ESPECTROMETRIA DE

MASSAS

- PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES

Lhaís Leal

Márcia Vieira

Mass Spectrometry -MS

Técnica analítica de identificação, quantificação e

caracterização molecular e estrutural de amostras,

com base na sua composição elementar.

Princípio

Ionização - formação de íons livres

Fragmentação e detecção desses íons com base

na sua relação de massa/carga(m/z)

Registro do número de íons formando um

espectro de massas

Espectrômetro de massas

• Identificar compostos desconhecidos.

• Quantificar materiais conhecidos.

• Elucidar as propriedades químicas e estruturais das

moléculas

• Medir a massa molecular de alguns compostos.

• Determinar modificações pós-traducionais de proteínas.

Aplicações

• Análise de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos.

• Na indústria farmacêutica.

• Aplicabilidade clínica: análise de hemoglobina, teste de

drogas, “screening” neonatal.

Primeiros MS

• 1897, descoberta do

elétron por J.J. Thomson• Tubo de raios catódicos

• e- como partícula subatômica

que circunda o núcleo atômico

das moléculas.

• 1907, “Espectrógrafo de

massa” rudimentar.

• 1909, descoberta de isótopos

estáveis do gás Neon.

• 1919, Aston aprimorou o

espectrômetro de massa.

J J. Thomson

Fonte das imagens:http://www.mundofisico.joinville.udesc.br

F. W. Aston

Componentes básicos

Como uma amostra é analisada?

Introdução

da amostra

IONIZAÇÃO

Formação

de íonsAnalisador de

massa (m/z)

SEPARAÇÃO

Detector

DETECÇÃO

Ions detectados

ANÁLISE DOS DADOS

ESPECTRO DE MASSAS

•Líquida

•Gasosa

•Sólida

Introdução da amostra

• Amostras: • Sólidas

• Líquidas

• Gasosas

• Técnicas cromatográficas acopladas ao MS.

Ex.: LC/MS e GC/MS

• Eletroforese

• Inserção direta.

Métodos de ionização

• O método escolhido depende da complexidade

da amostra:

• Ionização em fase gasosa.

• Por dessorção.

• Por evaporação.

Ionização

química a pressão

atmosférica(APcI)

[M+H]+=M+ou M-

Impacto de elétrons (EI):

M+

Ionização em fase gasosa

(Phase-gas)

Dessorção

Dessorção em campo(FD)Emissor de metal com

microagulhas de carbono

Bombardeamento

rápido de átomos

(FAB)Feixes de argônio ou xenônio

Dessorção

de plasma

(PDMS)Fissão de Californio 252

Dessorção a Laser

Matriz-assistida

(MALDI)

Dessorção: a transferência de átomos, moléculas ou agregados de um sólido para a fase gasosa.

Por evaporação

Electrospray (ESI)Formação de aerossol

ThermosprayIonização por

aquecimento

Análise de proteínas por MS

2DE

Recorte dos

spots de interesseDigestão com tripsina

Com ou sem cromatografia

MS

MALDI

Fonte: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/newversion/maldi-ionisation.htm

Electrospray (ES)

Fonte: http://www.magnet.fsu.edu

Analisador de massa

• Tem por objetivo separar os íons que são

produzidos na fonte de ionização de

acordo com as diferentes relações de

massa-carga;

• Principais características : o limite de

massa, a transmissão iônica e o poder

de resolução em massa.

Tipos de analisadores

Analisador de setor magnético

Quadrupolo

Quadrupolo

Quadrupolo x Instrumento de setor

magnético Vantagens

• Alta sensibilidade;

• Opera mais eficientemente sobre íons de baixa velocidade;

• Ideal para interface para LC e electrospray.

Desvantagem

• Inferior com relação a resolução e ao tamanho da massa;

TOF (Time of flight)

• O princípio de operação do TOF-MS

envolve a medida do tempo que um íon

leva para viajar da fonte de íons até o

detector.

• Após ionizada, a amostra entra no tubo e a

separação é feita baseado na diferença de

velocidade entre as partículas.

TOF

Tandem mass spectrometer

• Combinação de mais de um analisador para obter análise

em tandem no espaço;

• Os analisadores acoplados podem ser do mesmo tipo

(triplo quadrupolo) ou com equipamentos híbridos;

• Confere maiores informações estruturais e aumento da

seletividade para espectrometria de massa.

Interpretação de espectrometria de

massa• EI mass spectra

Feixe de

elétrons de

70 Ev.

Remove

um

elétron da

amostra.

Espectrometria de massa é a apresentação de

fragmentos carregados positivamente versus suas

concentrações relativas.

Padrão de fragmentação

• O padrão de fragmentação interfere no reconhecimento dopico;

• Envolve a quebra das ligações entre os elementos quecompõe a substância;

• Cada substância apresenta um padrão de fragmentaçãoespecífico;

• A intensidade do pico do íon molecular depende daestabilidade do íon molecular.

Padrão de fragmentação

• A quebra de uma ligação está favorecida nos pontos deramificação das moléculas no sentido de formarcarbocátions mais estáveis;

• Grupos de composto capazes de gerar picos de íonmolecular prominentes:

Aromáticos > Alcenos conjugados> Componentes cíclicos > Sulfeto orgânico > alcanos curtos > Mercaptanos

• Íons moleculares produzidos pelos componentes acima:

Cetonas > aminas > ésteres > éteres > ácidos carboxílicos > amida

Fragmentação do benzeno

• Proteases: grupo de enzimas hidrolíticas que desempenha um

papel importante em muitos processos regulatórios;

• Coagulação e a fibrinólise são proteolíticos associados a

cicatrização de feridas ;

• Coagulação: Fibrinogênio Fibrina

• Fibrinólise: Trombos Fibrina

Trombina

Plasmina

• RAJESH,R. et al. tem apresentado o envolvimento das

proteases do látex de Calotropis gigantea na coagulação e

fibrinólise;

• Menon et al. isolaram e caracterizaram duas proteases serina

• a partir de S. extracto de látex grantii;

• Objetivo do estudo purificar e caracterizar uma glicoproteína

fibrinogenolítica do látex de Synadenium grantii.

Referências

• RAJESHA, R; NATARAJUA,A.; GOWDAA, C.D.R.;

FREYB, B.M; FREYB, F.J.; VISHWANATH, B.S.

Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable

glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on

human fibrinogen and fibrin clot .Biochimie 88 ,1313 –

1322,2006.

• SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, X. F.; KIEMLE, J.D.

Spectrometric Identification of Organic Compound. 7

ed. 1, 8-17.1963;