite em virtude da complexidade dos mecanismos envolvidos na
atividade funcional deste antioxidante.
HADDAD & ALVES (2006) constataram que o selênio e vitamina E apresentam
forte relação de sinergismo prevenindo a oxidação de fosfolipídeos da membrana, enquanto
que NICOLODI et al. (2010) verificaram que a administração conjunta desses antioxidantes
em ruminantes propiciou melhor resposta imune. PASCHOAL et al. (2006) relataram que o
selênio e a vitamina E são antioxidantes importantes na defesa de células e tecidos que atuam
diretamente na manutenção da saúde do úbere, e que na dosagem utilizada no ensaio não se
constatou influencia do antioxidante sobre a contagem de células somáticas (CCS), que é
considerada uma prova indicadora de mastite. VALLE (2000) não observou efeito da
vitamina E sobre a incidência de mastite subclínica. JUARÉZ et al. (2009) ao trabalharem
com vacas de leite, relataram que o uso da suplementação de selênio e vitamina E nos dias 60
e 21 pré-parto e nos dias 30 e 90 pós-parto, também diminui a incidência de enfermidades
uterinas pós-parto e melhora as taxas de gestação aos 150 dias após o parto.
Em estudo avaliando o acréscimo de zinco na alimentação de bezerros verificou-
se que a suplementação melhorou a resposta imunológica mediada por células e a resposta de
18
anticorpos para vacinas comerciais de vírus mortos ou vivos modificados, com reflexo
positivo sobre o desempenho dos animais devido ao seu efeito (KEGLEY et al., 2001). COPE
et al. (2008) ao avaliar os efeitos da quantidade e da forma de suplementação com zinco sobre
o desempenho e a saúde de vacas leiteiras, concluíram que a suplementação proporcionou
diminuição da quantidade de células somáticas e na concentração de leite amiloide em vacas
leiteiras. WAGNER et al. (2008) ao estudarem as diferentes fontes orgânicas de zinco
concluíram que independente da fonte mineral utilizada os animais apresentaram resultados
semelhantes para o desempenho e de característica de carcaça.
Embora haja na literatura informações sobre a utilização de antioxidantes na dieta
animal e seus efeitos sobre a sanidade animal, pouco se sabe sobre a influência da
suplementação com antioxidantes sobre a medicina de produção animal. Diante dessa
realidade, muitos pesquisadores deram início aos estudos abrangendo esse eixo temático.
Sabe-se que a suplementação mineral tem contribuído muito para a produção animal, o que
leva a um desempenho de alta performance e obtenção de carcaças com qualidade superior.
Resultados estes que também têm sido obtidos com a utilização de antioxidantes nos animais
e que têm contribuído de forma significativa para a diminuição de enfermidades durante a
cadeia produtiva.
3 OBJETIVOS
No presente estudo, objetivou-se avaliar o efeito da suplementação com
antioxidantes de forma isolada (selênio, zinco e vitamina E) ou associada (selênio e vitamina
E) em bovinos confinados alimentados com feno de braquiária, por meio da determinação de
biomarcadores de estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa peroxidase e catalase) e em
hepatócitos (malondialdeído), complementando as informações com exames laboratoriais e
histológicos.
REFERÊNCIAS
1. AMARAL, B. C.; SOUZA, J. C.; BERTECHINI, A. G.; VIVEIROS, A. T. M.;
TEIXEIRA, J. C.; ARANTES, A. F. A. Efeito de diferentes dosagens de vitamina a
19
injetável na produção e qualidade de embriões bovinos da raça nelore. Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, v.28, n.3, p.662-667, 2004.
2. ANDERSON, D. Antioxidant defenses against reactive oxygen species causing genetic
and other damage. Mutation Research, Amsterdam, v. 350, n. 1, p.103-108, 1996.
3. BABIOR, B. M. Superoxide: a two-edged sword. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, Ribeirão Preto, v. 30, n. 2, p. 141-155, 1997.
4. BARBOSA, J. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; TOKARNIA, C. H.; PEIXOTO, P. V.
Fotossensibilização hepatógena em eqüinos pela ingestão de Brachiaria humidicola
(Gramineae) no Estado do Pará. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 26,
n. 3, p.147-153, 2006.
5. BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M. Estresse oxidativo: relação entre geração de
espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, São Paulo, v. 29, n. 1, p. 113-
123, 2006.
6. BASU, T. K.; TEMPLE, N. J.; GARG, M. L. Antioxidants in human health and
disease. London: British Library, 1999. 451p.
7. BELLÓ, A. Dano oxidativo e regulação biológica pelos radicais livres. In: MARRONI,
N. P. Estresse oxidativo e antioxidantes. Porto Alegre: Ulbra, p. 15-19. 2002
8. BIANCHI, M. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais antioxidantes
da dieta. Revista de Nutrição, Campinas, v. 12, n. 2, p. 123-130, 1999.
9. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Projeções do
Agronegócio: Brasil 2012/2013 a 2022/2023. Assessoria de Gestão Estratégica, 4ª ed.,
Brasília, 2013. 96 p.
10. BRITO, O. S.; CHALHOUB, M.; COSTA, J. N.; BITTENCOURT, T. C. C.;
FERREIRA, A. F. S. C. Efeito da suplementação parenteral de vitamina e no pré-parto
sobre a eficiência reprodutiva de vacas leiteiras. Arquivos de Veterinária, Jaboticabal,
v. 24, n. 1, p. 66-71, 2008.
11. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; GARUTTI, M. B.; NÓBREGA, F. N.; ROSA, B.;
FIORAVANTI, M. C. S. Steroidal saponin concentrations in Brachiaria decumbens and
20
B. brizantha at diferent develomental stages. Ciência Rural, Santa Maria, v. 39, p. 279-
281, 2009.
12. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; LEMOS, R. A. A.; RIET-CORREA F.,
FIORAVANTI, M. C. Crystal associated cholangiopathy in sheep grazing Brachiaria
decumbens containing the saponin protodioscin. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de
Janeiro, v. 27, p. 39-42, 2007.
13. BRYANT, T. C.; WAGNER, J. J.; TATUM, J. D.; GALYEAN, M. L.; ANTHONY, R.
V.; ENGLE, T. E. Effect of dietary supplemental vitamin A concentration on
performance, carcass merit, serum metabolites, and lipogenic enzyme activity in yearling
beef steers. Journal of animal science, Champaign, v. 88, n. 1, p. 1463-1478, 2010.
14. CARDOSO, D. Produção maior no Brasil e na Índia. Anuário DBO, São Paulo, v. 32, n.
399, p. 14-15, 2014.
15. CHAIYOTWITTAYAKUN, A., ERSKINE, R.J., BARTLETT, P.C., HERD, T.H.,
SEARS, P.M., HARMONT, R.J., The effect of ascorbic acid and L-histidine therapy on
acute mammary inflammation in dairy cattle. Journal of Dairy Science, Champaing, v.
85, p. 60-67, 2002.
16. CHEESEMAN, K. H.; SLATER, T. F. An introduction to free radical biochemistry. In:
Free radicals in medicine. London: Churchill Livingstone, 1993. p. 481-493.
17. COPE, C. M.; MACKENZIE, A. M.; WIDE, D.; SINCLAIR, L.A. Effects of level and
form of dietary zinc on dairy cow performance and health. Journal of Dairy Science,
Champaign, v. 24, n. 1, p. 66-71, 2008.
18. COSTA, J. N.; PEIXOTO, A. P. C.; KOHAYAGAWA, A.; FERREIRA, A. F. M. S. C.;
CASSETARI, M. L.; CROCCI, A. J. Influência do desenvolvimento etário e da
suplementação com vitamina E (acetato de DL-alfatocoferol) no metabolismo oxidativo
dos neutrófilos de bovinos da raça Holandesa (Bos taurus). Brazilian Journal of
Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 41, n. 5, p. 293-298, 2004.
19. CRUZ, C.; DRIEMEIER, D.; PIRES, V. S.; COLODEL, E. M.; TAKETA, A. T. C.;
SCHENKEL, E. P. Isolation of steroidal sapogenins implicated in experimentally induced
21
cholangiopathy of sheep grazing Brachiaria decumbens in Brazil. Veterinary Human
Toxicology, Manhattan, v. 42, p. 142-145, 2000.
20. CRUZ, C.; DRIEMEIER, D.; PIRES, V. S.; SCHENKEL, E. P. Experimentally induced
cholangiopathy by dosing sheep with fractionated extracts from Brachiaria decumbens. J.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 13, p. 170-172, 2001.
21. CURI, R.; POMPÉIA, C.; MIYASAKA, C. K.; PROCÓPIO, J. Entendendo a gordura –
Os ácidos graxos. Editora Manole. Barueri, 2002. 580p.
22. CUSACK, P. M. McMENIMAN, N. P.; LEAN, I. J. The physiological and production
effects of increased dietary intake of vitamins E and C in feedlot cattle challenged with
bovine herpesvirus. Journal of Animal Science, Champaign, v. 83, n. 10, p. 2423-2433,
2005.
23. DRIEMEIER, D.; DÖBEREINER, J.; PEIXOTO, P. V.; BRITO, M. F. Relação entre
macrófagos espumosos (“foam cells”) no fígado de bovinos e ingestão de Brachiaria spp
no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 19, n. 2, p. 79-83, 1999.
24. DROGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological
Reviews, Bethesda, v. 82, p. 47-95, 2002.
25. ESTERBAUER, H.; GEBICKI, J.; PUHL, H.; JÜRGENS, G. The role of lipid
peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology
& Medicine, New York, v. 13, p. 341-390, 1992.
26. FACCO, E. M. P.; LAGE, M. E.; GODOY, H. T. Influence of vitamin e supplemented
diet on charque quality and lipid stabilization. Brazilian Archives of Biology and
Technology, Curitiba, v. 52, n. 3, p. 729-736, 2009.
27. FAGLIARI, J. J.; OKUDA, H. T.; PEREIRA, G. T.; PASSIPIERI, M. Efeito de zinco
suplementar nos sintomas de fotossenssibilização causada pela esporidesmina em bovinos
jovens. Ars Veterinária, Jaboticabal, v. 19, n. 1, p. 96-103, 2003.
28. FERREIRA, A. L.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: Conceitos, doenças
relacionadas, sistemas de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica
Brasileira, São Paulo, v. 43, n. 1, p. 61-68, 1997.
22
29. FERREIRA, A. M. S. C.; COSTA, J. N.; PEIXOTO, A. P. C.; BRITO, O. S.;
CASSETARI, M. L.; NETO, A. O. C. Suplementação com vitamina E (acetato de DL-
alfa-tocoferol) e a ocorrência de mastites em vacas da raça Jersey. Revista Brasileira de
Saúde e Produção Animal, Salvador, v. 8, n. 2, p. 71-86, 2007.
30. FIORAVANTI, M. C. S. Incidência, avaliações clínica, laboratorial e
anatomopatológica da intoxicação subclínica por esporidesmina em bovinos.
Botucatu, 1999. 256p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista.
31. GAETANI, G. F.; GALIANO, S.; CANEPA, L.; FERRARIS, A. M.; KIRKMAN, H. N.
Catalase and glutathione peroxidase are equally active in detoxification of hydrogen
peroxide in human erythrocytes. Blood Cells, Belfast, v. 73, p. 334-339, 1989.
32. GHISI, O. M. A. A. Brachiaria na pecuária brasileira: importância e perspectivas. In:
PAULINO, V. T. et al. (Ed.). II ENCONTRO PARA DISCUSSÃO SOBRE CAPINS DO
GÊNERO BRACHIARIA. Anais… Nova Odessa, 1991. 356 p.
33. GUIMARÃES, E. L.; FRANCESCHI, M. F.; GRIVICICH, I.; DAL-PIZZOL, F.;
MOREIRA, J. C.; GUARAGNA, R. M. Relationship between oxidative stress levels and
activation state on a hepatic stellate cell line, Liver International, Oxford, v. 26, n. 4, p.
477-485, 2006.
34. GUYTON, A. C. Tratado de fisiologia médica. 6. ed. Rio de Janeiro. Guanabara
Koogan, 1997. 974 p.
35. HADDAD, C. M.; ALVES, F. V. Novos conceitos e tecnologias na suplementação
mineral de bovinos. Congresso Latino Americano de Nutrição Animal. 2ed. 10-13 jun.
2006. Anais eletrônicos... [on line]. Disponível em:
http://www.unb.br/posgraduacao/stricto_sensu/editais/12008/artigos_cienciasanimais_1_
2008/Novos%20Conceitos%20e%20Tecnologias%20na.pdf. Acesso em: 12 out. 2014.
36. HALLIWELL, B. Free radicals and antioxidants: a personal view. Nutrition Reviews,
New York, v. 52, n. 8, p. 253-265, 1994.
37. HALLIWELL, B. How to characterize a biological antioxidant. Free Radical Research,
London, v. 9, p. 1-32, 1990.
23
38. HALLIWELL, B. Oxidants and human disease: some new concepts. FASEB Journal,
Bethesda, v. 1, n. 5, p. 358-364, 1987.
39. HALLIWELL, B.; CLEMENT, M. V.; LONG, L. H. Hydrogen peroxide in the human
body, FEBS Letters, Amsterdam, v. 486, n. 1, p. 10-13, 2000.
40. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free radicals in biology and medicine.
Oxford: Clarendon Press, 2007, 543p.
41. HAN, D.; HANAWA, N.; SABERI, B. KAPLOWITZ, N. Mechanisms of liver injury.
III. Role of glutathione redox status in liver injury, American Journal of Physiology -
Gastrointestinal and Liver Physiology, Bethesda, v. 291, n.1, p. 1-7, 2006.
42. JIMÉNEZ, M. H.; CERRILLA, M. E. O.; PERALTA, M. C.; HARO, J. G. H.; DÍAZ-
CRUZ, A.; PERRUSQUÍA, R. G. Estrés oxidativo y el uso de antioxidantes en animales
domésticos. Interciência, Catanduva, v. 30, n. 12, p. 728-734, 2005.
43. JUÁREZ, L. A. R.; GONZÁLEZ, O. O.; FLORES, C. F. A.; GUTIÉRREZ, C. G.;
ROURA, S. M.; CERÓN, J. H. Incidence of uterine pathologies and fertility of Holstein
cows treated with selenium and vitamin E before and after parturition. Veterinaria
Mexico, México, v. 40, n. 2, p. 133-140, 2009.
44. KEGLEY, E. B.; SILZELL, S. A.; KREIDER, D. L.; GALLOWAY, D. L.; COFFEY, K.
P.; HORNSBY, J. A.; HUBBELL, D. S. The immune response and performance of
calves supplemented with zinc from an organic and an inorganic source. The
Professional Animal Scientist, Fayetteville, v. 17, n. 1, p. 33-38, 2001.
45. KINSCHERF, R., KAMENCIC, H., DEIGNER, H.P , PILL, J.; SCHMIEDT, W.;
SCHRADER, M.; METZ, J. Effect of alterations of blood cholesterol levels on
macrophages in the myocardium of New Zealand white rabbits. Journal of Leukocyte
Biology, New York, v. 62, p. 719-725, 1997.
46. KOURYI, J. C.; DONANGELO, C. M. Zinco, estresse oxidativo e atividade física.
Revista de Nutrição, Campinas, v. 16, n. 4, p. 433-441, 2003.
24
47. KOWALE, B. N.; RAO, V. K; BABU, N. P.; SHARMA. N.; BISHT, G. S. Lipid
oxidation and cholesterol oxidation in mutton during cooking and storage. Meat Science,
Barking, v. 43, n. 2, p. 195-202, 1996.
48. LEITE, H. P.; SARNI, R. S. Radicais livres, antioxidantes e nutrição. Revista Brasileira
de Nutrição Clínica, São Paulo, v. 18, n. 2, p. 87-94, 2003.
49. LEMOS, R. A. A.; OSÓRIO, A. L. A. R.; RANGEL, J. M. R.; HERRERO JR, G. O.
Fotossensibilização e colangiopatia associada a cristais em bezerros ingerindo Brachiaria
brizantha. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 63S, p. 22, 1996.
50. LEMOS, R. A. A.; PURISCO, E. Plantas que causam fotossensibilização hepatógena. In:
LEMOS, R. A. A.; BARROS, N.; BRUM, K. B. (Org.). Enfermidades de interesse
econômico em bovinos de corte: perguntas e respostas. Campo Grande: UFMS, p.
292. 2002.
51. LIMA, L. G.; DOMINGUES, J. L. Uso do selênio na produção de bovinos. Revista
Eletrônica Nutritime, Viçosa, v. 4, n. 4, p. 462-474, 2007.
52. LYKKESFELDT, J.; SVENDSEN, O. Oxidants and antioxidants in disease: Oxidative
stress in farm animals. The Veterinary Journal, London, v. 173, p. 502-511, 2007.
53. MACEDO, M. F.; BEZERRA, M. B.; SOTO BLANCO, B. Fotossensibilização em
animais de produção na região semi-árida do Rio Grande do Norte. Arquivo do Instituto
Biológico, São Paulo, v. 73, n. 2, p. 251-254, 2006.
54. MACHLIN, L. J.; BENDICH, A. Free radical tissue damage: protective role of
antioxidant nutrients. FASEB Journal, Bethesda, v. 1, p. 441-445, 1987.
55. MARÇAL, W. S. O edema de mama em bovinos leiteiros. Ciências Agrárias, Londrina,
v. 27, n. 1, p. 115-124, 2006.
56. MARRONI, N. P.; MARRONI, C. A. Estresse oxidativo e a mucosa gastrintestinal. In:
MARRONI, N. P. Estresse oxidativo e antioxidantes. Porto Alegre: Ulbra, p. 33-48.
2002.
57. MAZULLO FILHO, J. B. R.; BONA, S., ROSA, D. P., SILVA, F. G., FORGIARINI
JUNIOR, L. A., DIAS, A. S., MARRON, N. P. Os efeitos da ventilação mecânica no
25
estresse oxidativo. Revista Brasileira Terapia Intensiva, São Paulo, v. 24, n. 1, p.23-29,
2012.
58. McDOWELL, L. R. Minerals in animal and human nutrition. Academic Press. New
York. 1992. 524p.
59. MEZZADRI, F. P. Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento, Análise da
Conjuntura Agropecuária: Ano 2012/13 - PECUÁRIA DE CORTE, Departamento de
Economia Rural, Paraná, 2013, 49p.
60. MILES, C. O.; MUNDAY, S. C.; HOLLAND, P. T.; SMITH, B. L.; EMBLING, P. P.;
WILKINS, A. L. Identification of a sapogenin glucoronide in the bile of sheep affected
by Panicum dichotomiflorum toxicosis. New Zealand Veterinary Journal, Wellington,
v. 39, p. 150-152, 1991.
61. MILTERSTEINER, A.; MILTERSTEINER, D.; FILHO, N. P.; FROTA, A. R.; ELY, P.
B.; MARRONI, C. A.; MARRONI, N. P. Uso de quercetina a longo prazo em ratos
cirróticos. Acta Cirúrgica Brasileira, São Paulo, v. 18, n. 3, p. 232-237, 2003.
62. MOREIRA, C. N.; MORAIS M. GARCIA E. C.; CABRAL NETO, S. ARAÚJO, E. G.;
FIORAVANTI, M. C. S. Bovinos alimentados com Brachiaria spp e Andropogon
gayanus: alterações histológicas de fígado e linfonodos. Ciência Animal Brasileira, v.
10, n. 1, p. 206-218, 2009.
63. MOTTA, A. C.; RIET-CORREA RIVERO, G.; ANA LUCIA SCHILD, A. L.; RIET-
CORREA, F.; MÉNDEZ, M. C.; FERREIRA, J. L. Fotossensibilização hepatógena em
bovinos no sul do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, Santa Maria, v. 30, n. 1, 2000.
64. MUNDAY, R. Studies on the mechanisn of toxicity of the mycotoxin, sporidesmin. I-
Generation of superoxide radical by sporidesmin. Chemico-Biological Interactions,
Limerick, v. 41, n. 3, p. 361-374, 1982.
65. NICOLODI, P. R. S. J.; CAMARGO, E. V.; ZENI, D.; ROCHA, R. X.; CYRILO, F. C.;
SOUZA, F. N.; LIBERA, A. M. M. D.; BONDAN, C.; LEAL, M. L. R. Perfil proteico e
metabolismo oxidativo de cordeiros experimentalmente infectados pelo Haemonchus
contortus e suplementados com selênio e vitamina E. Ciência Rural, Santa Maria, v.40,
n.3, p.561-567, 2010.
26
66. NIESS, A. M.; DICKHUTH, H. H.; NORTHOFF, H.; FEHRENBACH, E. Free radicals
and oxidative stress in exercise – imunological aspects. Exercise Immunology Review,
Champaign, v. 5, p. 22-26, 1999.
67. NOVAS, A. J,. CHAMORRO, R. M. G.; PADRÓN, H. D. Estrés oxidativo asociado a la
exposición ocupacional a sustancias químicas. Revista Cubana de Salud y Trabajo,
Havana, v. 8, n. 1 p. 52-57, 2007.
68. PASCHOAL, J. J.; ZANETTI, M. A. Efeito da suplementação de vitamina A sobre a
incidência de mastite em vacas da raça Holandesa. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária, Belo Horizonte, v. 56, n. 2, p. 267-269, 2004.
69. PASCHOAL, J. J.; ZANETTI, M. A.; CUNHA, J. A. Contagem de células somáticas no
leite de vacas suplementadas no pré-parto com selênio e vitamina E. Ciência Rural,
Santa Maria, v. 36, n. 5, p. 1462-1466, 2006.
70. PASCHOAL, J. J.; ZANETTI, M. A.; CUNHA, J. A. Efeito da suplementação de selênio
e vitamina E sobre a incidência de mastite clínica em vacas da raça holandesa. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 55, n. 3, p. 249-
255, 2003.
71. PENHA-SILVA, N.; CUNHA, G. N.; FERREIRA, F. A.; COELHO, D. P. Determinação
da faixa de referência de glutationa peroxidase no soro de bovinos sadios. Bioscience
Journal, Uberlândia, v. 21, n. 2, p. 89-93, 2005.
72. PERCIVAL, M. Antioxidants. Clinical Nutrition Insight, Baltimore, v. 17. p. 1-4, 1998.
73. PEREIRA, A. S. C. Qualidade da carne de bovinos Nelore (Bos taurus indicus)
suplementados com vitamina E. Pirassununga, 2002. 83p. Dissertação (Mestrado em
Medicina Veterinária) - Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,
Universidade de São Paulo.
74. POLIDORI, M. C.; STAHL, W.; EICHLER, O.; NIESTROJ, I.; SIES H. Free Radical
Biology and Medicine, New York, v. 30, n. 5, p. 456-462, 2001.
27
75. POMPELLA, A. Biochemistry and histochemistry of oxidant stress and lipid
peroxidation. International Journal of Vitamin and Nutrition Research, Bern, v. 67,
n. 5, p. 289-297, 1997.
76. RADAK, Z.; KANEKO, T.; TAHARA, S.; NAKAMOTO, H.; PUCSOK, J.; SASVARI,
M.; NYAKAS, C.; GOTO, S. The effect of exercise training on oxidative damage of
lipids, proteins, and DNA in rat skeletal muscle: evidence for beneficial outcomes. Free
Radical Biology & Medicine, New York, v. 27, n. 1/2, p. 69-74, 1999.
77. RADOSTITS, O. M.; GAY, C. C.; BLOOD, D. C.; HINCHCLIFF, K. W. Clínica
Veterinária: um tratado de doenças dos bovinos, ovinos, suínos, caprinos e equinos.
9ª ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002. p.347-360.
78. REITER, J. R.; MAESTRONI, G. J. M. Melatonin in relation to the antioxidative defense
and immune systems: possible implications for cell and organ transplantation. Journal of
Molecular Medicine, Berlin, v. 77, p. 36-39, 1999.
79. RUSSOMANNO, O. M. R.; PORTUGAL, M. A. S. C.; COUTINHO, L. N.; CALIL, E.
M. B.; FIGUEIREDO. M. B. Leptosphaerulina chartarum (Pithomyces chartarum) e seu
envolvimento no eczema facial. Arquivo do Instituto Biológico, São Paulo, v. 70, n. 3,
p. 385-390, 2003.
80. SIES, H. Oxidative stress: from basic research to clinical application. American Journal
of Medicine, New York, v. 91(S), p. 31S-38S, 1991.
81. SIES, H. Strategies of antioxidant defense. European Journal of Biochemistry, Berlin,
v. 215, n. 2, p. 213-219, 1993.
82. SIES, H.; STAHL, W. Vitamins E and C, β-carotene, and other carotenoids as
antioxidants. American Journal of Clinical Nutrition, Bethesda, v. 62, n. 6, p. 1315-
1321, 1995.
83. SINGAL, P. K.; PALACE, V. P.; KHAPER, N.; QIN, Q. Antioxidant potentials of
vitamin A and carotenoids and their relevance to heart disease. Free Radical Biology
and Medicine, New York, v. 26, p. 746-761, 1999.
28
84. SORDILLO, L. M. Selenium-dependent regulation of oxidative stress and immunity in
periparturient dairy cattle. Veterinary Medicine International, Amsterdam, v. 2013,
p.1-8, 2013.
85. SORDILLO, L. M.; AITKEN, S. L. Impact of oxidative stress on the health and immune
function of dairy cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology, Amsterdam,
v. 128, p.104–109, 2009.
86. TOKARNIA, C. H.; DÖBEREINER, J.; PEIXOTO, P. V. Deficiências minerais em
animais de fazenda, principalmente bovinos em regime de campo. Pesquisa Veterinária
Brasileira, Rio de Janeiro, v. 20, n. 3, p. 127-138, 2000.
87. TOKARNIA, C. H.; DÖBEREINER, J.; PEIXOTO, P. V. Deficiências minerais em
animais de fazenda, principalmente bovinos em regime de campo. Pesquisa Veterinária
Brasileira, Rio de Janeiro, v. 20, n. 3, p. 127-138, 2000.
88. TORRES, M. B. A.; COELHO, K. I. R. Foamy macrophages in the liver of cattle fed
Brachiaria brizantha hay. Veterinary and Human Toxicology, Manhattan, v. 45, n. 3,
p. 163-164, 2003.
89. TOWERS, N. R.; STRATTON, G. C. Serum gamma-glutamyltransferase as measure of
sporidesmin-induced liver damage in sheep. New Zealand Veterinary Journal,
Wellington, v. 26, p. 109-112, 1978.
90. VALLE, C. R. Estudo da influência da suplementação de vitamina E nas atividades
funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos. Pirassununga, 2005. 83p. Tese (Doutora
em Medicina Veterinária) - Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,
Universidade de São Paulo.
91. VALLE, C. R. Influência da suplementação de vitamina E nos períodos pré e pós
parto na ocorrência de mastite clínica. 2000. 76f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)
– Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo.
92. VASCONCELOS, S. M. L.; GOULART, M. O. F.; MOURA, J. B. F.; BENFATO, V. M.
M. S.; KUBOTA, L. T. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, antioxidantes e
marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos analíticos para sua
determinação. Química Nova, São Paulo, v. 30, n. 5, p. 1323-1338, 2007.
29
93. WAGNER, J. J.; ENGLE, T. E.; WAGNER, J. J.; LACEY, J. L.; WALKER, G. The
effects of zinmet brand liquid zinc methionine on feedlot performance and carcass merit
in crossbred yearling steers. The Professional Animal Scientist, Fayetteville, v.24, n.5,
p.420-429, 2008.
94. YU, T. W.; ANDERSON, D. Reactive oxygen species induced DNA damage and its
modification: a chemical investigation. Mutation Research, Amsterdam, v. 379, n. 2, p.
201-210, 1997.
30
CAPÍTULO 2 - ERITROGRAMA E ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS
CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E
SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES
RESUMO
As Brachiaria sp contêm esporidesminas que podem ser oxidadas por lipoperoxidação e ocasionar estresse oxidativo. No presente estudo foram avaliados os efeitos de diferentes antioxidantes na lipoperoxidação dos eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno de Brachiaria sp. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em que 40 bovinos machos inteiros foram divididos, com cinco tratamentos (G1: controle - sem suplementação; G2: suplementação de selênio e vitamina E; G3: suplementação de zinco; G4: suplementação de selênio e G5: suplementação de vitamina E) e alocados em baias de confinamento, por 105 dias. Os animais foram alimentados duas vezes ao dia e receberam água ad libitum. Na dieta foi seguida a proporção de volumoso e concentrado de 70:30. Para a obtenção das amostras foi realizada a punção venosa e o sangue foi coletado em tubos com anticoagulantes (EDTA e heparina). Para a avaliação do estresse oxidativo, com o objetivo de analisar as características da membrana do eritrócito foram determinadas as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), glutationa total (GSH-t), glutationa peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD). Os resultados demonstraram que independente do tratamento não houve estresse oxidativo durante o período do confinamento experimental e que a associação conjunta de selênio e vitamina E na dieta dos bovinos proporcionou menor incidência de alterações deletérias sobre os eritrócitos.
Palavras chaves: enzimas antioxidantes, eritrócito, lipoperoxidação, Nelore, radical livre,
TBARS.
ABSTRACT
Brachiaria sp species contain sporidesmins, which lead to lipid peroxidation and oxidative stress due oxidation. The aim of the present study was to evaluate the effects of different antioxidants in Nelore cattle fed with Brachiaria sp in the prevention of lipid peroxidation in cell membranes. A total number of 40 animals were divided into five groups being confined for 105 days. The experimental design was completely randomized with five treatments (G1: control group - no supplementation; G2: supplementation of selenium and vitamin E; G3: zinc supplementation; G4: selenium supplementation and G5: vitamin E supplementation). Animals were fed twice a day and had access to water ad libitum. The diet followed the proportion of 70:30 for forage and concentrate, respectively. Blood samples were harvested by venous puncture. The samples were stored in heparinized tubes and then analyzed. To evaluate oxidative stress, erythrocyte membrane characterization, TBARS, GSH-T, GSH-Px, SOD and CAT were performed. No oxidative stress was detected during the experimental period when animals were confined even when using antioxidants. Additionally, selenium and vitamin E combined in same diet seemed to cause less deleterious alterations on the erythrocyte.
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Keys-words: antioxidants enzymes, erythrocyte, lipid peroxidation, Nelore, free radical, TBARS. 1 INTRODUÇÃO
A pecuária brasileira tem se desenvolvido muito nos últimos anos, o que resultou
em uma contribuição de 384 bilhões de reais para economia, com valorização de 11,6% do
PIB brasileiro de 2013 (CEPEA/USP, 2013). Uma das vantagens competitivas da cadeia
produtiva da carne brasileira é o sistema extensivo, porém esse sistema de criação a pasto
pode acarretar algumas ineficiências na produção (FIORAVANTI, 1999). Na tentativa de
minimizar essas ineficiências têm sido buscadas novas tecnologias, como a adoção de
aditivos, que visam melhorar a eficiência da cadeia produtiva tendo como foco a
sustentabilidade (BRASIL, 2013).
As espécies de gênero braquiária são importantes forrageiras consideradas como a
“salvação da pecuária nacional” (GHISI, 1991). Entretanto, algumas espécies como B.
brizantha, B. humidicola e, especialmente, B. decumbens foram descritas como causadoras de
fotossensibilização hepatógena em ruminantes (TOKARNIA et al. 2000, LEMOS &
PURISCO, 2002). A causa principal da fotossensibilização hepatógena em bovinos é a
ingestão da toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo Pithomyces chartarum,
(MOTTA et al., 2000; MACEDO et al., 2006).
O principal efeito tóxico da esporidesmina deve-se à ocorrência da peroxidação de
lipídeos e da carboxilação de proteínas presentes nas células, resultantes da quantidade
excessiva de radicais livres (CHILAUFF VIVANCO et al., 2006). Entretanto, alguns
pesquisadores tem atribuído como causa da intoxicação as saponinas esteróides litogênicas
presentes nas espécies de Brachiaria sp (CRUZ et al., 2001; BRUM et al., 2009). Essas
saponinas, ao serem metabolizadas no organismo animal formam sais insolúveis que se
depositam sob a forma de cristais no sistema biliar (MILES et al., 1991). Os cristais causam
inflamação e obstrução do sistema biliar, provoca necrose dos hepatócitos periportais
resultando em icterícia, fotossensibilização e hepatite (SANTOS et al., 2008).
O estresse oxidativo pode ser definido como um desequilíbrio entre produção de
radicais livres e a remoção pelos sistemas de defesa antioxidante (SIES, 1993), que ocasiona
danos moleculares às estruturas celulares, com consequente alteração funcional e prejuízo das
funções vitais em vários órgãos e tecidos (DROGE, 2002). Do ponto de vista funcional, o
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dano oxidativo promove alterações sobre a fluidez, permeabilidade e função metabólica, o
que resulta em um incremento em sua fragilidade da membrana eritrocitária (CHILAUFF
VIVANCO et al., 2006). Dentre os mamíferos, os bovinos exibem uma particularidade, na
qual apresentam uma menor susceptibilidade à ação dos radicais livres (BREZEZISKA-
SLEBODZISKA, 2003), em decorrência da composição e organização da membrana
eritrocitária que contém baixas quantidades de fosfatidilcolina, um fosfolipídio altamente
peroxidável (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 2001).
Devido ao transporte de oxigênio realizado pela hemoglobina, os eritrócitos estão
constantemente expostos às espécies reativas de oxigênio (EROs) (FLORIN-CHRISTENSEN
et al., 2001). O eritrócito apresenta em sua membrana grande número de grupos sulfidrilas,
que ao serem oxidados acarretam em desnaturação das proteínas de membrana. Nesse
processo, pode ocorrer lesão intracelular, com oxidação da hemoglobina à meta-hemoglobina,
que precipita e forma os corpúsculos de Heinz (CALDIN et al., 2005; TANG et al., 2007).
Para evitar os danos causados pela peroxidação, as células possuem sistema de
defesa antioxidante composto pelas enzimas glutationa reduzida (GSH), superóxido-
dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSHpx) e vitamina E (ÖZTÜRK &
GÜMÜSLÜ, 2004). Os agentes antioxidantes não enzimáticos são constituídos pelo ácido
ascórbico, pela glutationa-redutase (GSH-Rd), carotenos, ácido úrico e proteínas quelantes de
metais de transição (CIMEN, 2008).
A avaliação de ocorrência de estresse oxidativo em eritrócitos para acompanhar a
evolução da peroxidação nas biomembranas é a mensuração de TBARS (substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico) por meio da quantificação de malondialdeído (MDA) que é produzido
na peroxidação lipídica de ácidos graxos polinsaturados (TODOVORA et al., 2005;
MACHADO et al., 2007).
O emprego de antioxidantes adicionados à ração ofertada ao animal tem
constituído uma opção eficiente de melhoramento no sistema produtivo. Sua utilização tem
propiciado aos animais melhora na sanidade, reprodução e na produção (conversão alimentar
e ganho de peso). Isso significa que a eficiência alimentar exerce grande impacto sobre a
lucratividade da pecuária, que pode resultar em redução de custos de produção e aumentar a
eficiência do processo produtivo (SIQUEIRA et al., 2014).
Nesse contexto, objetivou-se com o presente estudo avaliar se a suplementação de
diferentes fontes de antioxidantes, na dieta de bovinos confinados alimentados com feno de
Brachiaria sp poderia reduzir a ocorrência de estresse oxidativo sobre os eritrócitos.
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2 MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Federal de Goiás (UFG) e foi registrado sob o número 360/2010. O estudo foi
desenvolvido na Fazenda Tomé Pinto de propriedade da Escola de Veterinária e Zootecnia da
UFG, localizada no Município de São Francisco de Goiás, Estado de Goiás, distante a 110 km
da capital.
Foram utilizados 40 bovinos machos não castrados de peso médio inicial de 360
Kg e idade entre 24 a 36 meses, criados em pastos de Brachiaria sp. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e oito repetições, em que
cada repetição foi representada por um animal. Os tratamentos foram representados pelos
diferentes antioxidantes e pelo grupo controle.
Após um período de adaptação de 14 dias nas instalações e com a alimentação, os
animais foram divididos em cinco grupos, que receberam os tratamentos seguintes:
• Grupo 1 (G1 = GC) - controle (sem suplementação);
• Grupo 2 (G2 = Se + Vit.E) - suplementação com 1000UI de vitamina E e 10mg de
selênio/animal/dia (2g na forma de acetato de α-tocoferol à 50% e 10g na forma de selênio
metionina);
• Grupo 3 (G3 = Zn) - suplementação de 600mg de zinco/animal/dia (6g na forma de zinco
metionina);
• Grupo 4 (G4 = Se) - suplementação com selênio 10mg de selênio/animal/dia (10g na forma
de selênio metionina);
• Grupo 5 (G5 = Vit.E)- suplementação com 1000UI de vitamina E/animal/dia (2g na forma
de acetato de α-tocoferol a 50%).
Durante o período de experimentação, os animais permaneceram alojados em baias
de confinamento e foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado
(ração). A dieta obedeceu à proporção entre volumoso e concentrado de 70:30, em que o
concentrado foi balanceado de acordo com a análise bromatológica do feno ofertado (Quadro
1), com base na estimativa de um ganho diário de 0,880kg/dia e para atender as exigências
nutricionais dos animais de acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC (1996).
O concentrado formulado (Integral Nutrição Animal, Goiânia, GO) teve uma concentração de
34% de proteína e 71% de NDT, sendo os principais constituintes, farelo de soja, farelo de
milho e mistura mineral (Quadro 2).
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QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento
Parâmetros % DP Materia seca 94,43 2,34
Nutrientes digestíveis totais 55,13 14,29 Proteína bruta 1,43 0,27
Fibra detergente ácida 37,30 8,51 Fibra detergente neutra 72,36 5,06
QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais
Ingredientes % em materia seca Feno capim Brachiaria sp 70,0 Milho moído 20,5 Farelo de soha 45% 7,5 Minerais1 2,0 *A formulação foi realizada utilizando o software RLM 3.2 (2009)
1 Minerais sem ureia e sem ionóforos
O feno de B. brizantha foi produzido e armazenado na própria Fazenda Tomé Pinto
e na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG, sendo que durante o período
experimental foram colhidas amostras para a contagem de esporos DIMENNA & BAILEY
(1973) e para extração e análise de saponina (Quadro 3) que foram realizadas no United States
Department of Agriculture – Poisonous Plant Research Laboratory (USDA-PPRL), Logan,
Utah, EUA. O manejo, vacinação, tratamento com ecto e endoparasiticidas foi similar para
todos os grupos.
QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ)
Procedência das gramíneas
Mês da análise
% de protodioscina % da redução da
protodioscina CAPIM FENO FTP – B. brizantha maio 1,08 0,75 30,55
FTP – B. decumbens maio 1,20 0,65 45,83 EVZ – B. brizantha agosto 0,55 0,38 30,55
Valores médios maio a agosto 0,94 0,59 35,64 *Valores estimados baseado na análise de maio
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Os antioxidantes foram pesados em uma balança de precisão da marca
Shimadzu®, modelo AY 220, diariamente em copos descartáveis, nas quantidades de 10g de
selênio metionina, 6g de zinco, 2g de vitamina E, de forma a propiciar que cada animal
recebesse a quantidade diária de antioxidante, conforme o seu tratamento no cocho. Para
melhorar o consumo da quantidade acima especificada, era colocado sobre o antioxidante um
pouco de ração, sendo ofertados individualmente por animal e monitorados pelo auxiliar até a
ingestão do antioxidante e do concentrado na sua totalidade, impedindo que outro bovino se
aproximasse do cocho. Os animais foram mantidos confinados em grupo por um período de
105 dias, de acordo com o tratamento, em baias sombreadas providas de bebedouros e
comedouros.
Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, às 8:00 e às 15:00 horas. A
alimentação foi fornecida sob a forma de dieta total. As sobras de alimentos foram pesadas e
descartadas diariamente antes do fornecimento matinal, para se determinar o consumo de
alimento pelo grupo e evitar que as sobras não ultrapassassem mais de 10% do total
fornecido, sendo que a água foi fornecida à vontade.
Para a colheita das amostras, os bovinos foram mantidos em estação e contidos no
brete. As amostras sanguíneas foram obtidas a cada período de 28 dias (0, 28, 56, 84 e 105
dias) por meio de punção da jugular em tubos contendo EDTA a 10% (ácido
etilediaminotetracético, sal dissódico) e tubo com heparina.
Em seguida a colheita, os tubos foram armazenados em caixas térmicas a 10ºC e
encaminhados ao Laboratório Multiusuário do Programa de Pós-Graduação em Ciência
Animal da EVZ/UFG, no período máximo de duas horas para a realização do hemograma e
obtenção do hemolisado. Após a obtenção das alíquotas para os ensaios de estresse oxidativo
(SOD, TBARS, grupamento tióis, CAT e glutationas), as amostras foram armazenadas no
freezer a -80ºC.
As amostras destinadas ao eritrograma foram processadas à medida que chegavam
ao laboratório, não ultrapassando seis horas a partir do momento da colheita. Para a obtenção
do hemograma, as amostras armazenadas em tubo de ensaio com EDTA, foram analisadas no
equipamento semiautomático BC 2800 VET (Mindray, Shenzhen), sendo determinadas as
variáveis: eritrócitos e hemoglobina. O volume globular (VG) foi obtido por meio de
microcentrifugação pela técnica de microhematócrito (JAIN, 1993).
O hemolisado obtido a partir das amostras destinadas à análise de estresse oxidativo
foi preparado segundo o protocolo utilizado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
de Universidade Estadual Paulista – UNESP/Botucatu (FERREIRA et al., 1999).
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Inicialmente, os dados foram submetidos à estatística descritiva e posteriormente,
foram analisados por análise de variância (ANOVA), empregando-se o teste de Tukey, por
meio do pacote computacional do SAS, com grau de significância de 5%.
3 RESULTADOS
Os valores médios (eritrócitos, hemoglobina e volume globular) estão descritos na
Tabela 1 e não sofreram influência dos diferentes esquemas de suplementação ao longo do
experimento (p<0,05). Os resultados referentes à quarta colheita foram descartados em
virtude do equipamento não estar devidamente calibrado no dia da execução dos exames
laboratoriais.
TABELA 1 - Médias ( X = média em cada momento e Média = média geral considerando
todos os momentos) de eritrócitos, hemoglobina e volume globular de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas Eritrócitos (x106/µl) Hemoglobina (g/dL) Volume globular (%)
X Média X Média X Média
G1
1º (Basal) 7,74
7,81a
11,96
11,37a
36,48
37,68a 2° 8,21A* 11,95AB* 39,24A* 3° 8,01A* 10,99A* 38,84A* 5° 7,27A* 10,58A* 36,15A*
G2
1° (Basal) 7,33
7,35a
11,78
11,05a
35,09
36,67a 2° 7,44AB* 11,06AB* 36,68A* 3° 7,49A* 10,61A* 37,99A* 5° 7,12A* 10,73A* 36,91A*
G3
1° (Basal) 7,51
7, 92a
11,74
11,44a
35,98
38,52a 2° 8,42A* 12,32A* 40,95A* 3° 7,85A* 10,74A* 38,55A* 5° 7,58B* 11,01B* 38,60A*
G4
1° (Basal) 7,45
7,38a
11,65
10,68a
34,95
35,43a 2° 7,33B* 10,35B* 34,41A*
3° 7,47A* 10,24A* 35,96A* 5° 7,26A* 10,46A* 36,38A*
G5 1°
(Basal) 8,09 7,84a 12,45 11,42a 36,28 37,46a
2° 7,91AB* 11,06AB* 36,66A*
37
3° 8,12A* 11,05A* 39,11A* 5° 7,56A* 11,11A* 37,80A*
Media 7,66 11,19 37,15 Probabilidade 0,471 0,528 0,215 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas colunas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
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Na avaliação hematológica (eritrócitos, hemoglobina e VG) foram encontradas
alterações numéricas nos parâmetros mensurados que não produziram diferenças estatísticas
entre os diferentes tratamentos. Em relação às colheitas foram observadas as ocorrências de
distanciamento dos valores médios obtidos para as variáveis avaliadas nas amostras referentes
à segunda e quinta colheita. Na contagem de eritrócitos, observados nessa colheita constatou-
se que G4 apresentou valores menores de eritrócitos que G1 e G3 (p<0,05). Na determinação
de hemoglobina houve variações estatísticas (p<0,05) em que o maior valor encontrado foi em
G3 e o menor em G4. O volume globular (%) não apresentou variações numéricas (p>0,05),
no período experimental.
Na determinação de TBARS (Tabela 2) ao analisar as colheitas realizadas,
verificou-se que houve interação grupos/tempo (p<0,05), com diferença significativa entre os
grupos na primeira, segunda, terceira e quinta colheitas. Foram identificadas diferenças
estatísticas (p<0,05) entre os grupos avaliados, de modo que G3 apresentou o maior valor
médio e o G2 o menor. As médias marginais entre as colheitas foram semelhantes (p>0,05).
TABELA 2 - Médias da concentração de TBARS (nM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Dia 0) 22,38 19,98 23,58 21,13 21,72 21,76ª
<0,0001 0,1079 0,001 2 (28 dias) 21,18A* 18,62B* 22,88A* 22,63A* 21,90A* 21,44ª 3 (56 dias) 23,54A* 18,93C* 23,26A* 20,55BC* 22,23AB* 21,70ª 4 (84 dias) 21,44A* 20,91A* 22,68A* 22,12A* 22,38A* 21,90a
5 (105 dias) 21,80B* 21,45B* 23,68A* 22,23AB* 22,69AB* 22,37ª Média 21,99B 19,98C 23,12A 21,88B 22,30AB
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
Na avaliação da atividade enzimática da GSH-T (Tabela 3), não foi observada
interação em relação grupo/tempo (p>0,05). Verificou-se diferença significativa entre as
médias dos grupos (p<0,05), sendo que o G5 apresentou o menor valor médio e o G1 o mais
elevado. No entanto, entre as colheitas não houve diferença significativa (p>0,05).
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TABELA 3 - Médias de GSH-T (µM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 42,58 42,85 44,86 44,19 41,18 43,13a
0,0112 0,4867 0,9196 2 (28 dias) 43,71A* 42,63A* 43,13A* 42,04A* 41,03A* 42,51a
3 (56 dias) 45,26A* 40,97A* 46,09A* 44,27A* 40,45A* 43,41a
4 (84 dias) 45,83A* 42,01A* 43,78A* 45,48A* 42,54A* 43,93a
5 (105 dias) 43,62A* 42,91A* 42,81A* 44,18A* 39,05A* 42,52a
Média 44,60A 42,13AB 43,95AB 44,00AB 40,77B Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
Na determinação da atividade enzimática de GSH-Px houve interação em relação
grupo/tempo (p<0,05), com diferença significativa em todos os momentos de colheita. Houve
diferença significativa (p<0,05) entre os grupos experimentais, sendo que o G3 apresentou o
menor valor médio e o G2 os maiores (Tabela 4). Considerando os momentos de colheita,
verificou-se as maiores médias no dia 56 e as menores aos 28 e 84 dias (p<0,05), entretanto,
sem diferença significativa (p>0,05) entre o início e o fim do estudo.
TABELA 4 - Médias de GSH-Px (UI/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 0,67 0,82 0,58 0,76 0,71 0,71ab
<0,0001 0,0022 0,0352
2 (28 dias) 0,66ABC* 0,79A* 0,53C* 0,63BC* 0,67AB* 0,66b
3 (56 dias) 0,69AB* 0,83A* 0,61B* 0,75AB* 0,87A* 0,75a
4 (84 dias) 0,62B* 0,86A* 0,52B* 0,67B* 0,68B* 0,67b
5 (105 dias) 0,72AB* 0,82A* 0,60B* 0,70AB 0,79A* 0,73ab
Média 0,68B 0,82A 0,56C 0,68B 0,75AB Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
Na mensuração da SOD foi observada interação em relação grupo/tempo (p<0,05)
nos valores médios verificou-se diferença significativa, nos grupos experimentais na terceira,
quarta e quinta colheita (Tabela 5). O G3 apresentou resultados estatisticamente inferiores aos
40
dos demais tratamentos e G1 e G4 apresentaram os valores mais elevados (p<0,05). As
médias marginais entre as colheitas foram semelhantes (p>0,05).
TABELA 5 - Médias de SOD (UI/mgHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e submetidos a tratamento com diferentes antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação
1 (Basal) 276,38 280,38 267,25 264,50 265,00 270,70a
<0,0001 0,0583 0,0125 2 (28 dias) 278,12A* 265,37A* 253,87A* 275,12A* 266,62A* 267,82a
3 (56 dias) 290,87A* 279,87AB* 255,00C* 298,37A* 266,00BC* 278,02a
4 (84 dias) 297,00A* 274,87AB* 246,75C* 297,25A* 268,50BC* 276,87a
5 (105 dias) 284,50AB 279,50AB* 239,50C* 304,00A* 274,25B* 276,35a
Média 287,63A 274,90B 248,78C 293,69A 268,84B
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
A determinação da CAT apresentou interação em relação grupo/tempo (p<0,05)
nos grupos experimentais somente na quarta e quinta colheitas (Tabela 6). Constatou-se, que
no G3, o valor médio foi superior (p<0,05) aos demais tratamentos, enquanto que o G2
apresentou os menores valores (p<0,05). As médias marginais entre as colheitas foram
similares (p>0,05).
TABELA 6 - Médias de catalase (UI/mgHb) em eritrócitos bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e submetidos a tratamento com diferentes antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 58,91 56,53 56,27 55,83 54,28 56,36a
<0,0001 0,8829 0,0087 2 (28 dias) 60,08A* 54,87A* 56,92A* 59,28A* 52,17A* 56,66a
3 (56 dias) 59,78A* 51,10A* 59,36A* 56,89A* 56,84A* 56,80a
4 (84 dias) 54,32A* 50,33A* 68,73B* 56,80A* 58,95AB* 57,82a
5 (105 dias) 53,13A* 51,07A* 66,88B* 57,81A* 56,33A* 57,04a
Média 56,82B 51,84C 62,97A 57,70AB 56,07BC Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas
41
4 DISCUSSÃO
O perfil eritrocitário dos animais durante todo o experimento manteve-se dentro
dos limites de referência proposto por FAGLIARI (1998). MOREIRA et al. (2009) ao
avaliarem bovinos alimentados com capim Brachiaria sp observaram resultados similares
para a contagem de eritrócitos. CHIHUAILAF VIVANCO et al. (2006) ao estudarem o efeito
da suplementação de selênio em vacas observaram resultados semelhantes para hemoglobina.
SHARMA et al. (2011) ao trabalharem com vacas em período de transição com a adição de
vitamina E à ração encontraram resultados semelhantes ao perfil hematológico para
hemoglobina deste estudo. CALAMARI et al. (2011) divergiram aos resultados obtidos nesse
experimento, em que os valores médios de eritrócitos, hemoglobina e VG obtidos com a
suplementação de diferentes fontes (orgânica e inorgânica) em dietas de vacas leiteiras foram
maiores aos obtidos no grupo controle. MACHADO et al. (2009) ao avaliarem a lesão
oxidativa eritrocitária concluíram que a associação de antioxidantes promove menos
alterações eritrocitárias com benefícios potenciais do tratamento por meio da suplementação
com antioxidantes sobre os eritrócitos.
Dentro dos momentos houve uma tendência de elevação dos eritrócitos no grupo
zinco, embora essa diferença numérica não refletisse em alterações biológicas. De acordo com
KOURY & DONANGELO (2003), a elevação dos valores médios dos eritrócitos poderia ser
explicada na função exercida pelo zinco na manutenção da integridade das membranas
celulares dos eritrócitos. A ação desempenhada por esse microelemento favorece a associação
das proteínas presentes na membrana com os demais componentes do citoesqueleto celular,
que por sua vez conferem a proteção antioxidante as membranas frente à oxidação de lipídeos
e proteínas e antagoniza possíveis efeitos deletérios por elementos iônicos.
A mensuração de TBARS nos eritrócitos evidenciou que durante as colheitas não
houve diferença significativa entre as médias marginais das colheitas. Porém, constatou-se
diferença significativa entre os tratamentos propostos (p<0,05). O malondialdeído (MDA) é
um dos principais marcadores da peroxidação lipídica e por meio dele são mensuradas as
TBARS. O acréscimo na concentração sanguínea desse marcador está relacionado ao aumento
da peroxidação lipídica e dano oxidativo (DRAPER & HADLEY, 1990). Os animais que
receberam a suplementação de selênio e vitamina E demonstraram maior estabilidade lipídica.
LIU et al. (2008) ao trabalharem com suplementação isolada e associada de selênio e vitamina
E de em bovinos também relataram a melhoria no estado redox do sangue quando ocorreu a
associação dos antioxidantes.
42
Os valores obtidos na mensuração de TBARS no grupo suplementado com
vitamina E associada ao selênio, demonstraram resultados similares aos observados por
KRIZANOVIC et al. (2008) em bovinos da raça Simental com idade próxima a 20 meses, que
relataram valores de TBARS inferiores no grupo que recebeu a suplementação associada de
vitamina E e selênio. CHANDRA et al. (2013) obtiveram resultados análogos ao avaliarem a
influência de alguns antioxidantes (zinco e vitamina E, de forma isolada e associada) sobre a
peroxidação lipídica no sangue de bovinos, em que observou-se que a associação dos
antioxidantes ocasionou a obtenção de menores índices de lipoperoxidação. Entretanto, os
resultados obtidos no presente estudo foram diferentes aos encontrados por CASTILLO et al.
(2005, 2006) e KUMAR et al. (2011) que obtiveram resultados maiores e por SHARMA
(2011) que encontrou resultados menores aos obtidos neste trabalho ao se avaliar a
lipoperoxidação em bovinos. Este fato ocorreu provavelmente, pela utilização de diferentes
metodologias e unidades de concentração que foram empregadas na mensuração do MDA
como indicador de estresse oxidativo.
Cabe ressaltar também que a manutenção dos níveis de GSH-t deveu-se ao fato de
que a glutationa em maior concentração na maioria das células, inclusive nos eritrócitos de
mamíferos, está sob a forma reduzida (GSH). A depleção dos níveis de GSH pode ocorrer
diretamente, por conjugação com radicais livres e, indiretamente por inibidores da sua síntese
e regeneração (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
Como o consumo de GSH provavelmente ocorreu apenas por sua propriedade
antioxidante, a permanência de altas concentrações de GSH nos eritrócitos contribuiu para a
manutenção dos níveis de GSH-t. Aliado a isso, a manutenção dos valores de GSH-t pode ter
ocorrido também em função do “aumento compensatório” na produção de GSH por outros
órgãos, na tentativa de auxiliar o organismo a combater o aumento na produção das EROs
(MACHEFER et al., 2004). Sendo que, por conseguinte, estes podem aumentar o grau de
peroxidação lipídica e danos celulares. Comportamento semelhante ao que ocorreu neste
estudo foi relatado por LIU et al. (2008), ao descreverem que a associação de selênio e
vitamina E proporcionou aos bovinos analisados um sinergismo entre o efeito dos
antioxidantes administrados resultando em menor efeitos deletérios sobre as células
eritrocitárias.
Ainda em relação à GSH, os resultados obtidos neste ensaio para a suplementação
isolada de selênio e vitamina E foram menores aos encontrados por CHIHUAILAF
VIVANCO et al. (2006), ao avaliar os benefícios da suplementação de selênio em bovinos
sobre a estabilidade da membrana dos eritrócitos. SHARMA et al. (2011), ao analisar os
43
efeitos da adição de vitamina E em vacas em período de transição, encontraram resultados
maiores e correlação negativa entre a atividade enzimática e o marcador de lipoperoxidação.
Acredita-se que essa divergência ocorreu em virtude do sexo, da concentração de antioxidante
fornecido e do estado fisiológico dos animais, além da metodologia empregada, com a
utilização de reagentes comerciais diferentes dos empregados neste estudo.
As médias de SOD entre as colheitas apresentaram diferença estatística
significativa (p<0,05) para os grupos analisados em função da variação na concentração de
H2O2 provocada pela ação da SOD, indicando que houve ativação do ciclo redutor da
glutationa, em que os grupos suplementados com selênio e vitamina E (G2), selênio (G4) e
vitamina E (G5) apresentaram valores crescentes ao longo das colheitas. ABD ELLAH et al.
(2009) ao trabalharem com mensurações de estresse oxidativo em bovinos por meio da
atividade de SOD e do percentual da atividade CAT, obtiveram resultados similares ao deste
estudo, o que demonstra que elevadas concentrações de H2O2 não produzem desequilíbrio com
os antioxidantes. DOBBELLAR et al. (2010) ao avaliarem a influência de distúrbios
metabólicos sobre o estresse oxidativo verificaram que a inclusão de vitamina E não propiciou
alterações em SOD e GSH-Px.
A avaliação da atividade enzimática da CAT promoveu elevação nas médias do
grupo que recebeu a suplementação com zinco (G3). Essa enzima apresenta um papel
importante na avaliação do estresse oxidativo, pois ela atua na neutralização do H2O2 em altas
concentrações, formado por meio da dismutação do radical O2- promovida pela SOD.
Entretanto, em baixas concentrações desse radical livre, a GSH atua exercendo a
neutralização do H2O2 (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Segundo FELTON &
SUMMERS (1995), é importante estabelecer a inter-relação entre as atividades dessas
enzimas para avaliar os mecanismos de defesa dos antioxidantes presentes no organismo.
LINKE et al. (2005) afirmaram que a atividade das enzimas SOD, GSH-Px e CAT é
comumente utilizada para avaliar a capacidade de defesa do organismo contra a ação das
EROs. As observações de variações entre as colheitas para CAT obtidos por KUMAR et al.
(2011) foram similares ao identificados neste estudo para ruminantes, indicando que essa
variação é provavelmente atribuída à condição de estresse.
A avaliação conjunta dos biomarcadores de estresse oxidativo avaliados neste
estudo revela que os eritrócitos não sofreram peroxidação lipídica, o que foi confirmado
principalmente pela não alteração dos valores de TBARS nas células eritrocitárias.
44
5 CONCLUSÃO
A suplementação, de bovinos confinados da raça Nelore alimentados com feno de
Brachiaria sp, com antioxidantes de forma isolada (zinco, selênio e vitamina E) ou associada
(selênio e vitamina E), não altera o estresse oxidativo nos eritrócitos.
REFERÊNCIAS
1. ABD ELLAH, M. R.; OKADA, K.; GORYO, M.; OISHI, A.; YASUDA, J. Superoxide
dismutase activity as a measure of hepatic oxidative stress in cattle following ethionine
administration. The Veterinary Journal, London, v. 182, p. 336-341, 2009.
2. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Projeções do
Agronegócio: Brasil 2012/2013 a 2022/2023. Assessoria de Gestão Estratégica, 4ª ed.,
Brasília, 2013. 96 p.
3. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; GARUTTI, M. B.; NÓBREGA, F. N.; ROSA, B.;
FIORAVANTI, M. C. S. Steroidal saponin concentrations in Brachiaria decumbens and
B. brizantha at diferent develomental stages. Ciência Rural, Santa Maria, v. 39, p. 279-
281, 2009.
4. CALAMARI, L.; F. PETRERA, F.; ABENI, F.; BERTIN, G. Metabolic and
hematological profiles in heat stressed lactating dairy cowsfed diets supplemented with
different selenium sources and doses, Livestock Science, London, v. 142, p. 128-137,
2011.
5. CALDIN, M.; CARLI, E.; FURLANELLO, T.; SOLANO-GALLEGO, L.; TASCA, S.;
PATRON, C.; LUBAS, G. A retrospective study of 60 cases of eccentrocytosis in the
dog. Veterinary Clinical Pathology, Santa Barbara, v.34, p. 224-231, 2005.
6. CASTILLO, C.; HERNANDEZ J.; VALVERDE, I.; PEREIRA, V. Plasma
malonaldehyde (MDA) and total antioxidant status (TAS) during lactation in dairy cows,
Research in Veterinary Science, London, v. 80, p. 133-139, 2006.
45
7. CASTILLO, C.; HERNANDEZ, J.; BRAVO, A.; LOPEZ-ALONSO, M.; PEREIRA, V.;
BENEDITO, J. L. Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy
cows, The Veterinary Journal, London, v. 169, p. 286-292, 2005.
8. CEPAE/USP. Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada. Desenvolvido
pela Universidade de São Paulo, 2013. Disponível em:
http://www.cepea.esalq.usp.br/comunicacao/Cepea_PIB_BR_dez13. Acesso em: 09 ago
2014.
9. CHANDRA, G.; AGGARWAL, A.; SINGH, K.; KUMAR, M.; UPADHYAY, R. C.
Effect of vitamin E and zinc supplementation on energy metabolites, lipid peroxidation,
and milk production in peripartum sahiwal cows, Asian-Australasian Journal of
Animal Sciences, Seoul, v. 26, n. 11, p. 1569-1576, 2013.
10. CHIHUAILAF VIVANCO, R.H.; MENGE, F.G.W.; BARRIGA, P.A.C. Variations of
the Erythrocyte Osmotic Fragility in Cattle Grazing on Pastures with Low Selenium
Content with or without Supplement with Selenium. Revista Científica, Trujillo, v. 3, p.
227-231, 2006.
11. CIMEN, M. Y. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clinica Chimica Acta,
Amsterdam, v. 390, n. 1, p. 1-11, 2008.
12. CRUZ, C.; DRIEMEIER, D.; PIRES, V. S.; SCHENKEL, E. P. Experimentally induced
cholangiopathy by dosing sheep with fractionated extracts from Brachiaria decumbens. J.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 13, p. 170-172, 2001.
13. DOBBELAAR, P.; BOUWSTRA, R. J.; GOSELINK, R. M. A.; JORRITSMA, R.; VAN
DEN BORNE, J. J. G. C.; JANSEN, E. H. J. M. Effects of vitamin e supplementation on
and the association of body condition score with changes in peroxidative biomarkers and
antioxidants around calving in dairy heifers, Journal of Dairy Science, Champaign, v.
93, p. 3103-3113, 2010.
14. DRAPER, H. H.; HADLEY, M. Malondialdehyde determination as index of lipid
peroxidation. Methods in Enzymology, New York, v. 186, p. 421-431. 1990.
15. DROGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological
Reviews, Baltimore, v. 82, p. 47-95, 2002.
46
16. FAGLIARI, J. J.; SANTANA, A. E.; LUCAS, F. A.; CAMPOS FILHO, E.; CURI, P. R.
Constituintes sanguíneos de bovinos lactantes, desmamados e adultos das raças Nelore
(Bos indicus) e Holandesa (Bos taurus), e de bubalinos (Bubalus bubalis) da raça Murrah.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 50, n. 3,
p. 263-71, 1998.
17. FELTON, G. W., SUMMERS, C. B. Antioxidant systems in insects. Archives of Insect
Biochemistry and Physiology, New York, v. 29, p. 187-197, 1995.
18. FERREIRA, A. L. A.; MACHADO, P. E. A.; MATSUBARA, L. S. Lipid peroxidation,
antioxidant enzymes and glutathione levels in human erythrocytes exposed to colloidal
iron hydroxide in vitro. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,
Ribeirão Preto, v. 32, n. 6, p. 689-694, 1999.
19. FIORAVANTI, M. C. S. Incidência, avaliações clínica, laboratorial e
anatomopatológica da intoxicação subclínica por esporidesmina em bovinos.
Botucatu, 1999. 256p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista.
20. FLORIN-CHRISTENSEN, J.; SUAREZ, C.E.; FLORINCHRISTENSEN, M.;
WAINSZELBAUM, M.; BROWN, W.C.; MCELWAIN, T.F.; PALMER, G.H. A unique
phospholipid organization in bovine erythrocyte membranes. Proceedings of the
National Academy of Sciences, Washington, v. 98, p. 7736-7741, 2001.
21. GHISI, O. M. A. A. Brachiaria na pecuária brasileira: importância e perspectivas. In:
PAULINO, V. T. et al. (Ed.). II ENCONTRO PARA DISCUSSÃO SOBRE CAPINS DO
GÊNERO BRACHIARIA. Anais… Nova Odessa, 1991. 356 p.
22. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free radicals in biology and medicine.
Oxford: Clarendon Press, 2007, 543p.
23. JAIN, N. C. Essentials of veterinary hematology. 4. ed. Philadelphia: Lea & Febiger,
1993. 407p.
24. KOURYI, J. C.; DONANGELO, C. M. Zinco, estresse oxidativo e atividade física.
Revista de Nutrição, Campinas, v. 16, n. 4, p. 433-441, 2003.
47
25. KRIŽANOVIĆ, D.; SUŠIĆ, V.; BOŽIĆ, P.; ŠTOKOVIĆ, I.; EKERT-KABALIN, A.
Changes of bovine blood lipid peroxides and some antioxidants in the course of growth.
Veterinarski Arhiv, Zagreb, v. 78, n. 4, p. 269-278, 2008.
26. KUMAR, A.; GYANENDRA SINGH, B. V.; MEUR, S. K. Modulation of antioxidant
status and lipid peroxidation in erythrocyte by dietary supplementation during heat stress
in buffaloes, Livestock Science, London, v. 138, p. 299–303, 2011.
27. LEMOS, R. A. A.; PURISCO, E. Plantas que causam fotossensibilização hepatógena. In:
LEMOS, R. A. A.; BARROS, N.; BRUM, K. B. (Org.). Enfermidades de interesse
econômico em bovinos de corte: perguntas e respostas. Campo Grande: UFMS, p.
292. 2002.
28. LINKE, A.; ADAMS, V.; SCHULZE, P .C ; ERBS, S.; GIELEN, S.; FIEHN, E.
Antioxidative effects of exercise training patients with chronic heart failure increase in
radical scavenger enzyme activity in skeletal muscle. Circulation, Baltimore, v. 111, p.
1763-1700, 2005.
29. LIU, Z. L.; YANG, P.; CHEN, P.; WANG, W. X. D. D. M. Supplementation with
selenium an vitamin E improves milk fat depression an fatty acid composition in dairy
cows fed fat diet. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, Seoul, v. 21, n. 6, p.
838-844, 2008.
30. MACEDO, M. F.; BEZERRA, M. B.; SOTO BLANCO, B. Fotossensibilização em
animais de produção na região semi-árida do Rio Grande do Norte. Arquivo do Instituto
Biológico, São Paulo, v. 73, n. 2, p. 251-254, 2006.
31. MACHADO, L. P.; KOHAYAGAWA, A.; SAITO, M. E.; DA SILVEIRA, V. F.;
YONEZAWA, L. A. Lesão oxidativa eritrocitária e mecanismos antioxidantes de
interesse na Medicina Veterinária. Revista de Ciências Agroveterinárias, Lages, v. 8, n.
1, p. 84-94, 2009.
32. MACHADO, L. P.; WATANABE, M. J.; KOHAYAGAWA, A.; SAITO, M. E.; DA
SILVEIRA, V. F.; YONEZAWA, L. A. Malondialdeído eritrocitário como índice de
estresse oxidativo em equinos da raça Árabe. Revista Brasileira de Hematologia e
Hemoterapia, São Paulo, v. 29, p. 237, 2007.
48
95. MACHEFER, G.; GROUSSARD, C.; RANOU-BEKONO, F.; ZOUHAL, H.; FAURE,
H.; VICENT, S.; CILLARD, J.; GRATAS-DELAMARCHE, A. Extreme running
competition decrease blood antioxidant defense capacity. Journal of the American
College of Nutrition, v. 23, n. 4, p. 358-364, 2004.
33. MILES, C. O.; HENDERSON, W.; EDE, R. M. Sporidesmin complex identified,
Toxicology & Food Safety, Wellington, n. 1, p. 37,1995.
34. MILES, C. O.; MUNDAY, S. C.; HOLLAND, P. T.; SMITH, B. L.; EMBLING, P. P.;
WILKINS, A. L. Identification of a sapogenin glucoronide in the bile of sheep affected
by Panicum dichotomiflorum toxicosis. New Zealand Veterinary Journal, Wellington,
v. 39, p. 150-152, 1991. 21.
35. MOREIRA, C. N.; CARVALHO, T. F.; COSTA, T. N.; QUEIROZ, J. A. C. C.; LAGE,
G.; HARAGUSHI, M.; FIORAVANTI, M. C. S. Bovinos alimentados com capim
Brachiaria e Andropogon: hematologia e bioquímica clínica. Ciência Animal Brasileira,
Goiânia, v. 10, n. 1, p. 195-205, 2009.
36. MOTTA, A. C.; RIET-CORREA RIVERO, G.; ANA LUCIA SCHILD, A. L.; RIET-
CORREA, F.; MÉNDEZ, M. C.; FERREIRA, J. L. Fotossensibilização hepatógena em
bovinos no sul do Rio Grande do Sul. Ciência Rural,Santa Maria, v. 30, n. 1, 2000.
37. NRC - NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Nutrient requirements of beef cattle.
7.ed. Washington: National Academy Press, 1996. 242p.
38. ÖZTÜRK, O.; GÜMÜSLÜ, S. Age-related changes of antioxidant enzyme activities,
glutathione status and lipid peroxidation in rat erythrocytes after heat stress, Life
Sciences Elmsford, v. 75, p. 1551-1565, 2004.
39. RUSSOMANNO, O. M. R.; PORTUGAL, M. A. S. C.; COUTINHO, L. N.; CALIL, E.
M. B.; FIGUEIREDO. M. B. Leptosphaerulina chartarum (Pithomyces chartarum) e seu
envolvimento no eczema facial. Arquivo do Instituto Biológico, São Paulo, v. 70, n. 3,
p. 385-390, 2003.
40. SANTOS, J. C. A.; RIET-CORREA, F.; SIMIÕES, S. V.; BARROS, C. S. L.
Patogênese, sinais clínicos e patologia das doenças causadas por plantas hepatotóxicas
49
em ruminantes e equinos no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.
28, n. 1, p. 1-14, 2008.
41. SHARMA, N.; SINGH, N. K.; SINGH, O. P.; PANDEY, V.; VERMA, P. K. Oxidative
stress and antioxidant status during transition period in dairy cows, Asian-Australasian
Journal of Animal Sciences, Seoul, v. 24, n. 4, p. 479-484, 2011.
42. SIES, H. Strategies of antioxidant defense. European Journal of Biochemistry, Berlin,
v. 215, n. 2, p. 213-219, 1993.
43. SIQUEIRA, G. R.; BENATTI, J. M. B.; OLIVEIRA, I. M.; RESENDE, F. D. Novas
recomendações no uso de aditivos – incremento de produção x custo Encontro de
Confinamento da Scot Consultoria, 3.ed. Bebedouro, 2014. p. 97-110.
44. TANG, X.; XIA, Z.; YU, J. An experimental study of hemolysis induced by onion
(Allium cepa) poisoning in dogs. Journal of veterinary pharmacology and
therapeutics, Oxford, v. 31, p. 143-149, 2007.
45. TODOVORA, I.; SIMEONOVA, G.; KYUCHUKOVA, D.; DINEV, D.; GADJEVA, V.
Reference values of oxidative stress parameters (MDA, SOD, CAT) in dogs and cats.
Comparative Clinical Pathology, London, v. 13, p. 190-194, 2005.
50
CAPÍTULO 3 - LIPOPEROXIDAÇÃO HEPÁTICA EM BOVINOS CONFINADOS
ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM
ANTIOXIDANTES
RESUMO
A esporidesmina é uma toxina facilmente oxidada, produzida pelo fungo Pithomyces chartarum que coloniza as espécies de Brachiaria sp, que tem sido descrita como causadora de lesão hepática em ruminantes. O presente estudo foi concebido para elucidar se a administração de antioxidantes na forma de suplementação minimiza a lipoperoxidação hepática em bovinos, por meio da determinação de malondialdeído (MDA) nos tecidos hepáticos. Durante 105 dias foram avaliados 40 bovinos da raça Nelore, com idade entre 24 e 36 meses, distribuídos em cinco tratamentos G1 (controle - sem suplementação), G2 (10mg de selênio e 1000UI de vitamina E), G3 (600mg de zinco/animal/dia), G4 (10mg de selênio/animal/dia) e G5 (1000UI de vitamina E/animal/dia). Foram colhidas amostras sanguíneas nos dias 0, 56 e 105 de tratamento para a mensuração da atividade sérica de gama glutamiltransferase (GGT) e aspartato aminotransferase (AST). Para as avaliações de estresse oxidativo e análise histopatológica foram obtidos fragmentos hepáticos por meio de biópsias (0 e 56 dias de confinamento) e por colheita de tecidos hepáticos durante o abate dos animais, ao final de 105 dias de confinamento. Os resultados demonstraram que os animais não apresentaram diferença estatística para as variáveis de GGT e AST durante o experimento. Na mensuração de MDA observou-se que não houve lipoperoxidação nos hepatócitos dos animais. Na avaliação histopatológica observou-se a redução quantitativa das alterações no parênquima hepático ao longo do ensaio. Dentre os antioxidantes utilizados como suplemento, a associação do selênio com a vitamina E apresentou os melhores resultados. Palavras-chaves: enzimas hepáticas, estresse oxidativo, fígado, malondialdeído, Nelore. ABSTRACT
Sporidesmin is an easily oxidized toxin produced by Pithomyces chartarum, a fungus that that colonizes Brachiaria spp, and has been associated to cause liver injury in ruminants. The present study was designed to clarify, through malondialdehyde (MDA) determination in liver tissues, if administration of antioxidant supplementation reduces hepatic lipid peroxidation in bovines. 40 Nelore bulls, aged between 24 and 36 months, were sorted into five treatments: G1 (non-supplemented control) G2 (10 mg of selenium and 1000 IU of vitamin E), G3 (600 mg zinc / animal - / day), G4 (10 mg selenium / animal / day) and G5 (1000 IU vitamin E / animal / day). Animals were evaluated for 105 days and blood samples harvested on days 0, 56 and 105 for measurement of gamma glutamyl transferase (GGT) and aspartate aminotransferase (AST) serum activity. Liver fragments were obtained through biopsies (0 and 56 days of confinement) and by harvesting liver tissue during the slaughter of animals at the end of 105 days of confinement. The animals showed no statistical difference for GGT and AST during the experiment. No hepatocyte lipid peroxidation was detected by measuring MDA. Histological evaluation showed reduction in the quantitative changes in the liver parenchyma throughout the experiment. Among the antioxidants used as a supplement, the association of selenium with vitamin E showed the best results.
51
Keywords: liver enzymes, oxidative stress, liver, malondialdehyde, Nelore.
1 INTRODUÇÃO
As espécies de Brachiaria sp são importantes forrageiras que têm sido descritas
como causadoras de lesões hepáticas em ruminantes. Segundo MACEDO et al. (2006), a
causa principal é a ingestão da toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo
Pithomyces chartarum. Acredita-se que o principal efeito tóxico da esporidesmina é a
formação de quantidade excessiva de radicais livres, responsáveis pela lipoperoxidação das
membranas celulares (MUNDAY, 1982). Outra causa de lesão hepática em ruminantes
alimentados com a Brachiaria sp é a intoxicação por saponinas esteróides litogênicas
presentes nessas gramíneas (CRUZ et al., 2001; BRUM et al., 2009) que promovem a
formação de sais insolúveis que se depositam na forma de cristais no sistema biliar (RIET-
CORREA et al, 2009). Esses cristais podem causar inflamação e obstrução do sistema biliar,
dificultando a metabolização e excreção da filoeritrina que ao se acumular nos tecidos,
provoca necrose dos hepatócitos periportais resultando em icterícia, fotossensibilização e
hepatite (SANTOS et al. 2008).
Laboratorialmente, as principais disfunções hepáticas observadas em ruminantes
com hepatotoxicidade são as alterações na atividade sérica das enzimas hepatobiliares. A
elevação da atividade de gama glutamiltransferase (GGT) indica a ocorrência de lesão de
ductos biliares (SANTOS et al., 2008). A mensuração da atividade da aspartato
aminotransferase (AST) também é empregada na investigação de hepatopatias. Porém, por
não apresentar especificidade é necessário realizar a mensuração de outras enzimas hepáticas
para concluir o diagnóstico (KERR, 2003).
Independente da causa da lesão hepática de ruminantes que se alimentaram de
pastagens do gênero Brachiaria, microscopicamente, as principais alterações observadas são
colangite, pericolangite, colangiohepatite, proliferação de ductos biliares e tecido fibroso
(MOREIRA et al, 2009b). É frequente a presença de macrófagos e células gigantes
multinucleadas com citoplasma espumoso (FIORAVANTI, 1999; MOREIRA et al., 2009b).
De acordo com KINSCHERF et al. (1997), o macrófago espumoso deriva da
internalização da lipoproteína de baixa densidade (LDL) por mecanismos de oxidação. O
estresse oxidativo, por diminuição dos mecanismos de proteção do organismo ou pela
presença de uma substância exógena capaz de produzir lipoperoxidação, também promove a
52
oxidação da LDL e, consequentemente, o surgimento dos macrófagos espumosos. FAGLIARI
et al. (2003) relataram que a esporidesmina é rapidamente auto-oxidada, gerando radicais
superóxidos. Segundo FIORAVANTI (1999), esses radicais podem ocasionar, no fígado a
peroxidação de lipídeos, que, por sua vez, poderia desencadear o surgimento de macrófagos
espumosos.
A lipoperoxidação é um fenômeno de lesão celular, em que ocorre a oxidação de
lipídeos constituintes da membrana celular devido à ação de radicais livres. Durante a
peroxidação, os ácidos graxos poli-insaturados presentes na membrana celular são
decompostos em malondialdeído (MDA) e o 4-hidroxynonenal (4-HNE) (DROGE, 2002;
ABD ELLAH et al., 2013), que por sua vez provocam danos sobre o metabolismo celular e as
características funcionais da célula. PESSAYRE et al. (2001) afirmaram que essas substâncias
induzem diretamente danos nos hepatócitos com geração de citocinas pró-inflamatórias,
ativação de células fusiformes e fibrogênese.
Para acompanhar a evolução da peroxidação, o número de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido empregado como metodologia de escolha. Pois nessa
reação, o MDA formado durante a oxidação de ácidos graxos poli-insaturados reage com o
TBARS sob altas temperaturas e baixo pH formando complexo com cor e absorbância
definida. A mensuração de TBARS é considerada adequada para detecção de produtos finais
de lipoperoxidação (ABDALLA & SENA, 2008) e avaliar o comprometimento que a
oxidação lipídica poderia promover no organismo (KOWALE et al., 1996).
GUIMARÃES et al. (2006), ao avaliarem a relação entre a ocorrência de estresse
oxidativo e a permanência de integridade de hepatócitos concluíram que um dos mecanismos
responsáveis pela formação da fibrose hepática poderia ser a indução de peroxidação lipídica.
HAN et al. (2006) verificaram que a depleção de glutationa, frequentemente encontrada nas
doenças hepáticas, favoreceria a produção de radicais livres e consequentemente a
peroxidação lipídica.
Com o presente estudo objetivou-se elucidar se a suplementação de diferentes
fontes de antioxidantes poderia reduzir a lipoperoxidação hepática em bovinos confinados
alimentados com feno de Brachiaria sp.
53
2 MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Federal de Goiás (UFG) e foi registrado sob o número 360/2010. O estudo foi
desenvolvido na Fazenda Tomé Pinto de propriedade da Escola de Veterinária e Zootecnia da
UFG, localizada no Município de São Francisco de Goiás, Estado de Goiás, distante a 110 km
da capital.
Foram utilizados 40 bovinos machos não castrados de peso médio aproximado de
360 Kg e idade entre 24 a 36 meses, criados em pastos de Brachiaria sp. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e oito repetições, em que
cada repetição foi representada por um animal. Os tratamentos foram representados pelos
diferentes antioxidantes e pelo grupo controle.
Após um período de adaptação de 14 dias nas instalações e com a alimentação, os
animais foram divididos em cinco grupos, que receberam os tratamentos seguintes:
• Grupo 1 (G1 = GC) - controle (sem suplementação);
• Grupo 2 (G2 = Se + Vit.E) - suplementação com 1000UI de vitamina E e 10mg de
selênio/animal/dia (2g na forma de acetato de α-tocoferol à 50% e 10g na forma de selênio
metionina);
• Grupo 3 (G3 = Zn) - suplementação de 600mg de zinco/animal/dia (6g na forma de zinco
metionina);
• Grupo 4 (G4 = Se) - suplementação com selênio 10mg de selênio/animal/dia (10g na forma
de selênio metionina);
• Grupo 5 (G5 = Vit.E)- suplementação com 1000UI de vitamina E/animal/dia (2g na forma
de acetato de α-tocoferol a 50%).
Durante o período de experimentação, os animais permaneceram alojados em baias
de confinamento e foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado
(ração). A dieta obedeceu à proporção entre volumoso e concentrado de 70:30, em que o
concentrado foi balanceado de acordo com a análise bromatológica do feno ofertado (Quadro
1), com base na estimativa de um ganho diário de 0,880kg/dia e para atender as exigências
nutricionais dos animais de acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC (1996).
O concentrado formulado (Integral Nutrição Animal, Goiânia, GO) teve uma concentração de
34% de proteína e 71% de NDT, sendo os principais constituintes, farelo de soja, farelo de
milho e mistura mineral (Quadro 2).
54
QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento
Parâmetros % DP Materia seca 94,43 2,34
Nutrientes digestíveis totais 55,13 14,29 Proteína bruta 1,43 0,27
Fibra detergente ácida 37,30 8,51 Fibra detergente neutra 72,36 5,06
QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais
Ingredientes % em materia seca Feno capim Brachiaria sp 70,0 Milho moído 20,5 Farelo de soha 45% 7,5 Minerais1 2,0 *A formulação foi realizada utilizando o software RLM 3.2 (2009)
1 Minerais sem ureia e sem ionóforos
O feno de B. brizantha foi produzido e armazenado na própria Fazenda Tomé Pinto
e na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG, sendo que durante o período
experimental foram colhidas amostras para a contagem de esporos DIMENNA & BAILEY
(1973) e para extração e análise de saponina (Quadro 3) que foram realizadas no United States
Department of Agriculture – Poisonous Plant Research Laboratory (USDA-PPRL), Logan,
Utah, EUA. O manejo, vacinação, tratamento com ecto e endoparasiticidas foi similar para
todos os grupos.
QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ)
Procedência das gramíneas
Mês da análise
% de protodioscina % da redução da
protodioscina CAPIM FENO FTP – B. brizantha maio 1,08 0,75 30,55
FTP – B. decumbens maio 1,20 0,65 45,83 EVZ – B. brizantha agosto 0,55 0,38 30,55
Valores médios maio a agosto 0,94 0,59 35,64 *Valores estimados baseado na análise de maio
55
Os antioxidantes foram pesados em uma balança de precisão da marca
Shimadzu®, modelo AY 220, diariamente em copos descartáveis, nas quantidades de 10g de
selênio metionina, 6g de zinco, 2g de vitamina E, de forma a propiciar que cada animal
recebesse a quantidade diária de antioxidante, conforme o seu tratamento no cocho. Para
melhorar o consumo da quantidade acima especificada, era colocado sobre o antioxidante um
pouco de ração, sendo ofertados individualmente por animal e monitorados pelo auxiliar até a
ingestão do antioxidante e do concentrado na sua totalidade, impedindo que outro bovino se
aproximasse do cocho. Os animais foram mantidos confinados em grupo por um período de
105 dias, de acordo com o tratamento, em baias sombreadas providas de bebedouros e
comedouros.
Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, às 8:00 e às 15:00 horas. A
alimentação foi fornecida sob a forma de dieta total. As sobras de alimentos foram pesadas e
descartadas diariamente antes do fornecimento matinal, para se determinar o consumo de
alimento pelo grupo e evitar que as sobras não ultrapassassem mais de 10% do total
fornecido, sendo que a água foi fornecida à vontade.
Para a colheita das amostras, os bovinos foram mantidos em estação e contidos
em brete. As amostras sanguíneas foram obtidas nos dias 0, 56 e 105 por meio de punção da
jugular em tubos sem anticoagulantes. Para a avaliação do estresse oxidativo e análise
histopatológica foram obtidos fragmentos hepáticos por meio de biópsias nos dias 0 e 56 de
confinamento e por colheita de tecidos hepáticos durante o abate dos animais, ao final de 105
dias de confinamento. Para a realização da biópsia hepática empregou-se à técnica descrita
por SMART & NORTHCOLE (1985) e McDOWELL (2003) adaptada com a confecção de
agulha com as seguintes dimensões: comprimento do mandril 25 cm, comprimento da cânula
23 cm, diâmetro interno da cânula 0,7 cm e externo 0,9 cm.
A biópsia foi realizada após anestesia local com lidocaína a 2% e antissepsia com
álcool iodado. Foram colhidos dois fragmentos hepáticos, um deles foi fixado em formalina
tamponada a 10% e depois de 48 horas armazenados em álcool a 70%. O outro fragmento foi
embalado por plástico filme, colocado em tubo do tipo falcon e congelado imediatamente em
nitrogênio líquido, sendo posteriormente transferido para freezer a -80ºC.
Durante o abate foram colhidas amostras de tecido hepático com as dimensões 1 x
1x 4 cm de altura, largura e comprimento, respectivamente. Todas as amostras foram
embaladas e seladas com plástico filme de forma a minimizar o contato com o oxigênio e a
formação de radicais livres. As amostras foram armazenadas em tubos plásticos previamente
56
identificados e acondicionados em nitrogênio líquido para o transporte, sendo transferidas
posteriormente para o freezer a -80°C até o seu processamento.
As amostras sanguíneas destinadas à análise bioquímica (GGT e AST) foram
processadas antes do congelamento das amostras. Os exames bioquímicos foram realizados
com reagentes comerciais padronizados (Labtest®, Lagoa Santa, MG) e analisados em
espectrofotômetro semiautomático (Bioplus 2000®, Barueri, SP), de acordo com a
metodologia descrita pelo fabricante. As atividades enzimáticas foram determinadas na
temperatura de 37ºC. A atividade sérica da AST foi determinada pelo método ultravioleta
(UV) otimizado, sem piridoxal fosfato. A atividade sérica da GGT pelo método cinético
utilizando-se como substrato glutamil-p-nitroanilida.
A metodologia utilizada para a mensuração de TBARS foi a descrita por
VYNCKE (1970 e 1975) e SORENSEN & JØRGENSEN (1996). Por oxidação lipídica, o
MDA formado reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) produzindo complexo com
pigmentação vermelha (TBARS) que é determinado por espectrofotometria com a
absorbância máxima de 532nm, em que o valor de malondialdeído é indicado como µmol por
quilo (µmol/Kg) de amostra.
As amostras histopatológicas foram processadas no Laboratório do Setor de
Patologia da EVZ/UFG. Os fragmentos de hepáticos foram fixados em formol tamponado,
clivados por 24 horas após a colheita, quando foi realizada a troca do fixador. Os fragmentos
permaneceram por mais 24 horas, para completar a fixação. Em seguida foram transferidos
para pequenas caixas plásticas individuais (unicassetes) e permaneceram estocados em álcool
a 70%. Ao final do período de colheita, as amostras foram processadas pelo método
convencional histopatológico e coradas pela técnica da hematoxilina e eosina (LUNA, 1968).
Os valores de TBARS, GGT e AST foram analisados por estatística descritiva e
foram analisados por análise de variância (ANOVA), empregando-se o teste de Tukey, por
meio do pacote computacional do SAS, com grau de significância de 5%. Para a avaliação de
frequência das alterações histopatológicas e a obtenção da correlação entre malondialdeído e
quantidade de macrófagos espumosos foi empregado o programa EXCEL for Windows 2010.
3 RESULTADOS
Os valores médios de MDA para cada grupo e por colheitas estão descritos na
Tabela 1 e não sofreram influência de interação grupo/tempo, dos diferentes esquemas de
57
suplementação e do tempo de duração do experimento (p>0,05). Entretanto verificou-se que a
suplementação de antioxidantes propiciou, ao longo do período de confinamento, redução na
mensuração de MDA para três grupos. Os bovinos que receberam selênio e vitamina E (G2)
tiveram a redução de 37,5%; os que receberam zinco (G3) de 36,7% e os que receberam
selênio (G4) de 2,2%.
TABELA 1 - Médias das concentrações de MDA (µmol/Kg) em tecido hepático de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Dia 0) 9,06 8,47 9,93 7,25 6,98 8,34a
0,5755 0,2389 0,2230 2 (56 dias) 9,09A* 6,88A* 7,96A* 7,17A* 7,93A* 7,80a
3 (105 dias) 9,11A* 5,29A* 5,99A* 7,09A* 8,88A* 7,27a
Média 9,09A 6,88A 7,96A 7,17A 7,93A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita
A atividade sérica da GGT (Tabela 2) não sofreu influência de interação
grupo/tempo, assim como não apresentou diferença significativa entre os grupos e as colheitas
(p>0,05). Em todos os grupos ocorreu pequeno acréscimo da atividade sérica da enzima
quando comparou-se o momento basal com o final do estudo.
TABELA 2 - Médias de GGT (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Médi
a Grupo Tempo
Interação
1 (Dia 0) 20,08 19,60 18,65 20,72 20,56 19,95a
0,9321
0,9086 0,8415 2 (56
dias) 19,92A
* 21,04A
* 20,24A
* 20,89A
* 21,52A
* 20,72
a
3 (105 dias)
20,72A
* 21,20A
* 22,47A
* 22,63A
* 21,54A
* 21,71
a
Média 20,24A 20,61A 20,45A 21,41A 21,20A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita
58
Na determinação da atividade de AST (Tabela 3), os valores médios não
apresentaram diferença estatística entre grupos, colheita e interação grupo/tempo (p>0,05).
Observou-se que, independente do tratamento adotado, os resultados obtidos apresentaram
elevação ao longo do período experimental, mais acentuada que a observada para a GGT.
TABELA 3 - Médias de AST (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Médi
a Grupo Tempo
Interação
1 (Dia 0) 61,52 66,78 73,99 59,07 71,37 66,55a
0,2913
0,1847 0,8902 2 (56
dias) 72,02A
* 71,80A
* 72,03A
* 65,41A
* 73,34A
* 70,92
a
3 (105 dias)
78,51A
* 84,40A
* 83,05A
* 74,49A
* 85,56A
* 81,20
a
Média 70,68A 74,33A 76,36A 66,32A 76,75A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita
A avaliação histopatológica dos fragmentos hepáticos colhidos por meio das
biópsias e durante o abate demonstraram pelo menos um tipo de alteração em todas as lâminas
avaliadas. Os achados de microscopia foram presença de degenerações, seguida de colangite,
associada ou não a presença dos macrófagos espumosos (Tabela 4).
A frequência de aparecimento das alterações foi semelhante, nos três momentos
avaliados, para as variáveis: degeneração, colangite, fibrose e necrose. Para essas variáveis
houve um aumento do número de ocorrência entre a primeira e a segunda biópsia e um
decréscimo entre a segunda biópsia e a colheita do frigorífico. Quanto à presença dos
macrófagos espumosos a frequência de aparecimento demonstrou um perfil diferente, uma
vez que houve diminuição de sua ocorrência ao longo experimento (Figura 1).
Foi estabelecida a presença de correlação positiva forte (Figura 2) entre o número
macrófagos espumosos e a concentração do MDA no fígado dos bovinos.
59
TABELA 4 - Frequência total (%) por grupo de alterações hepáticas em bovinos alimentados com feno de Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)
Grupos MOMENTOS
0 dias (biópsia 1) 56 dias (biópsia 2) 105 dias (frigorífico) Degeneração
G1 7 8 7 G2 8 8 7 G3 7 8 8 G4 8 7 8 G5 8 8 6
Frequência n=38 / 95% n=39 / 98% N=36 / 90% Colangite
G1 6 8 7 G2 8 8 7 G3 7 8 7 G4 6 6 8 G5 7 8 8
Frequência n=34 / 85% n=36 / 95% N=37 / 93% Fibrose
G1 1 4 2 G2 1 1 1 G3 2 5 0 G4 1 2 1 G5 2 5 1
Frequência n=6 / 18% n=17 / 43% n=5 / 13% Necrose
G1 1 3 0 G2 0 0 0 G3 0 3 1 G4 1 0 0 G5 0 1 0
Frequência n=2 / 5% n=7 / 15% n=1 / 3% Macrófagos espumosos
G1 5 7 5 G2 6 5 4 G3 8 6 6 G4 7 5 4 G5 5 4 4
Frequência n=31 / 75% n=27 / 68% n=23 / 58%
60
FIGURA 1 – Aglomerado de macrófagos espumosos com
macrófagos espumos isolados (seta fina) e com formação de célula gigante de Touton (seta grossa) em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes, HE, 40x
FIGURA 2 – Correlação positiva forte entre a quantidade de
macrófagos espumosos e concentração de MDA em fígado de bovinos
y=0,0723x+2,9258R²=0,75176
0
2
4
6
8
10
12
0 25 50 75 100
MDA
númerodemacrófagosespumosos
61
4 DISCUSSÃO
FAGLIARI et al. (1998), ao avaliarem o perfil bioquímico de bovinos da raça
Nelore hígidos encontraram resultados semelhantes os obtidos nesse experimento, o que
demonstra que os animais avaliados não desenvolveram disfunções hepáticas. MOREIRA et
al. (2009a) ao trabalharem com bovinos da mesma raça alimentados com pastagem de
Brachiaria sp. também encontraram valores similares de GGT e AST aos deste ensaio. A
presença de atividade sérica de AST dentro dos valores de referência indicou que não houve
dano significativo às membranas dos hepatócitos (YASUDA et al., 1988). A manutenção dos
valores de GGT dentro da normalidade para a espécie evidenciou que os animais não
apresentaram obstrução do sistema biliar decorrente da intoxicação (SANTOS et al., 2008).
Diversos estudos relatam a elevação de GGT tanto em casos naturais, como
nos experimentais da micotoxicoses (MORRIS et al., 2002) e, ainda, na intoxicação por
saponina (LEMOS et al., 2002). Os resultados mensurados para esse parâmetro
bioquímico revelaram uma tendência na elevação das atividades séricas da GGT durante o
período experimental. Entretanto, os animais não apresentavam sinais clínicos de
enfermidade hepática, podendo-se aventar a possibilidade de intoxicação subclínica por
esporidesmina e/ou saponina.
Neste estudo, a suplementação com zinco não propiciou a diminuição da
atividade sérica enzimática da GGT como observado por FAGLIARI et al. (2003). Esses
autores ao verificarem o efeito da suplementação mineral com zinco na dieta de bovinos,
observaram que a adição do mineral reduziu os valores séricos de GGT. Uma vez que,
esse elemento mineral atua sobre a estabilidade de esporidesmina, evitando a sua oxidação
e consequentemente a lipoperoxidação por meio da formação de radicais livres.
Avaliando-se em conjunto a AST e GGT notou-se o mesmo padrão de
comportamento nos grupos experimentais, ou seja, tendência de aumento gradativo ao
longo das colheitas. A AST elevou-se em 22,01% e a GGT em 8,82% durante o
confinamento experimental, o que demonstra que tais alterações percentuais poderiam
sugerir a presença de alterações hepáticas, que nos casos destes animais poderia estar
associada à ingestão contínua de pequenas quantidades de esporidesmina ou saponinas
provenientes do feno de Brachiaria sp (FAGLIARI et al., 2003; RIET-CORREA et al,
2009). Portanto, mesmo que as saponinas ou a esporidesmina tenham provocado lesão no
62
parênquima hepático, sua magnitude não foi suficiente para desencadear aumentos
importantes na atividade sérica da AST e da GGT.
Para MUDRON et al. (1999), bovinos com comprometimento hepático
apresentam um maior propensão de lipoperoxidação, em virtude do acúmulo de MDA com
elevação dos valores mensurados de MDA, GGT e AST quando comparados aos grupo
controle. No entanto, tal observação não pode ser correlacionada no presente estudo, pois os
animais não apresentaram quadro característico de disfunção hepática.
O perfil de estresse oxidativo dos animais apresentou redução ao longo do
experimento (8,34; 7,80 e 7,27µmol/Kg em 0, 56 e 105 dias, respectivamente), e dentre os
tratamentos propostos, a associação de selênio e vitamina E possibilitou a obtenção de
melhores resultados na contenção de peroxidação lipídica. Os resultados obtidos na
associação de selênio e vitamina E foram diferentes aos encontrados por SKRIVANOVÁ et
al. (2007) que identificaram um redução dos índices de MDA quando comparado aos grupos
controle e com suplementação de selênio.
Segundo ABD ELLAH (2011), a mensuração do estado oxidativo hepático
possibilitaria a obtenção de estimativa sobre a integridade do tecido avaliado, permitindo o
diagnóstico de disfunção hepática, além de propiciar a determinação do grau de deterioração
dos hepatócitos. E que a lipoperoxidação e o surgimento de alterações hepáticas seriam
diretamente proporcionais. Esta observação é corroborada pelos resultados do presente
estudo, uma vez que ficou estabelecida a correlação positiva entre o número de macrófagos
espumosos e a concentração de MDA. ABD ELLAH et al. (2013) reforçam a existência de
correlação entre lipoperoxidação e dano hepático, de modo que a presença do radical livre
resulta em aparecimento de degenerações, inflamações e fibrose, detectadas nas biópsias
hepáticas.
Na avaliação histopatológica observou-se que o G5 (suplementado com
vitamina E) demonstrou menor frequência de células espumosas ao longo do
experimento quando comparado aos demais grupos. LUCIANO et al. (2011)
verificaram que a inclusão de antioxidantes (vitamina E) na dieta dos ruminantes
possibilitou uma menor ocorrência de lipoperoxidação sobre as amostras avaliadas. A
vitamina E devido a sua característica lipossolúvel, atuaria minimizando os danos
provocados pelos radicais livres nas membranas biológicas e protegendo-as contra o
ataque de radicais livres. Além disso, a diminuição de vitamina E hepática favoreceria
a ocorrência de peroxidação lipídica (MUDRON et al., 1997). E que a suplementação
63
de vitamina E apresenta efeito supressor sobre a formação de MDA quando a
peroxidação lipídica for provocada artificialmente (SOKOL et al.,1993).
5 CONCLUSÃO
A suplementação com antioxidantes, por meio de aditivos na alimentação de
bovinos, da raça Nelore confinados alimentados com feno de Brachiaria sp, reduz o número
de macrófagos espumosos presentes no parênquima hepático e a suplementação com a
associação do selênio e vitamina E e com o zinco minimiza a ocorrência do dano oxidativo
hepático.
REFERÊNCIAS
1. ABD ELLAH, M. R. The role of liver biopsy in detection of hepatic oxidative stress.
Veterinary Medicine International, v. 2011, p. 1-7, 2011.
2. ABD ELLAH, M. R.; OKADA, K.; GORYO, M.; YASUDA, J. Levels of
malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals in bovine liver biopsy, Comparative Clinical
Pathology, Heidelberg, v. 22, p. 823-827, 2013.
3. ABDALLA, D. S. P.; SENA, K. C. M. Biomarcadores de peroxidação lipídica na
aterosclerose. Revista de Nutrição, Rev. Nutr., Campinas, v. 21, n. 6, p. 749-756, 2008.
4. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; GARUTTI, M. B.; NÓBREGA, F. N.; ROSA, B.;
FIORAVANTI, M. C. S. Steroidal saponin concentrations in Brachiaria decumbens and
B. brizantha at diferent develomental stages. Ciência Rural, Santa Maria, v. 39, p. 279-
281, 2009.
5. CRUZ, C.; DRIEMEIER, D.; PIRES, V. S.; SCHENKEL, E. P. Experimentally induced
cholangiopathy by dosing sheep with fractionated extracts from Brachiaria decumbens.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 13, p. 170-172, 2001.
6. DROGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological
Reviews, Baltimore, v. 82, p. 47-95, 2002.
64
7. FAGLIARI, J. J.; OKUDA, H. T.; PEREIRA, G. T.; PASSIPIERI, M. Efeito de zinco
suplementar nos sintomas de fotossenssibilização causada pela esporidesmina em bovinos
jovens. Ars Veterinária, Jaboticabal, v. 19, n. 1, p. 96-103, 2003.
8. FAGLIARI, J. J.; SANTANA, A. E.; LUCAS, F. A.; CAMPOS FILHO, E.; CURI, P. R.
Constituintes sanguíneos de bovinos lactantes, desmamados e adultos das raças Nelore
(Bos indicus) e Holandesa (Bos taurus) e de bubalinos (Bubalus bubalis) da raça Murrah.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 50, n. 3, p. 263-71, 1998.
9. FIORAVANTI, M. C. S. Incidência, avaliações clínica, laboratorial e
anatomopatológica da intoxicação subclínica por esporidesmina em bovinos.
Botucatu, 1999. 256p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista.
10. GUIMARÃES, E. L.; FRANCESCHI, M. F.; GRIVICICH, I.; DAL-PIZZOL, F.;
MOREIRA, J. C.; GUARAGNA, R. M. Relationship between oxidative stress levels and
activation state on a hepatic stellate cell line, Liver International, Oxford, v. 26, n. 4, p.
477-485, 2006.
11. HAN, D.; HANAWA, N.; SABERI, B. KAPLOWITZ, N. Mechanisms of liver injury.
III. Role of glutathione redox status in liver injury, American Journal of Physiology -
Gastrointestinal and Liver Physiology, Bethesda, v. 291, n.1, p. 1-7, 2006.
12. KERR; M. G. Exames laboratoriais em medicina veterinária, bioquímica clínica e
hematologia. 2. ed. Roca, São Paulo, 2003. p. 154-155.
13. KINSCHERF, R., KAMENCIC, H., DEIGNER, H.P , PILL, J.; SCHMIEDT, W.;
SCHRADER, M.; METZ, J. Effect of alterations of blood cholesterol levels on
macrophages in the myocardium of New Zealand white rabbits. Journal of Leukocyte
Biology, New York, v. 62, p. 719-725, 1997.
14. KOWALE, B. N.; KESAVA-RAO, V.; BABU, N. P.; SHARMA, N.; BISHT, G. S. Lipid
oxidation and cholesterol oxidation in mutton during cooking and storage, Meat Science,
Barking, v. 43, p. 195-202, 1996.
15. LEMOS, R. A. A.; PURISCO, E. Plantas que causam fotossensibilização hepatógena. In:
LEMOS, R. A. A.; BARROS, N.; BRUM, K. B. (Org.). Enfermidades de interesse
65
econômico em bovinos de corte: perguntas e respostas. Campo Grande: UFMS, p.
292. 2002.
16. LUCIANO, G., VASTA, V.; MONAHAN, F. J.; LÓPEZ-ANDRÉS, P.; BIONDI, L.;
LANZA, M.; PRIOLO, A. Antioxidant status, color stability and myoglobin resistance to
oxidation of longissimus dorsi muscle from lambs fed a tannin-containing diet. Food
Chemistry, London, v. 124, p. 1036–1042. 2011.
17. LUNA, L. G. Manual of the Histologic Staining Methods of the Armed Forces
Institute of Pathology. 3. ed. New York : McGraw Hill, 1968. 258p.
18. MACEDO, M. F.; BEZERRA, M. B.; SOTO BLANCO, B. Fotossensibilização em
animais de produção na região semi-árida do Rio Grande do Norte. Arquivo do Instituto
Biológico, São Paulo, v. 73, n. 2, p. 251-254, 2006.
19. McDOWELL, L. R. Minerals in animal and human nutrition. Academic Press. New
York. 1992. 524p.
20. MILES, C. O.; MUNDAY, S. C.; HOLLAND, P. T.; SMITH, B. L.; EMBLING, P. P.;
WILKINS, A. L. Identification of a sapogenin glucoronide in the bile of sheep affected
by Panicum dichotomiflorum toxicosis. New Zealand Veterinary Journal, Wellington,
v. 39, p. 150-152, 1991.
21. MOREIRA, C. N.; CARVALHO, T. F.; COSTA, T. N.; QUEIROZ, J. A. C. C.; LAGE,
G.; HARAGUSHI, M.; FIORAVANTI, M. C. S. Bovinos alimentados com capim
Brachiaria e Andropogon: hematologia e bioquímica clínica. Ciência Animal
Brasileira, Goiânia, v. 10, n. 1, p. 195-205, 2009a.
22. MOREIRA, C. N.; MORAIS M. GARCIA E. C.; CABRAL NETO, S. ARAÚJO, E. G.;
FIORAVANTI, M. C. S. Bovinos alimentados com Brachiaria spp e Andropogon
gayanus: alterações histológicas de fígado e linfonodos. Ciência Animal Brasileira, v.
10, n. 1, p. 206-218, 2009b.
23. MORRIS, C. A.; SMITH, B. L.; HICKEY, S. M. Relationship between sporidesmin-
induced liver injury and serum activity of gamma-glutamyltransferase in Romney lambs
sired by facial eczema-resistant or control rams. New Zealand Veterinary, Wellington,
v. 50, n 1, p.14-18, 2002.
66
24. MUDRON, P.; REHAGE, J.; QUALMANN, K.; SALLMANN, H. P.; SCHOLZ, H.;
KOVAC, G. A study of lipid peroxidation and vitamin E in dairy cows with hepatic
insufficiency, Zentralblatt f¨ur Veterin’armedizin. Reihe, v. 46, n. 4, p. 219-224, 1999.
25. MUDRON, P.; REHAGE, J.; SALLMANN, H. P.; MERTENS, M.; SCHOLZ, H.;
KOVAC, G. Plasma and liver alpha-tocopherol in dairy cows with left abomasal
displacement and fatty liver, Zentralblatt f¨ur Veterin’armedizin. Reihe, v. 44, n. 2, p.
91-97, 1997.
26. MUNDAY, R. Studies on the mechanism of toxicity of the mycotoxin, sporidesmin. I-
Generation of superoxide radical by sporidesmin. Chemico-Biological Interactions,
Limerick, v. 41, n. 3, p. 361-374, 1982.
27. NRC - NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Nutrient requirements of beef cattle.
7.ed. Washington: National Academy Press, 1996. 242p.
28. PESSAYRE, D.; BERSON, A.; FROMENTY, B.; MANSOURI, A. Mitochondria in
steatohepatitis, Seminars in Liver Disease, New York, v. 21, n. 1, p. 57-69, 2001.
29. RIET-CORREA, F.; MEDEIROS, R. M. T.; PFISTER, J.; SCHILD, A. L.; DANTAS, A.
F. M.. Poisonings by plants, mycotoxins and related substances in Brazilian
livestock, Pallotti, Santa Maria, 2009. p. 80-89.
30. SANTOS, J. C. A.; RIET-CORREA, F.; SIMIÕES, S. V.; BARROS, C. S. L.
Patogênese, sinais clínicos e patologia das doenças causadas por plantas hepatotóxicas
em ruminantes e equinos no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.
28, n. 1, p. 1-14, 2008.
31. SKRIVANOVÁ, E.; MAROUNEK, M.; DE SMET, S.; RAES, K. Influence of dietary
selenium and vitamin E on quality of veal, Meat Science, Barking, v. 76, p. 495-500,
2007.
32. SMART, M. E., NORTHCOTE, M. J. Liver biopses in cattle. Compendium on
Continuing Education for the Practicing Veterinarian, Princeton, v. 7, p. 327-332,
1985.
67
33. SOKOL, R. J.; DEVEREAUX, M. W.; O’BRIEN, K.; KHANDWALA, R. A.; LOEHR,
J. P. Abnormal hepatic mitochondrial respiration and cytochrome C oxidase activity in
rats with long-term copper overload, Gastroenterology, Philadelphia, v. 105, n. 1, p.
178-187, 1993.
34. SØRENSEN, G.; JØRGENSEN, S. S. A critical examination of some experimental
variables in the 2-thiobarbituric acid (TBA) test for lipid oxidation in meat products.
Zeitschrift fur Lebensmittel Untersuchung und Forschung, Berlin, v. 202, p. 205-210,
1996.
35. VYNCKE, W. Direct determination of the thiobarbituric acid value in trichloracetic acid
extracts of fish as a measure of oxidative rancidity. Fette Seifen Anstrichmittel,
Leinfelden, v. 72, p. 1084-1087, 1970.
36. VYNCKE, W. Evaluation of direct thiobarbituric acid extraction method for determining
oxidative rancidity in mackerel (Scomber scombrus L.). Fette Seifen Anstrichmittel,
Leinfelden, v. 77, p. 239-240, 1975.
37. YASUDA, J.; SANDA, K.; OKAZAKI, H.; IWASE, E.; MACHIDA, N.; TOO, K.;
SATOH, H. Glutamic oxaloacetic transaminase isoenzymes in bovine liver disease.
Japanese Journal of Veterinary Science, Tokyo, v. 50, n. 1, p. 71-81, 1988.
68
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nas últimas décadas, tem-se observado um grande aperfeiçoamento na produção
animal, com melhoras nas práticas de manejo a fim de se desenvolver espécies animais
consideradas biologicamente eficientes, capazes de traduzir a ingestão balanceada de massa
orgânica e mineral em produção proteica. Na produção animal, existe uma constante
preocupação em minimizar as perdas produtivas e gerar aumento de lucros. Em particular,
bovinos confinados encontram-se submetidos a condições produtivas com alta pressão, que
tem desencadeado a ocorrência de estresse devido ao sistema produtivo, e consequentemente
a excessiva produção de radicais livres.
O campo do estresse oxidativo na medicina de produção ainda encontra-se nas
fases iniciais de desenvolvimento. Pesquisas têm comprovado a participação de radicais livres
no desenvolvimento de enfermidades, como por exemplo, doença do músculo branco,
deficiências reprodutivas, hepatopatias, mastites dentre outras. No entanto, há muito a ser
descoberto sobre o seu papel na sanidade e na produção de ruminantes. A clareza da
compreensão da fisiopatologia sobre a ação dos radicais livres nos animais permitirá a
concepção de terapias antioxidativas específicas. Assim como delinear padronização de
técnicas, metodologias e valores de referência para os biomarcadores de ocorrência de
estresse oxidativo.
Na medicina veterinária, isso configura um desafio na área da investigação
laboratorial, em que esses biomarcadores sanguíneos, sorológicos e teciduais possam refletir
de forma confiável no estado clínico do animal. Vários questionamentos ainda precisam ser
respondidos na investigação do estresse oxidativo veterinária.
A adoção de aditivos na suplementação de bovinos confinados tem como
finalidade potencializar o desempenho animal, por meio de melhorias nos índices de produção
e na sanidade geral. O sucesso da utilização de antioxidantes na dieta de bovinos está
associado principalmente ao tipo de alimentação fornecida aos animais, rica ou não em
forragens verde, e na minimização dos efeitos deletérios ocasionado por estresse oxidativo.
Dentre os diferentes antioxidantes ofertados aos animais no presente estudo, verificou-se que
a associação de antioxidantes propicia a obtenção de melhores resultados quando comparado
à administração isolada do aditivo.
Este estudo buscou-se analisar o efeito do estresse oxidativo em bovinos
confinados alimentados com feno de Brachiaria sp sobre as alterações hematológicas,
69
bioquímicas e histopatológicas. Além disso, avaliar se o fornecimento de suplementação
poderia minimizar essas alterações. Observou-se que a utilização de suplementos minimizou
a ocorrência de estresse oxidativo nos animais confinados e que a associação conjunta de
selênio e vitamina E propiciou a obtenção de melhores resultados, seguida pela
suplementação com zinco. Verificou-se também que os animais apresentaram uma redução na
quantidade de macrófagos espumosos, e que essa redução foi diretamente proporcional ao
biomarcador de estresse oxidativo utilizado (MDA).
Ainda há muito a ser estudado e descoberto nessa área, e neste aspecto pode-se
aprofundar ainda mais os estudos sobre o assunto a partir dos resultados obtidos com o
presente trabalho:
a) Avaliar a influência do tempo sobre as alterações avaliadas, de modo que os animais
permaneceriam por um período maior de intoxicação por esporidesmina ou por saponinas
esteróides.
b) Administrar doses mais altas de suplementação por um período mais extenso, antes da
ingestão de feno de Brachiaria sp.
c) Estabelecer o perfil de estresse oxidativo, bem como os biomarcadores a serem
empregados nessa avaliação em diferentes espécies de ruminantes.
d) Realizar avaliações com diferentes metodologias com o intuito de se comparar os
resultados obtidos além de proporcionar a obtenção e a padronização dos valores de
referência adotados para a espécie, em que a mensuração dos parâmetros de estresse
oxidativo reflete na condição clínica.
e) Desenvolver um índice de estresse (cálculo entre relação de oxidantes e antioxidantes) para
correlacionar o grau de estresse oxidativo com a enfermidade do animal.